המצב הנוכחי של הגנה עצבית במחלות לב מולדות חלק 1

תַקצִיר:

נוכחות של DNA חוץ רחמי בציטופלזמה גורמת לדלקת ולמוות של תאים. דווח בהרחבה כי דליפה של DNA גרעיני לתוך הציטופלזמה יכולה להיות מורגשת בעיקר על ידי סינתאז cyclicGMP-AMP (cGAS).

DNA היא המולקולה שמפרטת את המידע הגנטי של כל אדם ונמצאת בכל אחד מהתאים שלנו. מחקרים אחרונים מראים ש-DNA יכול לדלוף לתוך הציטופלזמה דרך מסלולים מסוימים ולהשפיע על הזיכרון שלנו.

תופעה זו שכיחה בקרב מבוגרים ואנשים עם ליקוי קוגניטיבי. כאשר DNA דולף לתוך הציטופלזמה, הוא מפריע לתפקודים תקינים בתוך התא ומגביר את הסיכון לאובדן זיכרון ולפגיעה קוגניטיבית.

עם זאת, אנחנו לא צריכים להרגיש מדוכאים וחסרי תקווה לגבי זה. ישנן דרכים רבות לשפר את הזיכרון ואת היכולות הקוגניטיביות כדי לעזור לנו לשמור על מוח בריא.

ראשית, עליך לשמור על אורח חיים בריא. זה כולל אכילת תזונה מאוזנת, שינה מספקת, פעילות גופנית מתונה והפחתת מתח. שיטות אלה מעודדות את בריאות המוח, ובכך נמנעות מדליפת DNA ומשפרות את הזיכרון.

שנית, נדרש אימון קוגניטיבי. זה יכול לכלול משחקי מתמטיקה, קריאה, לימוד מיומנויות חדשות וכו'. פעילויות אלו יכולות לעזור לעורר את המוח ולקדם נוירוגנזה כדי למנוע דליפת DNA.

לבסוף, שמור על גישה חיובית. חוסר יציבות רגשית ומתח מוגזם עלולים לגרום לשינויים בכימיה של המוח המעודדים דליפת DNA. לכן, עלינו ללמוד להתמודד בצורה חיובית עם האתגרים בחיים ולשמור על גישה אופטימית.

לסיכום, למרות שדליפת DNA לציטופלזמה עשויה להשפיע על הזיכרון, אנו יכולים לשפר את בריאות המוח, להימנע מדליפת DNA, ובסופו של דבר לשפר את הזיכרון שלנו על ידי אימוץ אורח חיים נכון, עיסוק באימון קוגניטיבי ושמירה על חשיבה חיובית. זיכרון ויכולות קוגניטיביות. ניתן לראות שעלינו לשפר את הזיכרון, ו-Cistanche deserticola יכולה לשפר משמעותית את הזיכרון מכיוון ש-Cistanche deserticola הוא חומר רפואי סיני מסורתי בעל השפעות ייחודיות רבות, אחת מהן היא שיפור הזיכרון. היעילות של Cistanche deserticola מגיעה מהרכיבים הפעילים המרובים שהיא מכילה, כולל חומצה טאנית, פוליסכרידים, גליקוזידים פלבנואידים וכו'. מרכיבים אלו יכולים לקדם את בריאות המוח באמצעות מגוון מסלולים.

improve memory

לחץ לדעת 10 דרכים לשיפור הזיכרון

לאחרונה דיווחנו ש-DNA דו-גדילי ציטופלסמי (dsDNA) שמקורו במיטוכונדריה שנמלט מההתדרדרות הליזוזומלית גורם לתאים מחוללי ציטוטוקסיות משמעותית וב-in vivo. ההנחה היא שה-DNA המיטוכונדריאלי ציטופלזמי מעורב במחלות והפרעות שונות, ועוד ועוד מאמרים פורסמו המאשרים זאת. מצד שני, השיטה הנוכחית להערכת DNA מיטוכונדריאלי בציטופלזמה עשויה להיות לא כמותית.

כאן אנו מציגים בפירוט שיטה להערכת תאי DNA מיטוכונדריאלי חוץ רחמי. שיטה זו שימושית במחקר בסיסי כמו גם בחקר ההזדקנות, מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, אי ספיקת לב, מחלות אוטואימוניות, סרטן ומצבים אחרים.

מילות מפתח: DNA חוץ רחמי; DNA מיטוכונדריאלי; גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A (TFAM); מחלת פרקינסון.

1. הקדמה

ה-DNA מכיל מידע חשוב להישרדות ותורשה, ויש להגן עליו מפני גורמי לחץ שונים, כולל חומרים מחמצנים ומוטגנים. תאים אוקריוטיים מכילים מיטוכונדריה, המייצרות אנרגיה, יחד עם הרבה מיני חמצן פעילים, באמצעות נשימה אירובית.

לפיכך, בתא האיקריוטי, DNA קיים בגרעין או במיטוכונדריה, ארוז בתוך הממברנה הגרעינית או הממברנה המיטוכונדריאלית, בהתאמה. עם זאת, DNA יכול להיות נוכח בציטופלזמה בתנאים מסוימים, כגון במהלך זיהומים ויראליים או לא ויראליים [1– 4].

אפילו במצבים שאינם זיהומיים מסוימים (לדוגמה, הזדקנות או הפרעות שונות הקשורות לגיל או סרטן), DNA עשוי להיות דלף לתוך הציטופלזמה מהגרעין או המיטוכונדריה [5-7].

DNA בציטופלזמה יכול להיות דלקתי ורעיל לתאים. דווח בהרחבה שדליפה של DNA גרעיני לציטופלזמה גורמת לדלקת, ציטוטוקסיות ופנוטיפ הפרשה (SASP) הקשורים להזדקנות, בעיקר באמצעות הממריץ המחזורי GMP-AMP synthase (cGAS) של מסלול גני האינטרפרון (STING). 5,6].

לאחרונה דיווחנו כי DNA דו-גדילי ציטוזולי (dsDNA) ממקור מיטוכונדריאלי שנמלט מהתדרדרות ליזוזומלית הוכח כגורם ציטוטוקסיות וניוון עצבי במודלים תאיים של מחלת פרקינסון [8]. הנוכחות או העלייה ב-DNA חוץ רחמי שכזה צוינה לעתים קרובות על ידי תמונות מיקרוסקופיות מייצגות ועדויות נסיבתיות, לא על ידי העלייה בדליפת DNA עצמה.

short term memory how to improve

ההערכה של ה-DNA החוץ רחמי הזה תהפוך חשובה יותר ויותר, לא רק למחקר בסיסי אלא גם למחקר על הזדקנות ומחלות אחרות, כגון מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, טרשת צדדית אמיוטרופית, אי ספיקת לב, מחלות אוטואימוניות, סוכרת, סטאטהפטיטיס לא-אלכוהולית (NASH) וסוגי סרטן. דווח כי נתיב cGAS-STING הוא חיוני לא רק בהזדקנות אלא גם בפתוגנזה של מחלות אלו [8-17].

כנראה בגלל הנסיבות החמצוניות סביב המיטוכונדריה והיעדר מערכת תיקון DNA יעילה ל-DNA המיטוכונדריאלי, ה-DNA המיטוכונדריאלי הרבה יותר רגיש למוטציה או לנזק מאשר DNA גרעיני [18,19].

בניגוד ל-DNA גרעיני, ה-DNA המיטוכונדריאלי קיים במספר עותקים בתא בודד ומסונתז לפי הצורך. לכן, ל-DNA המיטוכונדריאלי יש סיכוי גדול בהרבה להידלף לציטופלזמה במהלך ההזדקנות או במצבים ממאירים כגון הפרעות הקשורות לגיל, הפרעות בתפקוד המיטוכונדריאלי. , או סרטן.

זיהוי ומדידה של DNA ציטופלסמימיטוכונדרי כזה עשוי להיות חשוב בהבנת הפתוגנזה של מחלות שונות והזדקנות ויכול להפוך לסמן ביולוגי ולמטרה טיפולית.

פיתחנו שיטה חצי כמותית להערכת DNA מיטוכונדריאלי חוץ רחמי דולף לציטופלזמה, וכאן אנו מתארים את השיטה בפירוט. מאמר זה מאפשר הערכה אובייקטיבית של דליפת DNA במיטוכונדריה והוא שימושי במחקר של פתולוגיות שונות של מחלות.

2. חומרים ושיטות

2.1. קווי תאים, טיפול siRNA וניתוח PCR כמותי (qPCR).

תאי HeLa נגזרו מתאי סרטן צוואר הרחם ממטופלת (ATCC,CCL-2). תאי HeLa תורבו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2 ב-Dulbecco Modified EagleMedium (DMEM) (Nacalai Tesque, קיוטו, יפן) בתוספת 10% בוינסרום עוברי (FBS) (Biowest, Nuaillé, צרפת) ותמיסת פניצילין-סטרפטומיצין ( 100 יחידות/מ"לפניצילין G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין סולפט, וואקו, אוסקה, יפן).

יום אחד לפני ההעברה, תאי HeLa צופו בצפיפות של 600 תאים/µL. הביטוי של גנים של עניין הושתק בתאי HeLa באמצעות Stealth RNAi siRNA (גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A, TFAM: HSS144251, glucocerebrosidase, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, ארה"ב) ב- Lipocientrfamine Reagent (The Transientrfamine ReRNAiMAX) הוראות היצרן (ריכוז RNA סופי של 10 ננומטר).

שלושה ימים לאחר השבתת siRNA, RNA תאי כולל בודד באמצעות TRIzolreagent לפי הוראות היצרן (Thermo Fisher Scientific). תבניות cDNA יוצרו מה-RNA המטוהר באמצעות ערכת הסינתזה של ProtoScript II First StrandcDNA (New England Biolabs, Ipswich, MA, ארה"ב) עם primers oligo (dT)20.qPCR בוצע באמצעות TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu , יפן) ונותחו ב-Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio). הפריימרים של PCR שנעשה בהם שימוש במחקר הנוכחי היו GBA קדימה (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA reverse(TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM קדימה (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM הפוך (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), Glyceraldehyde{{1}Dehydrogen דהידרוגן (CGATCTA) פוסיד (CGATCTA) DH הפוך (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת GraphPad Prism גרסה 9.3.1 (GraphPad Software, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). נעשה שימוש במבחני t של תלמידים דו-צדדיים כדי להשוות אמצעים אריתמטיים בין שתי קבוצות. הנתונים מוצגים כאמצעים ו± שגיאות סטנדרטיות של האמצעים.

2.2. זיהוי אימונופלואורסצנטי של DNA מיטוכונדריאלי חוץ רחמי וניתוח תמונה

יום אחד לפני ההעברה, תאי HeLa צופו בצפיפות של 600 תאים/µL. הביטוי של גנים בעלי עניין הושתק בתאי HeLa באמצעות Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) ב- Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) לפי הוראות היצרן (ריכוז RNA סופי של 10 ננומטר).

ways to improve memory

שלושה ימים לאחר דפיקת siRNA, תאים עברו צביעה אימונופלואורסצנטית. לזיהוי של DNA מיטוכונדריאלי, נוגדן אנטי-dsDNA (Abcam,Cambridge, UK, Clone 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 או EMD Millipore, Billerica, MA, USA, Clone AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) הראו יחס אות לרעש טוב יותר מאשר Hoechst 33258, DAPI או Picogreen. כאן שילבנו שלושה נוגדנים ראשוניים: נוגדן אנטי-dsDNA (35I9 DNA) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), נוגדן אנטי-היסטון-H2B (Abcam, Cat# ab134211), ואנטי-חום- נוגדן shock-protein-60 (Hsp60) (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

נוגדנים אחרים יכולים להיבחר או מתויגים עם היסטון, או Hsp60 ניתן להשתמש לחלופין, אבל יש צורך לייעל את התנאים של צביעה משולשת עבור כל שילוב.

תאים נשטפו פעמיים עם מי מלח מחוסם פוספט (PBS) וקבוע עם מתנול קר כקרח למשך 10 דקות ב-4 ◦C. לחילופין, ניתן להשתמש ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) לקיבוע, אך נראה כי אותות הרקע נראים הרבה יותר גדול בדגימות קבועות ב-PFA. לאחר הקיבוע, התאים נשטפו שלוש פעמים עם מי מלח מבוצר פוספט עם Tween 20 (PBST) למשך 5 דקות כל אחד. התאים עברו חלחול עם PBS המכילים 0.2% (w/v) Triton X-100 למשך 10 דקות.

לאחר שטיפה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות בכל פעם, התאים הודגרו עם 2% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBST למשך 30 דקות. התאים הודגרו עם נוגדן ראשוני יחיד, נוגדן אנטי-היסטון-H2B (1/400, Abcam, Cat# ab134211) מדולל ב-2%(w/v) BSA ב-PBST O/N ב-4 ◦C. לאחר שטיפה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות בכל פעם, התאים הודגרו עם Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17 }}) מדולל ב-2% (w/v) BSA ב-PBST למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).

לאחר שטיפה שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם PBST, תאים הודגרו עם נוגדנים ראשוניים, ונוגדן אנטי-dsDNA (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) ואנטי נוגדן Hsp60 (1/400, Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444) מדולל ב-2% (w/v) BSA ב-PBST יושמו למשך שעה אחת ב-RT או למשך הלילה (O/N) בשעה 4◦C.

לאחר שטיפה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות בכל פעם, התאים הודגרו עם Alexa Fluor 680-מצומד Donkey anti-rabbit IgG(H+L) עם ספיגה צולבת גבוהה (1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043 , RRID: AB_2534018) ו-Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073) מדולל ב-2% (w/v) BSA ב-PBST למשך שעה אחת ב-RT.

memory enhancement