התפקידים המכריעים של TRPM6 בוויסות הצירקדי של לחץ הדם

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

חשיבות תעלת היונים הכלייתית TRPM6 בהפרשה הצירקדית של רנין להעלאת לחץ הדם

Yosuke Funato, Daisuke Yamazaki, Daisuke Okuzaki, Nobuhiko Yamamoto & Hiroaki Miki

לחץ דםיש דפוס יומי, עם ערכים גבוהים יותר בתקופה הפעילה. העלייה שלו בתחילת התקופה הפעילה מעלה באופן משמעותי את הסיכון לאירועים קרדיו-וסקולריים קטלניים. הפרשת רנין המגורה על ידי נוירונים סימפטיים כליות נחשבת חיונית לתהליך זה; עם זאת, מנגנון הרגולציה שלו נותר לא ידוע במידה רבה. כאן, אנו מראים את החשיבות שלפוטנציאל לקולטן חולף הקשור למלסטטין 6 (TRPM6), ערוץ קטיון חדיר Mg2 plus, בהגברת הפרשת רנין בתקופה הפעילה.TRPM6הביטוי מופחת באופן משמעותי בצינורית המפותלת הדיסטלית של עכברים בעלי חוסר ב-Cnnm2-. אנו מייצרים ספציפי לכליהTRPM6-עכברים חסרים ולצפות בירידה בלחץ דםוהיעלמות של הווריאציה הצירקדית שלו. באופן עקבי, הפרשת רנין אינה מוגברת בתקופה הפעילה. יתר על כן, הפרשת רנין לאחר הפעלה תרופתית של -אדרנורצפטור, היעד לגירוי עצבי, מתבטלת, וביטוי הקולטן פוחת בתאים המפרישים רנין. תוצאות אלו מצביעות על התפקידים המכריעים שלTRPM6 ברגולציה הצירקדית שללחץ דם.

על פי הערכות, כמיליארד אנשים ברחבי העולם סובלים מיתר לחץ דם, מה שמגביר באופן משמעותי את הסיכון למחלות שונות, כולל מחלות שעלולות להיות קטלניות, כמו מחלת לב איסכמית ושבץ מוחי. ידוע כי מקרים קטלניים הקשורים ליתר לחץ דם מתרחשים לעתים קרובות בשעות הבוקר המוקדמות, תחילת התקופה הפעילה כאשרדָםלַחַץעולה בחדות. הפרשת רנין המופעלת על ידי נוירונים סימפטיים של הכליה נחשבת למלאת תפקיד מכריע בכךלחץ דםגובה, אך מנגנון הרגולציה שלו אינו מובן היטב².

פיתוח גוף cistanche

מקובל על כך שכמה מינרלים תזונתיים, במיוחד נתרן ואשלגן, ממלאים תפקידים חשובים בשליטה עלדָםלַחַץ. מגנזיום הוא מרכיב חיוני מרכזי המעורב במגוון פעילויות ביולוגיות. מחקרים אפידמיולוגיים הראו קשר הפוך משמעותי בין רמות המגנזיום בתזונה לבין הסיכון ליתר לחץ דם3-6. יתרה מכך, הפרשת מגנזיום בשתן, אשר מניחים שהיא נמצאת בשיווי משקל משוער עם ספיגת המגנזיום במעיים, נמצאת בקורלציה הפוכה עם הסיכון ליתר לחץ דם. ממצאים אלו מצביעים על קשר הדוק בין הומאוסטזיס מגנזיום אורגניזמי לביןלחץ דםרגולציה, תוך הדגשת החשיבות של ערוצי Mg2 plus ו/או טרנספורטרים בוויסות שללחץ דם.

כמות גדולה של מגנזיום כל הזמן נספגת מחדש בכליה. רוב המגנזיום בתסנין הגלומרולרי נספג מחדש בגפה העולה העולה של הלולאה של הנלה, אך השלב האחרון של הספיגה מחדש מתרחש בצינורית המפותלת הדיסטלית (DCT)8. התהליך האחרון מווסת היטב כדי להתאים את כמות הספיגה מחדש לרמה המתאימה לשמירה על הומאוסטזיס מגנזיום. ניתוחים גנומיים של מחלות מולדות עם סימפטומים של היפומגנזמיה חשפו מספר מולקולות מפתח המעורבות בתהליך זהTRPM6, קידודפוטנציאל לקולטן חולף הקשור למלסטטין 6(TRPM6), אשר עובר מוטציה בחולים עם היפומגנזמיה רצסיבית עם היפוקלצמיה משנית2,10.TRPM6יוצר תעלת יונים חדירת Mg2 פלוס הממוקמת לממברנה האפיקלית של תאי DCT ומתווכת צריכת Mg2 פלוס מהלומן הצינורי1. מולקולת מפתח נוספת היא cyclin M2(CNNM2), ו-Mg2 פלוס טרנספורטר הממוקמים לממברנה הבסיסית של תאי DCT12,13. מוטציות Cnnm2 גורמות להיפומגנזמיה דומיננטית משפחתית, המאופיינת בפגמים בספיגה מחדש של מגנזיום בכליה2. עכברים עם מחסור ב-Cnmm{11} מראים תסמינים דומים של היפומגנזמיה עם בזבוז מגנזיום בכליה4. התפקיד המולקולרי המדויק של CNNM2 עדיין שנוי במחלוקת, אך מספר שורות של ראיות מצביעות על כך שהוא מתווך Mg2 פלוס זרימה מתאי DCT דרך הממברנה הבסיסית5, ובכך תורם לספיגה מחדש של מגנזיום. ניתוחים נוספים של עכברים חסרי Cnnm2- גילו שלעכברים אלו יש גם נמוך משמעותיתדָםלַחַץמאשר עכברי שליטה4. עם זאת, הפרטים המכניסטיים והמעורבות של ערוצים/טרנספורטרים אחרים של Mg2 פלוס בזהדָםלַחַץהרגולציה נותרה לא ידועה.

ידוע גם כי ה-DCT הכלייתי ממלא תפקיד קריטי בדָםלַחַץויסות מכיוון שהוא סופג מחדש נתרן באופן משמעותי ומווסת את נפח נוזלי הגוף6. מספר תעלות/טרנספורטרים של קטונים, כגון Na-Cl co-transporter(NCC), תעלת נתרן אפיתל(ENaC), ו-Na plus /H plus מחליף 2(NHE2), מתבטאים בממברנה האפיקלית של DCT וחלקם חלבונים אלו מתווכים צריכת Na plus לתאי DCT מהלומן הצינורי. לאחר מכן נשלח Na plus תוך תאי מהתאים דרך הממברנה הבסיסית על ידי Na plus /K plus -ATPase כדי להשיג את הספיגה מחדש שלו. מלבד מעורבות ישירה בוויסות נפח נוזלי הגוף, ה-DCT ממוקם בסמוך ל-macula densa, השולטת בהפרשת הרנין, הורמון עם התפקיד העיקרי בתזמור.לחץ דםתקנה17,18. על ידי חישת רמות Cl- בשתן, תאי macula densa מגרים תאי juxta-glomerular (JG) סמוכים להפריש רנין.

בעבודה זו, אנו מבצעים ניתוחי תעתיקים עם כליות של עכברים בעלי חוסר ב-Cnnm2-. אנו מוצאים ירידה משמעותית בTrpm6, מה שמניע אותנו ליצור ספציפי לכליהTrpm6-עכברים חסרי. באופן בלתי צפוי, ניתוחים של זן עכברים זה חושפים פנוטיפ שונה איכותית מזה של חסר ב-Cnnm2-: אובדן וריאציה צירקדית שלדָםלַחַץ. אנו מוצאים גם שפנוטיפ זה נגרם על ידי הפרשת הפרשה של רנין, אלחץ דםהורמון מעלה שרמתו בדם מוגברת בדרך כלל בשלב הפעיל.

פיתוח גוף cistanche

תוצאות

הורדת רגולציה שלTRPM6 (פוטנציאל לקולטן חולף הקשור למלסטטין 6)ביטוי בעכברים חסרי Cnnm2-. לחקור את המנגנון המולקולרי שללחץ דםהפחתה בעכברים חסרי Cnnm2-, ביצענו ניתוחי מיקרו מערכי DNA כדי לחקור שינויים בביטוי גנים בכליה של Cnnm2f/il; שישה2-עכברי Cre, חסרים שני אללים Cnnm2 בכליה4. בין הגנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית (טבלה 1), בחרנו לנתח את Pvalb וTrpm6, שניהם באים לידי ביטוי ב-DCT919. ניתוחי PCR כמותיים (qPCR) גילו זאתTrpm6הביטוי היה מופחת באופן דומה בכליות של שני Cnnm2fi; שישה2-Cre ו-Cnnm2 פלוס / עכברים. מכיוון שגם Cnnm2 plus /A וגם Cnnm2fi/; שישה2-עכברי Cre היו בעלי יתר לחץ דם4, ניתחנוTRPM6 ביטוי ביתר פירוט. ניתוחי אימונובלוטינג של ליזטים של הכליות אישרו ירידה משמעותית שלTRPM6ברמת החלבון על ידי מחסור ב-Cnnm2-, בעוד שהרמות של NCC ו-NCC מזורחן (צורה פעילה) לא הושפעו בצורה ניכרת, ביטוי CNNM2 אושר על ידי ניתוחים רצופים של משקעים אימוניים ואימונובלוטינג). הירידה שלTRPM6בכליות של Cnnm2f/i; שישה2-עכברי Cre אושרו גם על ידי ניתוחי אימונופלואורסצנטי.

גם בדקנוTRPM6ביטוי בעכברים חסרי CNNM4, אשר מראים גם תסמינים של היפומגנזמיה20 אך עלולחץ דם4. ניתוחי אימונובלוטינג ואימונופלואורסצנטי הצביעו על כךTRPM6הביטוי מוגבר בתאי DCT של עכברים חסרי Cnnm4-, מה שמרמז על כךTRPM6ביטוי קשור קשר הדוק עםלחץ דםערכים, אבל זה לא קשור ישירות לרמות המגנזיום בדם.

תקנה שלTRPM6ביטוי על ידי Mg2 plus תוך תאי בתאי DCT. לאפיין את המנגנון המולקולרי שלTRPM6 הורדת ויסות בעכברים חסרי Cnnm2-, השתמשנו בקו תאים שמקורו ב-DCT MDCT21, המבטא באופן דומיננטי Cnnm2 ו-Cnnm3 ו-Cnnm4 באופן מתון בין הגנים של משפחת Cnnm. מכיוון של-CNNM2 ו-CNNM4 יש פעילות חזקה של Mg2 פלוס זרימה בעוד של-CNNM3 אין פעילות של Mg2 פלוס זרימה15, ביצענו נוק-דאון בתיווך RNA(siRNA) קטן של Cnnm2, Cnnm4 או שניהם. Cnnm2 נוק-דאון הגדיל את רמות ה-Mg פלוס התוך-תאי ([Mg plus ]), והפלה בו-זמנית של Cnnm4 הובילה לעלייה קלה של [Mg2] הממוצע; ערך, שלא היה מובהק סטטיסטית. בהמשך בדקנוTrpm6ביטוי על ידי qPCR ומצא ירידה משמעותית לאחר ה-Cnnm2 נוק-דאון וירידה גדולה בהרבה לאחר ה-Nockdown הכפול של Cnnm2 ו-Cnnm4. לָכֵן,Trpm6נראה כי הביטוי מווסת לרעה על ידי רמות Mg2 פלוס תוך תאי, מה שעולה בקנה אחד עם הדוחות הקודמים23. כדי לבחון ישירות את החשיבות של Mg2 פלוס, תרבתנו תאי MDCT במדיה עם ריכוזים שונים של Mg2 פלוס .1h, ירידה בריכוז Mg2 פלוס החוץ תאי הובילה להפחתה ברמת Mg2 פלוס התוך תאית ולעלייה שלTrpm6ביטוי, המצביע על תפקיד מדכא של Mg2 plus .במקרה של תאי MDCT כפולים (Cnnm2/Cnnm4),Trpm6הביטוי דוכא עם ירידה ב-Mg2 plus

פלוס ריכוזים עד 0.2 מ"מ, אך הפחתות נוספות ביטלו את האפקט המדכא; גם Mg2 פלוס תוך תאי וגםTrpm6רמות לא היו שונות באופן מובהק מתאי ביקורת שעברו transfected siRNA בתנאים של 0.1 וגם 0.02 mM. תוצאות אלו מצביעות על מנגנון ויסות תלוי ב-Mg2 פלוס שלTrpm6ביטוי, המסביר אתTrpm6הורדת ויסות בכליות של עכברים עם חסרי Cnnm{{0}.

שיבוש מותנה שלTrpm6 (פוטנציאל לקולטן חולף הקשור למלסטטין 6)בכליה. לאחר מכן, שאפנו ליצורTrpm6-עכברים חסרים כדי לחקור עוד יותר את החשיבות שלTRPM6בתקנה שללחץ דם. השתמשנו בשיבוט תאי גזע עוברי (ES) הנושא רקומביננטיTrpm6אלל (Trpm6-) המכיל רצף מקבל שחבור, הכופה שחבור מוקדם של mRNA וכתוצאה מכך mRNA קטוע לאחר אקסון 6. עכברים הטרוזיגוטיים כימריים הושגו על ידי הזרקת בלסטוציסט של תאי ES והרקומבינציה אושרה על ידי PCR. הצלבנו את אלהTrpm6פלוס /- עכברים, אבל לאTrpm6-/--off_אביב הושגו. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים המראים קטלניות עובריתTrpm6-עכברים חסרים24,25

לכן, ביצענו הפרעה מותנית ספציפית לכליה שלTrpm6באמצעות Six2-Cre, המאפשר ביטוי יעיל וספציפי של Cre recombinase מאוחד GFP בכליה העוברית.Trpm6fl/, שישה2-עכברי Cre (ספציפי לכליהTrpm6עכברים חסרים) נולדו ביחס המנדלאני הצפוי. כדי לקבוע את הביטוי שלTRPM6, ביצענו ניתוחי אימונובלוטינג באמצעות אנטי-TRPM6נוֹגְדָן.TRPM6רמות החלבון הופחתו מאוד בכליות שלTrpm6fl/fl, שישה2-עכברי קר, אך לא נצפו שינויים משמעותיים באיברים אחרים. ניתוחי צביעה אימונופלואורסצנטית גם לא הראו שום ביטוי שלTRPM6בתאי DCT חיוביים ל-NCC. לא ראינו שום דבר משמעותיTRPM6אות חיובי ביותר מ-100 אשכולות כאלה של תאים חיוביים ל-NCC, מה שמרמז על כךTRPM6הביטוי מדוכא כמעט לחלוטין בתאי DCT של Trpmfi/; שישה2-עכברי קר. תוצאות אלה מאשרות את הדור המוצלח של ספציפי לכליהTrpm6-עכברים חסרי.

תחילה בדקנו את ההשפעה של ספציפי לכליהTrpm6-מחסור בהומאוסטזיס של מגנזיום. שמרנו על עכברים בכלובים מטבוליים ואספנו דגימות שתן וסרום, שבוצעו לאחר מכן לכימות קולורימטרית של רמות המגנזיום באמצעות Xylidyl Blue-I. רמות המגנזיום בסרום היו נמוכות משמעותית בTrpm6l/l; שישה2-עכברי Cre בהשוואה לאלו שבשליטהTrpm6פלוס / פלוס ; שישה2-עכברי Cre, בעוד שרמות המגנזיום בשתן היו גבוהות יותר. ביצענו גם ניתוחי ספקטרוסקופיה של פליטת פלזמה בשילוב אינדוקטיבי (ICP-ES) למדידת מספר יסודות מתכת עיקריים בסרום ומצאנו שרק רמות המגנזיום הושפעו באופן משמעותי ב-Trpmd/; שישה2-עכברי קר. תוצאות אלו מצביעות בבירור על כך שלעכברים חסרי Trpm6-יש היפומגנזמיה עם בזבוז מגנזיום כלייתי, כפי שנצפתה ב-Cnnm2-מיסל4 ספציפי לכליה.

חוסר וריאציה צירקדית שלדָםלַחַץופעילות רנין. לאחר מכן, נתנוTrpm6i/l; שישה עכברים2-לדָםלַחַץמדידות באמצעות רדיו-טלמטריה. סיסטולי ודיאסטולילחץ דםשניהם היו נמוכים משמעותית בTrpm6l/; שישה2-עכברי קר מאשר בעכברי בקרה. ראוי לציין כי הווריאציה הצירקדית הרגילה שללחץ דם, עם ערכים גבוהים בתקופת החשיכה וערכים נמוכים בתקופת האור בעכברים, לא נצפו בTrpm6f/l; שישה2-עכברי קר. כדי לבחון אם הקצב הצירקדי ממשיך כרגיל, השתמשנו ברדיוטלמטריה כדי למדוד את פעילות הקטר של עכברים ואישרנו וריאציה צירקדית ברורה מאוד בTrpm6l/; שישה{{0}}עכברים. כמו כן, בדקנו את רמות הדם של vasopressin (AVP) ורמות mRNA של שני גנים שעון Bmall ו- Per2 במוח ובכליות; ידוע שכולם מראים וריאציה צירקדית טיפוסית27,28. ניתחנו בשש נקודות זמן שונות (ב-0,4,8 זמני צייטבר (ZT) לתקופת האור וב-12,16,20 ZT לתקופת החושך). עכברי בקרה מראים דפוסים ברורים של הביטוי שלהם כפי שדווח בעבר28, ושוב, לא מצאנו חריגות משמעותיות בTrpm6/il; שישה2-עכברי קר. בדקנו גם את רמת הביטוי של Trpm7, המקודד ערוץ Mg2 plus -חדיר הקשור קשר הדוק לTRPM6, בכליה. תבניות ההבעה היו דומות מאוד בשניהםTrpm6פלוס / פלוס ; שישה2-Cre ו-Trpm6f/; שישה2-עכברי קר, ולא הראו דפוסי יממה ברורים. ביחד, אנו מסיקים שהקצב הצירקדי ממשיך כרגילTrpm6אני; שישה2-עכברי קר. זה נחשב כךדָםלַחַץעלייה במהלך התקופה הפעילה (תקופת החושך עבור עכברים ותקופת האור עבור בני אדם) הן בבני אדם והן בעכברים מתרחשת בתגובה לעלייה בהפרשת הרנין לדם2. מדדנו פעילות רנין בדגימות דם שנאספו בשש נקודות הזמן השונות שתוארו לעיל. עלייה ברורה בפעילות הרנין בדם נצפתה בתקופות החשיכה בדגימות מעכברי ביקורת, אך לא נצפתה עליה משמעותית בדגימות מאלו שלTrpm6/lSix2-עכברים. כמו כן, מדדנו את רמת הנוראדרנלין בדם, ששחרורו ידוע כמעורר על ידי הפעלת מערכת הרנין-אנגיוטנסין29,30. כצפוי, גם הווריאציה הצירקדית שלהם נעלמהTrpm6, שישה2-עכברי קר. בינתיים, רמת החלבון של אנגיוטנסין בדם (AGT), מולקולה מגבילת קצב נוספת להפעלת מערכת הרנין-אנגיוטנסין בעכברים31, לא הושפעה על ידיTrpm6 מחסור ב. התוצאות מצביעות על כך שהוריאציה הצירקדית הפגומה של רנין חשובה לאובדן השונות הצירקדית שלדָםלַחַץעל ידיTrpm6-מחסור ב.

הקרבה שלTRPM6-מבטא תאים לתאים המפרישים רנין. רנין מתבטא ומופרש מתאי JG בכליה17,18. תאי JG נמצאים במגע ישיר עם macula densa, שנמצאת בסמוך ל-DCT ומעוררת הפרשת רנין מתאי JG בתגובה להפחתת רמות Cl בשתן18. צביעה אימונופלואורסצנטית עבור רנין וסינתאז תחמוצת החנקן העצבית (nNOS), סמן macula densa, לא הראה חריגות לא בדפוס או בעוצמת האותות החיוביים שנצפו ליד הגלומרולי בTrpm6f/; שישה2-עכברי קר. לכן, נראה כי תאים המעורבים ישירות בהפרשת רנין ובוויסות שלו אינם מושפעים באופן ניכרTrpm6מחסור ב. כפי שTRPM6בא לידי ביטוי יחד עם NCC ב-DCT, לאחר מכן בדקנו את הקשר המרחבי ביניהםTRPM6/NCC-expressing cells(DCT) ותאי macula densa או JG. תמונות קונפוקאליות של קטעי DCT sagittal הראו כמעט חפיפה מלאה שלTRPM6ואותות NCC בכל ה-DCT. לאחר מכן צבענו עבור nNOS ו-NCC, ומצאנו שהאזורים החיוביים עבור nNOS ו-NCC מחוברים, ללא שום חפיפה של אותות. בנוסף, צביעה כפולה עבור רנין ו-NCC.TRPM6/NCC חשף שחלקםTRPM6תאים המבטאים /NCC נמצאים בקרבת תאי JG המבטאים רנין, מה שמצביע על כךTRPM6לתאים המבטאים /NCC, כמו גם ל-macula densa, עשויה להיות השפעה משמעותית על הפרשת רנין.

הפרשת רנין לקויה על ידיTrpm6 (פוטנציאל לקולטן חולף הקשור למלסטטין 6)מחסור ב. באופן כללי, מערכת העצבים האוטונומית ממלאת תפקיד מכריע בתזמורת התקדמות המקצב הצירקדי. הפרשת רנין מתאי JG במהלך התקופה הפעילה נחשבת לגירוי על ידי נוראדרנלין המופרש מתאי עצב סימפטטיים כליות32. כדי לחקור ישירות את ההשפעה של גירוי כזה על הפרשת רנין, הכנו פרוסות כליה והמרנו אותן באמצעות איזופרוטרנול, אגוניסט -אדרנורצפטור (AR). התוצאות הראו ירידה ברורה מאוד בסיגנל חיובי לרנין שנותר בפרוסה לאחר גירוי איזופרוטרנול למשך 30 דקות. ניתוחים כמותיים הראו שאחוז הגלומרולי המוקפים באות חיובי לרנין ירד מכ-80% ל-30% לאחר גירוי איזופרוטרנול, דבר המעיד על התרחשות של הפרשת רנין מסיבית. עם זאת, לא ראינו השפעה משמעותית של גירוי איזופרוטרנול על אות רנין בפרוסות כליה מTrpm6/1; שישה2-עכברי קר. כדי לאשר את התוצאה, מדדנו גם את פעילות הרנין בדם לאחר מתן איזופרוטרנול. התוצאות מראות שעלייה משמעותית בפעילות הרנין בדם נצפתה רק בעכברי ביקורת, בעוד שעלייה בקצב הלב נצפתה בדרך כלל בשני הזנים. תוצאות אלו מרמזות שתאי JG מפרישי רנין אינם יכולים להגיב לגירוי מנוירונים סימפטיים של הכליה, בהתאם להיעלמות העלייה הצירקדית בדָםלַחַץופעילות רנין בTrpm6l/fl; שישה2-עכברי קר.

ניתן גם לעורר תאי JG להפריש רנין בתגובה לפרוסטגלנדינים, ביניהם פרוסטגלנדין E2(PGE2) נחשב למשמעותי ביותר שכן הוא מופרש פיזיולוגית על ידי תאי macula densa כאשר רמות Cl- בשתן יורדות17,18. יתרה מכך, ידוע גם ש-PGE, טיפול בפרוסות כליה יכול לעורר הפרשת רנין ביעילות33. גירוי של תאי JG עם PGE2 ואיזופרוטרנול מפעיל בדרך כלל ייצור cAMP, אשר בסופו של דבר גורם להפרשת רנין. לכן, בדקנו גם את ההשפעה של PGE, והאנלוגי cAMP החדיר לממברנה, dibutylyl-cAMP(db-cAMP).PGE2 ו-db-cAMP גירו בהצלחה הפרשת רנין בפרוסות כליה מ-Trpmdi/A, Six2- עכברי קר, ועכברי שליטה. זה מעיד על כךTrpm6 מחסור אינו מבטל את המנגנון הכללי הכרוך בחישת רמזים חיצוניים, העברת אותות תוך תאיים וביצוע הפרשת רנין, אך הוא משפיע באופן ספציפי על התגובה ל-AR.

ירידה בביטוי -AR בתאי JG על ידיTrpm6 (פוטנציאל לקולטן חולף הקשור למלסטטין 6)מחסור ב. תגובת קולטן -AR לקויהTrpm6l/l; שישה עכברי2-Cre הובילו אותנו לחקור את מצב הביטוי של הקולטן ל-AR, וכך ביצענו אימונופלואורסצנציה של 1-AR, תת-הסוג העיקרי -AR המתבטא בתאי JG34. כפי שדווח בעבר34, מצאנו את דפוס הצביעה דמוי הרצועה בחלקי הכליה של עכברי ה-Control ו-Trpmdi/l, Six2-Cre. ידוע ש-1-AR מתבטא בחוזקה גם בכלי דם וגם בתאי JG34, ובאופן עקבי, התאים 1-החיוביים ל-AR בסוף הצביעה דמוית הרצועה בכליית עכבר הבקרה היו חיוביים גם הם. לצביעת רנין (מוצג עם ראש חץ). לעומת זאת, הצביעה של Trpm6l/fl; שש2-Cre mouse כליות הראו מספר קטן יותר של 1-תאים חיוביים כפולים AR/renin, מה שמרמז ש1-ביטוי AR ירד בתאי JG. כדי לאשש ממצא זה, בודדנו תאי JG על ידי שימוש בשיטת צנטריפוגה צפיפות צפיפות Percoll לפי הדו"ח הקודם35. ניתוחים של אימונובלוטינג גילו שתאי JG חיוביים לרנין מועשרים בשבריר הרצועה 3, דבר העולה בקנה אחד עם הדיווח שלהם35, ו1-ביטוי AR בשבריר פס 3 זה היה נמוך בהרבה ב-Trpmdi/1; שישה2-עכברי קר. ביחד, מצאנו את זהTrpm6מחסור מקטין את רמת הביטוי של 1-AR בתאי JG, מה שעולה בקנה אחד עם הפרשת רנין לקויה.

השפעת ההתערבות המלאכותית על היממהדָםלַחַץוָרִיאַצִיָה. במערך הניסויים הסופי, בדקנו את ההשפעה של התערבויות שונות על היממהדָםלַחַץוָרִיאַצִיָה. כדי לאשר את החשיבות של רנין, הענקנו מעכב רנין זמין קלינית aliskiren36 לעכברים מסוג פרא. כמוTrpm6אבלציה, מתן אלישקירן על ידי השתלה כירורגית של מיני-משאבה אוסמוטי דיכא באופן משמעותי את היממה.דָםלַחַץוָרִיאַצִיָה. לאחר מכן, ביצענו פעולות דנרבציה של הכליה, מכיוון שהפעלה של -AR על תאי JG דרך מערכת העצבים הסימפתטית היא המסלול העיקרי לגירוי הפרשת רנין באופן צירקדי2. שוב, מצאנו שההתערבות דיכאה אתדָםלַחַץוָרִיאַצִיָה. תוצאות אלו תואמות את המודל שלנו לפיו פגמים בתגובת -AR ובהפרשת רנין אחראים לאובדן שללחץ דםוריאציה ב-Trpmdl/l; שישה2-עכברי קר.

בדקנו גם את ההשפעה של העלאת תכולת המגנזיום בתזונה. למטרה זו, עכברים מסוג פרא הוזנו בדיאטה עתירת Mg המכילה 0.6 אחוז (תזונה רגילה:0.3 אחוז מגנזיום) למשך חודש אחד. כצפוי, העכברים הללו הראו רמות Mg מוגברות בדם. לאחר מכן בדקנו את רמת הביטוי שלTRPM6ב-DCT; זה ירד באופן דרסטי על ידי האכלה של דיאטה עתירת Mg, והיקף הירידהTRPM6הביטוי היה גדול יותר מאשר אבלציה Cnnm2 כלייתית. כאשר מדדנו אתלחץ דםבעכברים אלה, מצאנו שעכברים שניזונו מתזונה עתירת Mg הראו פחות משמעותיתדָםלַחַץוריאציה מאשרTrpm6עכברים חסרים, מה שעולה בקנה אחד עם התפיסה שלנו שכלייתיתTRPM6חשוב עבור יממהלחץ דםוָרִיאַצִיָה.

טבלה 1 גנים שהיו מווסתים או מטה בכליות של Cnnm2flfl/flfl; שישה2-עכברי קר.

דִיוּן

במחקר זה הדגמנו את החשיבות שלTRPM6 (פוטנציאל לקולטן חולף הקשור למלסטטין 6)בתקנה שללחץ דם. בפרט, אנו מראים היעלמות כמעט מוחלטת של הווריאציה הצירקדית שללחץ דםבספציפית לכליהTrpm6-עכברים חסרי. מצאנו גם שהפרשת רנין, הורמון מפתח מתיזמר לחץ דם, בוטלה באופן חמור בTrpm6עכברים חסרים, מה שעולה בקנה אחד עם הנצפהלחץ דםפנוטיפ. מספר דיווחים הראו ש-TRPM7, ערוץ חדיר נוסף של Mg2 פלוס דומה מאודTRPM6, משפיע גם על לחץ הדם37,38. TRPM7 מונע עלייה שללחץ דםעם מתן אנגיוטנסין II על ידי דיכוי התגובה של תאי אנדותל כלי דם ל-Angiotensin II37. להיפך, לאחרונה דווח כי TRPM7 מקל גם על הרמה שללחץ דםעם מתן לפטין על ידי תיווך של Mg2 פלוס זרימה לתאי גוף הצוואר38. לפיכך, תפקידו של TRPM7 בלחץ דםהרגולציה אינה חד משמעית. עם זאת, מכיוון שרמת הביטוי של TRPM7 בכליה לא הושפעה מהכליותTrpm6אבלציה (איור משלים. 5), נראה ש-TRPM7 אינו מעורב ישירות בפנוטיפים שנצפו במחקר זה.

כפי שנצפה בעכברים חסרי Cnnm2-,לחץ דםהערכים הופחתו בTrpm6-עכברים חסרים (איור 2)14. עם זאת, יש לציין כי היה הבדל ברור בין העכברים הללו. שיבוש Cnnm2 ירד בדרך כלללחץ דם, אך עדיין ניתן היה לראות בבירור וריאציה יממה. לעומת זאת, וריאציה זו נעלמה פנימהTrpm6-עכברים חסרי. הבדל איכותי כזה תואם גם לתצפית שלנו שהווריאציה הצירקדית של רנין נשמרה בעכברים חסרי Cnnm2- (איור משלים.9). יש לציין שגם CNNM2 וגםTRPM6נחשבים כחשובים לספיגה מחדש של Mg2 פלוס כלייתי על ידי תיווך ההובלה הווקטוראלית של Mg2 פלוס דרך ה-DCT, ואכן, עכברים שחסרים בכל אחד מהגנים הציגו פנוטיפ זהה של Mg2 פלוס כליות (איור 1 ו-ref. 39). ההבדל האיכותי שללחץ דםפנוטיפ בין Cnnm2-וTrpm6עכברים עם מחסור מצביע על כך שתחבורה של Mg2 פלוס ב-DCT, התפקוד המשותף של שתי המולקולות, אינה מעורבת ישירות בווריאציה הצירקדית שללחץ דםוהפרשת רנין, מה שמרמז על התפקיד העצמאי של CNNM2-TRPM6עומד בבסיס הפנוטיפים המסקרנים הללו.

מספר מנגנונים פועלים כדי לעורר הפרשת רנין מתאי JG לשמירהלחץ דם. ביניהם, הקלט מהנוירונים הסימפתטיים הכליות נחשב למלא את התפקיד העיקרי בהגדלהלחץ דםבמהלך התקופה הפעילה של וריאציה צירקדית32. נוירונים אלה מפרישים נוראדרנלין, אשר נקשר ומפעיל -AR על תאי JG כדי לעורר ייצור cAMP, מה שמוביל בסופו של דבר להפרשת רנין1732. בניסויים שלנו באמצעות פרוסות כליה שהתקבלו מTrpm6עכברים חסרים, גירוי עם isoproterenol, אגוניסט -AR, לא הראו השפעה על הפרשת רנין, בעוד שגירוי עם PGE2 או db-cAMP הגביר ביעילות את הפרשת הרנין (איור 4). PGE2 מופרש על ידי macula densa בתגובה לרמות נמוכות של Cl- בשתן והוא מפעיל קולטני EP2 ו-EP4 על תאי JG, אשר, כמו הפעלת -AR, ממריץ בסופו של דבר ייצור cAMP40. לכן, תוצאות אלו מרמזות על כך שאיתות -AR מבוטלת באופן סלקטיבי בתאי JG שלTrpm6עכברים חסרים, מבלי להשפיע על מסלול האיתות המתווך באמצעות cAMP במורד הזרם. באופן עקבי, אימונופלואורסצנטיות של קטעי כליות עכברים ואימונובלוטינג של תאי JG מבודדים גילו שביטוי -AR ירד באופן משמעותי בתאי JG שלTrpm6עכברים חסרים (איור 5). ביטוי מופחת כזה של AR אמור לגרום לתאי JG לא להפריש רנין בתגובה לגירוי עצבי סימפטי במהלך התקופה הפעילה, ובכך לבטל את השונות הצירקדית של רמת הרנין בדם.לחץ דם. יש לציין שיש מחקר שמשתמש בעכברי נוקאאוט 1/ 2-AR, שהראה ירידה ביממה.לחץ דםוריאציה כמוTrpm6-עכברים חסרים41. הם ייחסו זאת לירידה בפעילות התנועתית, אך עדיין ייתכן ששונות יממה מופחתת של פעילות רנין תורמת לירידה בווריאציה צירקדית שללחץ דםe. לחלופין, הרקע החריג של העכברים שלהם (רקע מעורב של C57BL6/J, 129 ו-VFB; השתמשנו ברקע C57BL6/טהור) עשוי להסוות את ההשפעה של -AR עללחץ דםוָרִיאַצִיָה; רקע גנטי הוא קריטי עבור יממהלחץ דםוריאציה42.

פיתוח גוף cistanche

איך האובדן שלTRPM6 (פוטנציאל לקולטן חולף הקשור למלסטטין 6)בתאי DCT מוביל לירידה בביטוי -AR בתאי JG נשאר חמקמק. ניסויים בשימוש בסוגים אחרים של תאים הראו שביטוי -AR מווסת על ידי מולקולות שונות הידועות כמתווך איתות בין-תאי: תוספת של גלוקוקורטיקואידים למצע התרבות של קו תאים שמקורו ב-DDT1 MF-2 מגבירה את -AR expression43. כמו כן, דווח כי תחמוצת החנקן (NO) דיכאה את פירוק -AR בתאי הלב באמצעות S-nitrosylation של GRK24. בין המולקולות הללו, ראוי לציין ש-NO מופרש מתאי macula densa בכליות, וממריץ תאי JG באופן פרקריני להגברת הפרשת רנין45. בעוד הביטוי של nNOS, האנזים המייצר NO בכליה, מוגבל לתאי macula densa, הם נמצאים במגע ישיר עם תאי DCT, המקטע הבא של tubulel הכליה6. לפיכך, ייתכן שTrpm6-מחסור בתאי DCT מוביל לירידה בביטוי -AR בתאי JG על ידי השפעה על ייצור או שחרור NO מתאי המקולה הדנסה הסמוכים.

ידוע שתאי JG מתקשרים גם עם תאים אחרים על ידי יצירת חיבורי פערים עם תאים מסביב, כגון תאים מסנגיאליים, ומקבלים Ca2 פלוס לדיכוי הפרשת רנין7. למרות שתאי JG ותאי DCT אינם יוצרים קשר ישיר זה עם זה, הם עדיין ממוקמים קרוב (ref.46 ואיור.3) וייתכן שתאים אלה משתמשים בתקשורת צומתית מרווחת דרך תאים מתערבים, כגון תאים מזנגיאליים; על פי הדיווחים, כל שלושת סוגי התאים מבטאים Cx3747,48, איזופורם קונקסין שיוצר אוליגומריזציה ומהווה חיבורי פער. ניתוח נוסף עשוי לזהות את המולקולה ואת המסלול האחראי לאיתות הבין-תאי בין תאי DCT ו-JG, דבר שחשוב לחשוף את המנגנון הכולל של שיבושים ביממה.לחץ דםוריאציה לפיTrpm6-מחסור ב.

בTrpm6עכברים חסרים, השונות הצירקדית של רמות הדם של לא רק רנין אלא גם נוראדרנלין נעלמה. הפעלת מערכת הרנין-אנגיוטנסין מגרה את שחרור הנוראדרנלין לזרם הדם29,30, ולפיכך, נראה סביר שההשפעה שלTrpm6 (פוטנציאל לקולטן חולף הקשור למלסטטין 6)אבלציה על רמות רנין ונוראדרנלין בדם הייתה דומה. מכיוון שנוראדרנלין פועל גם על ה-AR של תאי JG כדי לקדם הפרשת רנין, מניחים ששתי המולקולות מהוות לולאת משוב חיובית, המגרה את הפרשת זו של זו. עם זאת, יש לציין כי התוצאות של ניסויים במתן איזופרוטרנול מראות במפורש את הפגם בהפרשת רנין (איור 4), ולפיכך נראה שזה הגורם העיקרי לאובדן השונות הצירקדית של רנין ונוראדרנלין כאחד.

עד כה פותחו מגוון תרופות יעילות והשתמשו בהן לטיפול בחולי יתר לחץ דם. עם זאת, מספר לא מבוטל של חולים מראים עמידות לטיפולים הקונבנציונליים המשתמשים בשילוב של תרופות נוגדות לחץ דם עיקריות של מנגנונים תפקודיים שונים4. דנרבציה כירורגית של נוירונים סימפטיים כליות באמצעות צנתרים אנדוסקולריים בוצעה על בסיס ניסוי לטיפול ביתר לחץ דם עמיד כזה50. היעילות המעשית שלו בשיפורלחץ דםהשליטה הייתה שנויה במחלוקת51,52, אך מחקרים שפורסמו לאחרונה הראו ירידה משמעותית בלחץ דםבהשוואה לבקרות מדומה53,54. ישנן גם תוצאות מעורבות על ההשפעה של דנרבציה כלייתית על וריאציה circadian שללחץ דם. כמה דיווחים הראו כי היקףלחץ דםהירידה בעצבוב הכלייתי הייתה גדולה יותר במהלך התקופות הפעילות53, אך אחרים דיווחו על שום שינוי בשונות הצירקדית שללחץ דם55,56. בניתוח באמצעות חיות מעבדה, פעולות הדנרבציה הכלייתית שלנו נגד עכברים דיכאו את הווריאציה הצירקדית שללחץ דם(איור 6). ניתוחים דומים בוצעו גם נגד חולדות, אבל אפילו חולדות בקרה מסוג בר לא מציגות כמעט יממה.לחץ דםוריאציה מלכתחילה57,58, מה שמקשה על הערכת השפעת הפעולה. נדרשים מחקרים נוספים כדי להבהיר את ההשפעה של דנרבציה כלייתית על היממהלחץ דםוריאציה, שתעזור לנו גם להבין את המנגנון המפורט יותר שללחץ דםחוסר ויסות על ידיTrpm6-מחסור ב.

מדידות טלמטריות שללחץ דם, דופק ופעילות תנועתית. מדידות טלמטריות שללחץ דםבוצעו כדלקמן4.לחץ דםמתמרים (TAl1PA-C10, Data Sciences International) הוכנסו בניתוח לעורק הצוואר המשותף השמאלי של 2- עד 3-עכברים בני חודש בהרדמה (על ידי מתן תוך צפקי של 0.3 מ"ג/ ק"ג מדטומידין, 4 מ"ג/ק"ג מידאזולם ו-5 מ"ג/ק"ג בוטורפנול). לאחר 3 שבועות של החלמה, סיסטולי ודיאסטולילחץ דםהערכים נרשמו עם 2-דקות דגימה מתוכננת כל 60 דקות באמצעות תוכנת Dataquest ART (Data Sciences International). רישומים הושגו לפחות חמישה ימים רצופים, וממוצעי המדידות שנלקחו באותו זמן בכל יום נקבעו עבור כל עכבר ושימשו לניתוחים סטטיסטיים נוספים, למעט איור משלים. 4. בהתבסס על Nakamori et al.68, renal דנרבציה בוצעה שבועיים לפני ההחדרהלחץ דםמתמרים כדלקמן. הכליות נחשפו על ידי חתך בטני ורקמת חיבור מסביב לכלי הכליה נותחה. לאחר מכן, כלי הכליה הוטבלו ב-95 אחוז אתנול למשך 2 דקות ולאחר מכן, ב-PBS למשך 2 דקות. פעולת הדמה בוצעה תוך שימוש בהליך המקביל ללא טבילת אתנול. Aliskiren קיבל 25 מ"ג/ק"ג ליום על ידי הטבעה תת עורית של משאבה אוסמוטית (1004, ALZET), והרישום החל מהיום שלאחר הכנסת המשאבה. עבור תוספת מגנזיום, עכברים קיבלו תזונה מועשרת במגנזיום המכילה 0.6 אחוז מגנזיום (CLEA Japan) במשך חודש אחד לפני כן.לחץ דםמדידה.

קצב הלב נמדד עם אותה מערכת רדיו-טלמטריה, פרט לכך שההקלטה בוצעה עם 30- דגימה מתוכננת בכל דקה, ומדידה בודדת שימשה לניתוח נוסף.

פעילויות תנועתיות הוערכו באמצעות אותה מערכת רדיו-טלמטריה, על ידי ניטור השינויים בעוצמת האות מהמתמר עקב תנועת החיה. במקרה זה, מתמרים הוכנסו בניתוח לחלל התת עורי בצד ימין. ההקלטות בוצעו באותם מרווחי זמן כמתואר לעיל.

פיתוח גוף cistanche

הפניות

1. גיילס, TDCircadian קצב שללחץ דםוהקשר לאירועים קרדיווסקולריים.J. יתר לחץ דם. 24, S11-S16 (2006).

2. Smolensky, MH, Portaluppi, F.& Hermida, RC inלחץ דםMonitoring in Cardiovascular Medicine and Therapeutics, 3rd EDT.(eds White, WB)Part II, Ch.6, 105-128(Springer,2016).

3. Witteman, JCet al. מחקר פרוספקטיבי של גורמים תזונתיים ויתר לחץ דם בקרב נשים בארה"ב. Circulation 80,1320-1327(1989).

4. Ascherio, A.et al. מחקר פרוספקטיבי של גורמים תזונתיים ויתר לחץ דם בקרב גברים בארה"ב. תפוצה 86,1475-1484(1992).

5. Ascherio, A.et al. מחקר פרוספקטיבי של גורמים תזונתיים,לחץ דם, ויתר לחץ דם בקרב נשים בארה"ב. יתר לחץ דם 27,1065-1072(1996).

הערה:האמור לעיל אינו רשימת הפניות מלאה