הבנייה של חיסון לקטובצילוס קאסי רקומביננטי ל-PEDV והתגובות החיסוניות שלו בעכברים

תַקצִיר

רקע כללי: שלשול מגפת חזירים (PED) היא מחלת מעיים מדבקת הנגרמת על ידי נגיף החזירים מגפת השלשול (PEDV) המאופיינת בהקאות, שלשולים, אנורקסיה והתייבשות, אשר גרמו להפסדים כלכליים אדירים ברחבי העולם. נכון לעכשיו, חסינות חיסון היא עדיין השיטה היעילה ביותר לשלוט בהתפשטות PEDs. במחקר זה, בנינו זן רקומביננטי חדש של L. casei-OMP16-PEDVS המבטא את חלבון PEDVS של PEDV וחלבון OMP16 של זן Brucella abortus. כדי לדעת את האימונוגניות של החיסון הרקומביננטי L. casei-OMP16-PEDVS המועמד, הוא הושווה ל-BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS, ו-BL21-PEDVS חלבון רקומביננטי.

תוצאות: התוצאות הראו שאנחנו יכולים לזהות רמות גבוהות יותר של IgG, נוגדן מנטרל, IL-4, IL-10 ו-INF- בסרום ו-IgA בצואה של L. casei-OMP16- עכברים מחוסנים PEDVS, שהצביעו על כך שחיסון L. casei-OMP16-PEDVS יכול לגרום לרמות גבוהות יותר של חסינות הומורלית, חסינות תאית וחסינות רירית.

סיכום: לכן, L. casei-OMP16-PEDVS הוא חיסון מועמד מבטיח למניעת זיהום PEDV.

מילות מפתח: PEDV, חיסון לקטובצילוס קאסי, חלבון PEDV S, OMP16, תגובות חיסון

יתרונות cistanche לגברים מחזקים את המערכת החיסונית

מבוא

שלשול מגפת חזירים (PED) נגרמת על ידי נגיף מגפת החזירים (PEDV) עם תסמינים הכוללים שלשול, הקאות, אנורקסיה, התייבשות וירידה במשקל בחזירונים [1, 2]. חזירים בכל הגילאים יכולים להידבק בתסמינים שונים ושיעור התמותה בחזרזירים הוא עד 100% [3], מה שהוביל להפסדים כלכליים אדירים בכל רחבי העולם. כדי לשלוט בהתפשטות PEDV, נבנים רוב סוגי החיסונים, כגון חיסון מומת עם אלומיניום הידרוקסיד, חיסון מומת עם אלומיניום הידרוקסיד, חיסון מוחלש ל-PEDV (TGEV), חיסון PEDV ו-PEDV מוחלש [4]. למרות שחיסונים אלה ממלאים תפקיד חשוב בשליטה על PEDs, לכולם יש פגמים. חיסונים מומתים אינם יכולים להפעיל תגובות חיסוניות תאיות, חיסון מוחלש אינו בטוח במיוחד, והם אינם יכולים לגרום לייצור מספק של נוגדני IgA ספציפיים לווירוס של תגובות חיסוניות ברירית. לכן, הכרחי ודחוף לפתח חיסון חדש לשליטה ב-PEDs.

Lactobacillus casei נחשב לרוב כמעין מערכת וקטורית בטוחה לאספקה ​​ממוקדת של אנטיגנים בחיסון דרך הפה, עם השפעות מועילות על בריאותם של בני אדם ובעלי חיים [5]. בינתיים, זה יכול לשמש כמערכת מסירה כדי לווסת את התגובה של תאי T-helper ולעורר הפרשת IgAs ספציפיים לחסינות הרירית [6]. מצד שני, החיסון הרקומביננטי לקטובצילוס קאסי קל יותר למתן, סיכוי נמוך יותר לתגובת רגישות יתר, וחסכוני יותר בהשוואה לחיסונים מסורתיים. בהתבסס על הדיווחים, חיסונים רקומביננטיים לקטובצילוס קאסי שימשו בהצלחה במניעה ובקרה של וירוס הפפילומה האנושי, דלקת ריאות סטרפטוקוקוס ו-Escherichia coli [7-9]. ישנם גם כמה ניסיונות דומים בתכנון חיסוני PED. החוקרים מצאו שזן רקומביננטי של Lactococcus lactis המבטא גן מסוג S1 של נגיף מגפת חזיר של מגפת חזיר יכול לגרום לרמות גבוהות של IL-4 ו-IFN- בעכברים מחוסנים [10]. חיסון נגד PEDV המבוסס על Lactobacillus casei המבטא פפטיד Co1 המכוון לתאים מיקרופלולי, שהתמזג עם אנטיגן COE של PEDV יכול גם לגרום לתגובה חיסונית יעילה [11]. לשיפור היעילות של חיסון PEDV. במחקר זה, אנו בונים חיסון רקומביננטי חדש של Lactobacillus casei של PED, שיכול לעורר תגובות חיסוניות חזקות יותר ברירית, הומוראלית ותאית נגד זיהום PEDV באמצעות מתן אוראלי. PEDV, חבר במשפחת ה-coronaviridae, מורכב מארבעה חלבונים מבניים המכילים את החלבון 150-220 kDa glycosylated spike (S), חלבון 20-30 kDa membrane (M), חלבון 7 kDa מעטפת (E), 58 kDa. חלבון נוקלאוקפסיד (N) [12]. שם, ניתן לחלק את חלבון S לתחומים S1 (1-735 חומצות אמינו) ו-S2 (736-חומצת אמינו אחרונה) [13], וחלבון S1 כולל את אזור קושר הקולטן ואת האפיטופים המנטרלים העיקריים [ 14]. תוסף החיסון פועל כאימונומודולטור ויכול לעורר ולשפר תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים המועברים יחד. חלבון OMP16 של זן Brucella abortus אומת להפעיל תאים דנדריטים in vivo, לעורר תגובה חיסונית th1, והיה חיסון מבטיח אדג'ובנטי [15-17]. לכן, החלבון OMP16 הוכנס לחיסון הרקומביננטי במקרה של Lacto bacillus במחקר שלנו. עד כה דווחו מחקרים מעטים על החיסון הרקומביננטי של Lactobacillus casei של PEDV. לכן, מחקר זה שואף לבנות חיסון פומי חדש מסוג Lactobacillus casei, שיכול לספק חסינות הומורלית טובה יותר, חסינות תאית וחסינות רירית כדי למנוע את התפשטות PED.

עשב סיני cistanche plant-Antitumor

חומרים ושיטות

זני חיידקים, וירוסים, תנאי תרבית, פלסמידים ופריימרים

אבקת Cistanche

זני החיידקים, הפלסמידים והפריימרים המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלה 1. זן ההתייחסות הסטנדרטי של Lactobacillus casei ATCC 393 הורכב במרק דה מאן רוגוסה ושארפ (MRS) ב-37 מעלות [18]. ה-BL21 (DE3) ו-DH5 תורבו במדיום Luria-Bertani (LB) ב-37 מעלות [19]. הזנים הרקומביננטיים של Lactobacil lus casei, BL21 (DE3) ו-DH5 תורבו במדיום המתאים עם אנטיביוטיקה מתאימה, בהתאמה. Brucella abortus גודל במרקם טריפטי סויה (TSB) או אגר סויה טריפטי (TSA) (מעבדות Difco, דטרויט, MI, ארה"ב) בטמפרטורה של 37 מעלות. תאי Vero שנדבקו בזני PEDV תורבו ב-DMEM (Gibco, Langley, VA, ארה"ב) בתוספת של 10 ug/mL טריפסין (Gibco, Langley, VA, ארה"ב) [20]. הפלסמידים pVE5523 ו-pET28a (+) היו וקטורי ביטוי של Lactobacillus casei ו-Escherichia coli, בהתאמה.

טבלה 1 מאפיינים של זני חיידקים, פלסמידים ופריימרים המשמשים במחקר זה

בניית זני Lactobacillus casei ו-BL21 רקומביננטיים

פלסמידים לביטוי רקומביננטי נבנו על סמך הפלסמידים והפריימרים בטבלה 1. בתחילה, הרצף החלקי של הגן PEDV S (493-708 חומצות אמינו), הרצף החלקי של הגן PEDV S' (493-708 חומצות אמינו), והרצף החלקי של הגן Brucella abortus OMP16 (26-168 חומצות אמינו) הוגבר באמצעות זוגות פריימר PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 ו-OMP16-F/R, בהתאמה. לאחר מכן, נעשה שימוש בשיטת הארכת החפיפה במקטעים של OMP16 ו-PEDVS כדי לבנות מקטע חדש של OMP16-PEDVS עם פוליפפטיד מקשר (GGGGSGGGGGGGGGGGGS) תקוע באמצע. לאחר מכן, הפרגמנטים PEDVS הוכנסו לפלסמיד pET28a עם אנזימי הגבלה של EcoRI/XbaI ליצירת פלסמיד רקומביננטי pET28a-PEDVS, והמקטעים החדשים OMP16-PEDVS הוכנסו לפלסמידים pET28a ו-pVE5523 SalI/XbaI ו-EcoV523/XbaI אנזימי הגבלה ליצירת פלסמיד רקומביננטי pET28a-OMP16-PEDVS ו-pVE5523-OMP16-PEDVS, בהתאמה. הפלסמידים הרקומביננטיים (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS ו-pVE5523-OMP16-PEDVS) הומרו ל-BL21 (DE3) או ל-Lactobacillus casei ATCC393 על ידי טרנספורמציה או אלקטרופורציה. המאמר המדווח [21].

ניתוח ביטוי חלבון על ידי ווסטרן כתם

ביטוי החלבון של זני BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS ו-L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS היו זוהה בהתבסס על השיטה המדווחת עם שינוי מסוים [21-23]. הזנים הרקומביננטיים BL21-pET28a-PEDVS ו-BL21-pET28a OMP16-PEDVS תורבו במרק LB ו-IPTG שימש לקציר ל-pET28a-PEDVS ו-pET28a-OMP{{22} } חלבוני PEDVS. הווקטור הריק שימש כבקרה שלילית. לאחר תמוגה של תאים וצנטריפוגה, הסופרנטנט והמשקעים נאספו. לאחר מכן, חלבוני היעד טוהרו באמצעות עמודת הכרומטוגרפיה של ניקל המבוססת על המחקר הקודם [24]. בינתיים, הסופרנטנט התרבותי של זן pVE5523-OMP16-PEDVS של L. casei הרקומביננטי נקצר גם הוא על ידי צנטריפוגה ב-9000×g למשך 10 דקות ב-4 מעלות. לאחר מכן, הדגימות עם חיץ טעינה של סודיום דודציל סולפט (SDS) הורתחו 10 דקות. החלבונים הופרדו על ידי אלקטרו-פורזה של ג'ל (SDS-PAGE) של 12% נתרן דודציל סולפט-פוליקרילאמיד ולאחר מכן הועברו לממברנות PVDF (Millipore, Mississauga, ON, קנדה). רצועות ה-Mem נחסמו עם חלב דל שומן 5% למשך שעתיים ב-37 מעלות ולאחר מכן הודגרו עם אנטי-גוף מונושבטי עכברי של חלבון S למשך הלילה ב-4 מעלות ו-HRP מצומד עז נגד עכבר IgG (ABclonal, ווהאן, סין) למשך שעתיים בשעה 37 מעלות. להקות החלבון הוצגו באמצעות מצע ה-Clarity™ Western ECL Blotting (Bio-Rad, Hercules, CA, ארה"ב).

חיסון ואיסוף דגימות

האימונוגניות של חיסון Lactobacillus casei רקומביננטי הוערכה באמצעות עכברי BALB/c בנות שישה שבועות (SPF) BALB/c [10, 18], אשר נרכשו ממרכז החיות של האוניברסיטה החקלאית של שאנדונג. בסך הכל 50 עכברים חולקו באופן אקראי ל-5 קבוצות עם 10 עכברים בכל קבוצה. העכברים היו מחוסנים עם חיסון לקטובצילוס קאסי רקומביננטי וחלבון מטוהר (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+תוסף מלא של פרוינד), בהתאמה. פרוטוקול החיסון בוצע על סמך טבלה 2 וניתן חיסון דחף לאחר 13 ימים. עבור המחקר הסרולוגי, הסרום נאסף ב-0, 14 ו-28 ימים לאחר החיסון (dpi) באמצעות ניקוב וריד הזנב ואוחסן ב-20 מעלות עד לשימוש. צואה נאספה יום אחד לפני החיסון וכל זמן חיזוק. לצורך זיהוי IgA, צואה דוללה (w/v) עם 0.05 M נתרן EDTA ביחס של 1:4 ממש לאחר האיסוף והודגרה למשך 14 שעות ב-4 מעלות לאחר ערבוב נכון. הסופרנטנט נאסף על ידי צנטריפוגה של 12,000×g ונשמר ב-20 מעלות עד לשימוש. ב-28 dpi; שלושה עכברים מכל קבוצה הוקרבו והמעי עבר עיבוד לזיהוי IgA על פי המחבר שתואר קודם [10, 18, 23].

ניתוח קביעה של רמות נוגדנים

רמות ה-IgG בסרה ו-IgA בצואה נמדדו בשיטות ELISA עם כמה שינויים [18, 23]. השיטות היו כדלקמן: צלחות מיקרוטיטר פוליסטירן צופו במשך הלילה ב-4 מעלות עם 100 μL 10 ug/mL חלבון PEDVS, OMP16-PEDVS חלבון, או 100 μL רקומביננטי L. casei-OMP16-זן PEDVS . לאחר חסימה עם 5% חלב דל שומן, הדגימות שנאספו דוללו באופן סדרתי ב-PBS, הוספו בשלושה עותקים, והודגרו ב-37 מעלות למשך שעה. לאחר מכן, נוגדן IgG או IgA של עיזים מצומדות נגד עכברים (Invi trogen, ארה"ב) נוסף לכל באר (1:5000) והודגרה למשך שעה אחת ב-37 מעלות. לוחות המיקרוטיטר של פוליסטירן נשטפו 5 פעמים במהלך כל שלב. לבסוף, 100 μL של מצע TMB (tetramethylbenzidine ו- H2O2) נוספו לכל באר ו-50 μL של תמיסת עצור נוספו לאחר 10 דקות. ערכי ה-OD ב-630 ננומטר נמדדו באמצעות קורא לוחות רב-מודים (EnVision).

מבחני נטרול וירוסים

טיטר הנוגדנים המנטרלים של PEDV בסרה נבדקו לפי השיטות עם כמה שינויים [25, 26]. בקצרה, הסרום העכברי הושבת בחום (56 מעלות למשך 30 דקות) ולאחר מכן דילול באופן סדרתי פי שניים בצלחות 96 באר (קורנינג, ארה"ב) עם עותקים משולשים של כל דגימה. לאחר מכן, נפח שווה של 200 זני TCID50 / 50 μL PEDV נוספו לצלחות 96 באר והודגרו למשך שעה אחת ב-37 מעלות. התערובת נוספה לצלחות חדשות של 96 באר מצופות ב-Vero cell monolayers והודגרה למשך שעה אחת ב-37 מעלות. לאחר מכן התאים נשטפו והודגרו במדיום התחזוקה ב-37 מעלות ב-5% CO2. לאחר יומיים, ההשפעה הציטופטית (CPE) נצפתה באמצעות מיקרוסקופ הפוך, וריכוז הגודל הנייטרלי הוגדר כריכוז הנמוך ביותר של נוגדנים בסרום.

טבלה 2 הפרוטוקול החיסוני של עכברי BALB/c

זיהוי ציטוקינים

כדי לזהות הפרשת ציטוקינים, התקבלו סופרנטנטים מעכברי המעבדה (0, 14 ו-28 ימים). רמות של IL-4, IL-10 ו-IFN- המופרשים נקבעו באמצעות ערכות ELISA מסחריות (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan) בהתאם להמלצות היצרן, בהתאמה. ציטוקין הוכמת מהעקומות הסטנדרטיות השונות שהוכנו מגיבים סטנדרטיים שסופקו על ידי הערכות בהתאמה וערך צפיפות אופטית (OD) זוהה ב-450 ננומטר מכל צלחת באמצעות קורא לוחות רב-מודים (EnVision) [23, 27].

ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים התקבלו משלושה ניסויים עצמאיים לפחות, והתוצאות הוצגו כממוצע ± סטיית תקן (SD). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מבחני t דו-צדדיים וניתוח חד-כיווני ב-Graph Pad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., ארה"ב). ההבדל המשמעותי הוגדר כ-∗ p < 0.05, והדרגות השונות של הבדל משמעותי סומנו כ-∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ ו-p < 0.001, בהתאמה.

תוצאות

האימות של זני Lactobacillus casei ו-BL21 רקומביננטיים

כדי לאמת את הפלסמידים הרקומביננטיים שנבנו, פלסמידים הביטוי הרקומביננטיים pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS ו-pVE5523-OMP16-PEDVS עוכלו באמצעות אנזימי הגבלה NcoI/XhoI, וה תוצאות עיכול אנזים הוצגו באיור 1. הגדלים של פסי המטרה באלקטרופורטוגרמות היו זהים לתוצאות הצפויות ותוצאות רצף הצביעו על כך שפלסמידים של ביטוי רקומביננטי לא הראו מוטציה. תוצאות אלו הצביעו על בנייה מוצלחת של פלסמידים רקומביננטיים pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS ו-pVE5523-OMP16-PEDVS. תוצאות הכתם המערבי הראו שהחלבונים הרקומביננטיים pET28a-OMP16-PEDVS ו-pET28a-PEDVS באו לידי ביטוי בסופרנטנט של BL21-pET28a OMP16-PEDVS ו-BL21- זני pET28a-PEDVS, בהתאמה. חלבון pVE5523-OMP16-PEDVS אומת גם בסופרנטנט התרבותי של זן L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS. הרצועות הספציפיות מאיור 2 הראו שהחלבונים הרקומביננטיים pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS ו-pET28a-PEDVS כולם נקצרו בהצלחה (איור 2).

איור 1 תוצאות עיכול האנזים של פלסמידים רקומביננטיים. ת: תוצאות עיכול האנזים של הפלסמיד pVE5523-OMP16-PEDVS. M: D8000 DNA Ladder Marker; 1: פלסמיד pVE5523-OMP16-PEDVS. ב: תוצאות עיכול האנזים של פלסמיד pet28a-OMP16-PEDVS ופלסמיד pET28a-PEDVS. M: D8000 DNA Ladder Marker; 1: pet28a-OMP16-פלסמיד PEDVS; 2: פלסמיד pET28a-PEDVS

רמות נוגדני IgG בסרום של עכברים שחוסנו עם חיסונים מועמדים

כדי להעריך את האימונוגניות הספציפית של מועמדים לחיסון שנוצרו, עכברי BALB/c נבחרו וחולקו ל-5 קבוצות. לאחר מכן, רמות ה-IgG בסרום ו-IgA בצואה נמדדו עם ערכות ELISA מסחריות. התוצאות גילו שלא היו הבדלים מהותיים ברמות ה-IgG בין הקבוצות המחוסנות וכמעט לא נמצא נוגדן IgG בכל העכברים לפני החיסון. עם זאת, הבדלים מהותיים נמצאו לאחר מכן לאחר החיסון הראשון ורמות נוגדני IgG בסרום לאחר 28 ימים היו גבוהות מזו ב-14 ימים. בין 5 עכברים בקבוצה, העכברים שחוסנו עם L. casei-OMP16- PEDVS ו-BL21-OMP16-PEDVS-F הראו אימונוגניות דומה והגבוהה ביותר. לכן, L. casei-OMP16- PEDVS ו-BL21-OMP16-PEDVS-F יכולים לייצר את האימונוגניות הגבוהה ביותר, ואחריו BL21-OMP16- PEDVS ו-BL21-PEDVS (איור 3).

תוסף תוסף cistanche-הגברת חסינות

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

רמות נוגדני IgA בצואה של עכברים שחוסנו בחיסונים מועמדים

כדי להעריך את האימונוגניות הספציפית של מועמדים לחיסון שנוצרו, הוערכו גם רמות נוגדני IgA בצואה של עכברים. התוצאות הראו שלא היה קיים נוגדן מיוחד נגד PEDVS IgA לפני החיסון. עם זאת, כמויות גדולות של נוגדן IgA בצואה של L. casei-OMP16-עכברים מחוסנים PEDVS BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} }PEDVS, ו-BL21-עכברים מקבוצת PEDVS 14 ימים לאחר החיסון. ב-28 ימים לאחר החיסון, רמות נוגדני IgA של עכברים מחוסנים של L. casei-OMP16-PEDVS הגיעו למקסימום הגבוה ביותר. בינתיים, רמות נוגדני IgA בשלוש הקבוצות האחרות לא הציגו עלייה ברורה. לכן, החיסון המועמד L. casei OMP16-PEDVS יכול לעורר רמות גבוהות יותר של נוגדנים בעכברים מחוסנים בהשוואה ל-BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ {18}}עכברים מחוסנים PEDVS ו-BL21- PEDVS (איור 4).

איור 2 האימות של חלבוני ביטוי רקומביננטי. M: סמן חלבון; 1: צורת החלבון המופרשת רקומביננטית L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS זן; 2: החלבון המטוהר מזן BL21- pET28a-OMP16-PEDVS; 3: החלבון המטוהר מזן BL21-pET28a-PEDVS

רמות הנוגדנים המנטרלים של הסרום בעכברים מחוסנים

כדי להעריך את ההשפעה המגנה של חיסונים מועמדים של L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS , ו-BL21-PEDVS בעכברים, נמדדו רמות הנוגדנים המנטרלים. התוצאות הראו שלא זוהה נוגדן מנטרל לפני החיסון. נוגדן מנטרל זוהה 14 ימים לאחר החיסון והוא עלה ב-14 ימים לאחר חיסון המאיץ. תגובת הנוגדנים בעכברים שקיבלו L. casei-OMP16-PEDVS הייתה בעלת פעילות נטרול אנטי-PEDV חזקה יותר מזו בעכברים שקיבלו דרך הפה BL21-OMP16-PEDVS-F, BL 21-OMP16-PEDVS, ו-BL21-PEDVS. לכן, החיסון המועמד L. casei OMP16-PEDVS יכול לעורר את רמת הנוגדנים המנטרלים הגבוהה ביותר, ואחריו BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS, ו-BL21-PEDVS (איור 5).

רמות ציטוקינים

כדי להשוות את רמת התגובה החיסונית התאית של L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, ו-BL21-PEDVS מחוסנים עכברים, IL- 4, IL-10 ו-IFN- נקבעו, בהתאמה. התוצאות הראו שרמות הציטוקינים IL-4, IL-10 ו-IFN- בסרום של עכברים היו כולן נמוכות מאוד ולא היה הבדל משמעותי לפני החיסון. ואילו שינויים דומים נצפו בתוצאות של IL-4, IL-10 ו-IFN- . 14 ימים לאחר החיסון, רמת ה-IL-4, IL-10 ו-IFN- בעכברים המחוסנים של L. casei-OMP16-PEDVS im היו גבוהים מ-BL21- עכברים מחוסנים של OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS ו-BL21-PEDVS. 14 ימים לאחר החיסון המאיץ, זוהתה רמת IL-4, IL-10 ו-IFN- גבוהה יותר בעכברים מחוסנים מסוג L. casei-OMP16- PEDVS בהשוואה לזו של בעכברים אחרים. שלוש קבוצות. לכן, החיסון המועמד L. casei-OMP16-PEDVS יכול לעורר את רמות ה-IL-4, IL-10 ו-IFN- הגבוהות ביותר, ואחריהן BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS ו-BL21-PEDVS (איור 6).

איור 3 רמות נוגדני IgG של חיסונים מועמדים בסרום של עכברים מחוסנים. הסרום נאסף בימים 0, 14 ו-28 ימים לפני או אחרי החיסון שנבדק באמצעות ערכות ELISA מסחריות, ונמדד בספיגה של 450 ננומטר. פסים מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן של שלושה ניסויים עצמאיים. * p < 0.05, ** p < 0.01, ו-**** p < 0.0001 מייצגים דרגות הולכות וגדלות של הבדלים משמעותיים, בהתאמה, ו-ns אומר שאין הבדל משמעותי

דִיוּן

התפרצות בקנה מידה גדול של PED שנגרם על ידי גרסאות PEDV התרחשה באוקטובר 2010, שהביאה להפסדים כלכליים אדירים בסין ובכל רחבי העולם [1]. עם זאת, החיסונים המסורתיים מתוכננים כולם על בסיס הזן הקלאסי CV777 שאינו יכול לספק הגנה מספקת לגרסה PEDV [4]. כדי לשלוט בהתפשטות PEDV ולהפחית הפסדים כלכליים, מתוכננים גם חיסונים חדשים של זני PEDV. נכון לעכשיו, החיסון המומת ל-PEDV והחיסון המוחלש של זני וריאנטי PEDV מאושרים כולם על ידי ממשלת סין וכולם מציגים סיכויים מבטיחים בשליטה ב-PED. אבל פגמים קיימים גם בשני סוגי החיסונים החדשים. PEDV מדביק חזירים דרך מערכת העיכול ויש לו טרופיזם של רקמת המעי. לכן, חסינות רירית יעילה יותר מחסינות מערכתית במניעת כניסת PEDV לתאי אפיתל מעיים, וחיסונים חייבים לספק הגנה יעילה על הרירית במערכת המעי. לכן, במחקר זה, אנו בונים סוג חדש של חיסון שיכול לעורר נוגדני IgG ו-IgA חזקים יותר נגד PEDV. ל-Lactobacillus casei תכונות פוטנציאליות למודנון חיסוני ככלי העברת חיסון והביטוי של תרכובות ביו-אקטיביות על דופן התא של חיידק זה יכול לעורר תגובות חיסוניות מתאימות [28, 29]. הוא נמצא בשימוש נרחב לביטוי מספר אנטיגנים הטרוליים של וירוס הפפילומה האנושי, דלקת ריאות סטרפטוקוקוס ו-Escherichia coli כחיסונים במודלים של בעלי חיים, שכולם הראו אימונוגניות מעולה [7-9]. בהשוואה לחיסון המומת וחיסון מוחלש, החיסון הווקטור של Lactobacillus casei יכול גם לעורר רמות IgA גבוהות יותר ותגובה חיסונית תאית. מחקרים הראו שקו ההגנה הראשון של IgA במעי יהיה טוב יותר מ-IgG בהגנה על חזרזירים מפני זיהום PEDV [10, 30]. לכן, מבטיח לפתח מעין חיסון וקטור לקטובצילוס קאסי של PED. בהתבסס על הדיווחים, ניתן לחלק את חלבון S של PEDV לתחומים S1 (1-735 חומצות אמינו) ו-S2 (736-חומצת אמינו אחרונה) [13], וחלבון S1 כולל את אזור מקשר הקולטן ואת אפיטופים מנטרלים עיקריים [14]. ה-core neutralizing epitope (COE) יכול לגרום לנוגדנים מנטרלים חזקים נגד PEDV [31, 32]. בשילוב עם ניתוח האנטיגניות, נבחר רצף חלקי של הגן S1 (1477-2124 bp) לבניית הפלסמיד הרקומביננטי. הוכח שהחלק הקטן שנבחר לא רק בעל גניבות חיסונית טובה אלא גם תורם לביטוי המופרש של Lactobacillus casei. מצד שני, Pasquevich מצא שחלבון הממברנה החיצונית Brucella abortus 16 יכול להפעיל תאים דנדריטיים in vivo, גורם לתגובה חיסונית th1, והיה חיסון עצמי מבטיח נגד ברוצלוזיס נרכשת מערכתית ואורמית [15]. מחקר דומה שחלבון ממברנה חיצונית לא שומנית omp16 מ- Brucella spp. כמו כן הוכח כי תוסף לאף יכול לעורר תגובה חיסונית th1 ולווסת את התגובה האלרגית th2 לחלבוני חלב פרה [16]. לכן, רצף חלקי של הגן omp16 נבחר לבניית פלסמיד רקומביננטי כדי לשפר את תפקוד החיסון במחקר שלנו. כדי לדעת אם החיסון החדש של Lactobacillus casei המומלץ יכול לגרום לתגובות חיסוניות הומורליות, נמדדו רמות IgG, IgA ונטרול נוגדנים. לרמת נוגדני IgG של עכברים מחוסנים בחיסון רקומביננטי מסוג L. casei-OMP16- לא היה הבדל משמעותי עם עכברים מחוסנים עם חיסון רקומביננטי מסוג BL21-OMP16-PEDVS-F. עם זאת, רמות ה-IgA והנוגדנים המנטרלים היו גבוהות מזו של ב-BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S ו-BL{{47 }}עכברים מותאמים לחיסונים רקומביננטיים של PEDVS. התוצאות הראו ש-L. casei-OMP16-PEDVS יכול לגרום לתגובות חיסון הומורליות חזקות יותר, במיוחד רמות נוגדני IgA. מחקרים הראו כי IgA הוא קו ההגנה הראשון במעי והוא יהיה טוב יותר מ-IgG בהגנה על חזרזירים מפני זיהום PEDV [30]. המחקר גם אימת את התוצאה שחיסון רקומביננטי L. casei-OMP16-PEDVS יכול לספק הגנה אימונולוגית טובה יותר ל-PEDV. כדי לחקור את סוג התגובה החיסונית המושרה על ידי L. casei-OMP16-PEDVS רקומביננטי, זוהו הרמות של IL-4, IL-10 ו-IFN- כדי להעריך את הפעילות של T לימפוציטים. בהתבסס על הדו"ח, IFN- ממלא תפקיד חשוב בתגובה החיסונית התאית הנגרמת כאשר פתוגנים פולשים לגוף, IL-4 ממלא תפקיד חשוב בתגובה החיסונית ההומורלית וקידום סובלנות חיסונית וחסינות רירית [33], IL -10 ממלא תפקידים חיוניים במלחמה נגד זיהום מיקרוביאלי ברירית ושמירה על שלמות מחסום הרירית בתוך המעי [34]. בינתיים, תוצאות של זיהוי ציטוקינים הראו שהעכברים שחוסנו עם החיסון הרקומביננטי L. casei-OMP16-PEDVS יכולים לגרום לביטוי חזק יותר של IL-4, IL-10 ו-IFN-, אשר תמכו בתוצאות שחיסון רקומביננטי L. casei-OMP16-PEDVS יכול לגרום לתגובה חיסונית הומורלית חזקה יותר, רמת נוגדני IgA ותגובה חיסונית תאית, בהתאמה.

איור 5 רמות הנוגדנים המנטרלים של חיסונים מועמדים בסרום של עכברים מחוסנים. הסרום נאסף בימים 0, 14 ו-28 ימים לפני או אחרי החיסון ונבדק באמצעות בדיקת נטרול. פסים מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן של שלושה ניסויים עצמאיים. * p < 0.05, ** p < 0.01, ו-**** p < 0.0001 מייצגים דרגות הולכות וגדלות של הבדלים משמעותיים, בהתאמה, ו-ns פירושו ללא מובהק הֶבדֵל

איור 6 זיהוי רמות ציטוקינים מסרום של עכברים מחוסנים. הסרום נאסף בימים 0, 14 ו-28 ימים לפני או אחרי החיסון ונבדק באמצעות ערכות ELISA מסחריות. ערך הספיגה נמדד בספיגה של 450 ננומטר עבור IL-4 (a), IL-10 (b) ו-IFN- (c), בהתאמה. פסים מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן של שלושה ניסויים עצמאיים. * p < {{10}}.05, ** p < 0.01, ו-****p < 0.0001 מייצגים דרגות הולכות וגדלות של הבדלים משמעותיים, בהתאמה

סיכום

לסיכום, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS ו-BL{{7 }}במחקר זה נבנו חיסונים מועמדים ל-PEDVS. בינתיים, הוערכו התגובה החיסונית ההומורלית ורמות התגובה החיסונית התאית של חיסונים מועמדים אלה בעכברים. התוצאות הראו שהעכברים שחוסנו עם L. casei-OMP16-PEDVS יכולים לייצר רמות גבוהות יותר של IgG, IgA, נוגדנים מנטרלים, IL-4, IL- 10 ו-INF- בהשוואה ל העכברים שחוסנו עם BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS ו-BL21-PEDVS. לכן, החיסון הרקומביננטי ל-L. casei OMP16-PEDVS עשוי לבסס את הקרקע לפיתוח של חיסון רירית רקומביננטי בטוח, יעיל ונוח למניעה של זיהום PEDV.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

הפניות

1. Wang D, Fang L, S X. שלשולים ממגיפת חזירים בסין. Res. 2016; 226:7–13.

2. Sueyoshi M, Tsuda T, Yamazaki K, Yoshida K, Nakazawa M, Sato K, et al. חקירה אימונוהיסטוכימית של שלשולים ממגיפת חזירים. J Comp Pathol. 1995;113(1):59–67.

3. Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, Liang PS, Song CXJEID. התפרצות של שלשול ממגיפת חזירים אצל חזרזירים יונקים, סין. Emerg Infect Dis. 2012; יח(1):161–3.

4. Tong YE, Feng L, Li W. פיתוח של חיסון מוחלש דו-משולב נגד וירוס גסטרואנטריטיס נגיף ונגיף מגפת חזירים. Chin J Prev Vet Med. 1999;21(6):35–9.

5. Pouwels PH, Leer RJ, Boersma WJ. הפוטנציאל של לקטובצילוס כנשא לחיסון דרך הפה: פיתוח ואפיון ראשוני של מערכות וקטוריות לאספקה ​​ממוקדת של אנטיגנים. J Biotechnol. 1996;44(1–3):183.

6. Tsai YT, Cheng PC, Pan TM. ביוטכנולוגיה: ההשפעות האימונומודולטוריות של חיידקי חומצת חלב לשיפור התפקודים והיתרונות של מערכת החיסון. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;96(4):853–62.

7. Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, Fujii T, Tomio A, Miura S, et al. חיסון דרך הפה עם חיסון לקטובצילוס קאסי המבטא וירוס פפילומה אנושי (HPV) מסוג 16 E7 הוא אסטרטגיה יעילה להשראת לימפוציטים ציטוטוקסיים ברירית נגד HPV16 E7. תַרכִּיב. 2010;28(16):2810–7.

8. Campos IB, Darrieux M, Ferreira DM, Miyaji EN, Silva DA, Arêas APM, et al. חיסון האף של עכברים עם Lactobacillus casei המבטא את חלבון פני השטח Pneumococcal A: אינדוקציה של נוגדנים, שקיעת משלים והגנה חלקית מפני אתגר Streptococcus pneumoniae. חיידקים נדבקים. 2008;10(5):481–8.

9. Wen LJ, Hou XL, Wang GH, Yu LY, Wei XM, Liu JK, et al. חיסון עם זני Lactobacillus casei רקומביננטיים המייצרים K99 וחלבון fimbrial K88 מגן על עכברים מפני Escherichia coli אנטרוטוקסגני. תַרכִּיב. 2012;30(22): 3339–49.

10. Guo M, Yi S, Guo Y, Zhang S, Niu J, Wang K, et al. בניית זן lactococcus lactis רקומביננטי המבטא גן S1 של נגיף מגפת חזירים מגיפת חזיר וניתוח האימונוגניות שלו בעכברים. אימונול ויראלי. 2019;32(3):144–50.

11. Wang X, Wang L, Zheng D. חיסון דרך הפה עם חיסון נגד וירוס מגפת חזירים מבוסס Lactobacillus casei (PEDV) המבטא את הפפטיד Co1 המכוון לתאים מיקרופלוליים שהתמזגו עם האנטיגן COE של PEDV. J Appl Microbiol. 2017;124(2):368–78.

12. Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, H L. ניתוח רצף של הגנום של נגיף נגיף מגיפת החזיר בין הגנים של חלבון נוקלאוקפסיד וספייק מגלה ORF פולימורפי. וירולוגיה. 1994;198(2):466.

13. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. הטרוגניות בגנים של חלבון ספייק של נגיפי שלשול מגפת חזירים המבודדים בקוריאה. Res. 2010;149(2): 175–82.

14. Sun DB, Feng L, Shi HY, Chen JF, Liu SW, Chen HY, et al. אזור חלבון הספייק (aa 636789) של נגיף השלשולים של מגפת חזירים חיוני להשראת נוגדנים מנטרלים. אקטה וירול. 2007;51(3):149–56.

15. Pasquevich KA, Garcia Samartino C, Coria LM, Estein SM, Zwerdling A, Ibanez AE, et al. חלק החלבון של חלבון הממברנה החיצונית Brucella abortus 16 הוא דפוס מולקולרי חדש הקשור לפתוגן חיידקי המפעיל תאים דנדריטים in vivo, גורם לתגובה חיסונית Th1, והוא חיסון מבטיח משפר את עצמו נגד ברוצלוזיס נרכשת מערכתית ובעל פה. J Immunol. 2010;184(9):5200.

16. Ibanez AE, Smaldini P, Coria LM, Delpino MV, Pacífico LGG, Oliveira SC, et al. חלבון קרום חיצוני לא מנוזל Omp16 (U-Omp16) מ- Brucella spp. שכן תוסף לאף גורם לתגובה חיסונית Th1 ומווסת את התגובה האלרגית Th2 לחלבוני חלב פרה. PLoS ONE. 2013;8(7):e69438.

17. Pasquevich KA, Estein SM, Samartino CG, Zwerdling A, Coria LM, Barrionuevo P, et al. חסינות: חיסון עם חלבון קרום חיצוני מסוג Brucella רקומביננטי Omp16 או Omp19 באדג'ובנט גורם לתאי T ספציפיים של CD4+ ו-CD8+ וכן הגנה מערכתית ופאלית מפני זיהום Brucella abortus. להדביק את אימוון. 2009;77(1):436–45.

18. Ma S, Wang L, Huang X, Wang X, Chen S, Shi W, et al. חיסון לקטובצילוס רקומביננטי אוראלי המכוון לתאי המיקרו-קפלים של המעיים ולתאים הדנדריטים לאספקת אפיטופ הליבה המנטרל של וירוס מגפת חזירים. מפעלי תאי מיקרוב. 2018;17(1):20.

19. Chu S, Zhang D, Wang D, Zhi Y, Zhou P. ביטוי הטרולוגי ואפיון ביוכימי של ניטראט ו-nitrite reductase מתבוללים חושף הסתגלות ופוטנציאל של Bacillus megaterium NCT-2 באדמת המלחה משנית. Int J Biol Macromol. 2017;101:1019.

20. Guo N, Zhang B, Hu H, Ye S, Chen F, Li Z, et al. Caerin1.1 מדכא את הצמיחה של נגיף שלשול מגפת חזירים במבחנה באמצעות קישור ישיר לנגיף. וירוסים. 2018;10:9.

21. Chen Z, Lin J, Ma C, Zhao S, She Q, Liang Y. ביוטכנולוגיה: אפיון של pMC11, פלסמיד עם מקורות שכפול כפולים מבודד מ-Lactobacillus casei MCJ ובניית וקטורים מעבורת עם כל רפליקון. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(13):5977.

22. Xiaona W, Li W, Xuewei H, Sunting M, Meiling Y, Wen S, et al. מתן דרך הפה של פרוביוטיקה המבטאת פפטיד המכוון לתאים דנדריטים, התמזג עם COE Antigen Virus Epidemic Diarrhea: אסטרטגיית חיסון מבטיחה נגד PEDV. וירוסים. 2017;9(11):312.

23. Bhuyan AA, Memon AM, Bhuiyan AA, Zhonghua L, Zhang B, Ye S, et al. בניית Lactobacillus casei רקומביננטי המבטא חלבון BVDV E2 והתגובה החיסונית שלו בעכברים. J Biotechnol. 2018;270:51–60.

24. Noi NV, Chung YCJB, Equipment B. אופטימיזציה של ביטוי וטיהור של תחום S1 רקומביננטי של חלבון ה-PEDV-S1 (PEDV-S1) ב-Escherichia coli. Biotechnol Biotechnol Equip. 2017;31(2):1–11.

25. Li C, Li W, Esesarte E, Guo H, Elzen P, Aarts E, et al. תחומי התקשרות תאים של חלבון ספייק נגיף מגיפת החזירים הם יעדי מפתח לנטרול נוגדנים. J Virol. 2017;91(12):1–16.

26. Wen Z, Xu Z, Zhou Q, Li W, Wu Y, Du Y, et al. מתן דרך הפה של מיקרוספרות מצופות ב-PEDV עורר חסינות ספציפית ל-PEDV בחזרזירים שנגמלו. תַרכִּיב. 2019;09(014):161–6.

27. Gao Q, Zhao S, Qin T, Yin Y, Yang Q. השפעות של וירוס מגיפת חזירים על תאים דנדריטים שמקורם במונוציטים חזיריים ותאי דנדריטי מעיים. וטרינר מיקרוביול. 2016;106:149–58.

28. Bonet MEB, Chaves AS, Mesón O. פעילות אימונומודולטורית ואנטי דלקתית הנגרמת על ידי מתן אוראלי של זן פרוביוטי של lactobacillus casei. דַלֶקֶת. 2006;4(1):31–41.

29. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy MC, Goudercourt D, Turner M, Mercenier A. הגנה מפני רעלן טטנוס לאחר מתן תוך קיבה של שני חיידקי חומצת חלב רקומביננטיים: השפעת קיימות הזנים והתמדה in vivo. תַרכִּיב. 2002;20(27–28):3304–9.

30. שיר DS, Oh JS, Kang BK, Yang JS, Moon HJ, Yoo HS, ועוד. יעילות אוראלית של זן וירוס DR13 של מגפת חזיר מוחלשת בתאי Vero. Res Vet Sci. 2007;82(1):134–40.

31. Makadiya N, Brownlie R, Jan V, Berube N, Allan B, Gerdts V, et al. תחום S1 של מגיפת החזירים של נגיף ספייק חלבון כאנטיגן חיסון. Virol J. 2016;13:1.

32. Chang SH, Bae JL, Kang TJ, Ju K, Chung GH, Lim CW, et al. תאים: זיהוי אזור האפיטופ המסוגל לגרום לנוגדנים מנטרלים נגד נגיף השלשולים של מגפת חזירים. מול תא. 2002;14(2): 295–9.

33. Sumi T, Fukushima A, Fukuda K, Kumagai N, Nishida T, Yagita H, et al. תרומות דיפרנציאליות של B7-1 ו-B7-2 להתפתחות של דלקת לחמית אלרגית ניסיוני של עכברים. אימונול לט. 2007;108(1):62–7.

34. Xue M, Zhao J, Ying L, Fu F, Li L, Ma Y, et al. IL-22 מדכא את הזיהום של נגיף הקורונה החזירי וה-rotavirus על ידי הפעלת מסלול האות STAT3. Antivir Res. 2017;142:68–75.