עיכוב מקומי מתמשך של תרומבין משמר את המיקרו-ארכיטקטורה והתפקוד של הכליות לאחר הופעת פגיעה חריפה בכליות

איש קשר: אודרי הוaudrey.hu@wecistanche.com

איאן ורגאס וחב'

תַקצִיר

פגיעה חריפה בכליותניהול (AKI) נותר תומך בעיקר מכיוון שאף גורם טיפולי ספציפי המכוון לנתיבי איתות יחידים לא הצליח בניסויים קליניים. כאן, אנו מדווחים שעיכוב של קרישה מונעת על ידי תרומבין ואיתות דלקתי עם שימוש בננו-חלקיקי פרפלואורי-פחמן ממוקדי תרומבין הפועלים באופן מקומי (PFC NP) מגן על כלי הדם הכלייתיים ומווסת באופן נרחב תהליכים דלקתיים מגוונים הגורמים לפציעה של איסכמיה-פרפוזיה כלייתית. כל PFC NP היה מורכב עם ~13,650 עותקים של מעכב טרומבין ישיר, PPACK (פרולין-פנילאלנין-ארגינין-כלורומתיל-קטון). עכברים שטופלו לאחר הופעת AKI עם PPACK PFC NP הפגינו חדירות של VCAM-1, ICAM-1, PGD2 prostanoid, M-CSF, IL-6 ותאי פיטום מטה. ארכיטקטורה מיקרו-וסקולרית, ממברנות מרתף צינוריות ורכיבי גבול מברשת נשמרו טוב יותר. אי-פרפוזיה חוזרת הופחת כפי שצוין על ידי מופחתת לכידת כדוריות דם אדומות וברזל לא-heme.כִּליָההתפקוד והנמק הצינורי השתפרו לאחר 24 שעות לעומת קבוצת הביקורת הלא מטופלת, מה שמצביע על יתרון לעיכוב כפול של פקקת ודלקת על ידי PPACK PFC NP.

מילות מפתח: פגיעה חריפה בכליות; פַּקֶקֶת; דַלֶקֶת; ננו-חלקיקים פרפלואוריים; נזק לכלי

Cistanche tubulosa מונע מחלת כליות, לחץ כאן כדי לקבל את הדגימה

פגיעה חריפה בכליות(AKI) היא בעיה קלינית שכיחה בקרב צעירים ומבוגרים כאחד, עם שכיחות גוברת ושיעור תמותה גבוה באופן בלתי מתקבל על הדעת שלא השתפר באופן משמעותי במשך עשרות שנים.1,2 התסמונת מתפתחת בדרך כלל בעקבות ירידה חולפת פתאומית בזרימת הדם הכוללת או האזורית הכִּליָהכתוצאה ממספר עלבונות כולל תת לחץ דם, אלח דם, רעלים וכו'.3 AKI מעורר מגוון מורכב של שחקנים מולקולריים פתופיזיולוגיים ואירועי איתות בתהליך מחלה המתפתח עם הזמן בשלבים. טיפולים עבור AKI עדיין לא קיימים, למרות הצורך הרפואי הדוחק.7 אכן, לאחר שנים של מאמצי מחקר פרה-קליניים וקליניים, הטיפולים הנוכחיים נותרים תומכים בעיקרם.

כאן אנו מניחים שהתערבויות טיפוליות מבוססות ננו-חלקיקים המכוונות לטרומבין שיכולות לשמור על שלמות מיקרו-וסקולרית ותפקוד מחסום ובו-זמנית להפחית איתות דלקתי יועילו לתוצאות AKI. תרומבין הוא מולקולה עיקרית אתרוגנית ומרפאת פצעים המניעה מולקולות דלקתיות רבות אחרות המשתתפות בהפעלת האנדותל לאחר פציעה כגון NF-κB,8 NADPH אוקסידאז,⁹

ואחרים באמצעות קולטנים מופעלי פרוטאז (PAR-1) הן באנדותל והן במקרופאגים.10,11 כל סוגי התאים ב-כִּליָהחוו שינויים בדפוס ביטוי גנים, הכוללים ביטוי מוגבר של סמני פציעה וגנים התפתחותיים כפי שהוצגו על ידי Rudman-Melnick וחב' במחקר רצף של תא בודד על איסכמיה חד-צדדית-רפרפוזיה.כִּליָהפגיעה.12 יתרה מכך, מחקר מכרסמים של ריצוף RNA יחיד בגרעין בפגיעה כלייתית איסכמיה-רפרפוזיה דו-צדדית13 זיהה אוכלוסיית תאי אבבובית פרוקסימלית ספציפית המבטאת יתר על המידה גנים של פרו-דלקת ופרופיברוטית לאחר פציעה חמה של איסכמיה-רפרפוזיה. תוצאות אלו מצביעות על כך שדלקת צריכה לייצג מטרה טיפולית שימושית. למרות שהיווצרות קרישים תוך-וסקולריים מוצקים נראית לא שכיחה ב-AKI, העלינו עוד השערה שהפחתת פעילות מעודדת קרישה מיקרו-וסקולרית באמצעות אנטגוניסטים חזקים של ננו-חלקיקים אנטי-תרומבין 14-17 עשויה לשפר את זרימת הדם, להפחית את "אין-זרימה חוזרת" ולהחליש את האיתות הדלקתי לשימור תפקוד כליות.

נושאים קריטיים המתנגדים להחלת מעכבי טרומבין ישירים למניעת פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה של הכליה (IRI) כוללים את תופעות הלוואי הרעילות הפוטנציאליות שלהם ואת הסיכון לדימום מערכתי. לגבי פקקת, תרופות נוגדות קרישה קונבנציונליות לא היו מוצלחות במיוחד, אם כי טרומבומודולין מסיס עשוי להפעיל פעולות הגנה מחדש, 18,19 כפי שעשוי להפעיל חלבון C,20,21 ואנטיתרומבין III,22 אם כי עם סיבוכים פוטנציאליים של דימום מוגזם.21 יתר על כן, הן וורפרין והן dabigatran נקשרו לרעילות כלייתית.^23,24עם זאת, העובדה שגישות נוגדות קרישה אלו עדיין לא הצליחו מבחינה קלינית אינה מפחיתה מערכו הפוטנציאלי של תרומבין כמטרה, בשל תפקידיו הכפולים הן בקרישה והן בדלקת. למרות שאין מחקר קליני בנוגע לטיפול ב-VEGF עבור AKI, מחקר פרה-קליני הראה כי VEGF הוא מתווך חשוב בהגנת רינו במהלך AKI,25 אשר תומך עוד יותר במנגנון הטיפולי ההיפותטי המוצע שלנו לשימור כלי הכליה בהגנה על תפקוד הכליות במהלך AKI.

פיתחנו פלטפורמה יציבה, תואמת ביולוגית ולא נפרוטוקסית של ננו-חלקיקי perfluorocarbon (PFC NP) המעכבת את פעילות הפרוטאזות של תרומבין מבלי לגרום לדיאתזה מדממת. ליבה וקליפה חיצונית של חומרי שטח פוספוליפידים וקוטר נע בין ~160-250 ננומטר. במחקרי AKI ראשוניים אחרונים, ניתנו אנטי-תרומבין PFC NP כטיפול מקדים כדי לאשר שטרומבין הוא יעד חשוב להאצת התאוששות של תפקוד הכליות, בין השאר על ידי שימור שלמות מיקרו-וסקולרית והפחתת אי-פרפוזיה חוזרת ב-IRI כאשר הוא מנוהל לפני איסכמיה-פרפוזיה. פציעה.16 אנטי-תרומבין PFC NPS גם מגן על שתל הכליה מ-IRI ומציג ירידה ניכרת באחוז הנמק הצינורי הפרנכימלי הקשור לאריכות חיים של הכליה לאחר ההשתלה.27 עם זאת, לא ברור אם ננו-חלקיק זה נוגד פקקת עדיין יעיל. לאחר תחילת ה-AKI, המייצג קבוצה שונה לחלוטין של אוכלוסיות חולים.

בהתאם לכך, בעבודה הנוכחית, ביקשנו להרחיב את השימוש בגישה זו ל-AKI שהוקם לאחר IRI כדי להבהיר את הפוטנציאל שלו לתרגום קליני. להוכחת הרעיון, אנו משתמשים ב-PPACK (Phe[D]-Pro-Arg-chloromethyl ketone) כחלק האנטי-תרומבין לצימוד ל-PFC NP, שהראינו מונע איתות טרומבין ופקקת מיקרו-וסקולרית במודלים של טרשת עורקים ופגיעה בכליות חריפה ( AKI).14–17 PPACK עצמו הוא מעכב תרומבין ישיר ובלתי הפיך ידוע, שצורתו החופשית מתנקה מהר מדי על ידי הכליה מכדי שיהיה לו ערך כחומר טיפולי.14,15 כאן אנו מבהירים את התגובות הפתופיזיולוגיות המוקדמות ל טיפול PPACK PFC NP המגביל אירועי איתות דלקתיים הן בכליות והן מבחינה מערכתית, משמר את המיקרו-ארכיטקטורה הכלייתית ומחליש את הנזק לכלי הדם. נתונים אלה מרמזים שגישה טיפולית זו המבוססת על ננו-חלקיקים ל-AKI מתמשכת יכולה להוות את הבמה לפיתוח קליני של חומר אנטי-טרומבין המפעיל השפעות פליאוטרופיות מוגבלות מקומית וניתן למתן בבטחה בשלבים המוקדמים של AKI.

שיטות

ניסוח ננו-חלקיקים

חלקיקי ננו-פחמן פרפלואורי פותחו כמתואר קודם לכן.14 בקצרה, תערובת שומנים של 98.5 מול אחוז ביצה L- - פוספטידילכולין ו-1.5 מול אחוז של 1,2-distearoyl snglycero- 3-phosphoethanolamine-N-[ קרבוקסי(פוליאתילן גליקול)-2000] (מלח נתרן) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) הוכן בכלורופורם: מתנול (3:1), לפני ייבוש ליצירת שכבת שומנים בוואקום. סרט הליפידים (2 אחוזים (Wt/vol)) לאחר מכן שולב עם PFOB (20 אחוז (וול/וול)) (Exfluor Research Corp.) (גליצרין 1.7 אחוז (Wt/vol)) (Sigma, St. Louis, MO ), ומים MilliQ, לפני שהם מתחלבים (Microfluidics Inc) על קרח למשך 4 דקות ב-20,000 פסי. כדי להפעיל את הננו-חלקיק עם צימוד PPACK, השתמשנו בשיטת הצימוד Amine-carboxyl. הננו-חלקיקים (1 מ"ל) ערבבו תחילה עם 2 מ"ג של EDCI 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-אתיל קרבודיאימיד מתיודיד (Sigma, St. Louis, MO) למשך שעה אחת , לפני הוספת 12.5 מ"ג PPACK (BACHEM, Torrance, CA) בטמפרטורת החדר של שייקר אורביטלי למשך הלילה. דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי 3000-5000 גרם/מול (Fisher Scientific, Waltham, MA) בוצעה כדי להסיר עודפי EDCI ו-PPACK. שיטת ניסוח מפורטת נכללה בחומרים משלימים.

המודל של פגיעה בכליות חריפה

עכברי C57BL/6 בוגרים (n=22) עברו איסכמיה חד-צדדית של איסכמיה דו-צדדית כדי לגרום לפגיעה חריפה בכליות. בעלי חיים הורדמו עם קוקטייל קטמין (85 מ"ג/ק"ג) וקסילאזין (13 מ"ג/ק"ג) לפני שעברו לפרוטומיה כדי לייצר 17 דקות של איסכמיה חמה. הוכנס חתך בטני בקו האמצע כדי לחשוף את עורק הכליה והווריד. איסכמיה כלייתית נגרמה על ידי מהדקים אטומים על העורק והווריד כדי להגביל את זרימת הדם לכליה. הפסקה מוצלחת של זרימת הדם בכליות אושרה חזותית על ידי שינוי של צבע הכליות מורוד לסגול כהה. טמפרטורת הגוף של העכברים נשמרה על 37 מעלות באמצעות מערכת חימום של בעלי חיים קטנים. המהדקים שוחררו לאחר 17 דקות כדי לאפשר שחזור זרימת הדם בכליות, דבר אשר אושר על ידי שינוי צבע הכליה לוורוד. לאחר מכן נסגר פצע הניתוח בשכבות ובעלי חיים נוטרו והוחזרו לכלוב לאחר תנועה חופשית. לאחר פרפוזיה חוזרת למשך 2 שעות, מנה אחת של PPACK

PFC NP ({{0}}.5 מ"ל/ק"ג PFC NP; 0.05 מ"ג/ק"ג PPACK) או PFC NP רגיל (ביקורת) ניתנו לווריד על ידי הזרקת וריד הזנב. מכיוון שהמחקר הקודם שלנו הוכיח שמנה מונעת אחת של PPACK PFC NP הראתה השפעות הגנה על הכליות, 16 כאן השתמשנו בטיפול במנה בודדת לאחר הופעת AKI כדי להעריך את ההשפעה המגנה על הכליות שלו. נהלים ופרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דרום פלורידה.

איסוף ושימור רקמות 24 שעות לאחר מתן ננו-חלקיקים, עכברים הורדמו והכליות חולצו לניתוח. לפני הסרת הכליות להערכות היסטולוגיות ומולקולריות, דם נאסף באמצעות ניקור לב לניתוח סרום במורד הזרם, ולאחר מכן כל עכבר הוזרם באופן מערכתי עם תמיסת מלח רגילה (Cat#: 23-535435, Fisher Scientific, Waltham, MA) עד לשאריות. דם נשטף מהכליות. כדי לאסוף סרום, דם מלא נקרש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, לפני שבוצע צנטריפוגה ב-2000 ×g למשך 10 דקות ב-4 מעלות. הסרום שנאסף אוחסן ב-80 מעלות לפני הערכות חנקן אוריאה בדם וציטוקינים. לצורך ניתוח היסטולוגי, כליות שנכרתו נקבעו ב-10 אחוז פורמלין, לפני עיבוד רקמות, הטבעה בפרפין וחיתוך. להערכת eicosanoids, כליות שנכרתו נותחו עוד יותר כדי להפריד בין קליפת המוח והמדולה, לפני שהוקפאו במהירות בחנקן נוזלי ואוחסנו ב-80 מעלות לניתוח.

היסטולוגיה

שיטות צביעה היסטולוגיות מפורטות וניתוח נתונים נכללו בחומרים המשלימים. השקופיות עברו דה-פראפין והוסרו מחדש לפני צביעת המטוקסילין ואאוזין, צביעת חומצה מחזורית (PAS) (Cat#: ab150680, Abcam, Cambridge, MA), צביעת ברזל כחול פרוסי, צביעה אימונוהיסטוכימית להמחשת CD31, VCAM-1, וביטוי ICAM-1, וצביעת תא מאסט-אאוזינופיל (Cat#: 150665, Abcam, Cambridge, MA). נתוני צביעת איזוטיפ בקרה של ארנב IgG מוצגים באיורים משלימים 2 ו-3 כדי להדגים את הספציפיות של תוצאות הצביעה האימונוהיסטוכימית. כל התמונות המיקרוסקופיות נרכשו באותן הגדרות כוח ופרמטרי דיגיטציה. הערכות מיקרוסקופיות בוצעו עם מיקרוסקופ שדה בהיר אולימפוס מצויד במצלמה דיגיטלית DP27 כדי להקליט תמונות של חתכים פתולוגיים בהגדלה של 20× או 40×. ניתוח נתונים כפול סמיות בוצע על כל התמונות.

חנקן אוריאה בדם (BUN)

מדידות ה-BUN בוצעו עם ערכת זיהוי קולורימטרית של אוריאה חנקן (BUN) (Cat#: K024-H5, Arbor Assays, Ann Arbor, MI) בהתאם להנחיות היצרן.

הכנה וניתוח של איקוסנואידים

Eicosanoids חולצו באמצעות תהליך מיצוי שונה ונותחו על ידי UPLC ESI-MS/MS כפי שתואר קודם לכן.28 שיטות מפורטות ששימשו למחקר זה נכללו בחומרים משלימים.

הערכת ציטוקינים בסרום

מערך ציטוקינים מותאם אישית נרכש מ-R&D Systems (Minneapolis, MN) והוערך עם Luminex 200 (Northbrook, IL) בהתאם להוראות במדריך למשתמש.

סטָטִיסטִיקָה

התוצאות מבוטאות כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). ניתוח סטטיסטי עבור כל ניסוי מסוכם בטבלה משלימה 1. נעשה שימוש בבדיקת t דו צדדית או ANOVA חד כיוונית עם מבחן Scheffe. ניתוח מתאם עבור צמדי מדדים נבחרים בוצעו כדי לחשב ערך Pearsonian r. מובהקות סטטיסטית של הבדלים יוחסה ב-P <>

תוצאות

טיפול PPACK PFC NP משפר את תפקוד הכליות לאחר תחילתפגיעה חריפה בכליות.

בדיקה מיקרוסקופית של המראה הכללי של הכליות 24 שעות לאחר טיפול אנטי-תרומבין (PPACK) PFC NP שלאחר הפרפוזיה, הצביעה על שיפור הנזק ב-AKI מבוסס (איור 1, AB). הפציעה ב-24 שעות אותרה בעיקר בצומת הקורטיקומדולרי של הכליה והאבובים הפרוקסימליים נפגעו באופן מועדף. דפוס הפגיעה היה של נמק מסוג קרישה. הייתה הסתננות דלקתית קלה בנקודת הזמן של 24-שעות. כימות של נזק צינורי בחתכים מוכתמים ב-H&E (איור 1, C) גילה כי עכברים שטופלו ב-PPACK PFC NP הביעו ירידה כוללת של 33.95 אחוז בנמק צינורי חריף (ATN) לעומת עכברים שטופלו ב-NP בשליטה (24.44 ± 1.76 אחוז לעומת 37.{{ 16}} ± 4.96 אחוזים בהתאמה; P=0.035). איור 1, D מראה שעכברים שקיבלו טיפול הביאו ירידה של 44.03 אחוז ב-BUN ב-24 שעות (110.96 ± 6.21 מ"ג/ד"ל לעומת 62.10 ± 8.71 מ"ג/ד"ל עבור NP בקרה לעומת PPACK PFC NP; P=0.000 . תוצאות מועילות מוקדמות אלו משקפות את ההגנה שצפינו בעבר עם משטרי אנטי-תרומבין לפני טיפול ב-24 שעות,16 מה שמרמז על כך שהטרומבין ממשיך לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות של AKI מעבר לעלבון האיסכמי הראשוני.

איור 2 ממחיש את התגובות האזוריות של מבני גבול בסיס ומברשת לטיפול באנטי-תרומבין המבוסס על כימות למחצה של צביעת PAS. איור 2, AC מראה שהטיפול הגביר את אחוז הגלומרולי עם ממברנות בסיס שלמות מ-51.43 אחוז ± 2.61 אחוז ל-70.00 אחוז ± 3.09 אחוז (P=0.00033). איור 2, DF ממחיש את הנזק העמוק יותר שספג גבולות מברשת צינוריים שבהם רק מיעוטם שמר על גבולות מברשת שלמים לחלוטין לאחר 24 שעות. עם זאת, הטיפול שיפר את שלמות גבול המברשת ב-50.79 אחוז (P=0.015). הטיפול הפחית את ההיקף הכולל של אגרגטים חלבונים ב-54.09 אחוז (P=0.032) (איור 2, GI), מה שעשוי להיות צפוי למנוע גודש צינורי כדי לשמור על תפקוד הכליות.

טיפול PPACK PFC NP שמר על שלמות כלי הדם לאחר הופעת IRI

כדי לכמת את הפוטנציאל של PPACK PFC NP להגן על אלמנטים כלי דם, קטעי כליות נצבעו עבור CD31.

איור 3 ממחיש את השכיחות הגדולה יותר של צביעת CD31 ב-24 שעות בקליפת המוח ובמדולה של עכברים שטופלו ב-PPACK NP לעומת NP בקרה (איור 3, A ו-D לעומת B ו-E). באזורי קליפת המוח, צביעת CD31 היוו 4.28 אחוז ± 0.62 אחוז מהמטופלים לעומת 1.75 אחוז ± 0.34 אחוזים עבור חיות ביקורת (P=0.0{{ 25}}18), או עלייה יחסית של 144.57 אחוזים (איור 3, ג'). באזורים מדולריים, צביעת CD31 כללה 3.24 אחוז ± 0.38 אחוז עבור PPACK NP שטופלו לעומת 1.91 אחוז ± 0.29 אחוז עבור בעלי חיים מטופלים ב-NP ביקורת (P=0.0073), או עלייה יחסית של 88.81 אחוז (איור 3, F) . הערכה מיקרוסקופית של שלמות כלי הדם לא גילתה נמק עורקי ניכר בנקודת הזמן של 24-שעות.

המראה של תאי דם אדומים (RBC) בתמונות מיקרוסקופיות היה שונה בין PPACK NP ועכברים שטופלו ב-NP ב-24 שעות (איור 4). מכיוון שהעכברים עברו זילוף סיסטמי כדי לשטוף דם בטריטוריות כליות שניתנות לחילוף, נוכחותם של RBC הצביעה על הצטברות בתוך צינורות מיקרו-וסקולריים שאינם זורמים בצורה גרועה או על אקסטרה ביניים, או אולי שניהם. בגלומרולי (איור 4, AB), RBCs נצפו בתוך ציצי כלי דם, אך לעתים רחוקות בקפסולה של באומן לאחר 24 שעות. הטיפול הפחית את שכיחות RBC הגלומרולרי ב-40.78 אחוז (P=0.007) (איור 3, C). במדולה (איור 4, DE), לא ניתן היה להקצות מיקום סופי ל-RBC בהתבסס על כתמי H&E, אך הטיפול הפחית את השכיחות הכוללת של RBC ב-34.92 אחוז (P=0.049) (איור 4, F) .

כדי להגדיר עוד יותר את ההשלכות של שקיעת RBC ולכידה, בוצעה צביעת ברזל לא-heme עם Prussian Blue. כתמי ברזל היו חיוביים במבנים תאיים גלומרולריים וצינוריים כאחד. הטיפול הפחית את השכיחות של ברזל בקורטקס (ירידה של 44.23 אחוזים; P=0.022) (איור 5, AC) ובמדולה (ירידה של 50.50 אחוז; P=0.006) (איור 5, DF ) ב-24 שעות, בהתאם להשפעה של טיפול אנטי-תרומבין על לכידת RBC.

טיפול PPACK PFC NP הפחית דלקת מקומית ומערכתית לאחר הופעת AKI

כדי להבהיר את תפקידו של תרומבין בשמירה על הפעלת האנדותל ודלקת מקומית בכליה, כימתנו גם ICAM-1 וגם VCAM-1. ביטוי VCAM-1 בקורטקס לא השתנה על ידי טיפול PPACK (איור 6, AC). עם זאת, ביטוי VCAM- 1 במדולה היה מווסת באופן משמעותי ב-65.25 אחוזים (P=0.011) לאחר הטיפול (איור 6, DF). ביטוי משופר של ICAM אנדותל -1 נצפה הן בקורטקס והן במדולה בעכברים שטופלו ב-NP בביקורת (איור 7, B ו-E). ICAM-1 הוסרה על ידי טיפול ב-36.89 אחוז (P=0.0083) בקליפת המוח (איור 7, AC) וב-31.17 אחוז (P=0.030) במדולה (איור 7) , DF).

כדי לשרטט את תפקידו של טרומבין בוויסות שומנים ביו-אקטיביים דלקתיים באבולוציה המוקדמת של AKI, ביצענו מבחני ליפידומיים על רקמות שחולצו בנפרד מקליפת המוח והמדולה ב-24 שעות. טבלאות משלימות 2 ו-3 מפרטות את המבחנים המולקולריים הספציפיים, אזור הכליות וסוגי הנושא (AKI מטופל, AKI לא מטופל או נורמלי ללא AKI). טבלה משלימה 4 מפרטת את אחוז השינוי הממוצע מקו הבסיס הנורמלי הבריא עבור כל שומנים בקורטקס ובמדולה. באופן כללי, גם אזורי קליפת המוח וגם אזורי המדולרי הביאו לידי ביטוי חריגה של כמעט כל השומנים הביו-אקטיביים שהוערכו בהשוואה לכליות תקינות (טבלאות משלימות 2 ו-3), וכמעט כל שומני האיתות נטו לעבור לרמות נורמליות לאחר טיפול אנטי-תרומבין. כמדד פשוט לדלקת אזורית (טבלה משלימה 4), אחוז השינוי הממוצע עבור כל השומנים היה 65.13 אחוז ו-38.60 אחוז עבור קליפת המוח ו-136.42 אחוז ו-90.76 אחוז עבור מדולה בקבוצות הביקורת NP ו-PPACK NP בהתאמה, מה שמצביע על דלקת זו. המדולה עלתה על זו של קליפת המוח על פי מבחני ליפידומיים.

למרות שמגמות פתרון נראו לאחר טיפול כמעט בכל מיני השומנים, רובם לא עמדו במובהקות סטטיסטית. עם זאת, בולטת במבחנים אלו התגובה המשמעותית של PDG2, אשר ירדה ב-47.62 אחוזים בקליפת המוח (איור 8, A) (P=0.012) וב-50.21 אחוזים במדולה (איור 8, B) ( P=0.0249), בהתאמה. בהתבסס על תצפית זו, כימתנו את השכיחות של תאי פיטום חודרים, שהם מקור בולט ידוע ל-PGD2 דלקתי. איור 8, CE מצביע על כך שטיפול באנטיתרומבין הפחית את תכולת תאי הפיטום בכל חלקי הכליה ב-54.27 אחוז (P=0.002) ב-24 שעות. זה תואם את ההפחתה שנצפו ב-VCAM-1 ו-ICAM-1 (איורים 6 ו-7) כתאי מאסט מופעלים המבטאים LFA-1 (אנטיגן 1 הקשור לתפקוד לימפוציטים) ו-VLA (מאוחר מאוד אנטיגן) קושרת מולקולות הידבקות ספציפיות לרקמות להעברה לרקמות דלקתיות.29,30 יתרה מכך, כימוקינים/ציטוקינים הקשורים לתאי פיטום כגון M-CSF ו-IL-6 הוגדרו במקביל על ידי ננו-חלקיקים אנטי-תרומבין. לאחר טיפול ב-PPACK NP, M-CSF ו-IL-6 בסרום הופחתו ב-36.60 אחוזים (P=0.0448) ו-27.44 אחוזים (P=0.0454), בהתאמה, בהשוואה ל- קבוצת הביקורת הלא מטופלת (איור 8, F).

מספר מתאמים מענינים עלו ממערך הנתונים הקשורים לחדירת תאי פיטום, נזק לכלי דם ותפקוד כליות עבור כלל הקבוצות המשולבות של בעלי חיים מטופלים ובלתי מטופלים הן באזורי קליפת המוח והן באזור המדולה. קשר עקיף היה בין BUN ל-CD31 (r=0.75, P=0.000009), המעיד על כך שהחמרה באי ספיקת כליות קשורה לפגיעה גדולה יותר בכלי הדם (איור משלים 1, A). קיים קשר ישיר בין מספרי תאי תורן ל-BUN (r=0.71, P=0.004), מה שמצביע על הקטנה מתקדמת

של תפקוד כליות בשיתוף עם חדירת תאי פיטום (איור משלים 1, ב'). נצפה קשר עקיף בין מספרי תאי פיטום לבין CD31 (r=0.59, P=0.002), המעיד על כך שהנזק לכלי הדם החמיר עם חדירת תאי פיטום מוגברת (איור משלים 1, C). לבסוף, נצפה קשר ישיר בין מספר תאי פיטום וביטוי ICAM-1 גלובלי (r=0.54, P=0.008), בהתאם לציפייה שמולקולות הידבקות כלי דם בעלות ויסות יתקיימו. לקדם איתור תאי פיטום לרקמות פגועות (איור משלים 1, D). קשר ישיר קרוב עוד יותר היה קשור לביטוי VCAM מדולרי ולספירת תאי פיטום (r=0.69, P=0.009; נתונים לא מוצגים).

דִיוּן

למרות עשרות שנים של מאמצים בחיפוש אחר ניהול יעיל שלפגיעה חריפה בכליות, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 חלקי אנטי-תרומבין באתרים של פקקת מיקרו-וסקולרית והפעלת PAR-1 (תיאור נוסף בחומרים משלימים), אסטרטגיית הגברה שלא ניתנת להשגה על ידי סטוכיומטריה 1:1 של חומרים חופשיים קונבנציונליים המעכבים תרומבין, כולל PPACK.

מערך הנתונים הנוכחי מראה כי פגיעת איסכמיה חדה כלייתית-רפרפוזיה לא הושלמה עד שעתיים לאחר הפרפוזיה וטרומבין נותר יעד בעל ערך גבוה ברקמות פגועות לאחר רפרפוזיה. מאמצים קודמים של מקורביו של Molitoris ואחרים תומכים במאמץ המתמשך לתכנן שיטות בטוחות לעיכוב ישיר של תרומבין ב-AKI.^18,31–33מהעבודה הקודמת שלנו בטיפול מקדים ב-AKI עם PPACK PFC NP, אנו יודעים שננו-חלקיקים אנטי-תרומבין מספקים מעקב מתמשך כנגד תרומבין המופעל מקומי, השומר על שלמות כלי הדם, מחליש בצורה ניכרת את תופעת אי-הזרימה החוזרת בכ-50 אחוז, ומהפוך במהירות אי תפקוד כליות ב-24 שעות 16 יחד עם הנתונים הנוכחיים, ברור שננו-חלקיקי אנטי-תרומבין ממשיכים לקבל גישה לרקמות כליות פגומות אך קיימות גם לאחר הפרפוזיה מחדש כדי למנוע נזק נוסף לכלי הדם והצינורות. דיווחים קודמים שעכברי נוקאאוט PAR-1 סובלים מפציעה מופחתת של איסכמיה-פרפוזיה כלייתית תואמים גם הם לאסטרטגיה שלנו של עיכוב תרופתי חזק ומתמשך של הפעלת PAR-1 ב-AKI באמצעות עיכוב טרומבין.³⁴

ההגנה על מבני כלי דם בכליות (איור 3), גבול מברשת וקרום בסיס (איור 2) המסופקים על ידי אנטי-תרומבין PFC NP, בהתאמה לנתונים הקודמים שלנו, המראים שטיפול אנטי-תרומבין מעורר שיפור פי 2 בזילוף באזורי קורטיקומדולרי ב AKI,16 מאשרת יתרון מתפתח של שיקום מיקרואנגיופתיה כלייתית. למרות שהטבע המדויק של הנזק לנימים ולוורידים פריטובולריים לא הובהר במלואו בנקודות זמן מוקדמות אלו לאחר פרפוזיה חוזרת, מתוארים חדירות כלי דם משופרים והפעלה של קספאז פרואפופטוטי אנדותלי-3, כמו גם הקטנת האות. עבור CD31 (PECAM),35 המווסת את שלמות צומת האנדותל.36 סינתזה וביטוי של CD31 בצמתים של תאים מווסתים על ידי ציטוקינים דלקתיים המתבטאים על ידי תאי מאסט מופעלים (TNF- ו-IFN-), המשפרים את חדירות כלי הדם.^37,38יתרה מכך, אינדוקציה של גורם רקמה על ידי תרומבין באמצעות הפעלת PAR-1 מווסתת על ידי CD31, ועכברי נוקאאוט CD31 מציגים אפופטוזיס צינורי ואנדותל מוגבר, שקיעת פיברין מוגברת וביטוי של גורם רקמה.³⁹בהתאם לכך, היכולת של PPACK PFC NP לשמר את ביטוי CD31 עשויה להיות חיונית להגבלת ההפעלה המתמשכת של מפל הקרישה ולשמירה על שלמות האנדותל.

קשר מקומי קיים בין דלקת וקרישה בשלב ההארכה של AKI המגביל זלוף נימי מדולרי חיצוני הגורם לאיסכמיה/היפוקסיה אזורית ממושכת, אשר לאחר מכן פוגע בתיקון ובהתחדשות של תאי צינורי.4 ירידה מתמשכת במספר המיקרו-כלים בפס הפנימי. של המדולה החיצונית ב-AKI מצביע על כך שנזק לכלי נמשך ואיתות VEGF מדוכא.^40–42יתר על כן, ישנן עדויות רבות לכך שדירות כלי דם מעוררת היפוקסיה כרונית המובילה לפיברוזיס טובולי-בין-מערכתי פרוגרסיבי.⁴³במודל איסכמיה/פציעה חריפה של חולדות, הצינוריות הפרוקסימליות רגישות במיוחד להיפוקסיה המתבטאת בנשירת תאי צינורית ואפילו התפוררות מוחלטת, מה שיוצר תמותה מוגזמת. מחלת כליות כרונית.⁴⁶

הנתונים שלנו גם מאשרים שנזק לכלי הדם מקדם לכידת RBC ותצהיר לא-heme (איורים 4 ו-5) שעלולים להחמיר מחלת כליות כרונית,⁴⁷אך מתאימה לטיפול באנטיתרומבין. מקור הברזל ברקמות הן בתאים גלומרולריים והן בתאים צינוריים (איור 5) מקורו ללא ספק מהתמוטטות RBC באותם טריטוריות כתוצאה מדימום ו/או פקקת מיקרו-וסקולרית, בהתאם לתמונה של פגיעה בכלי הדם המופחתת על ידי טיפול אנטי-תרומבין. בהתאם לכך, גישות השומרות על שלמות כלי הדם עשויות לייצג צעד ראשון קריטי לקראת שמירה על קווי האספקה ​​עבור מצעים תזונתיים המאפשרים ריפוי מהיר יותר של מבנים צינוריים פגומים.

באופן מעניין, נראה כי PPACK PFC NP מציע הגנה מוקדמת על מבני כלי דם ומחליש סמנים שונים של דלקת (איורים 6 ו-7; טבלאות משלימות 2-4) הן בקורטקס והן במדולה. במחקרים ניסיוניים מסורתיים של AKI, ההנחה היא שהקורטקס עמיד יותר לנזק מאשר המדולה עקב ביקוש מטבולי נמוך יותר, אולם הפעלת אנדותל ודלקת פתופיזיולוגית נראים נפוצים, כפי שמעידים מבחני ליפידומיים והיסטוכימיים שלנו. יתרה מכך, השקיעה הרחבה של ברזל לא-heme כתוצר לוואי של פירוק RBCs כלואים בקליפת המוח ובמדולה - והפחתה על ידי ננו-חלקיקים אנטי-תרומבין - תואמת דפוס כללי של דלקת ונזק, גם אם הקורטקס עשוי להוכיח יותר. מושפע באופן חולף ומתון מאשר המדולה במהלך המחלה.

התגובה המוקדמת המפתיעה של חדירת תאי פיטום תוך 24 שעות (איור 8) מעידה על תפקיד חשוב עבור תאים דלקתיים שאינם שחקנים מסורתיים כגון נויטרופילים ומקרופאגים. תאי מאסט נחשבים בדרך כלל כמתווכים של תגובות אלרגיות, אך קיים ספרות לגבי ההשלכות הפתופיזיולוגיות שלהם בפגיעה כלייתית חריפה וכרונית.^48–52 למרות שנויטרופילים הם מגיבים מוקדמים לפגיעה ברקמות, מקרופאגים לא נכנסים לתמונה עד מאוחר יותר בתהליך הדלקתי, מה שמצביע על כך שתאי פיטום ממלאים תפקיד חשוב בשלב המוקדם של AKI. ואכן, Danelli וחב' הראו שדגרנולציה של תאי פיטום מתרחשת מוקדם ב-AKI ושדלדול של תאי פיטום בזמן אינדוקציה של AKI אך לא 48 שעות לאחר מכן מקנה השפעה מועילה ארוכת טווח על תפקוד הכליות, ניוון ופיברוזיס.⁵³מסקנות דומות הגיעו על ידי Tong וחב' בהליכי תאי פיטום מיוצבים בקרומולין שבוצעו לפני הפרפוזיה מחדש.54 סאמרס הראה כי עכברים חסרי תאי פיטום (KitW-sh/W-sh) סובלים פחות מפציעה איסכמית מאשר סוגי בר וכי הם מפרטים רמות מופחתות של תרופות כימותרכות לויקוציטים.⁵⁵

תאי מאסט מבטאים קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז תאי מאסט מבטאים קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs) שניתן להפעיל על ידי תרומבין כדי לפרוק ולפרוק שורה של כימוקינים, ציטוקינים ושומנים ביו-אקטיביים שנוצרו מראש. חלבונים (למשל, פיברונקטין) וביטוי אינטרלוקין (למשל, IL-6) באמצעות אינטראקציות PAR- 1.⁵⁹לאחר עיכוב תרומבין, ראינו רמות מופחתות של PGD2 המתאימות לדלדול יחסי של תאי פיטום מכיוון ש-PGD2 הוא איקוסנואיד ביו-אקטיבי עיקרי המופרש על ידי תאי פיטום בתגובות מסוג אלרגי.60 יתר על כן, הירידה בוויסות ICAM-1 VCAM-1 לאחר טיפול בננו-חלקיקי אנטי-תרומבין עולה בקנה אחד עם חדירת תאי פיטום מופחתת שכן הם מבטאים LFA-1 ו-VLA ומשתמשים במולקולות הדבקה כדי להשיג כניסת רקמה.^29,30

תפקיד פתוגני ספציפי ל-PGD2 עצמו באבולוציה של IRI כלייתי לא תואר עד כה למיטב ידיעתנו, אך הוא משמש כסמן ביולוגי ברור להפעלת תאי פיטום.⁵²בדלקת ריאתית, הוכח כי PDG2 מגביר את ביטוי הציטוקינים הפרו-דלקתיים של מקרופאג דרך הקולטנים שלו (DP1 ו-DP2), אשר לאחר מכן מפעילים זרימת נויטרופילים.61 התצפית שלנו על מוגבר של M-CSF ו-IL-6 (איור 8) ב-AKI המווסתים על ידי PPACK PFC NP באמצעות דיכוי תאי פיטום יהיו עקביים עם מנגנון משוער שכזה. עם זאת, מכיוון שידוע כי תאי פיטום משחררים שורה של גורמים שעלולים להזיק לתפקוד הכלייתי, 51,52 כל מספר של דטרמיננטים אחראיים עשויים להיות נושאים למחקר עתידי לשליטה באמצעות עיכוב טרומבין או גורמים ממוקדים מולקולריים אחרים. בהתאם לכך, התערבויות המעכבות משיכה מוקדמת של תאי פיטום ודגרנולציה עשויות להגן מאוד על שלמות כלי הדם ותפקוד הכליות, כפי שמתבטאת בעיכוב טרומבין מקומי בנתונים הנוכחיים.

מגבלות

מחקרים אלו לא נועדו להבהיר יתרונות מתמשכים של עיכוב תרומבין שכן מודל AKI מתמקד בהגנה מוקדמת מפני IRI ומנגנונים נלווים. האם היתרונות ארוכי הטווח של מנה בודדת של חלקיקי ננו-תרומבין עשויים להגביל את ההתקדמות למחלת כליות כרונית היא מעבר להיקף הדו"ח הנוכחי וידרוש מודל ניסיוני והשערה אחרת. יתר על כן, חלון ההזדמנויות הזמני להשגת התאוששות תפקודית על ידי עיכוב תרומבין בשלב ההארכה של AKI אינו מטופל כאן אך הוא נושא לעניין למחקרים עתידיים. עד כמה ההשפעות המועילות העיקריות של עיכוב תרומבין מקומי ב-AKI נובעות מדיכוי של הפעלת תאי פיטום נותרה משערת אך ניתן יהיה לבדוק במחקרים מכניסטיים מפורטים הבאים. עם זאת, למרות שהמתאמים הליניאריים המשמעותיים בין מספרי תאי הפיטום, CD31 ו-BUN אינם בהכרח מבססים סיבה ותוצאה, הקונקורדנציה שלהם תומכת בקשר חזק בין תאי פיטום ונזק לכלי הדם בשלבים המוקדמים של IRI של הכליה. לבסוף, השימוש ב-PPACK כחלק האנטי-תרומבין הוא רק דוגמה אחת למרכיב טיפולי שניתן להצמיד אותו שניתן להעביר בצורה בטוחה ומקומית על מבנה ננו כדי להכניע את איתות הטרומבין.

1. Benoit SW, Devarajan P. פגיעה חריפה בכליות: טיפולים תרופתיים מתעוררים בניסויים קליניים נוכחיים. Pediatr Nephrol 2018;33:779-87.

2. Chen H, Busse LW. טיפולים חדשים לפגיעה חריפה בכליות. Kidney Int Rep 2017;2:785-99.

3. Bonventre JV, Yang L. פתופיזיולוגיה תאית של פגיעה איסכמית חריפה בכליות. J Clin Invest 2011;121:4210-21.

4. Sharfuddin AA, Molitoris BA. פתופיזיולוגיה של פגיעה כלייתית איסכמית חריפה. Nat Rev Nephrol 2011;7:189-200.

5. Bonventre JV. פתופיזיולוגיה של AKI: פציעה ותיקון נורמלי וחריג. Contrib Nephrol 2010;165:9-17.

6. Zuk A, Palevsky PM, Fried L, Harrell Jr FE, Khan S, McKay DB, et al. התגברות על מחסומי תרגום בפגיעה חריפה בכליות: דו"ח מסדנת NIDDK. Clin J Am Soc Nephrol 2018;13:1113-23.

7. Zuk A, Bonventre JV. ההתקדמות האחרונה בפגיעה בכליות חריפה והשלכותיה והשפעתה על מחלת כליות כרונית. Curr Opin Nephrol Hypertens 2019;28:397-405.

8. Rahman A, Fazal F. חסימת NF-kappaB: בעיה דלקתית. Proc Am Thorac Soc 2011;8:497-503.

9. Jagadeesha DK, Takapoo M, Banfi B, Bhalla RC, Miller Jr FJ. טרנסאקטיבציה של Nox1 של קולטן לגורם גדילה אפידרמיס מקדמת נשירת N-cadherin ונדידה של תאי שריר חלק. Cardiovasc Res 2012;93:406-13.

10. Lopez ML, Bruges G, Crespo G, Salazar V, Deglesne PA, Schneider H, et al. תרומבין משרה באופן סלקטיבי שעתוק של גנים במונוציטים אנושיים המעורבים בדלקת ובריפוי פצעים. Thromb Haemost 2014;112:992-1001.

11. Borissoff JI, Spronk HM, Heeneman S, ten Cate H. האם תרומבין הוא שחקן מפתח במבוך 'קרישה-אתרוגזה'? Cardiovasc Res 2009;82:392-403.

12. Rudman-Melnick V, Adam M, Potter A, Chokshi SM, Ma Q, Drake KA, et al. פרופיל תא בודד של AKI במודל עכברי חושף חתימות שעתוק חדשות, פנוטיפ פרופיברוטי והצלבה אפיתל לסטרומה. כתב העת של האגודה האמריקאית לנפרולוגיה: JASN 2020;31:2793-814.

13. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. פרופיל תאים של פגיעה חריפה בכליות של עכבר חושף תגובות סלולריות משומרות לפציעה. Proc Natl Acad Sci USA 2020;117:15874-83.

14. Myerson J, He L, Lanza G, Tollefsen D, Wickline S. Thrombin- inhibiting perfluorocarbon nano-particles מספקים אסטרטגיה חדשה לטיפול והדמיית תהודה מגנטית של פקקת חריפה. Journal of Thrombosis and hemostasis: JTH 2011;9:1292-300.

15. Myerson JW, He L, Allen JS, Williams T, Lanza G, Tollefsen D, et al. ננו-חלקיקים מעכבי תרומבין מהווים במהירות משטחים מגוונים וניתנים לזיהוי. ננוטכנולוגיה 2014;25:395101.

16. Chen J, Vemuri C, Palekar RU, Gaut JP, Goette M, Hu L, et al. חלקיקי ננו-אנטיטרומבין משפרים את תפקוד הכליות ומגנים על תפקוד הכליות לאחר פציעת איסכמיה-פרפוזיה מחדש. Am J Physiol Renal Physiol 2015;308:F765-73