אפיון מבני של Cistanche Deserticola polysaccharide והשפעתו המגן על HK -2 פגיעה בתאים הנגרמת על ידי גלוקוז גבוה

תַקצִיר:

 

המטרה: לחקור את המבנה של פוליסכרידים של Cistanche Deserticola (CDPs) ואת ההשפעה והמנגנון המגן של תאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים אנושיים (HK {0}}) פגיעה. שיטות: ההרכב הכימי, המשקל המולקולרי, הרכב המונוסכרידים והמבנה האפשרי של CDPs התגלו בשיטת פנול חומצה גופרתית, שיטת הידרוקסיל ביפניל, שיטת כחול מבריק קומאסי, שיטת כרומטוגרפיה של יונים, כרומטוגרפיה של פליטת ג'ל גבוהה וכרומטוגרפיה אינפרא אדום. ההשפעה המגן של CDPs על HK -2 פציעה והמנגנון שלה הוערכו על ידי הקמת מודל נזק של תאים HK -2 הנגרמים על ידי גלוקוז גבוה. תוספות: המשקל המולקולרי הממוצע של CDPs היה 8 {}} 31,4198,34444444, הורכב בעיקר, הוחל, הגלוקוס, הוחלקה, glucose, galucose, mana, galuse, man, galusend, galusend, ערבינוז, ויכול להיות שיש קשר גליקוזידי. זה יכול להפחית את הנזק החמצוני של תאי HK -2 הנגרמים על ידי גלוקוז גבוה והנזק של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדרית של תאי HK -2 הנגרמים על ידי גלוקוז גבוה. הביטוי היחסי של חלבון קולטן דמוי אגרה 4 (TLR4) ויחס הגורם p -nuclear (NF) -BB P65 / -Actin ו- P -IκB / -actin ב- HK -2 התאים ירידה משמעותית לאחר התערבות עם ריכוזים שונים של CDPs (P <0.05, P <0.01). מסקנה: CDPs יכולים לצמצם גבוהתאי אפיתל צינורי כליה הנגרם על ידי גלוקוזפגיעה על ידי עיכוב TLR4 / NF-κB לקידום התפשטות התאים ולעכב לחץ חמצוני ואפופטוזיס.

 

מילות מפתח: Cistanche Deserticola polysaccharide; תאי אפיתל צינוריים כליות אנושיים; לחץ חמצוני; מסלול TLR4/NF-κB

 

 

 

Cistanthe לסוכרת נפרופתיה (DN)

 

סוכרת נפרופתיה (DN)הוא הגורם המוביל למחלות כליות בשלב הסופי ומאיים ברצינות על חייהם ובריאותם של חולים [1]. פגיעה צינורית כליות ממלאת תפקיד מפתח בהתרחשותו ובהתפתחות של DN. חריגות המודינמיות, לחץ חמצוני, תגובה דלקתית וחריגות מטבוליות הנגרמות על ידי סביבת סוכר גבוהה עלולות לגרום לאפופטוזיס ונמק של תאי אפיתל צינוריים כלייתיים, מה שמוביל לנזק צינורי כלייתי [2,3]. TLR4 בכליה הוא בן למשפחת TLRS, והולכת האות הקשורה שלה ממלאת תפקיד חשוב בהתרחשות ובפיתוח של DN [4]. בתנאי גלוקוז גבוהים, ביטוי גבוה של TLR4 בכליה יכול להפעיל את מסלול NF-κB, מחמיר נזק חמצוני סלולרי ולגרום ל- HK -2 אפופטוזיס תאים [5, 6].
Cistanches Herba הוא הגבעול הבשרני המיובש עם עלי זרחן של Cistanche Deserticola Ycma ו- (OR) Cistanche Tubulosa (Schenk) Wight, צמח רפואי ואכיל מסורתי. טעים מתוק, מלוח,

זה מתחמם ונכנס לכליות ומרידיאנים במעי הגסו יש לו את ההשפעות של יאנג של כליות, שיפור המהות והדם, והרטיבות המעיים והקלה על עצירות. [7] פוליסכרידים הם אחד החומרים הפעילים העיקריים של Cistanche Deserticola. תוכן הפוליסכרידים בתמצית המים של Cistanche Deserticola הוא גבוה יחסית, כאשר הספרות מדווחת כי התוכן הוא 29.598 עד 39.609 מ"ג/גרם [8]. הוא מורכב בעיקר מגלוקוז, גלקטוז, רמנוזה, ערבינוז, פרוקטוז וכו '. הוא מורכב ממונוסכרידים ויש לו השפעות פרמקולוגיות רבות, כולל ויסות פעילות חיסונית, אנטי אייג'ינג, שיפור הלמידה והזיכרון, הגנה על עצבים, התנגדות לנזק בכבד, אנטי-וירוס ואנטי-טומור [9]. בשנים האחרונות מספר גדול של מחקרים הראו כי פוליסכרידים ברפואה הסינית המסורתית יכולים לשפר את נפרופתיה הסוכרתית. המאפיינים הרב-יעדים, מרובי הנתיבים וההשפעות המשמעותיות של פוליסכרידים צמחיים סיניים מראים פוטנציאל רב בהתערבות בנפרופתיה סוכרתית [10]. במחקר שנערך על ידי Wang et al. [11], פוליסכרידים בניאן הראו השפעות משמעותיות בשיפור חילוף החומרים הגלוקוז והליפידים, הפחתת התגובות הדלקתיות ובוויסות המיקרוביוטה המעירית של עכברים סוכרתיים מסוג 2 דרך ציר כבד הבטן. מחקרים קודמים של צוות המחקר הראו כי תמצית המים של Cistanche Deserticola יכולה להגדיל את שיעור ההישרדות של תאי HK -2 בסביבה גבוהה-סוכר ובשומן גבוה, מווסתים אפופטוזיס תאים, לחץ חמצוני ורמות דלקת, ויש להם השפעה טיפולית פוטנציאלית על נפרופתיה סוכרתית [12]. תוצאות ניסוי של בעלי חיים הראו כי CDPs יכולים לשפר ביעילות את נפרופתיה סוכרתית בעכברים, והתוצאות הפתולוגיות הראו כי פיברוזיס צינורית כלייתית שופרה משמעותית [13]. עם זאת, ישנם מעט מחקרים על תפקידם של פוליסכרידים של Cistanche Deserticola בהגנה על מודל התא הגבוה הנגרם על ידי גלוקוז HK -2. לאור הפעילות הפרמקולוגית הפוטנציאלית והמנגנון של פוליסכרידים, מחקר זה נועד לאתר את ההרכב הכימי, המבנה המולקולרי ומבנה מולקולרי של CDPs בשיטת פנול חומצה גופרתית, שיטת הידרוקסי -ביפניל, שיטת כרומטוגרפיה של כרומטוגרפיה גבוהה. נותחו המסה, הרכב המונוסכריד והמבנה האפשרי, ונבנה מודל נזק של תאי HK -2 הנגרמים על ידי גלוקוז גבוה כדי להעריך את ההשפעה המגנה של CDPs על נזק HK -2 ומנגנון הפעולה שלו. ספק בסיס תיאורטי וראיות ניסיוניות ליישום פוטנציאלי של CDPs בטיפול ב- DN.

1 חומרים ושיטות
1.1 חומרים ומכשירים

CDPS (Polysaccharide תוכן> 8 0%, מספר אצווה: 2306019, חברת Shaanxi Xintianyu); dapagliflozin (DAPA, מספר אצווה: BMS -512148, Astrazeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.); תאי אפיתל צינוריים כליות אנושיים HK -2 (מספר אצווה: 20231014, חברת Actt, ארה"ב); MEM תרבות מדיום, סרום שור עוברי (מספר מגרש: 20231014, 20231014, חברת גיבקו, ארה"ב); מאגר PBS (מספר מגרש: 20230906, חברת Hyclone, ארה"ב); 0.25% פתרון עיכול טריפסין המכיל EDTA (מספר מגרש: 20240411, חברת Anhui Biosharp); CCK -8 ערכת גילוי כדאיות תאים (מספר אצווה: 20240415, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); סופרוקסיד דיסמוטאז (SOD), Malondialdehyde (MDA), גלוטתיון פרוקסידאז
פרוקסידאז, GSH-PX) ערכת איתור (אצווה מס ': 20240505, 20240423, 20240423, שנחאי Youxuan Biotechnology Co., Ltd.); Hoechst33258 ערכת אפופטוזיס מכתים (אצווה מס ': 20240223, שנחאי Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.); JC -1 מכתים
ערכת זיהוי פוטנציאלית של קרום מיטוכונדריאלי (אצווה מס ': 20240319, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) תאים מינים חמצן תגובתי (ROS) מגיב לגילוי
ערכה (מגרש מס ': 20231225, בייג'ינג סולבו טכנולוגיה ושות' בע"מ); נוגדן מונוקלונאלי TLR4, גורם גרעיני זרחני P65 (פוספו-NF-κB P65, P-NF-κB P65) נוגדן מונוקלונאלי (LOT NO: 10032512, 00128965, Wuhan Sanying Biotechnology Co.

כרומטוגרף ICS5000 ION, קורא מיקרו-פלייט MUL-TIGO (Thermo Fisher, USA); מכשיר PowerPAC HC+Mini Protein Protein Estemant (Biorad, USA); TS2 מיקרוסקופ הפוך (ניקון, יפן); Lc -10 כרומטוגרף נוזלי בעל ביצועים גבוהים, Ri -20 גלאי דיפרנציאלי (Shimadzu Technology Co., Ltd., יפן); 105-103-101 (8 מ"מ × 300 מ"מ) עמודת ג'ל טנדם (חברת BRT, בריטניה); CPA225D איזון אלקטרוני, Eppendorf5424 Centrifuge (Sartorius, גרמניה).

 

1.2 שיטות ניסוי
1.2.1 קביעת סוכר סוכר, חומצה אורונית ותכולת חלבון של CDP

השיטה עקבה על פי התייחסות [14]. תכולת הסוכר הכוללת של CDP נקבעה בשיטת חומצה פנול-סולפורית; תכולת החומצה האורונית של CDP נקבעה על ידי השיטה M-hydroxybiphenyl Colorimetric; ותכולת החלבון של CDP נקבעה בשיטה הכחולה המבריק של Coomassie.

 

1.2.2 קביעת מסה מולקולרית

התפלגות המשקל המולקולרי של פוליסכרידים התגלתה על ידי עמודות טנדם של כרומטוגרפיה של ג'ל בעל ביצועים גבוהים. סדרה של dextran סטנדרטית (dextran p {{0}}, p -10, p -20, p -50, p {}}}}, p {} {5}, p -400} 7}}}}}} {}}}}}}}}}}}}}) 7}) 7}) 7}). 0. 0 5 mol/l לפני השימוש. הריכוז הסופי היה 5 מ"ג/מ"ל, מערבולת להתמוסס, וצנטריפוגות ב 12 0 00 r/min למשך 10 דקות. הסופר -נפט שואף וסונן עם קרום מיקרופורי של 0.22 מיקרומטר. לאחר צנטריפוגה במהירות גבוהה, 0.05 מול/ליטר NaCl שימש כשלב הנייד. העמודה הכרומטוגרפית הייתה BRT 105-103-101 (8 מ"מ × 300 מ"מ); קצב הזרימה היה 0.7 מ"ל /דקה; טמפרטורת העמודה: 40 מעלות; נפח הזרקה: 25 μl; גלאי: גלאי דיפרנציאלי רכב -20 a; זמן ניתוח: 62 דקות. בחר את השיטה הכרומטוגרפית לעיל לניתוח, השג את זמן השמירה ותכנן את הלוגריתם של המשקל המולקולרי השיא (MP) ב- Ordinate (LGMP) וזמן השמירה (RT) על האבסיסה (LGMP-RT). עקומה סטנדרטית: על פי השיטה לעיל, משקל המולקולרי בממוצע המשקל (MW) זמן השמירה עקומת סטנדרטית LGMW-RT והמשקל המולקולרי מספר הממוצע (MN) זמן השמירה עקומה LGMN-RT נעשו כדי להשיג את המשקל המולקולרי. נוסחת חישוב. החלפת זמן שמירת הדגימה לנוסחה, ניתן להשיג את המשקל המולקולרי (MP, MW, MN).

1.2.3 הרכב מונוסכריד

הרכב המונוסכריד נקבע באמצעות כרומטוגרפיה של יונים. קח כמויות מתאימות של 16 סטנדרטים מונוסכרידים (פוקוזה, רמנוזה, ערבינוז, גלקטוז, גלוקוז, קסילוז, מנוזה, פרוקטוז, ריבוז, חומצה גלקטורונית, חומצה גלוקורונית, אמינוגלקטוז הידרכולוניד, חומצה גולוקוסמין, חומצה גולוקורונית, היו חומצה גולוצילונית, היו מנוטרוניד, גולורוניד), גולורוניד, גולורוניד) של 3 מול/ליטר חומצה טריפלואורואקטטית (TFA), הידרוליזה של 120 מעלות למשך 3 שעות, מיובשת בחנקן, והוספה להסרת המערבולת את המים המיובשים כדי לערבב היטב ולהכין את תמיסת המלאי הסטנדרטית. קח כל פיתרון סטנדרטי של מונוסכריד והכין במדויק את תקן הריכוז כתקן המעורב. על פי שיטת הכימות המוחלטת, נקבעו המוני מונוסכרידים שונים, ויחס הטוחני חושב על סמך המסה הטוחנית של המונוסכרידים.
הוסף 2 מ"ל של 3 mol/l TFA לפוליסכריד והגיב על 12 0 תואר למשך 3 שעות. במהלך התגובה נעשה שימוש ב- N2 להגנה. מתמוססים לאחר אידוי בלחץ מופחת. הוסף 5 מ"ל מים ומערבולת לערבוב. קח 5 0 μl והוסף 950 μl מים מיוניזים. צנטריפוגה בסל"ד למשך 5 דקות. Supernatant סונן דרך קרום מיקרו -פילטרציה של 0.22 מיקרומטר ונותח על ידי כרומטוגרפיה של יונים. העמוד היה דיונקס Carbopactm Pa20 (3 מ"מ × 150 מ"מ); השלב הנייד היה A: H2O; B: 15 mol/lnaoh; C: 15 Mol/ L NaOH ו- 100 mol/ L Naac; קצב זרימה: 0.3 מ"ל/דקה; נפח הזרקה: 25 μL; טמפרטורת העמודה: 30 מעלות;. גלאי: גלאי אלקטרוכימי; שיפוע חיסול ראה טבלה 1.

 

טבלה 1 טבלת שיפוע שלב נייד

 

 

1.2.4 גילוי ספקטרום אינפרא אדום

שקלו 1 מ"ג פוליסכריד יבש ואבקת KBR, טוחנים ומערבבים אותם בטיט ולחצו אותם לסדינים דקים בעזרת לחץ על טבליות. הניתוח בוצע באמצעות ספקטרומטר אינפרא אדום טרנספורמציה של פורייה בטווח מספר הגלים של 4500 ~ 400 ס"מ -1.

 

1.2.5 השפעת מגן של CDP

1.2.5.1 HK -2 תרבית תאים

לאחר שתחיו תאי HK {{0}}}, הם היו תרבותיים במדיום שלם MEM המכיל 10% סרום שור עוברי ונוגדן כפול של 1%, והתאים הונחו בחממה של תרבית תאים במרחק של 37 מעלות, 5% CO2 ולחות רוויה לדבק בקיר. ו כאשר התאים גדלים ל 80% עד 90%, הם מתעכלים עם 0.25% טריפסין ותת -תרבותית. תאים HK -2 בשלב הגידול הלוגריתמי שימשו לניסויים הבאים.

 

1.2.5.2 הכנת תמיסת מלאי CDP וריכוז מינון.

שוקל במדויק 3 0 מ"ג של CDPs, הוסף 6 מ"ל של MEM גלוקוז גבוה מדיום שלם כדי להכין פתרון מלאי CDPS של 5 מ"ג/מ"ל, ולאחסן אותו במקרר של 4 מעלות. בעת השימוש, מדוד נפח מסוים של תמיסת האם CDPS, הוסף מדיום תרבות, ערבב היטב, עקר בעזרת פילטר סטרילי של 0.22 מיקרומטר, והכין תמיסת מדגם של ריכוז מתאים.

 

1.2.5.3 השפעות של CDP

תאי HK -2 בשלב הגידול הלוגריתמי נזרעו בצלחות באר 96- בצפיפות של 3000 תאים/באר. על פי תוצאות הניסוי המקדימות, התאים חולקו לקבוצת ביקורת רגילה (קבוצת ביקורת, CON), ריכוזי מסה שונים (25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 1600 UG/ml)
הוקמה קבוצה ריקה המכילה מדיום תרבותי בלבד; לאחר טיפוח עם מדיום תרבות או תרופות למשך 24 שעות ו 48 שעות, 100 μl של מדיום תרבות המכיל 10% CCK -8 נוספו לכל באר והתאים הודגרו ב 37 מעלות כדי להימנע מחופשה באור למשך 1.5 שעות. הצפיפות האופטית (OD) של כל באר נמדדה באורך גל של 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו -צלחות, וכדאיות התא (%) חושבה על פי הנוסחה "כדאיות התא (%)=(OD של תרופה של תרופה היטב של ריק) (OD של שליטה היטב / OD - OD של היטב) לתאים רגילים.

1.20
הכן את תמיסת המניות של גלוקוז (גלוקוז, GLC) (10 מ"ג/מ"ל) ודללו אותו במדיום תרבות מלא לריכוזי דוגמנות של 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 ו- 80 מ"מ/ליטר בהתאמה לשימוש. תאים HK -2 בשלב הגידול הלוגריתמי נזרעו ב 96- צלחות באר ב 3000/באר, וקבוצת דגם (מודל, MOD) וקבוצת התאמה ריקה הוקמו והעניקו להם תרבות מלאה של תרבות וולוקוז מדיום של ריכוזים שונים, בהתאמה. , כמות שווה של מדיום תרבות שלם, תרבות למשך 24 שעות ו 48 שעות, וגילוי כדאיות תאים בהתאם לשיטה תחת "1.2.5.3".

 

1.2.5.5 השפעת CDPs על קצב ההישרדות של תאי המודל

על פי התוצאות הניסיוניות של "1.2.5.4", תאי HK -2 בשלב הגידול הלוגריתמי זרעו בצלחות באר {5}} בצפיפות של 3000 תאים לבאר. התאים חולקו ל- CON, MOD, וריכוזי מסה שונים של 50, 100 ו -200 התאים היו מתורבתים ב -400 UG/ML, 400 UG/ML ו- 800 UG/ML CDPs. הוקמה קבוצת התאמה ריקה ללא תאים. קבוצות ההתאמה של CON וקבוצות ההסתגלות הוספו עם כמות שווה של מדיום שלם. MOD וכל קבוצה שטופלה בתרופות נוספו עם 60 מ"מ/ליטר GLC וטופחו למשך 24 שעות. , השלך את מדיום התרבות, הוסף תרופות תרבותיות או תרבות תואמות למשך 24 שעות ו -48 שעות, וגילה את שיעור ההישרדות של התא לפי השיטה תחת "1.2.5.3".

 

1.2.5.6 השפעות של CDPs על מדדי לחץ חמצוני בתאי מודל

על פי תוצאות הניסוי ב "1.2.5.5", התאים חולקו לקבוצת CDPs במינון גבוה (CDPS-H, 400 מ"ג/ק"ג), קבוצת CDPs במינון האמצעי (CDPS- M, 200 מ"ג/ק"ג), קבוצת CDPs במינון נמוך (CDPS-L, 100 מ"ג/ק"ג) וקבוצת DAPAGLOZIN (DAPA) של DAPA, 10 מיקרומליה, 10 מיקרומליה, 10 מיקרומלוזין, 10 מיקרומלוזן). קבוצת התאמה אפסית, לאחר דוגמנות, נוספו ותרבות תרבות תרבות או תרבות תואמת למשך 24 שעות. חלבונים נאספו והליזטים נורמליזמו באותה רמה על ידי תיקון ריכוז החלבון. על פי ההוראות של כל ערכת מחוון, התגלו תכולת ה- MDA, GSH-PX ופעילות SOD בכל קבוצת תאים.

 

1.2.5.7 איתור ROS בתאי HK -2

הוסף את השעיית התא לפלטת 6- היטב והניחו אותו בחממה של תרבית תאים עד שהתאים גדלים לשכב חד -שכבתי ומקבלים גירוי תואם. שוטפים את התאים 3 פעמים ב- PBS מקוררים מראש ומדללים במדיום MEM ללא סרום. צבע פלואורסצנטי DCF-DA היה מדולל לריכוז סופי של 10 מיקרומול/ל. הצבע התווסף לצלחת באר 6-, התאים נשטפו 3 פעמים עם PBS מקורר מראש, והצבע הפלואורסצנטי DCFH-DA היה מדולל לריכוז סופי של 10 מיקרומול/ליטר עם מדיום MEM ללא סרום. μmol/l, הצבע התווסף לצלחת באר {12}}, הצבע הושלך, התאים נשטפו שלוש פעמים במדיום MEM ללא סרום ואז נאספו תמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.