קטן אך אדיר - אקסוזומים, שליחים בין-תאיים חדשניים בנוירודגנרציה חלק 1

סיכום פשוט:

אקסוזומים הם ננו-חלקיקים ביולוגיים שהוכרו לאחרונה כשליחים בין-תאיים. הם מכילים מטען של שומנים, חלבונים ו-RNA. הם יכולים להעביר את התוכן שלהם לא רק לתאים בסביבה אלא גם לתאים במרחק.

אקסוזומים הם כלי תקשורת בין-תאי שהתגלה לאחרונה שיכול לשחרר שלפוחיות קטנות ועדינות לתאים שמסביב, לספק חלבונים מסוימים, חומרי איתות וחומרים אחרים לתאים שמסביב. חומרים אלו יכולים לעזור לתאים לשנות את מצבם ואף להשפיע על הצמיחה, ההתפתחות, חילוף החומרים והיבטים אחרים של תאים אחרים. בשנים האחרונות, מחקרים הראו כי אקסוזומים ממלאים תפקיד חשוב בתפקוד המוח האנושי, במיוחד בשמירה ושיפור הזיכרון.

ראשית, אקסוזומים יכולים לקדם העברת אותות בין נוירונים. העברת מידע בין נוירונים היא אחד התנאים ההכרחיים לפעולה תקינה של מערכת העצבים, ואקסוזומים ממלאים את התפקיד של שליחים, שיכולים להפוך את העברת המידע בין נוירונים לחלקה יותר, ובכך לשפר את הקוגניציה והזיכרון של המוח.

שנית, אקסוזומים יכולים גם לווסת את חילוף החומרים של נוירונים. בתהליך ייצור ושחרור אקסוזומים של נוירונים מעורבים מספר רב של תהליכים מטבוליים, המעודדים את האיזון והוויסות של חילוף החומרים בתאים. תהליכים אלה יכולים לא רק לשפר את יכולתם של נוירונים אלא גם לעזור להסיר פסולת מטבולית ומולקולות מזיקות ולשמור על בריאות תאי המוח.

לבסוף, אקסוזומים יכולים גם לעזור לנוירונים לתקן נזקים. חלבונים וחומצות גרעין רבים הנישאים על ידי אקסוזומים מועילים לצמיחה, תיקון והתחדשות תאים, ויכולים לקדם תיקון והתחדשות של נוירונים, ובכך לשפר את יכולת ההישרדות של תאי המוח ולחזק את מרכזי הזיכרון והיכולות הקוגניטיביות.

לסיכום, יש קשר הדוק בין אקסוזומים לזיכרון. אנחנו יכולים לשנות את הזיכרון של הילדים על ידי התחלת דיאטה. הנחיה פעילה של מבנה התזונה של ילדים ואכילת יותר מזונות עשירים במרכיבים מועילים כמו חומצות שומן, חלבונים וויטמינים יכולים לקדם את הייצור והשחרור של אקסוזומים, ובכך לעזור לילדים לשפר את יכולות הלמידה והזיכרון שלהם. ניתן גם לספק לילדים כמה משחקים ותרגילים לאימון מוח כדי לאתגר ולהפעיל את החשיבה שלהם, לעורר את הפוטנציאל של אקסוזומים ולמלא תפקיד טוב יותר. ניתן לראות שעלינו לשפר את הזיכרון, ו-Cistanche יכולה לשפר משמעותית את הזיכרון מכיוון ש-Cistanche הוא חומר רפואי סיני מסורתי עם השפעות ייחודיות רבות, אחת מהן היא שיפור הזיכרון. היעילות של Cistanche מגיעה מהמרכיבים הפעילים השונים שהוא מכיל, כולל חומצה טאנית, פוליסכרידים, גליקוזידים פלבנואידים וכו'. מרכיבים אלו יכולים לקדם את בריאות המוח בדרכים רבות.

לחץ על Know כדי לשפר את הזיכרון לטווח קצר

יכולת ייחודית זו מעצימה אותם לווסת את הפיזיולוגיה של תאי המקבל. במוח, אקסוזומים ממלאים תפקיד במחלות נוירודגנרטיביות כמו מחלת אלצהיימר מחלת פרקינסון, וטרשת צדדית אמיוטרופית.

תַקצִיר:

אקסוזומים ממקור אנדוזומלי הם סוג אחד של שלפוחיות חוץ תאיות החשובות בתקשורת בין תאית. אקסוזומים משתחררים על ידי כל התאים בגופנו ולמטען שלהם המורכב משומנים, חלבונים וחומצות גרעין יש טביעת רגל המשקפת את מקורם ההורי.

למטען האקסוזומלי יש את הכוח לווסת את הפיזיולוגיה של התאים המקבלים בקרבת התאים המשתחררים או תאים במרחק. רתימת הפוטנציאל של אקסוזומים מסתמכת על הטוהר של הכנת האקסוזומים.

לפיכך, פותחו שיטות רבות לבידוד ואנו מספקים סיכום תמציתי של מספר שיטות. למרות ההסתגרות שנכפה על ידי מחסום הדם-מוח, תאים ב-CNS אינם חסינים מפני השפעות חודרניות אקזומליות. הן נוירונים והן גליארליזה משחררים אקסוזומים, לעתים קרובות באופן תלוי פעילות.

ניתן תיאור קצר של אקסוזומים המשתחררים על ידי תאים שונים במוח ותפקידם בשמירה על הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. סימן ההיכר של מספר מחלות נוירודגנרטיביות הוא הצטברות של אגרגטים חלבונים. מחקרים עדכניים מרמזים על התפקיד המתקשר הבין-תאי של האקסוזומים בהתפשטות של חלבונים מקופלים שגויים ואומרים את התפשטות הפתולוגיה.

בסקירה זו, אנו דנים בתרומות הפוטנציאליות של אקסוזומים בהתקדמות מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון וטרשת צדדית אמיוטרופית.

הבנת התרומות של אקסוזומים בפתוגנזה של ניוון עצבי פותחת את השדה לשימוש באקסוזומים כסוכנים טיפוליים להעברת תרופות למוח, שכן אקסוזומים אכן חוצים את מחסום הדם-מוח.

מילות מפתח: אקסוזומים; נוירונים; תאי גליה; מערכת העצבים המרכזית (CNS); מחלות נוירודגנרטיביות;מחלת אלצהיימר; מחלת פרקינסון; טרשת צדדית אמיוטרופית.

1. מבוא ופרספקטיבה היסטורית

תקשורת בין-תאית היא בעלת עניין רב להתפתחות עוברית, התחדשות/החלפת אפיתליה, גמטוגנזה ותחזוקה של הומאוסטזיס.

מספר מנגנונים של תקשורת בין תאים כמו אנדוציטוזיס/אקסוציטוזיס ובולעות ציטופלזמה בולטות זוהו באמצעות מחקרים אולטרה-סטרוקטורליים וביוכימיים [1-3]. שחקן נוסף, שלפוחיות חוץ-תאיות, זוהה אך תפקידם בתקשורת בין-תאית לא הוערך מיד [4].

שלפוחיות חוץ-תאיות התגלו באופן מתמיד במהלך חקירה על שחרור של אנזימים הקשורים לממברנה בפלזמה, אקטו-ATPase ו-ecto-50-נוקלאוטידאז למדיום תרבית תאים. בשנת 1981, עמיתים לעבודה של Tramsand תרבו שורות תאים נורמליות ונאופלסטיות ממקור עכבר ואדם במדיום נטול נסיוב, משום שלסרום היה ידוע כבעל פעילות קטליטית של ATPase ו-50-נוקלאוטידאז.

לאחר הסרת תאים צפים ופסולת, המדיום המותנה עבר צנטריפוגה במהירות של 310,000×g למשך 90 דקות ברוטור Spinco Ti-70 והכדורים נבדקו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים. התגלו שתי אוכלוסיות של שלפוחיות עטיפות קרום תאיים, אחת בקוטר ממוצע בין 500 ל-1000 ננומטר ואוכלוסיה שנייה, קטנה יותר בקוטר של 40 ננומטר בערך.

שלפוחיות אלו, שתוארו בתחילה כ"שלפוחיות מגולפות" על ידי המחברים, הכילו הן פעילות אנזימטית של 50-50-נוקלאוטידאז והן ATPase. בנוסף, השלפוחיות המגולפות הכילו RNA ופוספוליפידים שהיו שונים מתאי האב וממברנת פלזמה האב, בהתאמה.

דגירה של שלפוחיות מגולפות מתאי גליומה C6 עם תאי נוירובלסטומה מסומנים מראש 32P עוררה דה-פוספורילציה של חלבוני נוירובלסטומה עם שחרור נלווה של זרחן חופשי מסומן רדיואקטיבי (32P).

נתונים אלה קבעו שהשלפוחיות המנופחות לא היו רק נושאות של פסולת סלולרית (אנזימים) אלא היו להן תפקיד פיזיולוגי. טראם ועמיתיו טבעו את המונח אקסוזומים כדי לתאר את ה"שלפוחיות המקולפות" [5] (ראה מאמר סקירה מאת [6] להיסטוריה של שלפוחיות חוץ-תאיות לפני 1981). כמה שנים מאוחר יותר, שתי קבוצות מחקר חקרו באופן עצמאי את גורלו של קולטן טרנספרין ברטיקולוציטים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים [7-9].

רטיקולוציטים מתבגרים אינם דורשים טרנספרין ולכן הם מאבדים קולטני טרנספרין. שתי הקבוצות הבחינו שרטיקולוציטים בתרבית משחררים שלפוחיות קטנות בקוטר של ~50 ננומטר לחלל החוץ-תאי.

שלפוחיות קטנות אלו הכילו קולטני טרנספרין שלא התפרקו. בשנת 1987, ג'ונסטון ועמיתיו השתמשו במונח אקסוזומים כדי לתאר שלפוחיות קטנות המכילות קולטני טרנספרין [10]. לאחר השנים הראשונות הללו, הפוטנציאל של אקסוזומים התממש כשליחים בין-תאיים חדשים שיכולים לווסת את הפיזיולוגיה של תאי מטרה.

באופן מעניין, היצירה של אקסוזומים מתחילה עם אנדוציטוזיס (תהליך שזוהה בשנת 1883; נסקר על ידי [3]) בתאים ושחרור אקסוזום לחלל התוך תאי משתמש בתהליך של אקסוציטוזיס. מאז הגילוי הראשוני שלהם, אנו יודעים כעת שאקסוזומים הם תת-סוג של שלפוחיות תאיות. ממקור אנדוציטי עם טווח גדלים של 40-160 ננומטר בקוטר [11].

מחקרי טראסר הוכיחו כי מקרומולקולות עוברות אנדוציטוזה בדליקות מצופות זיפים (כלומר, מצופה קלתרין) או בורות על פני התא. פלישות אלה נפרדות בסופו של דבר מממברנת הפלזמה ומתגלות בציטופלזמה.

לאחר אובדן זיפים (כלומר, קלתרין), שלפוחיות מצופות אנדוציטוזיות הופכות חלקות ומתמזגות עם אנדוזומים מוקדמים לצורך מיחזור מהיר אל פני התא (מיחזור אנדוזומים באיור 1) [12] או לעבור התבגרות ליצירת אנדוזומים מאוחרים.

אנדוזומים מוקדמים ומאוחרים פועלים כ"מרכזי מיון" כדי לכוון את תוכנם כראוי: (i) להובלה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולגית (כלומר, אחזור אנדוזום ל-TGN) [13,14]; (ii) לליזוזומים לפירוק מקרומולקולות למוצרים פשוטים לשימוש חוזר בתוך התא [15,16]; ו/או (iii) למיחזור למשטח התאים באמצעות גופים רב שלפוחיתיים [17].

במהלך ההבשלה של אנדוזומים מוקדמים לתוך האנדוזומים, קרום האנדוזום הפנימי עובר אינוואגינציה, וכתוצאה מכך היווצרות שלפוחיות תוך-לומינליות (המוגדרות כעת כאקסוזומים). מקרומולקולות ספציפיות כגון חלבונים ציטוסוליים, חומצות גרעין ושומנים ממוינים לאקסוזומים מתפתחים.

אנדוזומים מאוחרים עמוסים באקסוזומים מזוהים כגופים רב שלפוחיתיים הנודדים לכיוון קרום הפלזמה. לאחר היתוך עם קרום הפלזמה, גופים מרובים משחררים אקסוזומים לחלל החוץ-תאי באמצעות תהליך האקסוציטוזיס (איור 1) [18,19]. תת-קבוצה גדולה של חלבונים שמגוייסים ברצף ממלאות גורם מכריע בתהליך של אנדוציטוזיס לאנדוזומים מוקדמים, הבשלת אנדוזום ל-lateendosomes וגורלם התוך-תאי לאחר מכן (נבדק על ידי [17,18,20]).

חשיבותם של חלבונים אלה מודגשת על ידי אובדן ו/או מוטציות הגורמות למחלות שונות. לדוגמה, חלבוני Strumpellin ו-SWIP הם חלק מקומפלקס ה-WASH המשתתף בפילמור אקטין, כמו גם בביקוע ובמיון האנדוזום. מוטציות בגן סטרומפלין גורמות לפרפלגיה ספסטית תורשתית, המאופיינת על ידי ניוון של נוירונים מוטוריים [21].

מוטציה נקודתית אחת (Pro1019Arg) בחלבון SWIP מערערת את קומפלקס ה-WASH. קומפלקס ה-WASH המעורער מעכב את הסחר האנדוליזומלי, וגורם לגיבוש של אנדוזומים. תעבורה אנדוזומלית לקויה משפיעה על הקוגניציה ועל תפקוד מוטורינוירונים, כאשר תסמינים מתוארים כפיגור שכלי לא תסמונת [22,23].

בציטופלזמה, האקסוזומים מקורם באנדוזומים המשתמשים במתחמי המיון האנדוזומליים הדרושים להובלה (ESCRT), הידוע גם כמנגנון תלוי ESCRT של ביוגנזה של אקסוזום (נסקרה על ידי [18,20]).

שתי קבוצות דיווחו באופן עצמאי על ביוגנזה של אקסוזומים בתיווך שומנים, מנגנון בלתי תלוי ESCRT. שני ליפידים שזוהו במחקרים אלה היו bis(monoacylglycero)phosphate/lysobisphos phatidic acid(BMP/LBPA) ו-ceramide [29,30].

Rab31 הוא מנגנון נוסף שאינו תלוי ב-ESCRT לביוגנזה של אקסוזום בציטופלזמה. הפעלה של Rab31 מגרה את היווצרות שלפוחיות תוך-לומינליות [31]. ישנו מנגנון נוסף שכרגע לא נמצא בדיון ולא נחקר.

מנגנון זה מבוסס על תצפיות אולטרה-סטרוקטורליות שנעשו בשנות ה-50 המאוחרות עד שנות ה-70 של המאה ה-20, שהראו שגרעיני תאים יכולים להיות אתר למקורם של גופים מרובי-שלפוחית ​​עמוסים בשלפוחיות קטנות. שלפוחיות קטנות שתוארו במחקרים אלו היו אולי אקסוזומים אך המונח אקסוזום לא נטבע באותה תקופה. קילרסקי וג'אסינסקי צפו בתהליך שנקרא סתימות גרעיניות או שחול גרעיני בתאי שלפוחית ​​השחייה של דג הפרץ, Perca fluviatilis L. (איור 2a) [24] עם תוכן דומה ל-nucleolarkaryoplasm [32].

מחברים אלה ציינו כי ניתן לעורר סתימות גרעיניות על ידי הסרת גז משלפוחית ​​השחייה של דגי המוט [24]. נראה כי תהליך הבלבול הגרעיני ראוי כאתר המקור של אקסוזומים המועשרים בחומצות גרעין ו/אוריבונוקלאופרוטאין.

כדוריות גרעיניות מולאו בשלפוחיות קטנות שנוצרו מקיפולים בודדים של הממברנה הפנימית של הבלבולים הגרעיניים (איור 2b), תהליך הדומה להיווצרות שלפוחיות תוך-לומינליות באנדוזומים. נקודות גרעיניות מלאות ב'שלפוחיות קטנות' שהופרדו בסופו של דבר מהגרעינים והפכו לחלק מהציטופלזמה (איור 2c).

קילרסקי וג'אסינסקי התייחסו לבלבולים גרעיניים כאל גופים רב שלפוחיתיים בכתב היד שלהם בגלל היעדר מינוח טוב יותר. בשוגג, ייתכן שהכותבים הללו צדקו שכן מחקרים שלאחר מכן דיווחו על נוכחות של גופים רב שלפוחיתיים בגרעיני תאים [33]. לגרעיניות המלאות בשלפוחיות קטנות יש מורפולוגיה דומה לגופים רב שלפוחיתיים שמקורם באנדוזומים בציטופלזמה (איורים 1 ו-2).

בגלל הדמיון של גופים גרעיניים רב שלפוחיתיים עם נוקלאוקפסיד ויראלי, החוקרים מיקדו את תשומת לבם בווירולוגיה ותופעת הבלבול הגרעיני והתפקוד הסלולרי שלו נותרו לא נחקרו [34].

ללא קשר לאופן הביוגנזיס, האקסוזומים מורכבים משכבה דו-שכבתית של שומנים ומכילים תוכן מקרומולקולרי המורכב משומנים, חלבונים וחומצות גרעין.

חלק מהמקרומולקולות משותפות לאקסוזומים שמקורם בכל התאים ומכאן מסווגות כסמני אקסוזום ומשמשות ככלי אישור להבדיל בין אקסוזומים לבין שלפוחיות חוץ-תאיות אחרות. מקרומולקולות ייחודיות הקיימות ב-exosomesoften משקפות את המקור ההורי שלהן, ולכן צפויות להיות מוגדרות כסמנים ביולוגיים.

כל התאים משחררים אקסוזומים לחלל החוץ תאי. מהחלל החוץ-תאי, אקסוזומים מוצאים את דרכם לתוך נוזלים ביולוגיים שונים ומגיעים לתאים באופן מקומי ובמרחק. תאים בתרבית במבחנה משחררים את האקסוזומים שלהם לאמצעי תרבות. שחרור מתמשך של אקסוזומים לחלל החוץ-תאי הופך את מצע התרבות והנוזלים הביולוגיים למקור עשיר לבידוד אקסוזומים.

אקסוזומים מכילים כמות ניכרת של RNA מקודדים ולא מקודדים, שברי DNA גנומי דו-גדילי ו-DNA מיטוכונדריאלי. חשמליות ועמיתים היו הראשונים לתאר את נוכחותו של RNA ב"שלפוחיות מגולפות", תערובת של אקסוזומים ומיקרו שלפוחיות.

הם קבעו ש"שלפוחיות או אקסוזומים מגולפים" מכילים 5% RNA [5]. Valadi ועמיתיו היו הראשונים לנתח באופן שיטתי אינקסוזומים ארוזים של RNAs. ה-RNA האקסוזומלי כללו mRNAs ומיקרו-RNA (miRs) הניתנים לתרגום [35].

MicroRNAs הם מחלקה של RNAs שאינם מקודדים (ncRNAs). הם בערך 22 נוקלאוטידים באורך ומווסתים את ביטוי הגנים ברמה שלאחר התעתוק על ידי קישור ל30-אזורים לא מתורגמים של RNA שליח היעד שלהם [36]. מעניין לציין שכמה מירנאים המועשרים באקסוזומים אינם מזוהים בתאי האב, דבר המצביע על מערכת מיון/אריזה סלקטיבית של RNA במהלך הביוגנזה של אקסוזומים [35,37].

בניגוד לתאים, אקסוזומים מכילים מעט או ללא RNA ריבוזמלי אך מכילים שברי tRNA [38]. מיון של RNA לאקסוזומים תלוי ב-(1) חלבון הקשור להשתקה המושרה על ידי RNA (RISC), (2) מוטיבים של רצף RNA וחלבוני מנחים, (3) תוספות נוקלאוטידים בקצה ה-30 של ה-miRNA, (4) זמינות תאית של מירנאים, וכן (5) סרמיד [39,40].

אנו מאמינים שבלבול גרעיני הוא תהליך תאי נוסף המאפשר מיון דיפרנציאלי של RNA, קומפלקסים של חלבון RNA ו-DNA גנומי לאקסוזומים. ישנן מספר סיבות לנקודת מבט זו: (1) התוכן של 'שלפוחיות תוך-לומינליות' היה דומה לקריופלזמה גרעינית [32]. 'שלפוחיות' בגופים גרעיניים מולטיביים-סיקולריים (MVB II) הועשרו ב-RNA, חלבונים חומציים ובסיסיים, ולכן המחברים נחשבו ' שלפוחיות תוך-לומינליות 'כאתר של סינתזת RNA בנוסף לטונוקלאולוס [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10 kbin exosomes [43-47].

אגב, DNA גנומי זוהה רק באקסוזומים שמקורם בשורות תאים סרטניים ולא בתאים נורמליים [47]. לתאי סרטן יש כרומטין לא תקין עקב סידור מחדש/טרנסלוקציה של הכרומטין ואולי פלואידיה [48] שעלול לגרום לפיצול DNA גנומי בגרעינים של תאים סרטניים. ניתן לשלב בקלות שברי DNA אלה ב-MVB מסוג II (ואקסוזומים) המתפתחים בגרעינים. (3) האופן של ביוגנזה של 'שלפוחית ​​קטנה' בפלסטים גרעיניים שתוארו על ידי קילרסקי וג'סינסקי [24] דומה להיווצרות שלפוחיות תוך-לומינליות באנדוזומים מאוחרים בציטופלזמה.

אנו מאמינים מאוד שהנוכחות של DNA גנומי באקסוזומים היא פתולוגית ומכאן שנוכחותו באקסוזומים יכולה לשמש ככלי אבחון להתפתחות של תאים לא תקינים (או סרטניים) בגוף. (4) העלייה התלויה בפעילות במספר האקסוזומים המשתחררים על ידי תאים [49] דומה לתאי גז שהראו כמות מוגברת של פצעונים גרעיניים עם הסרת גז משלפוחית ​​השחייה של דגי מושב [24].

לאחרונה, חלבוני מיטוכונדריה ודנ"א זוהו באקסוזומים בפלזמה של חלק מחולי סרטן, ונוכחותם קשורה לאגרסיביות של סרטן [50,51].

פירוק מיטוכונדריאלי נצפה לעתים קרובות בתאים מתנוונים [52,53]. קריסטלים מיטוכונדריאליים המשתחררים מהמיטוכונדריה המתנוונים עשויים להיות מופנמים על ידי גופים רב שלפוחיתיים ובסופו של דבר הם אינקסוזומים ארוזים.

תפיסה זו נתמכת על ידי תמונות אולטרה-סטרוקטורליות של תאים לימפובלסטואידים אנושיים ולומן האציני של ערמונית הבבון שהיו להם "מיקרו-שלפוחיות" (או אקזוזומים) שנבעו מהתמוטטות הקריסטות של המיטוכונדריה [54].

בהתבסס על הדיון לעיל ועל ראיות ניסויות תומכות, אנו מציעים שהטבע ההטרוגני של אקסוזומים מקורו בביוגנזה של גופים מרובי שלפוחית ​​ואקסוסומס הקשורים במיקומים תת-תאיים שונים ולא לגמרי בציטופלזמה לפי האמונה הנוכחית שלנו. ההצעה שלנו יכולה להסביר את ההטרוגניות של אקסוזומים כמו גם חוסר התאמה בין חישובים תיאורטיים ונתונים ניסיוניים על מספר RNAs או מולקולות חלבון קטנות הכלולים בתוך אקסוזום אחד שטוהר מסרום [55].

בהתבסס על חישובים תיאורטיים באמצעות גודל אקסוזום ממוצע, Li ועמיתיו חזו שכל אקסוזום יכיל כ-70-25,000 מולקולות RNA או חלבון קטנות.

עם זאת, הנתונים הניסויים שלהם הראו נוכחות של מולקולת RNA אחת לכל אקזוזום מטוהר מסורום [55]. ההשערה שלנו מחייבת חקירה נוספת של צלעות גרעיניות, גופים גרעיניים מולטיביים-סיקולריים, והביוגנזה של אקזוומים המכילים RNA/ריבונוקלאופרוטאין, גופים רב-שוליתיים גרעיניים. שומנים הם חלק חשוב ממברנות אקסוזום ומפוזרים בצורה א-סימטרית בין שני עלים האקסוזומים. הרכב השומנים שונה בין קרום תא האב לממברנת האקסוזום.

באופן כללי, ליפידים המועשרים ב-exosomemembranes הם ספינגומיאלין, סרמיד, כולסטרול ומיקרו-דומיינים שומנים עשירים בכולסטרול, גנגליוסיד GM3, שומנים נטולי רוויים ופוספטידילסרין [56-58]. חלבונים אקזומליים מורכבים מאלה הנפוצים כמו גם לרוב האקסוזומים הייחודיים. לתא אב מסוים.

תכולת החלבון של כל האקסוזומים מועשרת בדרך כלל לחלבוני מיקוד והיתוך כגון טטרספאנינים, אינטגרינים, צ'פרונפרוטאינים, למשל חלבוני הלם חום (Hsp60, Hsp70 ו-Hsp90), חלבוני המסחר הקטנים בממברנות HSP, חלבוני Rab, ARF GTPases, אנקסינים, ו חלבונים המעורבים ביצירת גופים רב שלפוחיתיים כגון ALIX ו-TSG101 [59].

מחקרים עדכניים יותר מצביעים על נוכחות של חלבונים קושרי RNA היוצרים קומפלקסים של RNA-חלבון באקסוזומים [38]. מספר תהליכים תאיים המבטיחים העלאת חלבונים ל-exosomesare (1) מנגנוני ESCRT לחלבונים עם שינויים מסוימים לאחר תרגום כגון Ubiquitination, Wnt-stimulated arginine methylation, oxidation, phosphorylation, glycosylation ו-citrullination; (2) אוטופגיה מתווכת צ'פרונים (CMA) המסתמכת על האינטראקציה בין חלבון מקורב של 71 kDa של הלם חום (HSC70) לבין חלבונים עם KFERQmotif.

לאחר קשירת HSC70 לחלבונים עם מוטיב KFERQ, החלבונים מכוונים לגופים רב שלפוחיתיים. אוטופגיה בתיווך צ'פרונים פועלת בדרך כלל לפירוק חלבונים בליזוזומים. נתונים עדכניים יותר מצביעים על כך ש-CMA ממלא תפקיד בשחרור אקסוזומים ובהפצה מתווכת של אגרגטים חלבונים במחלות ניווניות מסוימות [60-63].

חלה עלייה אקספוננציאלית במחקר האקסוזומים מאז שנות ה-90 ונוצרו נתונים רבים על מטען אקסוזום. מסדי נתונים נוצרו כדי לספק קומפנדיום של מטען אקזומלי לפני שיהיה קשה מדי לנהל מערכי נתונים גדולים.

יכולת החזרה של הנתונים שפורסמו על אקסוזומים היא סיבה נוספת מכיוון שרוב המעבדות משתמשות בווריאציות של שיטות שונות שפותחו כדי לבודד אקסוזומים. לדוגמה, Vesiclepedia הוא אוסף שנערך באופן ידני של מטען מולקולרי (ליפידים, RNA וחלבון) שזוהה במחלקות שונות של שלפוחיות חוץ-תאיות [64]. Vesiclepedia מספקת משאב רב ערך לחוקרים.

מסד הנתונים Vesiclepedia זמין לציבור ומאפשר למשתמשים לבצע שאילתות ולהוריד נתוני מטען אקסוזומיים על סמך קריטריוני חיפוש שהוזנו על ידי המשתמש. EV pedia,Exocarta, ExoRbase ו-EV miRNA הם מסדי נתונים נוספים שמקטלגים חלבונים אקססומלים ו-RNA [64].

מאגרי המידע מונעים על ידי הערות קהילתיות. הנתונים שנאספו במסדי נתונים אלה מתקבלים על ידי בידוד אקסוזומים באמצעות מגוון טכניקות הפרדה שונות שאינן כלולות במסד הנתונים.

תכולת המטען האקסוזומלית עשויה להיות שונה בהתאם לשיטת הבידוד שבה נעשה שימוש, מה שגורם למידת אי בהירות בתוצאות המדווחות. כדי לשפר את יכולת השחזור והשקיפות הניסיונית, פותחה ערכת כלים של בסיס ידע EV-TRACK בקוד פתוח. EV-TRACK מקיף נתונים על הכנת אקסוזום ואפיון אקסוזום [65].

תכונה מרכזית של EV-TRACK היא EV-METRIC שמציגה את הדיווח של פרמטרים ניסויים כאחוז של רכיבים שהתממשו מתוך רשימה של תשעה [66]. רכיבים אלה הוחלטו על ידי קונסורציום EVTRACK ונחשבו הכרחיים לפירוש נתונים חד משמעי והפקה של נתונים ניסויים. לפיכך, EV-METRIC תוכנן לסייע לחוקרים ולצופים לספק סקירה מקיפה של הנתונים.

2. שיטות נוכחיות לבידוד אקסוזום

אקסוזומים מהווים משאב עשיר לגילוי סמנים ביולוגיים ולאסטרטגיות טיפוליות חדשות, כולל רפואה רגנרטיבית. העיקר להצלחת המטרות הללו הוא הבידוד של אקסוזומים טהורים באמצעות שיטה הניתנת לשחזור.

בידוד של אקזוזומים מוכשרים מבחינה תפקודית הוא קריטי במיוחד עבור יישומים טיפוליים פוטנציאליים. אקסוזומים טוהרו מנוזלים ביולוגיים שונים כמו דם, פלזמה, נוזל מוחי, רוק, שתן וחלב. לכל נוזל ביולוגי יש מאפיינים פיסיקליים וכימיים שונים שיש לקחת בחשבון לפני בידוד אקסוזום.

במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך באמצעי זהירות ספציפיים לבידוד אקסוזום. היישום הסופי של אקסוזומים מטוהרים הוא גורם נוסף שמשפיע על השיטה של ​​בידוד אקסוזומים.

עד כה פותחו מספר שיטות בידוד של אקסוזום וחלקן מבוססות על מאפיינים אקסוזומיים כגון גודלם, צפיפותם, מטען פני השטח וחלבונים הקשורים למשטח האקסוזום (איור 3) [67].

חלק משיטות הבידוד האקסוזום המועסקות כיום מופיעות בטבלה 1. רובן אינן שיטות עצמאיות ודורשות שלבי עיבוד קודמים לאחר הדגימה. שיטות בולטות נדון בקצרה להלן.

איור 3. שיטות נפוצות לבידוד אקסוזום ויישומין במורד הזרם. מספר שיטות שפותחו עד כה לבידוד אקסוזום מבוססות על צפיפות הציפה שלהן, סכימה 1, 13 ו-1.19 גרם/מ"ל, שיטת האולטרה-צנטריפוגה (UC) שוכללה עוד יותר כדי לבודד תכשירים טהורים של אקסוזומים בהתבסס על צפיפות הציפה שלהם על ידי אולטרה-צנטריפוגה איזופיקנית על-סוכרוז או שיפוע צפיפות יודיקסנול (DG).

כדי להסיר תכולת חלבון גבוהה בפרוטאינוריה, שולבה שיטת האולטרה-צנטריפוגה עם כרומטוגרפיה של אי הכללה בגודל (SEC). מגבלות זמן הקשורות לשיטת האולטרה-צנטריפוגה הביאו לפיתוח שיטת הסינון (UF).

העברת דגימות מדוללות כגון מצע תרבית ושתן דרך רכז ננו או מיקרו-ממברנה אפשרה טיהור אקסוזום. סתימת ממברנה והתאוששות לקויה של חלבון אקזומלי הפכו את השיטה הזו ללא פופולרית עבור יישומים במורד הזרם כגון בידוד RNA ויישומים בעלי תפוקה גבוהה.

שיטה נוספת שפותחה על מנת לבודד אקסוזומים מדיאליזה ביולוגית מדוללת מאוד בדיאליזה הידרוסטטית סינון (HFD *) בשילוב עם צנטריפוגה. בשיטת HFD, הדגימה עוברת דיאליזה דרך ממברנת דיאליזה עם גזירה של 1000 קילו-דאה במשקל מולקולרי בלחץ הידרוסטטי, מה שמאפשר להסיר מקרומולקולות לא רצויות מהדגימה ולחלץ אקסוזומים באמצעות צנטריפוגה.

שיטת משקעים אקסוזום המבוססת על מסיסות או פיזור וצבירה פותחה לעיבוד מספר דגימות בו זמנית. ערכות מסחריות לטיהור אקסוזום מבוססות על אסטרטגיה זו.

בשיטה זו מערבבים אוראסציטים בשתן עם פוליאתילן גליקול (PEG) 6000 או בשילוב עם פרוטמין (בתוספת PEG35,000) ומודגרים ללילה או שעה אחת על קרח.

התערובת העכורה שנוצרה היא בצנטריפוגה כדי לשחזר אקזוזומים המשמשים לניתוחי RNA וחלבונים במורד הזרם. ריאגנטים אחרים המשמשים עבור משקעים אקסוזומים הם (1) 0.1M נתרן אצטט pH 4.75 (שיטת המלחה) (NaAc), (2) פי 4-נפח של אצטון קר (-20 ◦C) ( PRotein Organic Solvent Precipitation ובקיצור PROSPR), (3) ותערובת של PEG ותמיסת דקסטרן (עד 1.5%) (שיטה דו-פאזית המאפשרת הפרדה של חלבונים מאקסוזומים).

זיהוי של חלבוני פני השטח האקסוזומליים הוביל לפיתוח שיטות מבוססות לכידת זיקה חיסונית תוך שימוש בנוגדנים לחלבוני פני השטח אקסוזומיים כגון Tim4, annexin, EpCAM, חלבון משטח אקסוזום נפוץ, CD63 וחלבוני הלם חום (אינטראקציית זיקה). זיקה ללקטין (הנקשר לגליקופרוטאינים על פני האקסוזומים) והפרין (הנקשר לפרוטאוגליקנים של הפראן סולפט על פני השטח של האקסוזום) נוצלה לפיתוח שיטות בידוד אקזוזומיות.

מספר פלטפורמות כגון חרוזים מגנטיים, מיקרו-קצות סיליקה מונוליטיים נקבוביים מאוד, משטח של לוחות פלסטיק, מסנני תאית, מסנני זיקה לממברנה, חומר ספוג אגרוז, והתקנים מיקרו-נוזליים שימשו לשיטות טיהור אקסוזומים מבוססות זיקה, ויש להם יתרונות שונים לשימושם ב אבחון, פרוגנוסטי, כמו מערכות אספקת תרופות, וזיהוי וניתוח מטען פורקסוזומלי.

מותאם באישור מ-Konoshenko MY, Lekchnov EA,Vlassov AV, Laktionov PP. בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות: מתודולוגיות כלליות ומגמות עדכניות. Biomed Res Int. 30 בינואר 2018; 2018:8545347. doi:10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; זכויות יוצרים © 2022 מריה יו. קונושנקו וחב'.

זהו מאמר בגישה פתוחה המופץ תחת רישיון הייחוס של Creative Commons, המתיר שימוש, הפצה והפקה ללא הגבלה בכל מדיום, בתנאי שהיצירה המקורית מצוטטת כהלכה [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com