תפקידו של טיפול מיטוכונדריאלי לפציעה איסכמית-רפרפוזיה ופגיעה חריפה בכליות

edmund.chen@wecistanche.com

תַקצִיר

חַדפגיעה בכליות (AKI) היא הפרעה קלינית נפוצה הקשורה לירידה בתפקוד כליותבגלל עלבונות איסכמיים ונפרוטוקסיים. הפתופיזיולוגיה של AKI כוללת מנגנונים תאיים מרובים, כגוןכִּליָהתפקוד לקוי של תאים פרנכימליים (אפיתל ואנדותל) וחדירת תאי חיסון. פגיעה מיטוכונדריאלית הגורמת לדלדול ATP ומעוררת אפופטוזיס ונמק היא לב ליבה של פגיעת איסכמיה חוזרת (IRI). אסטרטגיות פרמקולוגיות (SS-31 או MitoQ), תאיות (תאים דנדריטים או תאי גזע מזנכימליים), או גנטיות השומרות במישרין או בעקיפין את השלמות והתפקוד של המיטוכונדריה, הוכחו כמפחיתות AKI מקושר IRI במודלים פרה-קליניים. מעניין לציין כי לאחרונה הוכח כי מיטוכונדריה מבודדות נקלטות על ידי תאי יונקים שונים וכתוצאה מכך שילוב של מיטוכונדריה מושתלות ברשת המיטוכונדריה האנדוגנית של תאים נמענים ותורם להגנה מפני פגיעה איסכמית במודלים פרה-קליניים שונים של איסכמיה, כולל הלב, הכבד והלב.כליות. הסקירה המיני מסכמת את האסטרטגיות הטיפוליות הזמינות הנוכחיות המשתפרותתפקוד כליותעל ידי מיקוד לבריאות המיטוכונדריה.

מילות מפתח:פגיעה חריפה בכליות; מיטוכונדריה; פציעת רעפרפוזיה של איסכמיה; פגיעה בכליות; תפקוד כליות

מבוא

כִּליָהפציעת איסכמיה-רפרפוזיה (IRI) היא הגורם העיקרי לאקוטיפגיעה בכליות(AKI), אשר בנוסףהשתלת כליהמתרחשת במסגרות קליניות שונות אחרות כגון ניתוחי לב, אלח דם והלם. הפתופיזיולוגיה של IRI מורכבת וכוללת היבטים שונים, כולל פגיעה היפוקסית שגורמת לייצור של מיני חמצן תגובתיים, המעוררת מחזור של תרומת תאים מסימפוזיון AKI ו-CRRT 2021 בכנס הבינלאומי ה-26 בנושא התקדמות בטיפול קריטי בנפרולוגיה, A Virtual/ אירוע היברידי מסן דייגו, קליפורניה, ארה"ב, 28 בפברואר עד 5 במרץ 2021. סימפוזיון זה נתמך בחלקו על ידי אוניברסיטת אלבמה במימון NIDDK בברמינגהם-אוניברסיטת קליפורניה מרכז סן דייגו אובריאן לאקוטיפגיעה בכליותמחקר (P30DK079337). מוות ודלקת בין תאי אפיתל ותאי חיסון. בנוסף לתפקידיהם התפקודיים כיצרני אנרגיה מטבולית, מיטוכונדריה יכולה גם לווסת את מוות התא. IRI כרוך במפל מורכב של אירועים ברמת המיטוכונדריה הכולל אובדן מהיר של אנרגיה, ירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואובדן דימום יוני ומגיע לשיאו בייצור ROS ומוות תאים. תצפיות אלו מצביעות על כך שהמיטוכונדריה הן אברונים קריטיים שעוברים שינויים פתופיזיולוגיים גדולים במהלך IRI. חשוב לציין, למיטוכונדריה יש תפקיד קריטי לא רק בתחילת והתקדמות של פציעה איסכמית, אלא גם מעורבות בהחלמה ובתהליכים התורמים להתקדמות למחלה כרונית.מחלת כליות.אסטרטגיות טיפוליות טיפוליות ממוקדות למיטוכונדריה (SS-31 [1] או MitoQ), תאיות (תאי סטרומה מזנכימליים [2] או תאים דנדריטים שמקורם במח עצם [3]), ולאחרונה השתלת מיטוכונדריה [4] נבדק כדי לשפר את בריאות המיטוכונדריה כדי להפחית בסופו של דבר חוסר תפקוד במודלים פרה-קליניים שלכִּליָהIRI. למרות שטיפולים תרופתיים ותאי אלו הראו כמה יתרונות בשימורבריאות הכליות, התקדמותם לשימוש בסביבה קלינית מוגבלת עקב זמינות ביולוגית והשפעות שליליות מחוץ למטרה. בנוסף, מחקרים אלה חסרים מודל בעל חיים גדול יותר (חזירים) כדי להדגים עוד יותר את השימוש הפוטנציאלי שלהם, במיוחד אם מסירה ישירה לכליותנחוץ. שימוש טיפולי בהשתלת מיטוכונדריה למניעת פציעה הוכח במודלים פרה-קליניים שונים של פגיעה איסכמית במספר איברים כולל הלב, הכבד,כִּליָה, וריאות. אסטרטגיות המינון והטיפול של מחקרים אלה מסוכמים בסקירה הנוכחית.

CISTANCHE ישפר אי ספיקת כליות/כליות

מעורבות של מיטוכונדריה ב-IRI של הכליותבמצבים בריאים נורמליים, הובלת האלקטרונים לאורך שרשרת תעבורת האלקטרונים (ETC) מחוברת לזרחון חמצוני לייצור ATP. מים הם תוצר הלוואי האולטימטיבי של החמצן הנצרך ב-ETC שיוצר אלקטרונים בזמן שהוא עובר דרך קומפלקס I לקומפלקס IV. הכמויות הקטנות של ROS המיוצרות ב-ETC נחוצות כדי לשמור על מצב החיזור של התאים והינה חיונית לתפקודם של אנזימים שונים. באיסכמיה, ישנה ירידה בפעילות בקומפלקסים שונים שגורמת לדליפת אלקטרונים ומפחיתה את רדיקלי הסופראוקסיד היוצרים חמצן כאשר חמצן זמין לאחר פרפוזיה חוזרת, ובסופו של דבר מפחיתה את כמות ה-ATP הזמינה. בתוך הכליות, לצינוריות הפרוקסימליות (PTs) יש את הצפיפות הגבוהה ביותר של מיטוכונדריה, ותאי אפיתל PT תלויים מאוד בזרחן חמצוני לביצוע הובלת נוזלים ומומסים רגילים. במהלך איסכמיה, בנוסף לתפקוד המיטוכונדריה המופחת, ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי מגלה מיטוכונדריה מקוטעת תוך 15 דקות מהפרפוזיה חוזרת, וכתוצאה מכך בסופו של דבר לנפיחות במיטוכונדריה ולשיבוש של קריסטלים ארוזים היטב [5, 6]. שינויים פתופיזיולוגיים אלו הקשורים ל-IRI מצביעים על כך שהמורפולוגיה והתפקוד של המיטוכונדריה מתואמים מאוד ויכולים להגיב במהירות ללחץ מטבולי ותאי. הפתוגנזה שלכִּליָהIRI כרוך באינטראקציות מורכבות מרובות ביניהןכִּליָהתאים פרנכימליים ותאי חיסון חודרים [7]. בתגובה לפגיעה כימית או לרעלים, השפלה של התפקודים התאיים יכולה להיגרם על ידי שחרור ROS ממיטוכונדריה פגומה. נזק מבני למיטוכונדריה מתרחש תוך דקות ספורות מהפרפוזיה חוזרת שמובילה לשחרור ציטוכרום c ולשחרור נוסף של DNA מיטוכונדריאלי שיכול לעורר עוד יותר אפופטוזיס [8]. בדגמי עכברים שלכִּליָהפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי של IRI, PT יורד במהירות, וכתוצאה מכך למיטוכונדריה מקוטעת קצרים יותר מאשר בעכברים המופעלים מדומה. כדי לצפות בשינויים המבניים הללו במיטוכונדריה PT, יצרנו עכברי כתב מיטוכונדריה ספציפיים ל-PT שישמשו ככלי להערכת מורפולוגיה של המיטוכונדריה במודלים שונים של עכברים של AKI. מעניין לציין כי ניתן להשתמש בעכברים אלה גם כדי להעריך את המיטוכונדריה המשוחררת לאחר פציעה בתאים שונים אחרים כולל הטחול, הכבד והשתן. לפיכך, זה מאפשר עוד להעריך כיצד שחרור ממוקד של מיטוכונדריה מהאיבר הפגוע עשוי להשפיע על פגיעה באיברים דיסטליים בשל יכולתו לפעול כדפוס מולקולרי הקשור לפגיעה במיטוכונדריה. עכברי PepcKCre (מתנה מד"ר וולקר האז, אוניברסיטת Vanderbilt) גדלו ל-Phamfl/fl (נרכשו ממעבדת ג'קסון) כדי לייצר את העכברים הטרנסגנים PepcKCrePhamfl/fl בעלי PT מיטוכונדריה שסומנו בתג ירוק ניאון. עכברים אלה שימשו לאיסכמיה מדומה או דו-צדדית של 26 דקות עם 24 שעות של רפרפוזיה. הדם נאסף בהרדמה מהסינוס הרטרו-אורביטלי, וקראטינין בפלזמה (mg/dL) נקבע באמצעות שיטה אנזימטית מפרוטוקול היצרן (Diazyme Laboratories, Poway, CA, ארה"ב), וחנקן אוריאה בדם (BUN) ומדידות קריאטינין בוצעו באמצעות QuantiChrom Urea Assay Kit (DIUR-100). בהשוואה לעכברים מדומה, IRI מביא לעלייה משמעותית בקריאטינין בפלזמה (איור 1a) וב-BUN (איור 1b). להיסטולוגיה,כליותנקבעו למשך לילה ב-10 אחוז פורמלין והוטמעו בפרפין.כליותהוכנו ל-H&E. לכימות של ציון פגיעה בצינורית (צינורית חריפה

נמק), החתכים הוערכו על ידי ספירת אחוז הצינוריות שהציגו נמק תאים, אובדן גבול המברשת, היווצרות גבס והתרחבות צינוריות באופן הבא: 0=נורמלי; 1 =<10%; 2="10–25%;" 3="26–50%;" 4="51–75%;"  and="" 5="">75 אחוז. חמישה עד 10 שדות מכל מדולה חיצונית הוערכו וניקוד בצורה עיוורת.כליותשל עכברי IRI היה נמק צינורי חריף מוגבר בהשוואה לעכברי דמה (איור 1c) ו-H&E מייצגים מ-sham ו-IRIכִּליָה(איור 1ד). בנוסף, שינויים במורפולוגיה של המיטוכונדריה בעכברי PepcKCrePhamfl/fl המוצגים במיטוכונדריה של עכברי דמה מיושרים באופן אחיד ב-PTs, בעוד שהמורפולוגיה של המיטוכונדריה מופרעת לאחר IRI (איור 1e). נוכחות אות המיטוכונדריה (ירוק) אושרה עוד כממוקמת בקטע ה-PT שלכִּליָהבעכברי PepcKCrePhamfl/fl על ידי תיוג עם CD13 כנגד גבול מברשת PT ו-CD31 (PECAM) עבור האנדותל (איור 1f).

טיפול מיטוכונדריאלי ו-IRIישנם מעט מחקרים עד כה במודלים פרה-קליניים שונים של IRI המוכיחים שהשתלת מיטוכונדריה יכולה לשמש כדרך טיפולית להקלה או לטפל בתפקוד לקוי של IRI. סקירה מקיפה של המודלים, המקורות, המינונים ומסלול הלידה של מיטוכונדריה מבודדות במודלים שונים מפורטים להלן.לֵבבסדרה של מחקרים, קבוצת McCully's הוכיחה שניתן לשפר משמעותית את IRI הלב על ידי השתלה של מיטוכונדריה מבודדות. בסך הכל, במודלים של IRI של הלב (חזירים וארנבות), הקבוצה שלהם מדגימה שהמיטוכונדריה המוזרקות נקלטות באופן ספציפי על ידי קרדיומיוציטים ותורמות לצריכת חמצן מוגברת, סינתזת פוספט באנרגיה גבוהה, ייצור ציטוקינים מופחת באופן כללי, אנרגטיות שריר הלב ומשמרות חיים תאים, ותפקוד לב מוגבר כללי לאחר אוטם. קבוצת McCully ב-2017 דיווחה על היישום הקליני הראשון של מיטוכונדריה טיפולית בחולים ילדים עם אזורים של אקינזיס שריר הלב או היפוקינזיס. ב-5 חולים אלו, מיטוכונדריה קיימא בודדו מחתיכה עצמית של 6 × 6- מ"מ של רקטוס בטן בריא והוזרקו במינון של 1 × 108 ± 1 × 105 עם 1 × 107 ± 1 × 104 /0.1 מ"ל לכל אתר [9]. ארבעה מתוך חמישה חולים עם השתלת מיטוכונדריה בודדת, אם כי במספר אתרים, שיפרו את תפקוד החדרים, וחולים אלה הוצאו בהצלחה מתמיכה מכנית חוץ גופית.

מָקוֹרמיטוכונדריה בודדו משריר (pectoralis major) על ידי פרוטוקול סטנדרטי שפותח על ידי קבוצת McCully שלוקח 30 דקות ללא כל שלבי צנטריפוגה דיפרנציאליים עבור כל המחקרים in vivo [10].

דֶגֶםIRI לב ארנב (30 דקות של איסכמיה עם 2 שעות עד 28 ימים של רפרפוזיה). מיטוכונדריה מבודדות (9.7 × 106 ± 1.7 × 106/מ"ל, 1.2 × 106/0.1 מ"ל ב-8 אתרים) הוזרקו בזמן החזרה [11]. IRI לב חזיר (25 דקות של איסכמיה עם 28 ימים של רפרפוזיה). מיטוכונדריה מבודדות (9.9 × 107 ± 1.4 × 107 / מ"ל, 1.3 × 107 / 0.1 מ"ל ב-8 אתרים) הוזרקו בזמן של פרפוזיה חוזרת [12]. כל המיטוכונדריה מוזרקת ישירות ללב באתרי האיסכמיה האזוריים.

כִּליָהבכִּליָהIRI, 2 מחקרים שפורסמו לאחרונה הדגימו במודלים של בעלי חיים קטנים וגדולים את השימוש הטיפולי במיטוכונדריה בריאים מבודדים. העבודה המשותפת שלנו עם הקבוצה של McCully השתמשה במודל חזירים גדול [4] וחולדות [13]. במודל החיות הגדול יותר, Doulamis et al. [4], הגיע למסקנה שהמיטוכונדריה המוזרקת הגנו באופן משמעותיכליותמפגיעה איסכמית עם שיפורתפקוד כליות, פחות נזק היסטולוגי, נמק קרישה נמוך יותר של ה-PTs, ומטהכִּליָהרמות של IL6 [4]. בחולדות, בעלי חיים שטופלו במיטוכונדריה היו בעלי קריאטין ו-BUN נמוכים משמעותית החל מ-12 שעות של רפרפוזיה ונשארו משמעותיים עד 72 שעות. מעניין, גם לבעלי חיים שטופלו ברכב וגם במיטוכונדריה היו רמות דומות של קריאטינין ו-BUN בנקודת הזמן של שבוע. בסך הכל, החולדות שטופלו במיטוכונדריה היו גבוהות יותר באופן משמעותיכִּליָהביטוי של Ki67, PCNA, aquaporin 1 (AQP1, PT marker) ורמות נמוכות יותר של Kim1, cystatine C ו-TUNEL [13]. שני קבוצת המחקרים סיכמו בכך שהזרקה ישירה של מיטוכונדריה בריאות מבודדת מגנה באופן משמעותי על הכליות מפני IRI ועשויה לסייע בתיקון על ידי הגדלת יכולת ההתרבות של אפיתל הפציעה.

CISTANCHE ישפר כאבי כליות/כליות

מָקוֹרחזירים, מיטוכונדריה בודדו משריר sternocleidomastoid [10]. חולדות, מיטוכונדריה בודדו משריר החזה הגדול [10].דֶגֶםחֲזִירכִּליָהIRI (60 דקות של איסכמיה עם 24 שעות של רפרפוזיה). מיטוכונדריה אוטולוגיות מבודדות (1 × 109 /6 מ"ל, יחיד ×1 או מרובה ×3) הוזרקו לעורקי בזמן של פרפוזיה חוזרת [4]. עכברושכִּליָהIRI (חד צדדי, ימינה-כִּליָהכריתת כליה ו-45 דקות של שמאל-כִּליָההיא כימיה עם עד שבוע של רפרפוזיה). מיטוכונדריה מבודדות (7.5 × 106/1 מ"ל, 0.4 מ"ל הוזרק) הוזרקו לתוךשֶׁל הַכְּלָיוֹתעורק בזמן רפרפוזיה [13].כָּבֵדבמחקר של Lin et al. [14], הוכח שחולדות שטופלו במיטוכונדריה טריות מבודדות 45 דקות לאחר IRI בכבד מוגנות באופן משמעותי בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב. לחולדות שטופלו במיטוכונדריה הייתה פחות פגיעה בכבד עם רמות ALT נמוכות יותר, פחות דימום גודש, נמק של הפטוציטים ופחות תאים חיוביים ל-TUNEL.מָקוֹרמיטוכונדריה מבודדת מכבד החולדות בשיטת צנטריפוגה דיפרנציאלית סטנדרטית.דֶגֶםIRI של כבד עכברוש (45 דקות של איסכמיה עם 4 שעות של רפרפוזיה). מיטוכונדריה מבודדות (7.7 × 106 ± 1.5 × 106 / מ"ל) הוזרקו באמצעות זריקה תוך טחול בזמן החזרה.ריאהבמחקר זה של Zhu et al. [15], המחבר השתמש במודל של יתר לחץ דם ריאתי היפוקסי של חולדה כדי להעריך את השימוש הטיפולי בהשתלת מיטוכונדריה. חולדות שטופלו במיטוכונדריה היו מופחתות של היפוקסיה כרונית שנגרמה לשיפוץ כלי דם ריאתי שהביא למניעת יתר לחץ דם ריאתי. בנוסף, המחקר הנוכחי גם הוכיח שהשתלת מיטוכונדריה יכולה לשמש גם לטיפול בחולדות שפיתחו היפוקסיה כרונית.מָקוֹרתאי שריר חלקים מעורקי ריאה וירך שהושתלו. השיטות המשמשות לבידוד מיטוכונדריה לא פורטו.דֶגֶםחולדות אוחסנו בתא היפוקסי (10 אחוז O2) במשך 8 חה יום במשך 4 שבועות. החולדות טופלו תוך ורידי במיטוכונדריה של 2.25 × 108 (כ-2 מיקרוגרם חלבון) כל יומיים במשך שבועיים, שבועיים או 4 שבועות לאחר תחילת המחקר

סיכוםהשימוש הפוטנציאלי במיטוכונדריה כאמצעי טיפול הוכח כמשפר את תוצאות המחלה במודלים פרה-קליניים שונים. שלא כמו אסטרטגיות טיפול תרופתיות ממוקדות במיטוכונדריה, מחקרים עדכניים המשתמשים במיטוכונדריה אקסוגנית לא דיווחו על תופעות לוואי שליליות. פה אחד, אחת המגבלות שהוכרו על ידי כל המחקרים הייתה שמיטוכונדריה אקסוגנית חייבת להיות מבודדת טרי, לשמור קרה ולנצל אותה תוך מספר שעות. השימוש במיטוכונדריה בריאים מבודדים כאמצעי טיפולי להשלמה ושיפור פונקציונלי ולהחלפת מיטוכונדריה פגומה הוא אופציה מעשית. מיטוכונדריות מסומנות ומוזרקות באמצעות זריקה מקומית או סיסטמית נקלטות על ידי סוגי תאים שונים. הכדאיות של המיטוכונדריה היא קריטית מכיוון שהמיטוכונדריה והמוצרים המיטוכונדריים (DNA, RNA, חלבון, ATP וקומפלקסים) לא ניתנים לקיימא או פגומים אינם מספקים כל הגנה [16]. המיטוכונדריות המוזרקות משפרות את האנרגטיקה של התאים המקבלים [11], מעוררות ביוגנזה של המיטוכונדריה (מפעילה Pgc1a, תצפיות שלא פורסמו ב-Bajwa), מגבירה את יכולת ההתרבות [13] ומפחיתה את הציטוקינים הדלקתיים באופן כללי. מעניין, נותרו כמה שאלות קריטיות. כיצד מיטוכונדריה אקסוגניות נכנסות לתאים? בסביבה חוץ גופית, השימוש במעכבי מקרופינוציטוזיס או מנגנון דמוי מקרופינוציטוזיס [17] או מיקרוטובולים/ננו-צינוריות מנהרות או חיבורי פערים [18] חוסם חלקית את עדכון המיטוכונדריה. כמה זמן נמשכות המיטוכונדריה המוזרקות? למרות שמחקרים אלה קשים, ניתן לבצע מחקרים אלה על ידי ניצול העובדה שהמיטוכונדריה מגיעות עם DNA משלהן, כך ששימוש בהשתלות מיטוכונדריות קסנוגרט כדי להעריך את מיקומן של מיטוכונדריה המוזרקות מערכתית יכול לשמש לטיפול הן היכן והן כמה זמן נמשכת המיטוכונדריה המוזרקת. . למחקרים אלו יש גם מגבלות נוספות שכן טכניקה זו תאפשר רק זיהוי של DNA מיטוכונדריאלי מוזרק ולא ניתן להשתמש בהם כדי לבדוק אם המיטוכונדריה המוזרק מתפקדת. בהתאם למודל המחלה, באיזו תדירות יש צורך להזריק את המיטוכונדריה? במצבים חריפים, נראה כי מינון יחיד של מיטוכונדריה מספק, אך אף מחקר עדכני לא העריך את השימוש במיטוכונדריה במצבים כרוניים. מינונים נמוכים אלו של מיטוכונדריה עיכבו כיווץ כלי דם ריאתי חריף המופעל על ידי היפוקסיה והחלישו שיפוץ כלי דם על רקע היפוקסיה, למרות שהאות הקשור להזרקת מיטוכונדריה מערכתית נמצא ב-כִּליָה, כבד וטחול. האם יש חשיבות לדרך ההזרקה? ברוב המודלים הפרה-קליניים של מכרסמים איסכמיים, מלבד הלב, המיטוכונדריה האקסוגניות המבודדות מוזרקות באופן מערכתי דרך תוך ורידי. עם זאת, ניתן לבחון שימוש במודלים גדולים יותר של בעלי חיים כדי להשתמש במשלוח מקומי לאיבר המטרה כפי שהוכח לאחרונה על ידי Doulamis et al. [4] באמצעות זריקה תוך עורקית בחזירכִּליָהדגם IRI של AKI. אספקה ​​מקומית של מיטוכונדריה עשויה להיות גם מועילה שכן התערבויות אלו עשויות לדרוש מינון נמוך יותר של מיטוכונדריה מבודדות. למרות שמחקרים לאחרונה הוסיפו לידע הנוכחי שלנו כיצד ניתן לנצל את השתלת המיטוכונדריה כאסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית, נותרו שאלות רבות אחרות. מהו המינון האופטימלי של המיטוכונדריה הדרוש לשימוש קליני? האם מקור המיטוכונדריה משנה? האם זה גורם לתגובה פרו-דלקתית, אוטולוגית מול סינגניית מול אלוגנית מול קסנוגנית? כל המחקרים שפורסמו משתמשים במיטוכונדריה טריות מבודדות תוך שעה מהבידוד. האם ניתן לשמר את המיטוכונדריה לאחר בידוד? קיום מיטוכונדריה שיכולה להיות זמינה להשתלה כאסטרטגיית טיפול מדף עשויה לחולל מהפכה בדרך שבה אנו משתמשים בה כדרך טיפולית לטיפול במחלות. לבסוף, השתלה של מיטוכונדריה בריאות קיימא מספקת אפשרות טיפולית חדשה למניעה ולטפל ולשיפור התקדמות המחלה במודלים פרה-קליניים שונים. לאפשרויות טיפול אלו באמצעות אברונים לשיפור תוצאות המחלה עשויות להיות השפעה קלינית משמעותית.

CISTANCHE ישפר את תפקוד הכליות/כליות