אפקט מגן על הכליות של טיפול מקדים בעדשים בלוגה לפציעת איסכמיה-פרפוזיה

סינג-אוק לי,¹ אז צ'ון צעיר,²EunHye Lee,²בומי קים,²בוהיון יון,² et al

רקע ומטרה. פציעת איסכמיה/פרפוזיה (I/R), הנגרמת על ידי חריפהכִּליָהנֵזֶקגורם לשינויים היסטופתולוגיים, אפופטוזיס של תאי צינורית, דלקת, חמצון ואובדן תפקוד הכליות. הערכנו את השפעות ההגנה מפני פציעת I/R של טיפול מקדים של עדשי בלוגה. חומרים ושיטות. עכברים חולקו לארבע קבוצות: קבוצות לטיפול בעדשים בלוגה רגילות, לא מטופלות, נמוך (2 מ"ג) ובמינון גבוה (8 מ"ג). עדשת Beluga ניתנה דרך הפה למשך שבועיים, ולאחר מכן איסכמיה כלייתית דו-צדדית למשך 20 דקות ורפרפוזיה למשך 30 דקות. דגימות דם וכִּליָהרקמות נאספו ונותחו כדי לחקור את תפקוד הכליות, היסטופתולוגיה, תאי אפיתל ואנדותלנֵזֶק, אפופטוזיס, מתח חמצוני ותגובות דלקתיות. תוצאות. הקבוצות שטופלו מראש שמרו על תפקוד כליות, עם רמות נמוכות משמעותית של חנקן אוריאה בדם (BUN) וקריאטינין, בהשוואה לקבוצות האחרות. הניתוח ההיסטופתולוגי הראה ירידה בפגיעה באבובית הפרוקסימלית וירידה במולקולה הקשורה לפציעה (כִּליָההפרשת מולקולת פגיעה 1 (KIM-1) והפרשת ליפוקלין (NGAL) הקשורים ל-Nutrophil gelatinase בקבוצות שטופלו מראש בהשוואה לקבוצות האחרות. תאים חיוביים ל-TUNEL-(TUNEL-) והפרשת מולקולות הקשורות לאפופטוזיס (Fas ו-Caspase 3) הופחתו באופן משמעותי בקבוצות שטופלו מראש בהשוואה לקבוצות האחרות. הקבוצות שטופלו מראש הראו ביטוי חיובי של גנים הקשורים למיקרו-כלי (Cluster of Differentiation (CD31)) וביטוי של מולקולת הידבקות שלילית (מולקולת הידבקות תוך-תאית 1 (ICAM{11}})). השפעת נוגד חמצון נצפתה בקבוצות הקדם-טיפול, עם ביטוי מופחת של מלונאלדהיד (MDA) והפרשת אנזים נוגד חמצון מוגבר (סופרוקסיד דיסמוטאז (SOD), קטלאז (CAT), גלוטתיון (GSH) וגלוטתיון פרוקסידאז (GPx)). בקבוצות שטופלו מראש, F4/80 פלוס מקרופאגים ו-CD4 פלוס תאי T עוכבו ורמות ציטוקינים פרו-דלקתיים (אינטרלוקין-(IL-) 1, IL-6 ו-Tumor necrosis factor- (TNF-)) ירדו; עם זאת, הרמות של ציטוקינים אנטי דלקתיים (טרנספורמציה של גורם גדילה- (TGF-), IL-10 ו-IL-22) עלו. מסקנות. טיפול מקדים בעדשים של בלוגה הוכיח השפעות הגנה מפני נזק כלייתי הנגרם על ידי I/R, באמצעות פעילויות אנטי-אפופטוטיות, אנטי דלקתיות ונוגדי חמצון.

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche propiedadesdeserticola מונעכִּליָהמחלה, לחץ כאן כדי לקבל את המדגם

1. הקדמה

פציעת איסכמיה/פרפוזיה חוזרת (I/R), במהלך כריתת כליה חלקית או השתלת כליה, גורמת לחריפהשֶׁל הַכְּלָיוֹתפציעה [1, 2] ועלולה לגרום להידרדרות בלתי הפיכה של תפקוד הכליות [3]. איסכמיה מעוררת אפופטוזיס בתאי אפיתל צינורי כליה, מה שמגביר את התגובות הדלקתיות של תאי ביניים. רפרפוזיה גורמת לנזק מיקרו-וסקולרי, המעודד נדידת תאים דלקתיים, באמצעות ביטוי של גורם הידבקות על פני השטח של תאי האנדותל [4-8]. פגיעה ב-I/R גורמת גם ללחץ חמצוני, הגברת מיני חמצן תגובתיים (ROS) והפחתת פעילות האנזים נוגדי החמצון [9], וכתוצאה מכך ייצור מוגבר של גורמים מעודדי דלקת [10], הפעלת מסלול קספאז ומוות תאים אפופטוטי מוגבר, אשר בסופו של דבר לגרום לאובדן תפקוד הכליות [11]. כדי למנוע פגיעה כלייתית הנגרמת על ידי I/R, הוצע שימוש בחומרים נוגדי חמצון, בעלי פונקציות אנטי-דלקתיות ואנטי-אפופטוטיות [10-14].

זני עדשים (ירוק, אדום, צרפתי או בלוגה) מכילים תרכובות ביו-אקטיביות שונות, במיוחד נוגדי חמצון [15]. תכולת הפוליפנול והפלבנואידים הכוללת שלהם נעה בין 27.30-30.30 מ"ג (שקולות חומצה טאנית)/ג' ל-13.14-16.29 מ"ג (מקבילות לקוורצטין)/ג', בהתאמה [16]. הוכח שלעדשי בלוגה יש תכולת פוליפנול גבוהה באופן משמעותי והשפעות ניקוי ROS [16]. הצוות שלנו דיווח על השפעות נוגדי החמצון של עדשים, תוך שימוש בניסוי קו תאי כבד במבחנה [16]. עדשי בלוגה הראו השפעות הגנה משמעותיות מפני ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי אלכוהול בתאי AML-12 בהשוואה לזני עדשים אחרים. ההשפעות האנטי-דלקתיות של עדשי בלוגה נצפו גם בתאי RAW264.7 שטופלו בליפופוליסכריד [17]. טיפול בעדשים בלוגה הפחית באופן משמעותי את ייצור תחמוצת החנקן (NO) ואת ביטוי ה-NO synthase (iNOS) מושרה, באמצעות וויסות מוגברת של גורם גרעיני E2-קשור לגורם 2- (Nrf2-) המתווך. מסלול oxygenase-1 (HO-1). ניסויים במבחנה אלה הציעו את ההשפעות נוגדות החמצון והאנטי דלקתיות של עדשי בלוגה.

כדי להרחיב את היישומים של עדשי בלוגה, החלנו אותם על מודל של פגיעה בכליות I/R של עכבר והערכנו את ההשפעות המגנות על הכליות. עבור ניסוי זה, עדשים בלוגה ניתנו למשך שבועיים, כטיפול מקדים, ולאחר מכן איסכמיה למשך 20 דקות וריפרפוזיה למשך 30 דקות. השפעות ההגנה הכלייתיות של טיפול מקדים בעדשי בלוגה אומתו על ידי ניתוח תפקוד כליות, היסטופתולוגיה, נזק לתאי אפיתל ואנדותל, אפופטוזיס, עקה חמצונית ותגובות דלקתיות. שיערנו שטיפול מקדים עם עדשי בלוגה ימנע פגיעה כלייתית הנגרמת על ידי I/R, באמצעות פעילויות נוגדות חמצון, אנטי דלקתיות ואנטי אפופטוטיות.

2. חומרים ושיטות

2.1. קבוצות בעלי חיים ותנאי טיפול.

כל ההליכים בוצעו באמצעות פרוטוקול בעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת Yeungnam (AEC2019-003). עכברים (ICR, בני 8 שבועות, זכר, 23-25 ​​גרם, אוריינט, Seongnam, קוריאה) חולקו באופן אקראי ל-4 הקבוצות הבאות (n =7 לקבוצה): (1) קבוצת ביקורת נורמלית, נורמלית; (2) קבוצה לא מטופלת, מטופלת במלח; (3) מינון נמוך ונמוך (2mg/100μL תמיסת מלח/-BioMed Research International עכבר), 14-יום קבוצת טיפול מקדים עם עדשים בלוגה; ו-(4) במינון גבוה (8 מ"ג/100 מיקרוליטר מי מלח/עכבר), 14-יום שניתנה דרך הפה עדשי בלוגה, קבוצת טיפול מקדים. עדשי בלוגה סופקו על ידי פרופ' סינג-אוק לי (אוניברסיטת קיימיונג, דאגו, קוריאה), והכנת התמצית וניתוח התרכובות הביו-אקטיביות דווחו במחקר קודם [16]. לאחר הטיפול, החיות הונחו במצב שכיבה, תחת הרדמה, ובוצע חתך גב [1]. עורק הכליה והוורידים של שתי הכליות נחסמו עם מהדק כלי דם למשך 20 דקות, ולאחר מכן רפרפוזיה למשך 30 דקות, על פי פרוטוקול שתואר קודם [18, 19]. דם נאסף על ידי ניקור לב, והכליות חולצו. הכליות נשטפו בתמיסת מלח מוגברת בפוספט; כליה אחת שימשה למיצוי RNA וחלבונים, ואילו הכליה השנייה שימשה לניתוח היסטולוגי.

2.2. ניתוחים היסטופתולוגיים ואימונוהיסטוכימיים (IHC).

בדיקות היסטופתולוגיות בוצעו באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E), ופציעות הוערכו על סמך הגורמים הבאים: נוכחות של תאי צינורית הנופלים בלומן, אובדן גרעיני בתאים מגולפים, פסולת לומינאלית, קריסת חלל לומינלי והסתרה של תאי מערכת החיסון. . הניקוד הושג על ידי מומחה פתולוגי: ציון 0, ללא פגיעה בצינורית; ציון 1,<10% of="" tubules="" injured;="" score="" 2,="" 10–25%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 3,="" 25–50%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 4,="" 50–74%="" of="" tubules="" injured;="" and="" score="" 5,="">75 אחוז מהאבובים נפגעו. לצורך ניתוח IHC, הכליה תוקנה עם 4 אחוז פרפורמלדהיד, ודגימות מוטבעות בפאראן נחתכו לקטעים של 5 מיקרומטר. בוצעו צביעת H&E ו-IHC, בעקבות תהליכים שגרתיים. נוגדנים ראשוניים נגד תא חיסון (F4/80 ואשכול התמיינות 8 (CD8), Abcam, Cambridge, בריטניה) ותאי אנדותל (CD31 ומולקולת הידבקות תוך תאית 1 (ICAM-1), Abcam) הוחלו על החתכים , למשך 24 שעות ב-4 מעלות (דילול 1:200), ואחריו הנוגדן המשני (Alexa Fluor 594, Life Technology, Waltham, MA, ארה"ב), למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ו-4',6-diamidino{ {19}}פנילינדול (DAPI) שימש לצביעה של גרעינים.

2.3. בדיקת חלבון.

לצורך ניתוח תפקודי כליות, הסרום הופרד, ללא חומר נוגד קרישה, וריכוזי קריאטינין וחנקן אוריאה בדם (BUN) זוהו באמצעות ערכת קריאטינין קולורימטרית וערכת בדיקת אוריאה Quanti-Chrom (BioAssay Systems LLC, Hayward, CA, ארה"ב ), בהתאמה. כדי להעריך פגיעה באבובית/כלי הכליה, עקה חמצונית, אנזימים נוגדי חמצון ואפופטוזיס, רקמת הכליה הומוגגה עם כל מאגר בהתאמה. כדי לנתח פגיעה בתאי אפיתל של צינורית הכליה, מולקולת פגיעה בכליות-1 (KIM-1) וריכוזי ליפוקלין (NGAL) הקשורים לג'לטינאז נויטרופילים הוערכו באמצעות מבחן אימונוסורבנט מקושר אנזים (ELISA) (USCN Life Science Inc. ., ווהאן, סין). כדי לנתח אפופטוזיס, נמדדו ריכוזי Fas ו-caspase 3 באמצעות ערכות ELISA בהתאמה (Abcam). כדי להעריך עקה חמצונית, רמות המלונאלדהיד (MDA) נמדדו באמצעות ערכת בדיקת MDA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute, נאנג'ינג, סין). אנזימים נוגדי חמצון, כולל סופראוקסיד דיס-מוטאז (SOD), קטלאז (CAT), גלוטתיון (GSH) וגלוטתיון פרוקסידאז (GPx), נמדדו באמצעות ערכת בדיקת SOD כוללת (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), ערכת בדיקת CAT ( Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), ערכת בדיקה פלואורומטרית של GSH, וערכת GPx Assay (BioVision Inc.), בהתאמה. כל הערכות שימשו בהתאם להוראות היצרן.

2.4. ניתוח ביטוי גנים.

RNA כולל הוצא עם ריאגנט TRIzol, ו-cDNA סונתז מ-20 אג' RNA כולל, באמצעות ערכת סינתזה של cDNA (Invitrogen, Waltham, MA, ארה"ב). תנאי ה-PCR בזמן אמת היו כדלקמן: 95 מעלות למשך 10 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 מעלות למשך 10 שניות, 60 מעלות למשך 50 שניות ו-72 מעלות למשך 20 שניות. הגברה גנים זוהתה באמצעות ירוק SYBR, ושיטת 2−ΔΔCt שימשה לניתוח ביטוי. ניסויים בוצעו בשלושה עותקים, תוך שימוש ברצפי הפריימר הבאים: interleukin- (IL-) 1 , 5'-gcccatcctctgagactcat-3' ו-5'-aggccacagg- tattttgtcg-3'; IL-6, 5'-agttgccttcttgggactga-3' ו-5' -tccacgatttccccagagaac-3′; tumor necrosis factor- (TNF-) , 5'-agccccagtctgtatcctt-3' ו-5'-ctccctttgcagaactcagg-3′; גורם גדילה מתמר- (TGF-) , 5'-tggttgtagaggg- caaggac-3' ו-5'-ttgcttcagctccacagaga-3′; IL-10, 5′ -acctggtagaagtgatgccc-3′ ו-5'-agggtcttcagcttctcacc-3′; IL- 22, 5′-tccaacttccagcagccata-3′ ו-5'-tagcactgactcctcggaac- 3′; ו-glyceraldehyde 3'-phosphate dehydrogenase (GAPDH), 5'-tgtgtccgtcgtggatctga-3' ו-5'-cctgcttcac- caccttcttga-3'.

2.5. מבחן TUNEL.

כדי להעריך אפופטוזיס, בוצע בדיקת dUTP nick-end תיוג (TUNEL) בתיווך TdT באמצעות ערכת זיהוי אפופטוזיס (Chemicon, Bedford, MA, ארה"ב) בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, שקופיות שעברו שחרור מפראפין והוסרו מחדש, עוכלו עם 20ug/mL proteinase K, ב-37 מעלות למשך 15 שעות, להסרת חלבונים, וטופלו ב-3.0 אחוז מי חמצן, כדי להרוות פרוקסידאז אנדוגני. השקופיות נטבלו במאגר 1x TdT שיווי משקל, וחוזק עבודה של האנזים TdT נוספה למשך שעה אחת ב-37 מעלות. צימוד אנטי-דיגוקסיגנין הוחל על קצה ה-3'-OH DNA למשך 30 דקות, והצבע פותח באמצעות מצע פרוקסידאז למשך 3 דקות. לאחר טיפול DAPI, השקופיות הורכבו. גרעינים חיוביים ל-TUNEL נספרו בכל שדות הראייה בכל דגימת רקמה, בהגדלה של פי 200.

2.6. ניתוח סטטיסטי.

כל הערכים מבוטאים כממוצע ± סטיית התקן. הבדלים משמעותיים עבור קבוצת הפגיעה הכלייתית I/R וקבוצות הטיפול המקדים של בלוגה עדשים-I/R הוערכו באמצעות ניתוח שונות, ולאחר מכן המבחן הפוסט-הוק של Tukey, ב-SPSS (Statistical Package for the Social Sciences v. 9.{{ 2}}; שיקגו, IL, ארה"ב). ערכי p < 0.05="" נחשבו="">

יתרונות cistanche סלסה

3. תוצאות

3.1. השפעות של טיפול מקדים עדשים בלוגה על תפקוד הכליות.

שתי הקבוצות שטופלו מראש הראו השפעות הגנה משמעותיות מפני פציעת I/R (איור 1). ריכוזי ה-BUN והקריאטינין הממוצעים בסרום בקבוצה שלא טופלה היו 89:92 ± 7:29 מ"ג/ד"ל ו-0:48 ± 0:16 מ"ג/ד"ל, בהתאמה. הקבוצות שטופלו מראש הראו BUN מופחת באופן משמעותי (נמוך: 22 :6±3:67 מ"ג/ד"ל; גבוה: 21:6± 3:17 מ"ג/ד"ל) וקריאטינין בסרום (נמוך: 0:25 ± {{19} }:04mg/dL; גבוה: 0:23 ± 0:04mg/dL) בהשוואה לאלו בקבוצה הלא מטופלת (p<0:01), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" two="" pretreatment="" groups.="" these="" results="" indicated="" that="" pretreatment="" with="" beluga="" lentils="" can="" protect="" against="" acute="" renal="" functional="">

3.2. השפעות של טיפול מקדים עדשים בלוגה על פגיעה בתאי אפיתל צינוריים ואפופטוזיס.

פגיעה בצינורית, במיוחד ניוון של תאי אפיתל, נצפתה לעתים קרובות במדולה החיצונית של הכליה, ומדי פעם זוהו אובדן גרעיני של תאים עם פילינג, פסולת לומינלית על צינורית הכליה, קריסת חלל לומינלי ותפילות נויטרופילים בין-סטיציאליים של הכליה. קבוצה לא מטופלת (איור 2(א)). לעומת זאת, הכליות מהקבוצות שטופלו מראש הראו מורפולוגיות תאי כמעט נורמליות, ופגיעה בצינורית נצפתה בתדירות נמוכה יותר בקבוצת המינון הגבוה מאשר בקבוצת המינון הנמוך. כאשר הפציעה באה לידי ביטוי כאחוז ליחידת שטח, ציון הפציעה הופחת בקבוצות שטופלו מראש (נמוך: 2:0±0:93; גבוה: 1:5± {{ 11}}:53) בהשוואה לזה בקבוצה הלא מטופלת (2:87 ± 1:25) (איור 2(ב)). בעת בחינת הפרשת KIM-1 ו-NGAL (איור 2(ג)), תוצאות ה-ELISA הראו שתכולת ה-KIM-1 ירדה בקבוצות שטופלו מראש (נמוך: 1, 922:83 ± 199:42 pg/ מ"ג; גבוה: 1,827:83 ± 278:26 פג"ג/מ"ג) בהשוואה לזה בקבוצה הלא מטופלת (1,977:83 ± 184:49 פג"ג/מ"ג). ביטוי NGAL הופחת באופן משמעותי בקבוצת המינון הגבוה (489:34 ± 19:95 פג/מ"ג) בהשוואה לאלו במינון הנמוך (527:36 ± 15: 19 פג'ג/מ"ל) ולא טופלו (537:05 ± 15 : קבוצות של 70pg/mg (עמ'<>

לאחר מכן נותחו האם פגיעה בתאי אפיתל צינורי גרמה לאפופטוזיס. אפופטוזיס תאית הוערכה על ידי זיהוי DNA כרומוזומלי מקוטע, באמצעות מבחן TUNEL (איור 2(ד)). תאים חיוביים ל-TUNEL נצפו לעתים רחוקות בקבוצות שטופלו מראש (נמוך: 5:00 ± 1:22; גבוה: 2:25 ± 1:09). לעומת זאת, הקבוצה שלא טופלה הראתה מספר מוגבר יחסית של תאים חיוביים ל-TUNEL באזור המדולה החיצונית (47:50 ± 16:77) (p<0:01), showing="" apoptotic="" bodies="" that="" extruded="" into="" the="" tubular="" lumen="" (figure="" 2(e)).="" when="" the="" secretion="" of="" apoptosis-related="" molecules="" (fas="" and="" caspase="" 3)="" was="" analyzed="" by="" elisa="" (figure="" 2(f)),="" fas="" expression="" was="" high:="" 3:96="" ±="" 0:55ng/mg)="" compared="" with="" that="" in="" the="" untreated="" group="" (7:10="" ±="" 0:87ng/mg),="" and="" caspase="" 3="" expression="" showed="" similar="" results="" (low:="" 8:44="" ±="" 2:05ng/mg;="" high:="" 8:25="" ±="" 1:28ng/="" mg;="" and="" untreated:="" 11:99="" ±="" 0:63ng/mg)="" (p=""><0:05). these="" results="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="">

אפופטוזיס של תאי אפיתל צינורי המושרה על ידי I/R.

3.3. השפעות של טיפול מקדים עדשים בלוגה על פגיעה בתאי אנדותל.

ההשפעות של טיפול מקדים בעדשי בלוגה על תאי האנדותל אומתו על ידי IHC, באמצעות נוגדן CD31 (איור 3(א)). בקבוצה הרגילה זוהו כלי דם חיוביים ל-CD31-, אך תאים חיוביים ל-CD31- לא זוהו בקבוצה הבלתי מטופלת, מה שמעיד על הפרעה בכלי הדם הנגרמת על ידי I/R. קבוצת הטיפול המקדים במינון גבוה הראתה תאים חיוביים ל-CD31- בנימים הפריטבולריים, מה שמעיד על אפקט מגן על כלי הדם של טיפול מקדים של עדשים בלוגה במינון גבוה. תאי אנדותל נבדקו על ידי זיהוי ICAM- 1, מולקולת הידבקות, ותאים חיוביים זוהו בתדירות גבוהה יותר באזור הצינורי של הקבוצה הלא מטופלת (46:4±41:7 תאים/שקף) בהשוואה לקבוצות שטופלו מראש ( נמוך: 5:77 ± 1:01 תאים/שקופית; גבוה: 3:72 ± 1:05 תאים/- שקף) (איור 3(ב)). תוצאות אלו הצביעו על כך שטיפול מקדים של עדשי בלוגה שימר נימים ועכב את הפעלת מולקולת ההדבקה על פני תא האנדותל.

3.4. השפעות של טיפול מקדים עדשים בלוגה על מתח חמצוני.

To evaluate the antioxidant effects of beluga lentil pretreat- ment, MDA, SOD, CAT, GSH, and GPx levels were detected by ELISA (Figure 4). MDA levels decreased in the pretreated groups (low: 0:85 ± 0:23nmol/mg; high: 0:81 ± 0:22nmol/ mg) compared with that in the untreated group (0:96 ± 0:11nmol/mg) (p >0:05) (Figure 4(a)). However, the antioxidant enzyme activities increased in the pretreated groups (Figure 4(b)) compared with those in the untreated group (p >{{{{20}}}}:05), עבור SOD (נמוך: 360:21 ± 56:42U/mL; גבוה: 362:7{{ 36}} ± 70 :32U/mL; ולא מטופל: 333:52 ± 41:58U/mL), CAT (נמוך: 3:64 ± 1:09 ננומול/ג; גבוה: 3:21 ± 0:76 ננומול/ג; ולא מטופלים: 3:18 ± 0:40 ננומול/ג', GSH (נמוך: 4:13 ± 0:53 ננומול/מ"ג; גבוה: 4:56 ± 0:69 ננומול/מ"ג; ולא מטופל: 3:59 ± 0 :53nmol/mg), ו-GPx (נמוך: 198:89 ± 48:43U/ug; גבוה: 219:61 ± 138:08U/ug; ולא מטופל: 165:14 ± 34:73U/ug). למרות שההבדלים הללו לא היו מובהקים סטטיסטית, תוצאות אלו הצביעו על כך שטיפול מקדים של עדשי בלוגה מנע מתח חמצוני כלייתי המושרה על ידי I/R על ידי שיפור העוצמה נוגדת החמצון בכליות.

3.5. השפעות של טיפול מקדים עדשים בלוגה על החדרת תאים חיסוניים, ציטוקינים ודלקת. חדירת מקרופאג (F4/80 פלוס) ותאי T (CD4 פלוס) ושחרור ציטוקינים פרו-אינפלמטוריים (IL-1, IL-6 ו-TNF-) נותחו כדי להעריך דלקת הנגרמת על ידי אפופטוזיס. פחות תאי חיסון מסתננים F4/80 פלוס ו-CD4 פלוס נצפו בקבוצות שטופלו מראש מאשר בקבוצה שלא טופלה, כפי שהוערך על ידי ניתוח IHC (איור 5(א)). ניתוח ה-PCR בזמן אמת הראה שרמות ה-mRNA הכליות של ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1, TNF- ו-IL 6) ירדו בקבוצה שטופלה מראש בהשוואה לאלו בקבוצה שלא טופלה (איור 5(ב) )). עם זאת, רמות ה-mRNA של ציטוקינים אנטי דלקתיים (TGF-ו-IL-22) עלו בקבוצות שטופלו מראש בהשוואה לקבוצה שלא טופלה, למעט IL-10 (איור 5(ג)). תוצאות אלו הצביעו על כך שפגיעה דלקתית הנגרמת על ידי I/R בכליות עשויה להימנע על ידי טיפול מקדים של עדשי בלוגה עקב השפעות אנטי דלקתיות, אם כי IL-10 לא הושפעה.

תוסף אנתוציאנין

4. דיון

פגיעה כלייתית הנגרמת על ידי I/R מאופיינת באופן מסורתי על ידי ירידה מהירה בתפקוד הכליות [20]. ניתן להעריך את תפקוד הכליות באמצעות ערכי BUN וקריאטינין בסרום, שהם תוצרים סופיים מטבוליים חנקניים המעידים על תפקוד מסנן גלומרולרי [21]. הקבוצה שלא טופלה הראתה ערכי BUN מוגברים (89:92 ± 7:29 מ"ג/ד"ל) וקריאטינין (0:48 ± {{20}}:16 מ"ג/ד"ל), המעידים על אי ספיקת כליות תפקודית המושרה על ידי I/R. עם זאת, הקבוצות שטופלו מראש בעדשים הראו BUN מופחת באופן משמעותי (נמוך: 22:6±3:67 מ"ג/ד"ל; גבוה: 21:6±3:17 מ"ג/ד"ל) וקריאטינין בסרום (נמוך: 0: ערכי 25 ± 0:04mg/dL; גבוהים: 0:23 ± 0:04mg/dL) (p<0:01) compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" group.="" these="" values="" are="" similar="" to="" those="" observed="" in="" normal="" mice="" (male,="" 6wks;="" bun:="" 22:68="" ±="" 3:05mg/dl;="" creatinine:="" 0:25="" ±="" 0:06mg/dl)="" [22].="" the="" significantly="" decreased="" bun="" and="" serum="" creatinine="" values="" observed="" in="" the="" pretreated="" groups="" relative="" to="" the="" untreated="" group="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="" exerted="" protective="" effects="" on="" renal="" function="" against="" i/r-induced="" renal="">

הירידה בתפקוד הכלייתי מצביע על בעיות סינון גלומרולריות הנגרמות על ידי דליפה אחורית של הפילטרט הגלומרולרי על פני האפיתל הצינורי, המייצג את האזור שנפגע בצורה הקשה ביותר מ-I/R [23]. I/R גרם לאובדן גרעיני של תאים מפולפים, לפסולת לומינלית על צינור הכליה ולקריסת חללים לומינליים בתאי אפיתל צינוריים. הקבוצות שטופלו מראש הראו פגיעה צינורית היסטופתולוגית מופחתת באופן תלוי מינון. הפציעה ההיסטופתולוגית של הצינורית שנצפתה אושרה על ידי הערכת סמנים מולקולריים, KIM-1 ו-NGAL [24]. KIM-1 הוא קולטן לפוספאטידילסרין הפועל כמולקולת זיהוי תאים אפופטוטיים, ומעביר תא פצוע לליזוזום עבור פגוציטוזיס של תאים אפופטוטיים/נקרוטיים, פינוי פסולת אפופטוטי והגבלת תגובה פרו-דלקתית [25]. NGAL הוא חלבון סידרופור קטן הנקשר לג'לטינאזות שמקורן בנויטרופילים אנושיים. NGAL מתבטא לעיתים רחוקות בכליות תקינות, אך נזקים חריפים, איסכמיים או רעילים בכליות מביאים להפרשת NGAL על ידי תאי האפיתל בצינוריות הפרוקסימלית/דיסטלית, מה שמגדיל את ריכוזי ה-NGAL בשתן ובדם; לפיכך, NGAL יכול לשמש כסמן ביולוגי מוקדם חדש לאי ספיקת כליות חריפה המושרה על ידי I/R[26]. הקבוצות שטופלו מראש הראו הפרשת KIM-1 ו-NGAL מופחתת, וקבוצת הטיפול המקדים במינון גבוה הראתה ירידה משמעותית בהפרשת NGAL בהשוואה לקבוצה שלא טופלה. ההפחתות שנצפו בפציעה בצינורית ובהפרשת חלבון KIM-1 ו-NGAL הצביעו על כך שטיפול מקדים בעדשי בלוגה הפעיל השפעות הגנה מפני נזק לתאי אפיתל צינורי שנגרמו על ידי I/R.

כאשר פציעת I/R חמורה, תאים פגומים מתפנים דרך המסלול האפופטוטי, שהוא מנגנון מוות תאים פתופיזיולוגי [27]. ניתן לזהות נזק ל-DNA ספציפי לאפופטוזיס באמצעות בדיקת TUNEL.

תאים חיוביים ל-TUNEL נצפו לעתים קרובות בקבוצה הלא מטופלת, בעוד שהקבוצות שטופלו מראש בעדשי בלוגה הראו מספר תאים חיוביים ל-TUNEL מופחת באופן משמעותי, באופן תלוי מינון. עדות היסטולוגית זו לאפופטוזיס אוששה על ידי בחינת ביטויי Fas ו-caspase 3. Fas הוא ליגנד הנקשר לקולטן המוות של התא ונצפה בתחילה במהלך מוות תאי מתוכנת [28]. Caspase 3 הוא אנזים ביצוע תוך תאי של מסלול מוות תא אפופטוטי, וכתוצאה מכך היווצרות גוף אפופטוטי [29]. סינתזות חלבון Fas ו-Caspase 3 פחתו משמעותית בקבוצה שטופלה מראש בהשוואה לאלה בקבוצה שלא טופלה, מה שמאשר שטיפול מקדים של עדשי בלוגה יכול לעכב את העברת אותות אפופטוטיים בעקבות פציעת I/R.

פגיעה ב-I/R גורמת גם לאובדן של כלי דם מיקרו-כליות [30], וכתוצאה מכך לשינויים פתואיסטולוגיים בתאי האנדותל [20]. נזק כלייתי לכלי זוהה באמצעות נוגדן נגד CD31, סמן תאי אנדותל [30]. ביטוי CD31 לא זוהה בקבוצה שלא טופלה, מה שמעיד על אובדן של כלי דם כליות. עם זאת, הקבוצה שטופלה מראש במינון גבוה הראתה ביטוי CD31 חיובי, עם צפיפות כלי דם דומה כפי שנצפתה בקבוצה הרגילה, מה שהצביע על כך שטיפול מקדים של עדשי בלוגה, במינונים גבוהים, הפעיל אפקט מגן על שימור תאי האנדותל. תאי אנדותל פגומים מבטאים מולקולות הידבקות אנדותל-לוקוציטים, כגון ICAM-1 [31]. מולקולות הידבקות מוגברת יכולות להוביל להפעלת לויקוציטים, חסימה נימית, ייצור ציטוקינים ותגובות פרו-דלקתיות [32]. הקבוצה שלא טופלה הראתה ביטוי חיובי של ICAM-1, המעיד על ביטוי משופר של מולקולת הידבקות המושרה על ידי נזק לתאי האנדותל. עם זאת, הקבוצה שטופלה מראש במינון גבוה הראתה ביטוי שלילי של ICAM-1, המצביע על השפעות ההגנה של טיפול מקדים בעדשים בלוגה לשמירה על תאי אנדותל, הן מבחינה תפקודית והן מבחינה פיזיולוגית. מבני כלי הדם המתוחזקים יכולים לספק זרימת דם עקבית, לספק חמצן וחומרי מזון לרקמות ולתאים שניזוקו על ידי I/R, ולסייע בהתאוששות תפקודית והיסטולוגית של הכליה.

רפרפוזיה משחזרת את אספקת החמצן לתאים פגומים, מה שיכול לעורר ביטוי של אנזימים הקשורים ללחץ חמצוני, הממיר חמצן ל-ROS [33]. ROS הם מוצרים לא יציבים ותגובתיים מאוד היוצרים רדיקלים חופשיים, הגורמים נזק ל-DNA, אפופטוזיס ונמק, באמצעות השינוי בחלבונים, שומנים וחומצות גרעין. רדיקלים חופשיים פוגעים בחומצות שומן בלתי רוויות בממברנת התא, וכתוצאה מכך לחמצן שומנים [34]. ליפיד פרוקסיד מפורק לאחר מכן ל-MDA, מה שמפחית את פעילות האנזים נוגדי החמצון, כגון SOD, GPx, GSH ו-CAT [35]. SOD מזרז את הפיכת הסופראוקסיד לחמצן ומי חמצן, שמתכלה עוד יותר על ידי CAT. GPx הוא אנזים נוגד חמצון מפתח שמבטל פרוקסיד, באמצעות GSH. GSH יכול לבצע ניקוי רעלים ממוצרים חמצוניים שונים, בשילוב עם GPx. רמות MDA ואנזים נוגדי חמצון הדגימו קשר הפוך בניתוח ELISA. בקבוצות שטופלו מוקדם, ביטוי MDA היה נמוך יחסית, אך האנזימים נוגדי החמצון באו לידי ביטוי גבוה בהשוואה לרמות שלהם בקבוצה הלא מטופלת.

תוצאות אלו הצביעו על כך שטיפול מקדים בעדשי בלוגה יכול להפחית נזק כלייתי המושרה על ידי I/R על ידי חסימת מסלול הלחץ החמצוני, באמצעות עיכוב של חמצון שומנים בקרום והפעלה של אנזימים נוגדי חמצון.

רפרפוזיה מפעילה גם הפעלת תאי אנדותל כלי דם, וכתוצאה מכך ביטוי ICAM-1 על פני התא. ה-ICAM המבוטא-1 מתחבר עם נויטרופילים באמצעות אנטיגן הקשור לתפקוד לימפוציטים-1 (LFA-1), מה שגורם להתקשרות של נויטרופילים לתאי אנדותל, החדרת נויטרופילים והפרשת דלקת. ציטוקינים על ידי נויטרופילים [36]. לאחר הופעת נויטרופילים באזור פגום, מתרחשת החדירה של F4/80 פלוס מקרופאגים. מקרופאגים מבדילים לפנוטיפים M1 פרו-דלקתי ואנטי-דלקתי M2, בהתאם לזמן ולסביבה הסובבת. מקרופאגים M1 מפרישים ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1, TNF- ו-IL- 6) הקשורים לנזק כלייתי המושרה על ידי I/R, ואילו מקרופאגים M2 מפרישים ציטוקינים אנטי-דלקתיים (TGF-, IL{ {19}}, ו-IL-22) [37, 38]. מקרופאגים גם מעוררים הפעלה של תאי CD4 פלוס T. תאי T פעילים מסנתזים אינטרפרון (IFN-), אשר מגביר את התגובה החיסונית באמצעות הפעלת מקרופאג M1 [39]. במחקר זה, הקבוצות שטופלו מראש בעדשי בלוגה הראו השפעות מעכבות נגד F4/80 פלוס מקרופאג ו-CD4 פלוס תאי T לאזור קליפת הכליה, וכתוצאה מכך ירידה בביטוי של IL-1, IL-6, ו-TNF-mRNA והביטוי המוגבר של TGF-, IL-10 ו-IL-22 mRNA. תוצאות אלו הצביעו על כך שטיפול מקדים בעדשי בלוגה יכול להפחית את התגובה הדלקתית על ידי עיכוב הסתננות של תאי חיסון והפחתת ביטוי ציטוקינים דלקתי.

5. מסקנות

לסיכום, קבוצות הטיפול המקדים של עדשי בלוגה הראו פגיעה מופחתת באבובית הפרוקסימלית, ירידה בהפרשת מולקולה הקשורה לפציעה, הפחתת תאים חיוביים ל-TUNEL, ירידה בהפרשת מולקולה הקשורה לאפופטוזיס, ביטוי חיובי של מיקרו-כלי, ביטוי של סמן הידבקות שלילי, אפקט נוגד חמצון מעוכב. תגובות. לכן, טיפול מקדים בעדשי בלוגה הפעיל השפעות הגנה מפני נזק כלייתי הנגרם על ידי I/R, באמצעות פעילויות אנטי אפופטוטיות, אנטי דלקתיות ונוגדות חמצון. בהתבסס על תוצאות מחקר זה, ניתן לשמר את תפקוד הכליות על ידי שימוש בטיפולי עדשים של בלוגה במצבים קליניים הקשורים לפציעות I/R, כגון כריתת כליה חלקית.

תוספי פלבנואידים בכליות

זמינות נתונים

נתונים זמינים לפי בקשה.

גילוי נאות

תקציר כתב היד דווח במפגש השנתי ה-72 של האגודה האורולוגית הקוריאנית.

ניגוד עניינים

אין ניגודי אינטרסים.

תרומות מחברים

Syng-ook Lee ו-So Young Chun תרמו באותה מידה לעבודה זו.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מכון מחקר ביו-רפואי מבית החולים האוניברסיטאי הלאומי Kyungpook (2019).

1 המחלקה למדע וטכנולוגיה של מזון, אוניברסיטת Keimyung, Daegu 42601, הרפובליקה של קוריאה

2BioMedical Research Institute, Kyungpook National University Hospital, Daegu 41940, Republic of Korea

3צוות התמיכה של המחלקה לחקר בעלי חיים במעבדה, בית החולים האוניברסיטאי Yeungnam, Daegu 42415, הרפובליקה של קוריאה

4 המחלקה לרפואה פנימית, המכללה לרפואה של אוניברסיטת Yeungnam, Daegu 42415, הרפובליקה של קוריאה

5 המחלקה לאורולוגיה, בית הספר לרפואה, האוניברסיטה הלאומית Kyungpook, Daegu 41566, הרפובליקה של קוריאה

6 המחלקה לפתולוגיה, בית הספר לרפואה, האוניברסיטה הלאומית Kyungpook, Daegu 41566, הרפובליקה של קוריאה

7 המחלקה לאורולוגיה, המכללה לרפואה של אוניברסיטת Yeungnam, Daegu 42415, הרפובליקה של קוריאה

הפניות

[1] SY Chun, DH Kim, JS Kim, et al., "חריץ גב חדשני התקרב לשיטת כריתת כליה חלקית לא-איסכמית להתחדשות רקמת כליה במודל של עכבר," הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, כרך. 15, לא. 4, עמ' 453–466,2018.

[2] M. Agrawal ו-R. Swartz, "אי ספיקת כליות חריפה," American Family Physician, vol. 61, לא. 7, עמ' 2077–2088, 2000.

[3] KR Tuttle, "Ischemic nephropathy," Current Opinion in Nephrology and Hypertension, vol. 10, לא. 2, עמ' 167–173,2001.

[4] K. Singbartl and K. Ley, "Protection from Ischemia-Reperfusion-induced Severe acute renal failure by blocking E- selectin," Critical Care Medicine, vol. 28, לא. 7, עמ' 2507–2514, 2000.

[5] M. Takada, KC Nadeau, GD Shaw, KA Marquette, ו-NL Tilney, "מפל מולקולות ההדבקה של הציטוקינים בפגיעת איסכמיה/פרפוזיה חוזרת של כליית החולדות. עיכוב על ידי ליגנד P-selectin מסיס," The Journal of חקירה קלינית, כרך. 99, לא. 11, עמ' 2682–2890, 1997.

[6] J. Niu, J. Wu, X. Li ו-F. Zhang, "הקשר בין אנדותלין-1/אנדותלין קולטן A ודלקת בכליות עכברים בעקבות איסכמיה/פרפוזיה חריפה," Molecular Medicine Reports, vol. . 11, לא. 5, עמ' 3981–3987, 2015.

[7] L. Wang, X. Liu, H. Chen וחב', "השפעה של מי חמצן II על אפופטוזיס הנגרמת על ידי פגיעה של איסכמיה של הכליה/פרפוזיה חוזרת בחולדות," Experimental and Therapeutic Medicine, vol. 9, לא. 3, עמ' 817–822, 2015.

[8] B. Dong, H. Zhou, C. Han, et al., "ביטוי קצוץ המושרה על ידי איסכמיה/פרפוזיה מקדם אפופטוזיס ופוגע בהחלמה של תפקוד הכליות: תפקיד החמצת ו-Gpr4," PLoS One, vol. 9, לא. 10, מאמר e110944, 2014.

[9] DL Cruthirds, L. Novak, KM Akhi, PW Sanders, JA Thompson, ו-LA MacMillan-Crow, "מטרות מיטוכונדריאליות של עקה חמצונית במהלך איסכמיה/רפרפוזיה של הכליה," Archives of biochemistry and biophysics, vol. 412, מס'. 1, עמ' 27–33, 2003.

[10] B. Yang, S. Jain, IZ Pawluczyk, וחב', "דלקת והפעלת קספסה בפגיעה ארוכת טווח באיסכמיה של הכליות/פרפוזיה ודיכוי חיסוני בחולדות," Kidney International, vol. 68, לא. 5, עמ' 2050–2067, 2005.

[11] HH Wu, TY Hsiao, CT Chien, וח"כ Lai, "התניה איסכמית על ידי תקופות קצרות של רפרפוזיה מחלישה איסכמיה בכליות/אפופטוזיס הנגרמת מחדש על ידי רפרפוזיה ואוטופגיה בחולדה," Journal of biomedical science, vol. 16, לא. 1, 2009.

[12] EM El Morsy, MA אחמד, ו-AA Ahmed, "הפחתת פגיעה כלייתית באיסכמיה/פרפוזיה חוזרת על ידי התניה מוקדמת של תמצית אסאי במודל חולדה," מדעי החיים, כרך. 123, עמ' 35–42, 2015.

[13] H. Ilhan, M. Eroglu, V. Inal, et al., "טיפול בחמצן היפרברי מקל על מתח חמצוני ופגיעה ברקמות באיסכמיה של הכליות/פגיעה חוזרת בחולדות," Renal Failure, vol. 34, לא. 10, עמ' 1305–1308, 2012.

[14] H. Chen, B. Xing, X. Liu, וחב', "התניה מוקדמת של חמצון אוזון מעכבת דלקת ואפופטוזיס במודל של חולדה של איסכמיה/פגיעה חוזרת של כליות," European Journal of pharmacology, vol. 581, מס'. 3, עמ' 306–314, 2008.

[15] BJ Xu, SH Yuan ו-SK Chang, "ניתוחים השוואתיים של הרכב פנולי, קיבולת נוגדי חמצון וצבע של קטניות העונה הקרירה וקטניות מזון נבחרות אחרות," Journal of Food Science, vol. 72, לא. 2, עמ' S167–S177, 2007.

[16] SO Lee ו-SH Lee, "תכולת פוליפנול ופעילויות נוגדות חמצון של תמציות עדשים מזנים שונים", כתב העת של האגודה הקוריאנית למדעי המזון והתזונה, כרך. 45, לא. 7, עמ' 973–979, 2016.

[17] SO Lee ו-SH Lee, "Nrf2-תיווך אפקט אנטי דלקתי של תמצית מתנולית מעדשי בלוגה בתאי RAW264.7 שטופלו ב-LPS," בשנת 2018, סימפוזיון ומפגש שנתי של KFN, עמ' {{ 7}}, בוסאן, קוריאה, 2018.

[18] EE Hesketh, A. Czopek, M. Clay, וחב', "פגיעה בכליות איסכמיה-רפרפוזיה: מודל עכבר של פגיעה והתחדשות," JoVE (Journal of Visualized Experiments), מס'. 88, עמ'. 8, 2014.

[19] Q. Wei ו-Z. Dong, "מודל עכבר של פגיעה כלייתית איסכמית חריפה: הערות טכניות וטריקים," American Journal of Physiology-Renal Physiology, vol. 303, מס'. 11, עמ' F1487– F1494, 2012.

[20] JV Bonventre and L. Yang, "Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury", The Journal of Clinical Investigation, vol. 121, לא. 11, עמ' 4210–4221, 2011.