למידע נוסף:ali.ma@wecistanche.com

סנטה פרינסיירו ברלינג'ריו^1,†, ג'ונלינג הוא^2,†, Lies De Groef ³, הרולד טייטר⁴, תומס נורטון⁴, פיטר באצן ⁵, שרה קאירולי⁶, ביאנקה גופרדו⁶, פיטר דה ויטה ⁷, למברטוס ואן דן היובל^1,8, Hans J. Baelde²ואלנה לבצ'נקו^1,*

^{חלק א': ביטויים כלייתיים וכליות נוספים בדגי זברה בוגרים מודל של ציסטינוזיס}

¹מעבדה לנפרולוגיה ילדים, KU Leuven, 3000 Leuven, בלגיה; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (SPB); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (LvdH)

²המחלקה לפתולוגיה, המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן, 2300 RC Leiden, הולנד; J.He@lumc.nl (JH); j.j.baelde@lumc.nl (HJB)

³ קבוצת המחקר לפיתוח והתחדשות מעגלים עצביים, KU Leuven, 3000 Leuven, בלגיה; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Group of M3-BIORES, חטיבה להנדסת בריאות בעלי חיים ובריאות אדם, KU Leuven, 3000 Leuven, בלגיה; harold.taeter@kuleuven.be (HT); tomas.norton@kuleuven.be (TN)

⁵נוירוביולוגיה מולקולרית, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, בלגיה; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶המחלקה לרפואת ילדים, היחידה למעבדה לביוכימיה מטבולית, בית החולים לילדים Bambino Gesù, IRCCS, 00146 רומא, איטליה; sara.cairoli@opbg.net (SC); biancamaria.goffredo@opbg.net (BG)

⁷מעבדה לגילוי ביולוגי מולקולרי, KU Leuven, 3000 Leuven, בלגיה; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸המחלקה לנפרולוגיה ילדים, המרכז הרפואי האוניברסיטאי Radboud, 6525 GA Nijmegen, הולנד

^*התכתבות: elena.levtchenko@uzleuven.be; טל.: פלוס 32-16-34-38-22

^† מחברים אלה תרמו באותה מידה לעבודה זו.

תַקצִיר:ציסטינוזההיא מחלה נדירה, חשוכת מרפא, אוטוזומלית רצסיבית הנגרמת על ידי מוטציות בגן CTNS. גן זה מקודד את ציסטין טרנספורטר ליזוזומלי של ציסטין, המוביל להצטברות ציסטין ליזוזומלי בכל תאי הגוף, כאשר הכליות הן האיברים המושפעים הראשונים. הטיפול הנוכחי עם ציסטאמין מקטין את הצטברות ציסטין אך אינו מחזיר את הפרעות בתפקוד הצינורי הפרוקסימלי, פציעה גלומרולרית או אובדן שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתפוּנקצִיָה. במחקר הקודם שלנו, פיתחנו מודל של דגי זברה של ציסטינוזיס באמצעות מוטציה שטות בגן CTNS והראינו שזחלי הזברה משחזרים אתכִּליָהפנוטיפ המתואר בבני אדם. במחקר הנוכחי אפיינו את המבוגרציסטינוזיסמודל דג הזברה והעריך את ההשפעות ארוכות הטווח של המחלה עלכִּליָהוחוץ כליות איברים באמצעות מחקרים ביוכימיים, היסטולוגיים, פוריות ופעילות תנועתית. גילינו שהמבוגרציסטינוזיסדג הזברה מציג הצטברות ציסטין באיברים שונים, שינוי במורפולוגיה של הכליות, הפרעה בפיגמנטציה של העור, ירידה בפוריות, שינוי בפעילות התנועתית, ואנומליות עיניים. בסך הכל, הנתונים שלנו מצביעים על כך שהמבוגרציסטינוזיסמודל דג הזברה משחזר מספר פנוטיפים אנושיים של ציסטינוזיס ועשוי להיות שימושי ללימוד פתופיזיולוגיה והשפעות ארוכות טווח של טיפולים חדשים.

מילות מפתח:כִּליָהמַחֲלָה;ציסטינוזיס; דגם דג זברה;שֶׁל הַכְּלָיוֹתוחוץ כליות תוֹפָעָה; מאפיינים פנוטיפיים למבוגרים

1. הקדמה

ציסטינוזההיא הפרעת אחסון אוטוזומלית רצסיבית הנגרמת על ידי מוטציות בגן CTNS המקודד לפרוטון הציסטין הליזוזומלי קוטרנספורטר cystinosis, הנושא את הציסטין מהלומן הליזוזומלי אל הציטוזול. מספר איברים מעורבים במחלה, כמו שרירים, אשכים, עיניים ומוח, ובין כולם,כליותהם האיברים הראשונים והמושפעים ביותר [1]. הווריאציה הקלינית השכיחה והחמורה ביותר היא הנפרופתיה האינפנטיליתציסטינוזיס, שבו הביטוי הקליני הראשון הוא השֶׁל הַכְּלָיוֹתתסמונת Fanconi, המאופיינת בתא אפיתל פרוקסימלי צינורי לקוי

(PTE) ספיגה חוזרת וכתוצאה מכך לאובדן שתן של חומצות אמינו, גלוקוז, חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך עד בינוני ומטבוליטים אחרים. הנזק של PTEC מלווה בחוסר תפקוד גלומרולרי מתקדם, וכאשר אינו מטופל, מוביל לשלב הסופיכִּליָהמחלה [1]. הגישה הטיפולית הנוכחית מורכבת מציסטאמין, שהוא טיול אמינו מדלדל ציסטין השובר את גשר הדיסולפיד של ציסטאין, וכתוצאה מכך היווצרות חומצת אמינו ציסטאין ודיסולפיד מעורב ציסטאמין-ציסטאין. מולקולה אחרונה זו יכולה לצאת מזומים באמצעות מעביר חומצת אמינו PQLC2[2]. עם זאת, טיפול בציסטאמין, למרות הפחתת הצטברות ציסטין ליזוזומלית, רק מעכב את התקדמות המחלה [3-5]. לכן, הבנה נוספת של הפתוגנזה שלציסטינוזיסופיתוח חדש אונס עדיין על סדר היום המחקרי. מספר מודלים של בעלי חיים פותחו על מנת לשחזר את הפנוטיפ של הציסטינוזיס [6,7]. אחד הדגמים הנפוצים ביותר הוא העכבר Ctns−/− C57BL/6, המפתח הצטברות ציסטין וטובולופתיה פרוקסימלית קלה. עם זאת, הוא אינו מראה נזק גלומרולרי והפנוטיפ נמצא תלוי ברקע הגנטי [8].

עד כה, מודלים של דגי זברה הפכו לכלי אטרקטיבי לחקר מחלות אנושיות בשל מספר יתרונות כגון התפתחותם המהירה, פריון גבוה, עלות תחזוקה נמוכה יותר וזמינותן של טכנולוגיות עריכת גנים ניתנות ליישום בקלות [9]. במחקר קודם, הצגנו מודל מולד של זחלי זברה עם מוטציית שטות הומוזיגוטית באקסון 8 של הגן ctns−/−, וכתוצאה מכך אובדן תפקודי של ציסטינוזה [10], המוביל להצטברות ציסטין בכל הגוף, גדל עיוות זחלים, עיכוב בהתפתחות, וכִּליָהנֵזֶק. עם זאת, השלכות מחלה ארוכות טווח בדגי זברה בוגרים לא נחקרו עד כה. במחקר הנוכחי, שאפנו לאפיין אתשֶׁל הַכְּלָיוֹתוביטויים חוץ-כליים במודל דג הזברה הבוגר שלציסטינוזיס.

לחץ על אורגניCistanche למחלת כליות

2. תוצאות

2.1. ציסטין מצטבר ב-Ctns-/- זברה

ציסטינוזהנחשבת להפרעה רב מערכתית הגורמת להצטברות ציסטין בכל תאי הגוף. בעבודה הקודמת שלנו, מצאנו שדגי הזברה בציסטינוזיס (ctns-/-) מציגים הצטברות ציסטין החל משלב ההתפתחות הזחל ובמספר איברים עד גיל 8 חודשים [9]. על מנת להעריך אם המודל שלנו שומר על הצטברות ציסטין בשלבים מאוחרים יותר של המחלה, מדדנו את רמות הציסטין בכל הגוף,כִּליָה, אשך, עיניים, שרירים ומוח ב-18-ctns-/− זברה בני חודש בהשוואה לדגי זברה זכרים מסוג בר תואם גיל. מצאנו עלייה של פי 54- בתכולת ציסטין בכל הגוף (איור 1A) ועלייה של פי 146- בכליה (איור 1B) של דג זברה ctns-/− בהשוואה לזברה מסוג בר. יתרה מכך, צפינו בהצטברות נרחבת של ציסטין באשך, בעיניים, בשריר ובמוח (איור 1C-F) אצל ctns-/- זברה.

2.2. ביטוי כליות

2.2.1. Ctns−/− Zebrafish מציג נזק PTEC

מאזכִּליָההוא האיבר הפגוע ביותר, בדקנו את המאפיינים ההיסטולוגיים של הכליה באמצעות צביעת Hematoxylin ו-Eosin(H&E) ו-Periodic Acid-Shiff(PAS). ציינו את נוכחותם של נפיחות עכורה, טיפות אאוזינופיליות דמויות היילין ו-vacuole ציטופלזמיים ב-PTEC של דגי זברה ctns-/- (איור 2B, D), אך לא בדגי זברה מסוג פרא (איור 2A, C). יש לציין, לא נמצא נזק צינורי דיסטלי. גבישי ציסטין נצפו בעבר ב-PTEC כ-vacuoles ציטופלזמיים בעלי צורות מלבניות או פולימורפיות [11]. לכן, חקרנו אם מבנים אלה היו קיימים גם בצינוריות של דג זברה. מצאנו ואקוולים ציטופלזמיים רבים ב-PTEC של דג הזברה ctns-/- דרך צביעה כחולה טולואידין (איור 3B, D, מסומן בכוכביות). בנוסף, מצאנו חלל ואקוולרי עם צורות מלבניות או פולימורפיות (איור 3B, D, מסומן עם ראשי חץ). אישרנו את הממצא הזה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים העברה (TEM) (איור 3F). מבנים אלה לא היו נוכחים ב-PTEC של דגי זברה מסוג פרא (איור 3A, C, E). מעניין לציין שבנוסף לנוכחות של ואקוולים בצורת פולימורפית, ראינו אובדן חלקי של גבול המברשת באולטרה-מבנה של PTEC (איור 3F).

איור 1. תוכן ציסטין בהומוגניות של דג פראי ו-ctns-/- דג הזברה. (A–F) תוכן ציסטין בכל הגוף (A),כִּליָה(B), אשך (C), עיניים (D), שריר (E) ומוח (F) בדג זברה זכר בן חודש מסוג פראי ו-ctns−/− 18-. ריכוז ציסטין מתבטא כ-nmol/mg חלבון. כל נקודה מייצגת דג זברה אחד, בסך הכל n=3 סוג בר ו-n=3 סנט−/− 18-זברה זכר בן חודש; מבחן t לא מזווג עם התיקון של Welch, דו-זנבתי: * p < 0.05;=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

איור 2.כִּליָההיסטולוגיה בדגי זברה מסוג בר ו-ctns-/-. (א, ב) תמונות מייצגות שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתצינורות של סוג בר (A) ו-ctns−/− (B) 18-זברה בן חודש. פרטים של צינוריות פרוקסימליות עם טיפות אאוזינופיליות דמויות היאלין (ראשי חץ שחורים) ו-vacuole ציטופלזמי (*). צביעת H&E. פסי קנה המידה מייצגים 50 מיקרומטר. (C,D) תמונות מייצגות של צביעת PAS של צינוריות כליה מסוג פראי (C) ו-ctns-/- (D) 18- זברה בני חודש. פרטים של צינוריות פרוקסימליות עם טיפות דמויות היאלין (ראשי חץ שחורים) ו-vacuole ציטופלזמי (*). צביעת PAS. פסי קנה המידה מייצגים 50 מיקרומטר. PT: צינורית פרוקסימלית; DT: צינור דיסטלי.

איור 3.כִּליָהגבישי ציסטין ב-PTEC של דג זברה מסוג פראי ו-ctns-/-. (א, ב) נציג toluidine כחול מוכתם תמונות שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתצינורות פרוקסימליים בסוג פראי (A) ו-ctns−/− (B) 18-זברה בני חודש. פסי קנה המידה מייצגים 50 מיקרומטר. (C,D) איורים 3C, D מציגים הגדלה גבוהה יותר של איור 3A,B. פרטים של צינוריות פרוקסימליות כליה עם ואקוולים ציטופלזמיים ((D); *), חללים ואקואולרים מלבניים ופולימורפיים ((D); ראשי חץ שחורים). (E, F) תמונות TEM מייצגות של הצינורית הפרוקסימלית הכלייתית של סוג פראי (E) ו-ctns-/- 18- דג זברה בן חודש (F). (ו) אובדן חלקי של גבול מברשת פרוקסימלטובולי (PB) והצטברות של ואקוולים מלבניים ופולימורפיים (*) נצפו באבובית הפרוקסימלית הכלייתית של דגי זברה. התצוגה בהגדלה גבוהה של המלבן בפינה הימנית התחתונה מציגה את הוואקווולים הפולימורפיים ו-vacuole גדול עם מקטעי גבול קרום ישרים (קו ישר). פסי קנה המידה מייצגים 5 מיקרומטר.

2.2.2. Ctns−/− דג הזברה מציג היפרטרופיה גלומרולרית

מכיוון שנזק גלומרולרי בדרך כלל עוקב אחר נגעי PTEC, הערכנו את ההיסטולוגיה הגלומרולרית של דג הזברה, וצפינו שדגי מלזברה הראו הגדלה משמעותית של קפסולת באומן (איור 4B, E 4), ו-Figur 4 (Figur B, 4, אבל לא רווח, B), , G) בהשוואה לזכר זברה מסוג פראי (איור 4A, E-G). אותו הדבר אושר לגבי הגלומרולרי של דגי זברה נשיות הנושאות את המוטציה ctns-/− (איור 4F), ומגמה דומה נצפתה במדידות של המרחב של Bowman ושל קפסולת Bowman's (איור 4E, G). לא נצפתה התפשטות של תאים מזונגיים או גלומרולוסקלרוזיס. בתמונות TEM, לא צפינו בשינויים בממברנת הבסיס הגלומרולרית, בחיסול תהליך כף הרגל של פודוציטים, או בתאי אנדותל מאופקים בצורה לא תקינה בגלומרולי של דג זברה ctns-/- (איור 4D) בהשוואה לזברה מסוג פרא (איור 4C).

איור 4. מורפולוגיה גלומרולרית בסוג פראי וב-ctns-/- דג הזברה. (א, ב) תמונות מייצגות של הגלומרולוס של דג פראי (A) ו-ctns−/− (B) 18-זברה בן חודש. צביעת PAS. פסי קנה המידה מייצגים 50 מיקרומטר. (C,D) תמונות TEM מייצגות של הגלומרולוס של דג זברה מסוג בר (ctns−/− (D). פסי הסולם מייצגים 1 מיקרומטר. (E–G) כימות שטחי הפנים של קפסולת באומן (E), ציוץ גלומרולרי (F), ומרחב של באומן (G) של דג בר ודגי זברה בשני המינים.

2.2.3. Ctns-/− דג הזברה מוגברת אפופטוזיס ברמת PTEC

לאחר מכן, בדקנו האםציסטינוזיסגרם למוות של תאים במודל דג הזברה שלנו [10,12]. ביצענו צביעה חיסונית של קספאז-3 מפוצלתשֶׁל הַכְּלָיוֹתרקמות של זברה מסוג פראי ו-ctns-/- וצפינו בעלייה משמעותית של רמות חלבון caspase3 מפוצל ב-PTEC של ctns-/- זברה (איור 5B, D, G) בהשוואה לדגי זברה מסוג פרא (איור 5A, C, ז) בשני המינים. הביטוי של caspase מבוקע -3 היה קיים בעיקר בתאים המציגים את ה-vacuoles הפולימורפי הציטופלזמי (איור 5B, D). לא היה ביטוי של caspase מפוצל -3 ב- glomeruli, הן בסוג הבר והן ב-ctns−/− זברה (איור 5E, F).

איור 5. אפופטוזיס מוגברת ב-PTECs עם vacuoles ב- ctns-/- דג הזברה. (א, ב) תמונות מייצגות של צביעה חיסונית של caspase-3 של צינוריות מסוג פרא (A) ו-ctns- דג זברה ישן. פסי קנה המידה מייצגים 50 מיקרומטר. (C,D) הלוחות התחתונים מראים הגדלה גבוהה יותר של האזורים המסודרים בפאנלים העליונים. פרטים של PTECs עם ואקוולים ציטופלזמיים (*). פסי קנה המידה מייצגים 50 מיקרומטר. (E, F) תמונות מייצגות של צביעה חיסונית של caspase-3 של גלומרולוס מסוג פראי (E) ו-ctns−/− (F) 18-זברה בן חודש. פסי קנה המידה מייצגים 50 מיקרומטר. (ז) הכימות של האזור החיובי המכתים את הקספס הצינורי-3 בסוג פראי ודגי זברה בשני המינים. כל נקודה מייצגת דג זברה אחד, בסך הכל n=3 פראי ו-ctns−/− 18-זברה בן חודש. ANOVA דו-כיווני עם בדיקת פישר לפחות מובהקת (PLSD): ** p < 0.01;="" ***="" p=""><>

2.3. גילויי כליות נוספים

2.3.1. Ctns-/- דג זברה מציג תבנית עור מנוקד אופיינית בהיפופיגמנטציה

ציסטינוזהמטופלים מראים לעתים קרובות הזדקנות מוקדמת של העור, היפופיגמנטציה ושיער בלונדיני [1,13]. מעניין לציין שצפינו בדפוס מנוקד בהיפופיגמנטציה של העור של דגי זברה ctns-/-, בעוד שדגים מסוג פרא הציגו את דפוס הפסים השחורים האופייניים. הפנוטיפ קיים בשני המינים במהלך כל חייהם (איור 6A, B). על מנת לחקור את ההבדל בפיגמנטציה, ביצענו צביעת PAS על עור דג הזברה ומצאנו ש-ctns-/- דג הזברה מציג פיזור שונה של שכבת המלנין באפידרמיס, מה שגרם לדפוס הכתמים הבהיר (איור 6C, D).

איור 6. דפוס עור מנוקד בהיפופיגמנטציה בדג הזברה ctns-/-. (א, ב) תמונות מייצגות של דג פראי (A) ו-ctns−/− (B) 18-זברה בני חודש. פסי קנה המידה מייצגים 0.5 ס"מ. ראשי החצים השחורים מציינים את דפוסי העור המפוספסים השונים. (C,D) תמונות מוכתמות ב-PAS של האפידרמיס של דג זברה בן חודש (C) ו-ctns-/- (D) 18-. ראשי החצים השחורים מדגישים את שכבת המלנין. ההפרעה בשכבת המלנין קיימת ב- ctns-/- (D) בעוד שהיא נעדרת בדג הזברה (C). פסי קנה המידה מייצגים 50 מיקרומטר

2.3.2. Ctns−/− דג הזברה מציג ציסטות זרעוניות מועשרות בזרעונים

ציסטינוזהידוע כמשפיע על תפקודי האשכים, וכתוצאה מכך אזוספרמיה ועקרות בחולים גברים [14-16]. מקורה של אזוספרמיה עדיין לא ברור, אם כי spermatogenesis הוכח כי הוא שלם ברמת האשכים. בניגוד לחולים גברים, נקבות עם ציסטינוזיס פוריות [17]. במודל דג הזברה שלנו, דג הזברה נקבה וזכר הן פוריות. על מנת לחקור האם מוטציית ctns−/− משפיעה על האנטומיה של האשך, ביצענו צביעת PAS ומצאנו הצטברות מוגברת של spermatozoa בציסטות spermatogenic בדגי זברה ctns−/−

איור 7. ציסטות spermatogenic מועשרות spermatozoa ב ctns-/- דג הזברה. (א, ב) תמונות מוכתמות של נציג H&E של אשך מסוג בר (A) ו-ctns-/- (B) 18- דג זברה בן חודש. כחול כהה וצביעה מעוגלת מייצגים את הזרעונים שהצטברו בציסטות הזרעוניות (מסומן עם הכוכביות). פסי קנה המידה מייצגים 200 מיקרומטר.

2.3.3. Ctns−/− נקבות זברה מציגות ירידה בייצור הביצים

על מנת לחקור את הפונקציונליות של מערכת הרבייה, מדדנו את ייצור הביציות ואת אחוז הביציות המופריות הן בדגי הבר והן בדגי הזברה. מצאנו כי נקבות ctns-/- מראות ירידה בייצור ביצים (איור 8A) וירידה באחוז הביציות המופרות (איור 8B) בהשוואה לנקבות מסוג פרא.

איור 8. ייצור ביצים ואחוז ביציות מופרות בדגי זברה מסוג בר ו-ctns-/-. (א) ייצור ביצים נמדד כמספר כולל של ביצים בדגי זברה מסוג בר ו-ctns−/− 18-זברה בני חודש. קצב ייצור הביצים גבוה ב-1.941 בדגי זברה מסוג בר בהשוואה ל-ctns−/− דג זברה בני 18 חודשים (יחס שיעור=1.941); 95 אחוז CI (גבול תחתון=1.165, גבול גבוה יותר=3.234); ניתוח רגרסיה של Poisson; ע'=0.011. (ב) אחוז הביציות המופרות נמדד על סך הביציות. הסיכויים של הביצים המופרות גבוהים ב-3.504 בדגי זברה מסוג בר בהשוואה ל-ctns−/− 18-זברה בני חודשים (יחס סיכויים=3.504); 95 אחוז CI (גבול תחתון=2.005, גבול גבוה יותר=6.124); ניתוח רגרסיה לוגיסטית; p < 0.001;="" לא="" רלוונטי:="" לא="">

2.3.4. Ctns−/− תצוגת דג זברה ירידה בפעילות התנועה

מאז אובחנו דלדול שרירים וחולשה בציסטינוזיסחולים, בדרך כלל מהעשור השני לחייהם [1,18], הערכנו את הפעילות התנועתית במודל דג הזברה שלנו. גילינו שדג הזברה ctns-/- משני המינים הראו ירידה בפעילות התנועה בהשוואה לדג הזברה מסוג פרא, מה שמרמז על תפקוד שריר לקוי (איור 9). עם זאת, ניתוח היסטולוגי של רקמת שריר השלד לא גילה חריגות לכאורה בדג הזברה ctns-/-.