הערכה כמותית של הסתננות דלקתיות בביופסיות של השתלות כליה באמצעות הגברת אותות טירמיד מרובה ולמידה עמוקה

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

מייקה הרמסן¹ולרי וולק²יאן הינריך ברסן²et al

תַקצִיר

תפקוד השתלה מושהה (DGF) הוא גורם סיכון חזק להתפתחות של פיברוזיס בין תאי וניוון צינורי (IFTA) בהשתלות כליה. הערכה כמותית של דלקות דלקתיות בביופסיות כליות של חולי DGF יכולה לחשוף סמנים מנבאים להתפתחות IFTA. במחקר זה, שילבנו הגברת אותות טירמיד מרובה (mTSA) ורשתות עצביות קונבולוציוניות (CNNs) כדי להעריך את המיקרו-סביבה הדלקתית בביופסיות כליה של חולי DGF (n=22) שנלקחו ב-6 שבועות לאחר ההשתלה. המטופלים היו מרובדים לפיתוח IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola מונע מחלת כליות, לחץ כאן כדי לקבל את הדוגמה

מבוא

תפקוד שתל מושהה (DGF) לאחר השתלת כליה הוא רב גורמים וקשור בעיקר למאפייני התורם ולזמן איסכמיה. DGF מתואר בדרך כלל כצורך בדיאליזה תוך 7 ימים לאחר ההשתלה ומהווה גורם סיכון חזק לפגיעה כרונית בהשתלת כליה [1-3]. מרכיב קלאסי של פגיעה כלייתית כרונית הוא נוכחות של פיברוזיס אינטרסטיציאלי וניוון צינורי (IFTA). עם זאת, לא כל חולי DGF מתקדמים להתפתחות של IFTA, והקשר המורכב בין DGF ל-IFTA עדיין לא מובן. ראשית, זה נובע מהפיגור בין אירועים שעלולים לגרום לירידה בתפקוד, ושנית בגלל ההשפעות המשתנות והמורכבות של גורמים פוטנציאליים כגון דחייה ותופעות לוואי של תרופות [1, 4]. הנוכחות הכללית של דלקת ומקרופאגים ספציפיים תוארה במחקרים רבים כמנבא לאובדן שתל [5-8]. עם זאת, התהליכים הפתולוגיים הבסיסיים אינם מובנים במלואם, ורמות גבוהות של דלקת לא מובילות תמיד לאובדן שתל ארוך טווח. כתוצאה מגירויים סביבתיים, מקרופאגים רוכשים פונקציות מיוחדות ומקוטבים לפנוטיפים שונים. מחקרים רבים מצביעים על כך שתתי סוגים ספציפיים של מקרופאגים (לחלופין מקרופאגים מופעלים) מעורבים בעיצוב רקמה מחדש על ידי גרימת תיקון רקמות או פיברוזיס. הקיטוב לכיוון פנוטיפ שיפוץ רקמות (לעיתים פרו-פיברוטי) ידוע כתלוי במגוון רחב של גירויים סביבתיים, בין היתר מסופקים על ידי תת-סוגי לימפוציטים עוזרי T [9-11]. הערכה של אוכלוסיות תאי T-helper בשתל בזמן ה-DGF גילתה תת-סוג T-helper 1 נפוץ, אך מתאמים לתוצאת השתל או התקדמות ל-IFTA לא נחקרו עד כה [12]. הערכה מקיפה של המיקרו-סביבה הדלקתית, המתמקדת במיוחד במקרופאגים ובתת-קבוצות של תאי T-helper בקבוצות חולים שנבחרו בקפידה, עשויה לספק תובנה מדוע חלק מהחולים, אך לא כל חולי DGF, מתקדמים לפיתוח IFTA.

עם זאת, חקירה מקיפה של התנשמות דלקתיות מונעת על ידי מספר מגבלות (טכניות). אימונוהיסטוכימיה מסורתית (IHC) וטכניקות אימונופלואורסצנטיות תומכות בהדמיה של מספר מוגבל של סמני תאים בלבד בקטע רקמה אחד. חיתוך סדרתי של שברי רקמה קטנים ובעלי ערך כמו ביופסיות של כליה אינו רצוי והפרשנות של יחסים בין תאים במקטעים שונים היא קשה. בנוסף, הערכה כמותית של ההסתננות הדלקתית על ידי הערכה ויזואלית מגיעה עם רמה משמעותית של שונות בין צופים [13]. טכניקות עיבוד תמונה מסורתיות כגון סף פיקסלים, פרשת מים ופילוח מבוסס מורפולוגיה מסתמכות על ידע מוקדם של כל ייצוגי התאים המורפולוגיים ועוצמת כתמי הרקמה לאורך מערך הנתונים [14-16]. לכן, שיטות אלה חסרות לעתים קרובות חוסן עבור וריאציות תמונה ביולוגיות וטכניות ומתורגמות גרוע למערכות נתונים חדשות או חיצוניות. עליית הפתולוגיה הדיגיטלית האיצה את הפיתוח של שיטות חלופיות להערכת תמונות של שקופיות שלמות (WSI) [17, 18]. מודלים של למידה עמוקה, במיוחד, רשתות עצביות קונבולוציוניות (CNNs) הוכחו כמסוגלות לפלח ולזהות מבנים ביולוגיים רלוונטיים בשקופיות היסטופתולוגיות [19-23]. לטכניקות אלו יש פוטנציאל לעבור מהערכה חזותית סובייקטיבית ועיבוד תמונה מסורתי לזיהוי תאים מדויק, אובייקטיבי וניתן לשחזור.

מטרת מחקר זה היא לפתח שיטה להערכה אובייקטיבית וכמותית של סמני תאים דלקתיים מרובים, ולעקוף את הצורך בחתך שקופיות סדרתי נרחב. לשם כך, אנו משלבים IHC מרובים, הדמיה רב-ספקטרלית ומודלים של למידה עמוקה. כדי להדגים את הישימות של טכניקות אלה, אנו חוקרים את המתאמים של המיקרו-סביבה הדלקתית, המכומתת על ידי מודלים של למידה עמוקה, עם פיתוח של IFTA בביופסיות השתלות מעקב של חולי DGF.

תמצית cistanche לטיפול במחלות כליות

חומרים ושיטות

כדי להעריך את המיקרו-סביבה הדלקתית בביופסיות כליות של חולי DGF, ביצענו IHC מרובים בביופסיות מעקב שנלקחו 6 שבועות לאחר ההשתלה. המטופלים היו מרובדים לפיתוח IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

דגימות רקמות

השתמשנו בביופסיות מעקב של מושתלי כליה בבית הספר לרפואה בהנובר (הנובר, גרמניה), שנרכשו במסגרת תוכנית ביופסיית מעקב פרוספקטיבית. קריטריוני הכללה היו: התרחשות DGF (מוגדר כ<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

הערכת IFTA

היקף הפיברוזיס הבין-סטיציאלי (ci) וניוון צינורי (ct) (IFTA) לאחר 6 שבועות ו-6 חודשים, לידי ביטוי באמצעות מערכת דירוג הנגעים של Banff [24] נרכש מהדוח הפתולוגי. כדי להעריך את הקשר בין התנפלות דלקתית מוקדמת לפיתוח IFTA ביתר פירוט, כל השקופיות המוכתמות ב-PAS הועברו דיגיטאליות לבדיקה חוזרת באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי Pannoramic 250 Flash II (3DHistech, הונגריה) עם 20 × אובייקט ברזולוציה של 0.24 מיקרומטר/פיקסל. ה-PAS WSI של שתי נקודות הזמן (6 שבועות ו-6 חודשים) נמדדו עבור מידת ה-IFTA (אחוז משטח הפנים, עם מרווחים של 10 אחוזים) על ידי שלושה פתולוגים כליות. ציוני ה-IFTA הממוצעים של הפתולוגים שימשו כציון סופי כדי לחשב את השינוי ב-IFTA בין 6 שבועות ל-6 חודשים לאחר ההשתלה. המטופלים רובדו לפי עלייה מוחלטת בציון IFTA של 10 אחוזים או יותר (n=13) ולא או<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

בנוסף, ציוני הנגע ב-Banff הושוו בין נקודות זמן באמצעות מבחן הדרגות החתומות של Wilcoxon. זה חשף הבדלים משמעותיים בין ביופסיות של 6 שבועות ל-6 חודשים עבור קטגוריות Banff ti (p=0.017), ci (p=0.004) ו-ct (p=0.011) .

צביעת TSA מרובה

ביצענו Multiplex IHC באמצעות mTSA כדי להמחיש סמני תאים מרובים בביופסיות של 6 השבועות. לאחר דגירה עם נוגדן ראשוני ומשני, הרקמה טופלה בטירמיד מסומן פלורסנטי. פרוקסידאז חזרת מהנוגדן המשני מזרז יצירת רדיקלים פעילים של טירמיד. רדיקלי הטירמיד נקשרים באופן קוולנטי לשאריות הטירוזין על האנטיגן. קשירה קבועה זו אפשרה הסרה הנגרמת על ידי חום של קומפלקס הנוגדנים הראשוני-משני תוך שמירה על משקע הטירמיד הפלורסצנטי [25]. זה אפשר את הדגירה העוקבת עם נוגדנים נוספים מאותו המין נגד אנטיגני המטרה.

mTSA בוצע בשתי שקופיות עוקבות מביופסיות המעקב של 6 שבועות. פיתחנו שני פאנלים של mTSA כדי להעריך את ההסתננות הדלקתית ואת היקף הנימים הפריטבולרי בקבוצות החולים שלנו. לוח I היה קיים של נוגדנים נגד CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 ו-CD34. פאנל II שימש כדי לחקור את הקיטוב של תאי T-helper ומקרופאגים על ידי שימוש בנוגדנים נגד CD4, Tbet, GATA3, CD68 ו-CD163. מפרטי נוגדנים, דילולים וסדרי צביעה מפורטים בטבלה משלימה 1. כל השקופיות עברו דה-פרפינציה בקסילן, התייבשו ב-95% אתנול, נשטפו במי ברז והורתחו לצורך שליפת אפיטופים ב-10x trisborate-EDTA (TBE) מדולל. , 0658, VWR Life Sciences, US) חיץ. לאחר התקררות, השקופיות נשטפו בתמיסת מי חמצן של 3 אחוזים לחסימת פרוקסידאז אנדוגנית ונשטפו עם חיץ מלוח טריס-buffered עם 0.05 אחוז Tween 20 (822184, Merck KGaA, גרמניה) (TBS-T). חסימת חלבון בוצעה באמצעות TBS-T עם 1 אחוז אלבומין בסרום בקר (BSA) (mTSA step 1). נוגדנים ראשוניים הודגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, או לילה בארבע מעלות צלזיוס (mTSA שלב 2). לאחר שטיפה ב-TBS-T, השקופיות הודגרו עם נוגדן משני מצומד HRP (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, הולנד) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (שלב 3 mTSA). לאחר מכן, TSA בוצע באמצעות ה-Opal TSA fluorophores מ-Opal 7-צבע IHC Kit (NEL811001KT, Akoya Biosciences, ארה"ב) (mTSA שלב 4) (פלואורופורים והנוגדנים המתאימים להם מפורטים בטבלה משלימה 1). קומפלקס הנוגדנים-TSA הוסר עם מחזור רתיחה במאגר TBE (שלב mTSA 5). שלבי mTSA 1-5 חזרו על עצמם עד שהשקופיות נצבעו בכל הנוגדנים מהלוח הנוגע. השקופיות כוסו ב-fluoromount-G עם DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, ארה"ב).

herba cistanche

אימות TSA מרובה

מחזורי רתיחה חוזרים יכולים להשפיע על זיקת האפיטופ היעד. נוגדנים מסוימים מראים דפוס צביעה חלש יותר לאחר רתיחה של הרקמה מספר פעמים, נוגדנים אחרים זקוקים ליותר מחזורי רתיחה כדי להגיע לעוצמת הצביעה האופטימלית, ואחרים אינם מושפעים כלל. הערכנו את ההשפעה הזו עבור כל הנוגדנים באמצעות IHC כרומוגני על רקמת שקד בקרת FFPE. עבור כל נוגדן שנבדק (n=9), נחתכו שישה חלקים (עובי 4 מיקרומטר). כל השקופיות עברו דה-פרפיניזציה בקסילן, התייבשו ב-95 אחוז אתנול, נשטפו במי ברז והורתחו לצורך שליפת אפיטופים ב-TBE מדולל פי 10 (מחזור רתיחה ראשון). לאחר התקררות, שקופית אחת לכל נוגדן שנבדק אוחסנה במי מלח עם פוספט (PBS). שאר השקופיות הותרו שוב. מחזור זה חזר על עצמו חמש פעמים. כל השקופיות נשטפו לאחר מכן בתמיסת מי חמצן של 3 אחוז ולאחר מכן שטיפה ב-PBS. נוגדנים ראשוניים (טבלה משלימה 1) הודגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, השקופיות נשטפו ב-PBS. שקופיות מוכתמות בנוגדנים אנטי-CD68, טיבט ו-GATA3 דרשו דגירה נוספת עם חסימת נוגדנים לאחר (PAB) למשך 15 דקות (חסימת VWRKDPVB, Immunologic, הולנד). לאחר הדגירה, השקופיות נשטפו ב-PBS והודגרו עם נוגדן משני מצומד HRP (בעקבות PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, הולנד, עבור אחרים, ראה טבלה משלימה 1 של נוגדן משני). הדמיה בוצעה באמצעות 3,3′- diaminobenzidine (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, הולנד). התוצאות מוצגות באיור משלים 1. בהתבסס על תוצאות אלו, קבענו את סדר הנוגדנים האופטימלי עבור ניסויי mTSA, כפי שמופיע בטבלה משלימה 1.

אם אפיטופים של עניין ממוקמים יחד, מרבצי הטירמיד יכולים להפריע זה לזה. כדי לבדוק את העיכוב הסטרי הזה, השתמשנו בשקופיות רקמות בקרת שקדים וצבענו אותן עם לוחות ה-mTSA שלנו. ביטוי הנוגדנים ב-mTSA הושווה לזה בשקפים מוכתמים בודדים, שעברו אותו מספר של מחזורי רתיחה. לא ראינו הבדלים בדפוסי צביעה בין השקופיות המוכתמות ביחיד ומרבבי (דוגמאות כלולות בלוח I, איורים משלימים 2 ו-3). כל הנוגדנים העיקריים ב-mTSA שימשו באותו דילול ששימש ל-IHC כרומוגני. עוצמת האות הפלורסנטי עברה אופטימיזציה על ידי התאמת דילול תמיסת ה-TSA.

הדמיית TSA מרובה

הדמיה רב-ספקטרלית בוצעה באמצעות מערכת הדמיה Vectra Polaris (CLS143455, Akoya Biosciences, ארה"ב) עם מטרה של 20x, ברזולוציה של 0.49 מיקרומטר לפיקסל, ובאמצעות DAPI, FITC, CY3, Texas Red, ו קוביות ספקטרליות Cy5. מערכת Vectra מאפשרת בחירה ידנית של אזורים לרכישה רב-ספקטרלית, אשר מחולקים לאחר מכן על ידי המערכת לאריחים (איור 1.1). הספקטרום של הקרינה האוטומטית וכל הפלואורופורים של Opal TSA תועדו מראש ב"ספרייה" ספקטרלית באמצעות Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, ארה"ב). הספרייה הספקטרלית אפשרה את פירוק האריח המרובה למספר רב של אריחים בודדים המייצגים את התרומה של כל פלואורופור ("בלתי ערבוב"). זה הביא לאריחים מונו כרום, רב-ערוציים, כל תעלה תואמת לפלואורופור בודד ולפיכך, נוגדן (איור 1.2).

המרה ל-IHC מלאכותי של שדה בהיר

בהתבסס על קואורדינטות מאוחסנות, האריחים נתפרו ליצירת WSI רב-ערוצי באמצעות סקריפט פיתון מותאם אישית (איור 1.3). הערוצים המייצגים את אות DAPI (IDAPI) והתעלות המייצגות את אחד הנוגדנים (IIHC) הומרו לצביעה מלאכותית של המטוקסילין ו-DAB, בהתאמה (איורים 1.4 ו-1.5). בהתבסס על המטוקסילין כרומטי ו-DAB Cx ידועים, קואורדינטות Cy לאחר טרנספורמציה של גוון-רוויה-צפיפות (HSD), וקטורי כתמים נרכשו במחקרים קודמים [26, 27]. וקטורי כתמים אלה שימשו לחישוב ערכי אדום-ירוק-כחול עבור שדה הבהיר המלאכותי IHC (איור 1.5), כמו:

עם CR, סט את ספיגת האור של צבע st בחלק האדום של הספקטרום. ערכי B ו-G חושבו באופן דומה.

ניתוח תמונה

אזורי עניין (ROI)

אזורי עניין (ROI) צוינו עבור כל מקרה בקבוצה באמצעות תוכנת הפלטפורמה האוטומטית לניתוח שקופיות (בהקדם האפשרי; גרסה 1.9, זמינה כתוכנת קוד פתוח ב-GitHub). ROIs אלה מורכבים מ-cortical tubulointerstitium, ובכך אינם כוללים את הקפסולה, הגלומרולי והעורקים. מכיוון שדלקת באזורים תת-קפסוליים של הכליה נחשבת לא ספציפית בפתולוגיה של השתלות, הביופסיות במחקר זה נותחו בעיקר למעט האזור התת-קפסולרי (מוגדר כ-400 מיקרומטר מתחת לקפסולה). שנית, חזרנו על הניתוחים כולל האזור התת-קפסולרי. דוגמאות חזותיות של החזר ROI כלולות באיור משלים. 4.

זיהוי לימפוציטים CNN I

תמונות IHC של שדה בהיר מלאכותי המייצגים צביעה CD3, CD4, CD8 ו-CD20 נותחו באמצעות CNN קיים עם ארכיטקטורת U-Net [22, 28]. רשת זו תוכננה במיוחד לזיהוי סמני לימפוציטים ציטופלסמטיים ב-IHC. ביצועי CNN יכולים לבוא לידי ביטוי בדייקנות, זכירה וציון F1-, כאשר:

ה-CNN השיג דיוק של {{0}}.76, ריקול של 0.79 וציון F1- של 0.78 במערך הבדיקה ששימש בעיתון המקורי, המורכב מ-IHC WSI מסורתי. זיהוי של תאים חיוביים בודדים דורש סף פלט CNN, ואחריו עיבוד לאחר. מכיוון שצביעת ה-CD3 בלוח mTSA הייתה חזקה יותר בהשוואה ל-CD4, CD8 ו-CD20, נעשה שימוש בסף זיהוי אובייקט נמוך יותר עבור שלושת האחרונים (0.4) ובסף זיהוי האובייקט המקורי עבור CD3 (0.7). כדי להעריך את ביצועי ה-CNN על IHC WSI של שדה בהיר מלאכותי במחקר זה, ארבעה IHC WSI של שדה בהיר מלאכותי (CD8 ו-CD20 משני מטופלים) שימשו כמבחן במחקר זה. הערות נקודות (n=1115) נוצרו באמצעות תוכנת ASAP. לאחר החלת הרשת, דיוק, ריקול וציון F1- חושבו כדי להעריך את ביצועי CNN. זיהויים נחשבו חיוביים אמיתיים אם הם נמצאו בטווח של 4 מיקרומטר (קוטר לימפוציטים ממוצע) מהערת אמת קרקעית. כאשר נמצאו שני זיהויים בטווח של 4 מיקרומטר, רק הזיהוי שהיה הקרוב ביותר להערה נחשב חיובי אמיתי. לאחר מכן, זיהוי לימפוציטים CNN I שימש לניתוח של כל IHC WSI של שדה בהיר מלאכותי המייצג סמני לימפוציטים ציטופלסמטיים (CD3, CD4, CD8 ו-CD20).

זיהוי לימפוציטים CNN II

הניתוח של IHC WSI בשדה בהיר מלאכותי עם דפוסי צביעה גרעיניים (כפי שהוצגו על ידי T-bet ו-GATA3) ערוצים המייצגים DAPI ו-CD4 נבחרו לשילוב ב-WSI אחד (4). וקטורי כתמים שנרכשו במחקרים קודמים שימשו כדי לצבוע באופן מלאכותי את האות DAPI בכחול (המטוקסילין) ואת האות CD4 חום (DAB), וכתוצאה מכך לשדה בהיר IHC WSI מלאכותי (5).

נדרש הכשרה, אימות ובדיקה של CNN חדש. לשם כך, נחתכו תשע שקופיות מרקמת בקרה של הכליות, השקדים והנספח FFPE. שקופיות אלו נצבעו ב-IHC באנטי-טיבט (שיבוט 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, ארה"ב) ואנטי-GATA3 (שיבוט L50-823, CM -405B, Biocare Medical, הולנד) נוגדנים. השקופיות עברו דיגיטציה באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי Pannoramic 250 Flash II ברזולוציה של 0.12 מיקרומטר/פיקסל. שני משקיפים הפיקו הערות של 5726 נקודות באזורים שונים באמצעות תוכנת ASAP. הערות מחמש שקופיות שימשו להכשרת ארכיטקטורת U-Net CNN באמצעות תיקונים של 256 × 256 פיקסלים עם גודל פיקסל של 0.49 מיקרומטר/פיקסל. שני WSI שימשו לאימות ה-CNN ולקביעת סף זיהוי האובייקט (0.4). ביצועי ה-CNN ב-IHC WSI המסורתיים הוערכו במערך בדיקות שנמנע של שני IHC WSI. ביצועי CNN על IHC WSI של שדה בהיר מלאכותי הוערכו במערך בדיקות משני המורכב מארבעה IHC WSI של שדה בהיר מלאכותי (טיבט ו-GATA3 משני מטופלים) עם 1082 הערות נקודות. דיוק, זכירה וציון F1-חושבו כדי להעריך את הביצועים בשתי קבוצות הבדיקות. זיהויים נחשבו חיוביים אמיתיים אם הם נמצאו בטווח של 4 מיקרומטר מהערת אמת קרקעית. כאשר נמצאו שני זיהויים בטווח של 4 מיקרומטר, רק הזיהוי שהיה הקרוב ביותר להערה נחשב חיובי אמיתי. לאחר מכן, זיהוי לימפוציטים CNN II שימש לניתוח של כל שדה הבהיר IHC WSI מלאכותי המייצג סמנים גרעיניים (לימפוציטים) (טיבט ו-GATA3).

זיהוי מקרופאגים CNN

בניגוד לזיהוי לימפוציטים, הזיהוי של מקרופאגים בודדים אינו חד משמעי. במיוחד בסצינות מקובצות, ניתן לצפות לרמה משמעותית של שונות של צופה. לכן, מספר גדול בהרבה של מקרים והערות אנושיות שימשו כדי להכשיר CNN ייעודי שלישי לזיהוי מקרופאגים CD68 פלוס ו-CD163 פלוס. נאספו שקופיות מוכתמות ב-IHC (n=111) מרקמת כליה מקומית ומושתלת. צביעת IHC בוצעו באמצעות אנטי-CD68 (שיבוט PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, דנמרק או שיבוט KP1, M0876, Dako, דנמרק) או אנטי-CD163 (משובט MRQ -26, או נוגדן 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK). שקופיות IHC עברו דיגיטציה באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי 250 Flash II דיגיטלי או Aperio AT2 Slide Scanner (Leica Biosystems, Wetzlar, גרמניה) ברזולוציה של 0.24 או 0 .25 מיקרומטר/פיקסל, בהתאמה. ארבעה משקיפים הפיקו 37,709 הערות נקודות על פני מספר ROIs ב-WSIs, תוך שימוש בפרוטוקול לביאור מקרופאגים, אשר סוכם לאחר ניסויי פיילוט ראשוניים. ההערות מ-101 שקופיות שימשו להכשרת ארכיטקטורת YoloV2 CNN [29]. Yolo מתאים במיוחד למשימות המכוונות למשימות זיהוי. הרשת, המורכבת משבע שכבות קונבולוציוניות, אומנה על טלאים של 256×256 פיקסלים שחולצו ברזולוציה של 0.98 מיקרומטר/פיקסל עם תיבות תוחמות של 21 מיקרומטר (בהתבסס על גודל מקרופאג ממוצע). עשרה WSI שימשו לאימות ה-CNN ולקביעת סף זיהוי האובייקט (0.45) ופרמטרים לא מקסימליים של דיכוי (0.05). ביצועי ה-CNN ב-IHC WSI המסורתיים הוערכו במערך בדיקות שנמנע של עשרה IHC WSI. ביצועי CNN על IHC WSI מלאכותי של שדה בהיר הוערכו במערך בדיקות משני המורכב מארבעה שדה בהיר IHC WSI מלאכותי (CD68 ו-CD163 משני מטופלים) עם 1033 הערות נקודות. ציוני דיוק, זכירה וציוני F1 חושבו כדי להעריך את הביצועים בשני ערכות המבחנים. גילויים נחשבו חיוביים אמיתיים אם הם נמצאו בטווח של 21 מיקרומטר (קוטר מאקרו-פאג ממוצע) מהערת אמת קרקעית. כאשר נמצאו גילויים נוספים בטווח של 21 מיקרומטר, רק הזיהוי שהיה הקרוב ביותר להערה נחשב חיובי אמיתי. לאחר מכן, זיהוי המקרופאגים CNN שימש לניתוח של כל IHC WSI של שדה הבהיר המלאכותי המייצג סמני מקרופאגים (CD68 ו-CD163).

cistanche tubolosa טסטוסטרון

חיוביות כפולה

החיוביות של תאים עבור שני סמנים (חיוביות כפולה) הוערכה על ידי קביעת מספר הפיקסלים בין זיהוי תאים בערוצים השונים. אם המרחק בין שני גילויי לימפוציטים היה<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

מספרי תאים חושבו בתוך ה-ROI, וצפיפות התאים התבססה על ספירת תאים ושטח ה-ROI המוער.

יחסים מרחביים

זיהוי תאים אוטומטי ב-WSI מאפשר חקירה של יחסים מרחביים בין תאים. המרחק הממוצע הקצר ביותר נקבע (באזורים שאינם כוללים את האזור התת-קפסולארי) עבור תאי CD68 פלוס ותאי CD3 פלוס, CD3 פלוס CD8 פלוס ו-CD20 פלוס ב-WSI של פאנל I עבור שתי קבוצות החולים, ובין תאי CD163 פלוס ו-CD4 פלוס, CD4 פלוס Tbet פלוס ו-CD4 פלוס GATA3 פלוס ב-WSI עבור שתי קבוצות המטופלים.

היקף נימי פריטובולרי

על מנת להעריך את היקף הנימים הפריטבולרי, WSIs לא מעורבים המייצגים את ערוץ CD34 נותחו בפיג'י (ImageJ גרסה 2.0.0, ארה"ב, פקודות מאקרו ותוספים: "פתח ושכפל", "בהקדם האפשרי" קורא ROI") [30]. פיקסלים חיוביים נקבעו באמצעות סף אוטומטי ולאחר מכן הובעו כאחוז ממספר הפיקסלים הכולל בתוך ה-ROI.

ניתוח סטטיסטי

הצפיפות של אוכלוסיות התאים הבאות חושבו בביופסיות של 6 השבועות: לימפוציטים מסוג T (CD3 פלוס ), לימפוציטים T ציטוטוקסיים (CD3 פלוס CD8 פלוס ), לימפוציטים B (CD20 פלוס ), מקרופאגים (CD68 פלוס , לוחות I ו- II), מקרופאגים מקוטבים (CD68 פלוס CD163 פלוס, CD163 פלוס), לימפוציטים T-helper 1 (CD4 פלוס Tbet פלוס), ו-T-helper 2 לימפוציטים (CD4 פלוס GATA3 פלוס). מקדמי המתאם של Spearman חושבו כדי להעריך אם קיים מתאם בין צפיפות לימפוציטים T-helper 1 ו-T-helper 2 (CD4 פלוס Tbet פלוס, CD4 פלוס GATA3 פלוס) וצפיפות מקרופאגים מקוטבים (או CD68 פלוס CD163 פלוס או CD163 פלוס). צפינו באות CD68 (פלואורופור 540 ננומטר) ב-CD4 המלאכותי (פלואורופור 520 ננומטר) IHC של פאנל I. לכן, אנו מדווחים בנוסף על צפיפות התאים עבור תאי CD3 פלוס CD8−. כדי להעריך הבדלים בין קבוצות חולים עם תוצאות IFTA שונות, אנו מדווחים על ערכי צפיפות תאים חציוניים, מינימליים ומקסימליים לכל קבוצה. הבדלים משמעותיים בצפיפות התאים ובהיקף הנימים הפריטבולרי (מוגדר כאחוז הפיקסלים החיוביים של CD34-) בין הקבוצות הוערכו באמצעות מבחן U של Mann–Whitney עבור דגימות עצמאיות. האם מטופלים עם תוצאות IFTA שונות מציגים יחסי CD3 פלוס CD8-/CD3 פלוס CD8 פלוס תאים שונים באופן מובהק, הוערכה באמצעות מבחן t עבור דגימות עצמאיות. הבדלים בין קבוצות חולים ביחסים מרחביים של תאי CD68 פלוס ו-CD163 פלוס עם תאי חיסון אחרים הוערכו לגבי מובהקות באמצעות מבחן U של Mann–Witney עבור דגימות עצמאיות.

תוצאות

זיהוי מבוסס CNN של תאים חיוביים ל-IHC

על מנת ליישם את ה-CNN הקיימים, שפותחו במקור עבור מיקרוסקופיה של שדה בהיר, תמונות פלואורסצנטיות של mTSA הועברו לתמונות שדה בהיר מלאכותיות. דוגמאות של אזורים מוכתמים ב-mTSA עם תמונות IHC של שדה בהיר מלאכותי כלולות באיור 2. דוגמה לשדה בהיר IHC WSI מלאכותי מוצגת באיור משלים. תוכנות כגון ASAP ו- Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. כפי שמוצג באיור 2, השדה הבהיר המלאכותי IHC WSI מתאים לניתוח אוטומטי על ידי CNN שפותחו במקור עבור IHC WSI מסורתי.

שלושה CNNs שימשו להערכה כמותית של תאים דלקתיים בביופסיות מושתלות מושתלות של 6 שבועות ב-mTSA: לזיהוי לימפוציטים עם צביעה ציטופלזמית (CNN I) וגרעינית (CNN II) ולזיהוי מקרופאגים. טבלה 2 מציגה את ביצועי ה-CNN (דיוק, זכירה וציוני F1-) עבור ערכות חזקה של IHC WSI מוכתמים ב-DAB ו-IHC WSI מלאכותיים של שדה בהיר. ביצועי CNN היו בדרך כלל טובים או טובים יותר מה-CNN הבסיסי שתואר קודם (עם ציון F1- של 0.78), שהוכח כבעל ביצועים דומים לצופים ידניים מנוסים [22] . בעוד שזיהוי הלימפוציטים CNN II הראה ביצועים מופחתים במקצת בתמונות של שדה בהיר וירטואלי בהשוואה לתמונות DAB האמיתיות (עליהן הוכשר ה-CNN), ההיפך נצפה עבור CNN לזיהוי מקרופאגים.

דוגמה להערכת חיוביות כפולה אוטומטית מוצלחת כלולה באיור 3.

מתאם בין סוגי תאים שונים

המתאם החזק ביותר נצפה בין צפיפות תאים CD4 פלוס GATA3 פלוס וצפיפות תאים CD163 פלוס (מקדם Spearman's 0.75, p < 0.001)="" ב-="" ביופסיה="" של="" 6="" שבועות="" (איור="" משלים="" 5a).="" מתאם="" זה="" היה="" חלש="" יותר="" בין="" cd4="" פלוס="" tbet="" פלוס="" צפיפות="" תאים="" לבין="" צפיפות="" תאים="" cd163="" פלוס="" (מקדם="" spearman's="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (איור="" משלים.="" 5b)="" .="" כאשר="" מגבילים="" את="" אוכלוסיית="" התאים="" למקרופאגים="" כפולים="" חיוביים="" (cd68="" פלוס="" cd163="" פלוס),="" מקדם="" המתאם="" של="" ספירמן="" היה="" 0.65="" (p="">< 0.01)="" עם="" תאים="" cd4="" פלוס="" gata3="" פלוס="" ו-0.66="" (p=""><0.01) עם="" cd4="" בתוספת="" tbet="" פלוס="" תאים="" (איור="" משלים.="" 5c,="" d).="" הכללת="" האזור="" התת-קפסולרי="" בניתוחים="" לא="" שינתה="" את="">

השוואה בין הסתננות דלקתיתחולים המתקדמים ל-IFTA לעומת לא-IFTA

חולים שהתקדמו ל-IFTA לאחר 6 חודשים הראו צפיפות CD163 פלוס תאים גבוהות יותר באופן משמעותי בביופסיות שנלקחו 6 שבועות לאחר ההשתלה (חציון 505 תאים/מ"ר) לעומת חולים שלא התקדמו ל-IFTA (חציון 370 תאים/ממ"ר; p=0 .043) (טבלה 3). הכללת האזור התת-קפסולרי הביאה להפחתה קלה של אפקט זה (עמ'=0.051). CD68 ו-CD4 שימשו בשני הפאנלים. שקופיות מוכתמות בלוח mTSA I הראו יותר חיוביות של CD68 מאשר השקופיות המוכתמות בלוח mTSA II. צפיפות תאי CD4 גבוהה יותר בלוח mTSA II בהשוואה ללוח mTSA I (טבלה 3).

היקף הנימים הפריטבולרי היה דומה בביופסיות של 6 שבועות של חולי DGF עם תוצאות IFTA שונות (טבלה 3), גם כאשר לא נכללו (p=0.74) וגם כולל (p=0.90) את האזור התת-קפסולרי מתוך/בניתוח.

הערכה של יחסי CD3 פלוס CD8-/CD3 פלוס CD8 פלוס תאים הראתה יחס גבוה יותר באופן משמעותי בחולים עם<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

המרחק הקצר הממוצע מתאי CD68 פלוס לתאי CD3 פלוס , CD3 פלוס CD8 פלוס ו-CD20 פלוס (פאנל I) ומתאים CD163 פלוס לתאי CD4 פלוס , CD4 פלוס Tbet פלוס ו-CD4 פלוס GATA3 פלוס (פאנל II) עשה אין הבדלים משמעותיים בין קבוצות המטופלים. התוצאות מוצגות באיור 4.

תמצית cistanche: שיפור תפקוד הכליות וחוזק פיזי

דִיוּן

במחקר זה, פיתחנו שיטה לכימות מדויקת ואובייקטיבית של תאי דלקת דלקתיים בביופסיות שתל של חולי מושתלי כליה עם DGF אשר עוקפת חיתוך סדרתי נרחב של חומר ביופסיית כליה. למטרה זו, שילבנו IHC מרובה, הגברת אותות טירמיד, הדמיה רב-ספקטרלית וכימות על ידי CNN. היינו הראשונים שהמירו נתונים רב-ספקטרליים עם אריחים לתמונה אחת כרומוגנית מלאכותית לכל סמן תא, מה שהקל על ניתוח WSI ויישום של CNNs המיועדים ל-IHC בשדה בהיר. תכננו שני CNNs חדשים לזיהוי של לימפוציטים ומקרופאגים מוכתמים בגרעין והדגמנו את יכולת ההכללה של CNN שפותחו על IHC WSI מסורתי ל-IHC WSI מלאכותי של שדה בהיר. ישימות השיטה שלנו הוכחה על ידי שימוש בתוצאות הכמותיות שהושגו על ידי ה-CNN כדי לחקור מתאמים של המיקרו-סביבה הדלקתית בביופסיות של 6 שבועות של חולי DGF עם התפתחות של IFTA 6 חודשים לאחר ההשתלה.

השתמשנו בערכת צביעה ידנית זמינה מסחרית ל-Multiplex IHC כדי לדמיין תאי חיסון ונימים פריטובולריים בביופסיות מעקב שהתקבלו 6 שבועות לאחר ההשתלה. הליך הצביעה המרובה כלל שלבי שטיפה, דגירה והרתחת רקמות מרובים וכולל מספר תמיסות מגיב. לכן יש חשיבות רבה לאימות שיטות ובקרות איכות נרחבות, ומומלץ להשתמש בנוגדנים ספציפיים המניבים עוצמת צביעה עקבית. למרות שלבי האימות שבוצעו, נראו דפוסי צביעה דמויי מקרופאגים בערוצי CD4 של שקופיות מלוחות mTSA I ו-II. מחזורי צביעת CD4 ו-CD68 לא בוצעו ברציפות, ולכן תופעה זו לא יכולה להיגרם על ידי הפשטה לא מלאה של הנוגדן CD68 (טבלה משלימה 1). למרות שתוארו התרחשויות נדירות של חיוביות כפולה מקרופאגים עם CD4 [31], הסבר סביר יותר טמון בקרבת ספקטרום הפליטה של ​​הפלואורפורים ששימשו להדמיה של CD4 (520 ננומטר) ו-CD68 (540 ננומטר), שניהם מכוסים על ידי קוביית המסנן FITC של מיקרוסקופ הפלורסצנטי. זה יכול לגרום ל"דימום" של האות החזק של CD68 לתוך ערוץ CD4. חלק גדול מהאות הזה לא נכלל בניתוח בפאנל I מכיוון שרק תאי CD4 פלוס שהיו חיוביים כפולים עם CD3 שימשו לניתוח תאי T-helper כללי. עם זאת, החלטנו להעריך בעקיפין גם תאי T-helper כלליים, תוך שימוש ב-CD3 פלוס CD8- כתחליף. בלוח II, נעשה שימוש ב-CD4 אך ורק בשילוב עם טיבט ו-GATA3, מה שמגביל את הסיכון לשימוש בגילויים חיוביים כוזבים.

חיוביות נמוכה יותר של CD68 נצפתה בפאנל II בהשוואה לפאנל I. אנו משערים שזו תוצאה של עיכוב סטרי על ידי משקע טירמיד השייך ל-CD163 ("אפקט מטריה") [32]. צפינו בהרבה יותר תאים חיוביים ל-CD163- בקבוצה הנחקרה מאשר ברקמת השקדים ששימשה לבדיקת עיכוב סטרי, מה שמסביר אולי מדוע ההשפעה הזו לא התגלתה במהלך האימות.

Multiplex IHC שולב עם הדמיה מולטיספקטרלית לבדיקת המיקרו-סביבה של הגידול במספר מחקרים אונקולוגיים, ולאחרונה גם לניתוח של דחיית שתל הכליה [33-35]. כדי לחלץ את התרומה של כל הסמנים בשקופיות mTSA, קטעים מצטלמים עם מערכת Vectra או מיקרוסקופ פלואורסצנטי דומה עם מערך רב-ספקטרלי. לאחר הקלטת תמונת סקירה בהגדלה נמוכה, מערכת Vectra מחלקת את הרקמה לאריחים וסורקת אוטומטית את האריחים באופן רב ספקטרלי. כתוצאה מכך נוצרים אריחי תמונה עם ספקטרים ​​תורמים מרובים. מכיוון שהספקטרום של הפלואורפורים הבודדים ידועים מה"ספרייה הספקטרלית" המוקלטת מראש, ניתן לפרק את האריחים המרובים למספר רב של אריחים בודדים המייצגים את התרומה של כל פלואורופור ("בלתי ערבוב"). ברוב המחקרים, התמונות הלא מעורבות מנותחות לאחר מכן עם תוכנה מסחרית. במקרים רבים, תוכניות אלה אינן תומכות בניתוח WSI, מתקשות לנתח תאים מקובצים, ולעתים קרובות אינן עמידות בפני חפצים וריאציות של צביעה. המרת האריחים הלא מעורבבים ל-IHC WSI מלאכותיים של שדה בהיר, אפשרה לנו ליישם CNN קיים שתוכנן במיוחד לזיהוי לימפוציטים ב-IHC [22] (המכונה זיהוי לימפוציטים CNN I). רשת זו יכולה לזהות לימפוציטים בודדים ומקובצים עם דיוק גבוה תוך עמידה בפני צביעת רקע (איור 2, CD3). בנוסף, הכשרנו שני CNNs חדשים לאיתור תאים עם דפוסי צביעה גרעיניים (טיבט, GATA3) (זיהוי לימפוציטים CNN II) ולאיתור מקרופאגים. ידוע לשמצה שקשה לזהות מקרופאגים בגלל דפוס ההכתמה המפוזר שלהם. לפיכך, זיהוי המקרופאגים CNN הוכשר באמצעות הערותיהם של ארבעה מומחים שונים. לפני ביצוע ההערות, תוכננו פגישות מרובות בהן נדונו ונבדקו הקריטריונים לביאור מקרופאגים. זה הביא לרשת שיכולה לזהות מקרופאגים בצורה ניתנת לשחזור תוך שהיא חזקה עבור צביעה לא ספציפית (טבלה 2, איור 2 ואיור משלים 6). למיטב ידיעתנו, זהו האלגוריתם הראשון לזיהוי מקרופאגים בקטעים היסטופתולוגיים סרוקים. בדקנו את הביצועים של כל שלוש הרשתות על ערכת מבחנים המורכבת מ-IHC WSI מסורתי (בדומה לאלו המשמשות במהלך אימון) ועל מערך מבחנים משני שהורכב מ-IHC WSI מלאכותי של שדה בהיר, שנוצר מהתמונות המוקלטות בספקטרלי רב. כל רשתות ה-CNN מציגות ביצועים טובים מאוד בקבוצות הבדיקה הראשוניות וציוני F1- דומים בקבוצות הבדיקות המשניות. מדדי הביצועים של זיהוי לימפוציטים CNN I חושבו על רקמה תקינה, חפצים ואשכולות תאים. ה-IHC המלאכותי של שדה הבהיר של מערך הבדיקות השני לא הכיל חפצי רקמה ופחות צבירי תאים. זה יכול להסביר את הביצועים הטובים הכוללים של רשת זו במערך הבדיקה השני. זיהוי המקרופאגים CNN הוכשר ונבדק על סמך הערות מארבעה מפרשים שונים. בעוד קריטריונים להערה נדונו במיוחד, בכל זאת נצפו וריאציות בסגנון ההערה. לכן הרגישות של CNN היא כנראה איפשהו באמצע הקיצוניות בסגנון ההערות. ההערות עבור מערך הבדיקה השני נוצרו על ידי יוצר אחד, התואמים לכאורה את הרגישות של CNN.

השימוש ב-CNN המתואר איפשר לנו לחקור את ההסתרה הדלקתית בדיוק חסר תקדים בסדרה ייחודית של ביופסיות מעקב מוקדם שנבחרו בקפדנות של חולים מושתלים עם DGF.

למרבה הצער, דגימות מרובות נאלצו להחריג מהאנליזה, בעיקר בגלל לא מספיק רקמה לאחר אבחון אבחון. אפילו עם הגודל המוגבל של מערך הנתונים, מצאנו צפיפות CD163 פלוס תאים גבוהות יותר באופן משמעותי בביופסיות של חולי DGF שהתקדמו לפיתוח של IFTA, מה שעולה בקנה אחד עם התפקיד הפרו-פיברוטי הפוטנציאלי של תאים אלה [11]. למרות שהמגמה הנצפית הייתה עקבית עם הנתונים שפורסמו, לא הצלחנו לאשר את ההשפעה המזיקה של נוכחות מוקדמת של CD68 פלוס מקרופאגים שדווחו בעבר עבור קבוצות אחרות של מושתלי כליה [7, 36, 37]. מצאנו מתאם חיובי בין הצפיפות של תאי CD4 פלוס GATA3 פלוס ותאי CD163 פלוס, מה שעשוי לאשר את התרומה של לימפוציטים T-helper 2 לסביבה מיקרו-פרו-פיברוטית. למרות שלא התגלו במחקר זה סמנים ביולוגיים חדשים להתפתחות IFTA בחולי DGF, פיתחנו בהצלחה שיטות להערכה מדויקת, ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה של התנפלות דלקתית ברקמה דלילה כגון ביופסיות השתלות. שיטות אלו בעלות ערך עבור מחקרים כמותיים עתידיים על דלקת ברקמה היסטופתולוגית.

כדי להקל על עייפות יותרת הכליה עם cistanche, לחץ כאן כדי לקבל פרטים נוספים

זמינות נתונים

בקשות לשיתוף פעולה הכרוכות בשימוש בנתונים המוצגים במחקר זה ניתן להפנות למחבר המקביל (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) או ל-FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

תודות

אנו מודים ל-Mark Gorris ו-Kiek Verrijp על העצות שלהם לגבי צביעה והדמיה של mTSA, ל-Merijn van Erp על פיתוח פונקציונליות ImageJ מותאמת אישית, ול-Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg ומרטין אוטן על יצירת אמת קרקעית עבור רשת זיהוי המקרופאגים. בנוסף, אנו מודים לאירינה שפנר על עזרתה באיסוף הנתונים הקליניים.

תרומות מחברMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH ו-JAWML

עיצב את המחקר. חומר המטופל ונתונים קליניים נאספו וסופקו על ידי JS, WG ו-FF. FF ריכז את המאמצים שבוצעו במח"ח. JHB, EJS ו-JK קלעו את השקופית PAS עבור אחוזי IFTA. MH ביצע את צביעת ה-mTSA, אימותים של לוחות I ו-II, והדמיה וביטול ערבוב של פאנל I. VV תמונה ופאנל לא מעורבב II. DJG פיתחה את השיטות להמרת אריחי mTSA ל-WSI מלאכותי של שדה בהיר. מ"ה ביצעה את ההמרות. ZS-C פיתח את ה-CNNs לזיהוי לימפוציטים וכתב את התסריטים לכימות לימפוציטים. JL פיתח את CNNs זיהוי המקרופאגים וכתב את התסריטים לכימות מקרופאגים. MH ביצע את כימות התא והנימים. NSS חישב את מרחקי התא. MH, BS, LBH ו- JAWML ניתחו את הנתונים. MH הכין את הדמויות וניסח את העיתון. הגרסה הסופית של כתב היד תוקנה ואושרה על ידי כל המחברים.

מימוןעבודה זו נתמכה על ידי יוזמת ERACoSysMed (פרויקט SysMIFTA) כחלק מתוכנית המסגרת Horizon 2020 של האיחוד האירופי המוצעת על ידי ZonMw (מענק מס' 9003035004), במימון משותף של משרד המחקר והחינוך הגרמני (BMBF), מענק מס' . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T), ו-FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML קיבלה דמי ייעוץ מפיליפס (הולנד), ומענקים מ

ContextVision, Philips (הולנד) ו-Sectra (שבדיה), מחוץ לעבודה שהוגשה. JK קיבלה תמיכה כלכלית מקרן הכליות ההולנדית (פרויקט DEEPGRAFT, מענק מס' 17OKG23).

עמידה בתקנים אתיים

ניגוד אינטרסיםהמחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

אישור אתיקה והסכמה להשתתפותאיסוף וניתוח הנתונים בוצעו בהסכמה מדעת של המטופל ובאישור ועדת האתיקה (מס' 2765) של בית הספר לרפואה בהנובר.

הערת המוציא לאורSpringer Nature נשאר ניטרלי בכל הנוגע לתביעות שיפוט במפות שפורסמו ובשיוכים מוסדיים.

גישה חופשיתמאמר זה מורשה תחת רישיון Creative Commons Attribution 4.0 בינלאומי, המתיר שימוש, שיתוף, התאמה, הפצה ושכפול בכל מדיום או פורמט, כל עוד אתה נותן קרדיט מתאים למחבר/ים המקוריים ) והמקור, ספקו קישור לרישיון Creative Commons, וציינו אם בוצעו שינויים. התמונות או חומר צד שלישי אחר במאמר זה כלולים ברישיון Creative Commons של המאמר אלא אם צוין אחרת בקו אשראי לחומר. אם החומר אינו כלול ברישיון Creative Commons של המאמר והשימוש המיועד שלך אינו מותר על פי תקנה סטטוטורית או חורג מהשימוש המותר, תצטרך לקבל אישור ישירות מבעל זכויות היוצרים.

הפניות

1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. תפקוד השתלה מושהה בהשתלת הכליה. Am J Transplant. 2011;11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. גורמי סיכון לאובדן שתל ארוך טווח אצל מושתלי כליה עם הפרעות בתפקוד כרוניים של שתל. Exp Clin השתלת. 2010;8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. קשר בין תפקוד שתל מושהה לבין הישרדות אלוגרט והמטופל: סקירה שיטתית ומטה-אנליזה. השתלת חוגה של Nephrol. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. תפקוד השתלת כליה מושהה: ממנגנון לתרגום. כליות אינט. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. ציון הדלקת הכוללת עדיפה על ציון הדלקת הנוכחי של Banff בחיזוי התוצאה ומידת ההפרעה המולקולרית בהשתלות כליה. Am J Transplant. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. חיזוי ירידה שלאחר מכן בתפקוד השתל הכליות מביופסיות מעקב מוקדם. Am J Transplant. 2005;5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. תפקידם של מקרופאגים בפיתוח של פיברוזיס אלוגרט כליות אנושי בשנה הראשונה לאחר ההשתלה. Am J Transplant. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. מקרופאגים מופעלים לחילופין בפתוגנזה של פגיעה כרונית באלוגרט כליות. רופא ילדים נפרול. 2015;30:1007–17.

9. Biswas SK, Mantovani A. פלסטיות מקרופאג ואינטראקציה עם תת-קבוצות לימפוציטים: סרטן כפרדיגמה. נאט אימונול. 2010;11:889–96.

10. אנדרס HJ, Ryu M. מיקרו-סביבות כליות ופנוטיפים של מקרופאגים קובעים התקדמות או פתרון של דלקת כליות ופיברוזיס. כליות אינט. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Macrophages in the organ transplantation. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. T helper 1, 2 ו-17 תת-קבוצות של תאים בחולים מושתלי כליה עם תפקוד שתל מושהה. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. ניקוד של לימפוציטים המסתננים גידולים: מהערכה חזותית ועד למידת מכונה. סמינר סרטן ביול. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. שיטה המבוססת על ניתוח תמונה לכימות של פרמטרים של אינדקס נזק כרוניים באלוגרפט. AMPS. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. יישום אלגוריתמים של פרשת מים לפילוח של גרעינים מקובצים. ציטומטריה. 1997;28:289–97.

16. Lai YK, Rosin PL. סף מעגלי יעיל. IEEE Trans Med Imaging. 2014;23:992– 1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. סקר על למידה עמוקה בניתוח תמונה רפואית. Med Image Anal. 2017;42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. ניתוח תמונה ולמידת מכונה בפתולוגיה דיגיטלית: אתגרים והזדמנויות. Med Image Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. הערכה אבחנתית של אלגוריתמי למידה עמוקה לאיתור גרורות בבלוטות לימפה בנשים עם סרטן השד. JAMA. 2017;318:2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. הערכה היסטופתולוגית מבוססת למידה עמוקה של רקמת הכליה. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.