HLA-G מתבטא באופן נרחב על ידי תאי מאסט באזורים של פיברוזיס איברים בכבד, ריאות וכליות

edmund.chen@wecistanche.com

תַקצִיר:הוכחנו בעבר שתאי מאסט המבטאים HLA-G קשורים לאזורים של נגיף הפטיטיס C המושרהכָּבֵדפיברוזיס. כאן, שאפנו לקבוע אם ביטוי HLA-G בתאי פיטום הוא ספציפי לאטיולוגיה ויראלית,כָּבֵד, או לתהליך הכללי של פיברוזיס. מנינו תאי HLA-G פלוס ותאי פיטום לפי האימונוהיסטוכימיה של (i)כָּבֵדחסימות מ-41 מקרים של שחמת אלכוהול, (ii) 10 של פיברוזיס ריאתי אידיופטי (IPF), ו-(iii) 10 של רנהlפיברוזיס. האופי של תאי HLA-G פלוס צוין על ידי אימונופלוארסצנציה מרובה באמצעות תוכנה. יותר ממחצית מכל תאי HLA-G פלוס היו תאי פיטום באזורים פיפיברוטיים של שחמת אלכוהולית ו-IPF. בתוך הכליות,נתון לפיפיברוזיס, תאי HLA-G plus היו אכן תאי פיטום אך לא ניתן היה לספור אותם. יתרה מכך, במקרים מסוימים שלכָּבֵדוריאות, צפינו במספר צמתים תאיים, שהיו זקיקים משניים או שלישוניים, שבהם HLA-G בא לידי ביטוי גבוה על ידי לימפוציטים B. לסיכום, ניתן היה לצפות בתאי פיטום HLA-G פלוס באזורים הפיפיברוטיים של כל האיברים שנחקרו. מחקרים קודמים מצביעים על תפקיד מגן לתאי HLA-G פלוס נגד דלקות ופיפיברוזיס. הזקיקים שנצפו עם לימפוציטים B המבטאים HLA-G עשויים גם לחזק את תפקידם האנטי-פיברוטי.

מילות מפתח:לַיֶפֶת; HLA-G; תאי תורן; זקיקים; לימפוציטים B; אנטי פיברוטיק; כִּליָה; כָּבֵד

מבואמחלות כרוניות שמובילות לפיפיברוזיס של איברים קשורות לתמותה ותחלואה משמעותיים, המהווים עד 45 אחוז ממקרי המוות במדינות מפותחות [1]. השכיחות של מחלות פיפיברוטיות עולה בהתמדה והיא בעיה חשובה בבריאות הציבור. מחלות פיברוטיות יכולות להשפיע על כל האיברים, כגוןכָּבֵד, כליות, ריאות ולב. פיברוזיס פתולוגי מאופיינת בתצהיר מוגזם של רכיבים של המטריצה ​​החוץ-תאית (ECM), כגון קולגן. הצטברות ECM כזו הורסת את הארכיטקטורה הרגילה של האיבר ומובילה לחוסר תפקוד ואיברים כשל עם שינוי בתפקודים המיוחדים של כל איבר, כלומר, עבורכָּבֵד, הפונקציה של ניקוי רעלים, עבור הריאה, הפונקציה של חילופי גזים, ועבור הכִּליָה,הפונקציה של הסתננות. בנוסף, פיברוזיס יכול לקדם התפתחות של סרטן. השתלה להחלפת האיבר הפיפיברוטי מייצגת לעתים קרובות את האפשרות הטיפולית הטובה ביותר. תהליך הפיפיברוזיס מתרחש בתגובה לפציעה או נזק לרקמות בעקבות תגובה דלקתית מתמשכת או חזקה מדי. פיברוזיס, שהיא בתחילה הפיכה, יכולה להתפתח למצב בלתי הפיך [2]. הכָּבֵדיכול להיפצע על ידי וירוסים (הפטיטיס B, C, D, E), רעלנים פטרייתיים, טפילים, נוגדנים אוטומטיים, תזונה עתירת שומן וצריכת אלכוהול מופרזת, שהיא אטיולוגיה תכופה שלכָּבֵדפיברוזיס [3] ואפילו הגורם העיקרי במדינות מסוימות. כשהעלבונות חוזרים על עצמם, הכָּבֵדמפתחת דלקת כבד כרונית עם פיברוזיס ואחריה פיברוזיס מתקדם או שחמת, שהוא מצב נטייה לקרצינומה של הכבד (HCC).

בריאה, פיברוזיס ריאתי אידיופטי (IPF) מייצג את המחלה הנפוצה ביותר מבין קבוצת המחלות הכוללות פיברוזיס רגישות יתר וריאה שגרונית. מחלת ריאות אינטרסטיציאלית פרוגרסיבית כרונית זו ממקור לא ידוע היא נדירה, ומשפיעה על שלושה מיליון אנשים ברחבי העולם. עם זאת, IPF קשור למוות מוקדם. אכן, IPF מוביל לאי ספיקת נשימה מתקדמת ומייצג גם גורם סיכון עצמאי לסרטן ריאות [4]. השתלת ריאות צריכה להיחשב כאופציה עבור חולים צעירים עם מחלה מתקדמת.

שֶׁל הַכְּלָיוֹתפיברוזיס הוא המסלול השכיח הסופי של פרוגרסיביים רביםמחלות כליות.שכיחות של כרונימחלת כליות, המוביל לשלב הסופימחלת כליות, גדל באופן משמעותי, והשפיע על 10 אחוזים מאוכלוסיית העולם, עם תמותה גבוהה [5]. בנוסף, חולים עם כרונימחלת כליותיש סיכון מוגבר להתפתחכִּליָהסרטן (עד פי 10 מזה של האוכלוסייה הכללית), עם נזק דו-צדדי ו/או רב-מוקדי תכופים [6].

ללא קשר לאיבר שמפתח פיפיברוזיס, חשוב להבין את המנגנונים הכרוכים בהופעתה כדי לפתח טיפולים למניעתה. בפרט, דלקת כרונית מובילהכָּבֵדאוֹשֶׁל הַכְּלָיוֹתפיברוזיס, והשליטה בה עשויים לאפשר להגביל את התקדמותה ואת הופעת אי ספיקת איברים או סרטן. ציטוקינים וכימוקינים ממלאים תפקיד מרכזי הן בכיוון התגובה החיסונית והן בשמירה על הדלקת [7,8]. בנוסף למולקולות החיסוניות הללו, נחקרו חלבונים אחרים, כגון HLA-G, מולקולת HLA Class Ib הידועה בתכונות האימונומודולציה שלה [9]. הדגמנו בעבר ש-HLA-G מתבטא על ידי תאי פיטום הקשורים לאזור של נגיף הפטיטיס C המושרהכָּבֵדפיברוזיס [10,11]. במחקר הנוכחי, חקרנו האם ביטוי HLA-G בתאי פיטום הוא ספציפי לאטיולוגיה ויראלית,כָּבֵד, או תהליך של פיברוזיס, ללא קשר לאיבר. אפינו את ביטוי HLA-G בתאי פיטום ותאי חיסון על בלוקים פרפיפין של קבוצות של 41 חולים עם שחמת אלכוהול הנגרמת על ידי אלכוהול, 10 עם IPF ו-10 עםשֶׁל הַכְּלָיוֹתפיברוזיס. זיהוי מדויק של תאים המבטאים HLA-G בוצע באמצעות אימונופלואורסצנטי מרובע על קטעי פרפיפין ותוכנה המנתחת בנפרד את הפלואורסצנציה וממזגת אותה בשלושה מקרים שלכָּבֵדפיברוזיס הנגרמת על ידי אלכוהול ושתיים של IPF.

תוצאות

ביטוי כמותי והטבע של תאים HLA-G פלוס בפיברוזיס המושרה על ידי אלכוהולמחקר אימונוהיסטוכימיה ראשוני בוצע על סדרה של דגימות פיברוזיס המושרה על ידי אלכוהול (n=41), המאפשר ספירה של תאי HLA-G plus ו-CD117 plus על פני כל השקופיות על ידי ספירה חצי אוטומטית באמצעות תוכנת HALO. התוצאות מסוכמות בטבלה 1.

תאי HLA-G plus ו-CD117 plus נספרו על פני כל פני השטח של שקופיות סדרתיות של 41 מקרים של שחמת אלכוהול באמצעות תוכנת HALO עם האלגוריתם המתאים בעקבות אימונוהיסטוכימיה עם 4H84, המזהה HLA-G, ו-anti-CD117/c-kit. הממוצע, סטיית התקן והטווח מסומנים עבור תאי HLA-G plus ו-CD117 פלוס: 555 ± 699 HLA-G plus /(41-2686) ו-200 ± 271 תאי CD 117 פלוס (12-1113).

המאפיינים המורפולוגיים של תאי HLA-G פלוס בשחמת שחמת המושרה על ידי אלכוהול תואמים באופן אופייני לתאי פיטום (איור 1A). במקרים מסוימים, בוצע תיוג כפול עבור CD117 ותאי מאסט אנושיים והראה שתאי CD117 פלוס הכבד הם תאי פיטום באזור הפיפיברוטי (איור 1A). שלושה מקרים מייצגים של שחמת שחמת הנגרמת על ידי אלכוהול נחקרו על ידי אימונופלואורסצנציה מרובעת וצביעת Sirius Red באמצעות תוכנת HALO לזיהוי מדויק של תאי HLA-G plus. השטח הממוצע של פיפיברוזיס התאים ל-19.4 אחוזיםכָּבֵדרִקמָה. הזיהוי של תאי HLA-G פלוס הראה ש-51 אחוז הם תאי פיטום (טבלה 2; איור 1A,1B1) המוגדרים על ידי הפנוטיפ של תאי תורן אנושיים בתוספת CD1177 או טריפטאז תאי תורן אנושי פלוס צביעה משותפת עבור CD117. תאי מאסט המבטאים HLA-G אותרו באזורים הפיפיברוטיים (איור 1B1). לעומת זאת, 49 אחוז מתאי HLA-G פלוס לא היו תאי תורן ולא תאי CD117 פלוס (טבלה 3) ונראה כי הם מקובצים יחד כצמתים (איור 1B2). לפיכך, בוצע תיוג אחר באזורים השונים כדי לזהות תאים אלה (טבלה 4). החלוקה מחדש של הסוגים השונים של תאי HLA-G פלוס הייתה שונה בהתאם לאזור שלכָּבֵדרקמה שנבדקה (טבלאות 3 ו-4). בסך הכל, נראה כי 63 אחוז מתאי HLA-G פלוס באזור הפיפיברוטי הם תאי פיטום לעומת 3 אחוז בלבד בצמתים. בנוסף, 68 אחוז מתאי HLA-G פלוס בצמתים הביאו לידי ביטוי CD20, סמן של לימפוציטים B (איור 1C1), ו-3 אחוז CD3 (איור 1C2). HLA-G פלוס CD117 טריפטאז תאי תורן HLA-G פלוס CD117 HLA-G פלוס CD117 טריפטאז תאי תורן פלוס , ו-HLA-G פלוס CD117 פלוס טריפטאז תאי פיטום פלוס תאים נספרו בשלושה מקרים מייצגים שלכָּבֵדפיברוזיס באמצעות תוכנת HALO עם האלגוריתם המתאים. התאים נספרו בשני אזורים שונים של דגימת שחמת האלכוהול, כלומר, אזור פיפיברוטי וצומת התא, במקרה מייצג שלכָּבֵדפיברוזיס באמצעות תוכנת HALO עם האלגוריתם המתאים. אין תאי HLA-G plus המבטאים יחד CD31, סמן של תאי אנדותל או CD1a, סמן של תאים דנדריטים.

איור 1. אופי תאי HLA-G על מקרה מייצג שלכָּבֵדפיברוזיס. (א) בפסקה הראשונה, שתי התמונות משמאל מציגות ביטוי HLA-G ו-CD117 על מקרה מייצג שלכָּבֵדפיברוזיס מתוך 41 מקרים באמצעות אימונוהיסטוכימיה, כאשר 4H84 מזהה נוגדנים HLA-G ו-CD117 המזהים תאי c-kit. השקופיות נצבעו על ידי Mayer hematoxylin. טווחי פיברוזיס מוקפים בקו אדום. האזורים במעגלים מתאימים מבחינה טופוגרפית לשקופיות מוכתמות HLA-G ו-CD117. המלבן מראה הגדלה חזקה של אזורים אלה המעידה על כך ששני תאי HLA-G תואמים לשני תאי CD117. יתר על כן, יש להם מורפולוגיה תואמת לתא תורן. הצילום בפלואורסצנטי כפול (CD117/טריפטאז תאי מאסט) עם שלושת התמונות מימין התואמות לפלואורסצנטיות הפשוטה (DAPI צובע את הגרעינים בכחול, CD117 בירוק, טריפטאז תאי מאסט באדום) מציגים את רוב התאים עם תיוג משותף בצהוב. תאי CD117 הם במידה רבה תאי תורן. (ב) אימונופלואורססנציה מרובעת על מקרה מייצג שלכָּבֵדפיברוזיס (מתוך שלושה) באמצעות DAPI עם גרעינים כחולים, HLA-G (עם נוגדן 4H84) עם פסאודו-צבע ירוק, CD117 בפסאודו-צבע ציאן, טריפטאז תאי מאסט בפסאודו-צבע אדום, והתמונה המרוכבת או מיזוג. בצד ימין, מכתים סיריוס אדום מיוצג. 1 ו-2 תואמים לשני אזורים שונים שלכָּבֵד,תוחלת פיפיברוזיס וצומת תא בהתאמה. רוב תאי HLA-G מבטאים יחד CD117 וטריפטאז תאי מאסט בפיפיברוזיס (1). לעומת זאת, רוב תאי HLA-G אינם תאי פיטום משותפים, למעט תאי HLA-G מסוימים בפריפריה של צומת התא (2), ליד או בפיפיברוזיס. (ג) אימונופלואורסצנטי מרובע על תאי הצומת שלכָּבֵדפיברוזיס מוצג ב-B2, עם DAPI, HLA-G עם פסאודו-צבע ירוק, CD20 עם ורוד פוקסיה, או CD3 עם פסאודו-צבע ציאן, בהתאמה, ב-1 ו-2. התאמת הצבע של סיריוס אדום נמצאת בצד ימין. הריבוע מראה אזור מוגבל מבחינה טופוגרפית המכיל תאים חיוביים HLA-G ואת התאים המתאימים באותו אזור. התמונה המרוכבת מציגה את התיוג הוורוד של HLA-G ו-CD20. לא נצפתה צביעה משותפת בין HLA-G עם פסאודו-צבע ירוק לבין CD3 עם פסאודו-צבע ציאן.

המספר המוחלט של תאי HLA-G plus , CD3 פלוס (לימפוציטים T), CD20 פלוס (לימפוציטים B) ותאים טריפטאז פלוס תאי פיטום (תאי פיטום) נקבע באמצעות תוכנת HALO עם האלגוריתם המתאים על מקרה מייצג אחד והוא מבוטא. לכל מ"מ.

ניתוח של תאים HLA-G plus ב-IPFבמחקר הראשון שבוצע על סדרה של IPF (n=10) על ידי אימונוהיסטוכימיה, כפי שתואר קודם לכן, הערכנו את מספר תאי HLA-G פלוס ב-135 ± 62/ממ"ר ואת זה של תאי CD117 פלוס 227 ± 134/mm2 (טבלה 5). תאי HLA-G פלוס לא התאימו לתאי CD117 פלוס בפיברוזיס ריאות (איור 2A). ניתוח HALO של אימונופלואורססנטיות מרובעת וצביעה אדומה של סיריוס הראה שהטבע של תאי HLA-G שונה בהתאם לאזור ההיסטולוגי של הריאה (טבלה 6). ואכן, 63 אחוז מתאי HLA-G פלוס באזורים פיפיברוטיים היו תאי פיטום (B1, C1), בעוד שהם היוו רק 7 אחוז מתאי HLA-G פלוס בצמתים (B2, C2). רוב תאי HLA-G פלוס בצמתים הביאו לידי ביטוי CD20 (איור 2B).

איור 2. אופי תאי HLA-G על מקרה מייצג של IPF. (א) בפסקה הראשונה, התמונה משמאל מציגה את הצבע האדום של סיריוס של מקרה מייצג אחד מתוך עשרה IPF, התמונה האמצעית מציגה את הכתם הנגדי של מאייר המטוקסילין באמצעות אימונוהיסטוכימיה. האזורים במעגלים תואמים טופוגרפית בשקופיות מוכתמות HLA-G ו-CD117 עם 4H84 המזהה נוגדנים HLA-G ו-CD117 המזהים תאי c-kit. המלבנים מראים הגדלה חזקה של אזורים אלו, מה שמצביע על כך שתאי HLA-G אינם תואמים לתאי CD117. (ב) אימונופלואורססנציה מרובעת על מקרה מייצג שלכָּבֵדפיברוזיס מתוך שניים באמצעות DAPI עם גרעינים כחולים, HLA-G (עם נוגדן 4H84) עם פסאודו-צבע ירוק, CD117 בפסאודו-צבע ציאן, טריפטאז תאי מאסט בפסאודו-צבע אדום, והתמונה המרוכבת או מיזוג. מימין סיריוס אדום מיוצג; 1 ו-2 תואמים לשני אזורים שונים של הריאה, בהתאמה תוחלת הפיפיברוזיס וצומת התא. (ג) חימונופלוארסצנציה חמשה עם DAPI, HLA-G עם פסאודו-צבע ירוק, טריפטאז עם פסאודו-צבע אדום, CD3 עם פסאודו-צבע ציאן, CD20 עם פסאודו-צבע ורוד פוקסיה, באותו מקרה של IPF שמוצג ב-(B) . (C1) מתאים לאזור (B1). ב-(C1), רוב תאי HLA-G תואמים לתאי פיטום באזור הפיפיברוזיס, בעוד שתאי פיטום נדירים מאוד הם HLA-G בצומת המוצג ב-(C2). רוב התאים של הצומת הם CD20. ניתוח HALO הראה שרוב תאי HLA-G פלוס הם לימפוציטים B.

תאי HLA-G plus ו-CD117 plus נספרו עבור 10 המקרים באמצעות תוכנת HALO עם האלגוריתם המתאים, בעקבות אימונוהיסטוכימיה. הממוצע, סטיית התקן והטווח מסומנים.

ניתוח של תאים HLA-G פלוס בפיברוזיס כלייתיבמחקר של סדרה של 10 מקרים שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתפיפיברוזיס על ידי אימונוכימיה, מצאנו 133 ± 102 תאים HLA-G פלוס/מ"ר ו-426 ± 207 CD117 פלוס תאים/ממ"ר (טבלה 7). לא הייתה התאמה בין תאי HLA-G plus ו-CD117 פלוס (איור 3A).

איור 3. אופי תאי HLA-G על מקרה מייצג שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתלַיֶפֶת. (א) בפסקה הראשונה, התמונה משמאל מציגה את הצבע האדום של סיריוס, התמונה האמצעית מציגה את הכתם הנגדי של מאייר המטוקסילין באמצעות אימונוהיסטוכימיה. האזורים במעגלים תואמים מבחינה טופוגרפית לשקופיות מוכתמות HLA-G ו-CD117, כאשר 4H84 מזהה HLA-G ו-CD117 מזהה תאי c-kit. חיצים אדומים הם תאים חיוביים. המלבנים מראים הגדלה חזקה של אזורים אלה המעידה על כך שתאי HLA-G אינם תואמים לתאי CD117. (ב) אימונופלואורסצנטי מרובע על מקרה מייצג שלכָּבֵדפיברוזיס באמצעות DAPI עם גרעינים כחולים, HLA-G (עם נוגדן 4H84) עם פסאודו-צבע ירוק, CD117 בפסאודו-צבע ציאן, טריפטאז תאי מאסט בפסאודו-צבע אדום, והתמונה המרוכבת או מיזוג. בצד ימין, סיריוס אדום מיוצג. תאים שנצבעו בצהוב במיזוג תואמים לתאי HLA-G פלוס מאסט. (ג) האזורים המוכתמים בציאן תואמים לצינורות רבים המבטאים רק CD117. תאים שנצבעו בצהוב במיזוג תואמים לתאי HLA-G פלוס מאסט.

תאי HLA-G plus ו-CD117 פלוס נספרו עבור 10 מקרים שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתפיברוזיס באמצעות תוכנת HALO עם האלגוריתם המתאים, בעקבות אימונוהיסטוכימיה. הממוצע, סטיית התקן והטווח מסומנים עבור תאי HLA-G plus ו-CD117 plus. תיוג מרובע עם תוכנת HALO בשילוב עם Sirius Red וניתוח מורפולוגיה הראו הטרוגניות משמעותית של התיוג בקטע שלכִּליָהלפי לא רק האזור האנטומי אלא גם בתוך אותו תא אנטומי (איור 3B,C). לפיכך, הספירה והחישוב של אחוז תאי HLA-G פלוס לא היו רלוונטיים באיבר זה. ואכן, בדיקה מיקרוסקופית הראתה צביעה חזקה של היקף הצינוריות עם CD117 שלא תיוגה יחד עם זה של תאי פיטום (איור 3C). תאי HLA-G plus הם תאי פיטום וממוקמים באינטרסטיטיום הדלקתי (איור 3B,C).

דִיוּןהביטוי של חלבוני HLA-G הודגם לראשונה בציטטרופובלסטים בממשק העובר לאימהי [12]. בתנאים בסיסיים, הביטוי שלו מוגבל במידה רבה לרקמות ספציפיות, כגון הקרנית [13], תימוס [14], ואיים של הלבלב [15]. עם זאת, סוגים מסוימים של תאים מסוגלים גם לבטא את זה, כגון תאי אפיתל הסימפונות [16], תאים מזנכימליים [17], תאים בעלי שושלת מונוציטית [18-20], ומבשרי אריתרואידים ואנדותל [21], בתנאים מיוחדים . הוכחנו בעבר שתאי פיטום יכולים לבטא HLA-G במצב הבסיסי, עם ביטוי מוגבר בסביבות עשירות בציטוקינים מסוימות, בפרט, פיפיברוטי.רקמת כבד.בדקנו האם HLA-G יכול להתבטא על ידי תאי פיטום הקשורים לכָּבֵדפיברוזיס מאטיולוגיה אחרת או פיפיברוזיס באיבר אחר על ידי לימוד 41 מקרים של אלכוהול.כָּבֵדשחמת, 10 של IPF, ו-10 שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתפיברוזיס.

זיהומים, פציעות רעילות ומטבוליות, ומחלות דלקתיות אידיופטיות יכולים לקדם את התפתחות פיברוזיס מכיוון שפציעה כרונית גורמת לאפופטוזיס של תאים פרנכימים המשחררים ציטוקינים פרופיברוגניים ודלקתיים כגון TGF-. התאים המייצרים קולגן מתמיינים מהתאים המזנכימליים השוכנים בתגובה לפציעה. מעבר אפיתל למזנכימלי הוא תופעה של התבדלות תאים שנצפית עבור כולנגיוציטים בכָּבֵד, pneumocytes בריאות, ותאי אפיתל צינורי בכִּליָה[22]. תאים אפופטוטיים גורמים לעלייה בריכוז TGF- בכל האיברים. עם זאת, ניתן להבחין במאפיינים ספציפיים של פיפיברוגנזה באיברים השונים. בתוך הכָּבֵד,אפופטוזיס נוגע להפטוציטים, בעוד שהוא משפיע על תאי אפיתל בריאות וכִּליָה[22]. לפיכך, פיברובלסטים תושבים פנימהכִּליָהוריאות מופעלות לתוך myofifibroblast המבטא a-SMA, collagen1, ואילוכָּבֵדmyofifibroblast שומרים על הסמנים העצביים-ספציפיים שלהם [23].

בתוך הכָּבֵד,תאי ה-stellate הכבד תורמים ליותר מ-80 אחוז מכלל התאים המייצרים קולגן. בריאות, הנזק של pneumocytes קשור לאפופטוזיס של תאי אנדותל. תפקידה של דלקת ב-IPF שנוי במחלוקת. IPF טיפוסי אינו מראה זרימה של תאים דלקתיים, אך כמה מחברים מציעים תפקיד של דלקת בהתמיינות של פיברובלסטים ריאתיים למיופיברובלסטים המייצרים ECM [24]. נגעים חוזרים של אפיתל מכתשית של אטיולוגיה לא ידועה ואפופטוזיס אפיתל מכתשית מעורבים ב-IPF [25]. בתוך הכִּליָהוכָּבֵד,תאים מיאלומונוציטים מגוייסים ממח העצם ומייצגים בהתאמה 14 עד 15 אחוזים ו-8 עד 12 אחוזים מהמיופיברובלסטים. לא נצפית הפיפיברוזיס בריאה בניגוד ל-כָּבֵדוכִּליָהבהיעדר פציעה ובמידה ולא הושגה נקודת האל-חזור. ואכן, תהליכים דלקתיים מוגבלים ב-IPF, במיוחד בשלב המוקדם של המחלה, בעוד שנגעים חוזרים ונשנים של אפיתל מכתשית עם אטיולוגיה לא ידועה ואפופטוזיס אפיתל מכתשית יכולים לקדם שגשוג והפעלה של פיברובלסטים ריאתיים או מיופיברובלסטים [25].

בנוגע לכָּבֵדפיברוזיס, תהליך ריפוי פצעים כושל שלכִּליָהרקמה לאחר פציעה כרונית מתמשכת מובילה לייצור ולהפרשה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כמו גם TGF-, אשר ממלא תפקיד מפתח בתהליך הפיפיברוטי. לדוגמה, בכָּבֵדfifibrosis, TGF-, שמתבטא ככמות דקה ב-HSC שקט, מיוצר במהירות על ידי סוג זה של תאים לאחרפגיעה בכבד.בנוסף ל-HSC, מקורות אחרים של TGF- תוארו כטסיות דם, מקרופאגים, הפטוציטים וגם תאי פיטום [26]. TGF- 1 מאוחסן במטריצה ​​בצורתו הסמויה, ולאחר הפעלתו, הוא מקדם את המעבר מפיפיברובלסט למיופיברובלסט, שהוא בסיסי לתהליך הפיפיברוזיס. בנוסף, הוא מעכב פירוק ECM על ידי דיכוי מטאלופרוטאזות וקידום מעכב טבעי TIMP. לפיכך, הוא גורם לייצור של ECM באמצעות מנגנונים תלויי SMAD3- או שאינם קשורים ל-SMAD [27]. אכן, קיימת אינטראקציה הדדית בין תאי מאסט לבין TGF-. TGF- הוא חומר משיכה חזק לתאי פיטום; ואכן, התהליכים הפתולוגיים המתווכים על ידי TGF- קשורים לעתים קרובות להצטברות תאי פיטום [28]. בנוסף, תאי פיטום הם אחד המקורות העיקריים של IL-17 המניעים פיפיברוזיס- -תלוית ב-TGF [29]. דווח כי TGF- גם מקדם או מדכא תפקודים של תאי פיטום. אכן, TGF- מעכב את הביטוי של קולטן IgE בעל זיקה גבוהה Fc1RI, המפעיל תאי מאסט [30]. מצד שני, הוא מעכב שגשוג תאי פיטום, דה-גרנולציה וייצור של מספר מולקולות אפקטורים כגון היסטמין ו-TNF- [31]. לאור העלייה ב-MC בפיפיברוזיס, ההשפעה של TGF- על תפקודי MC יכולה להיות חשובה בוויסות תגובות דלקתיות השומרות על תהליך הפיפיברוזיס.

כמו בנגיף הפטיטיס Cכָּבֵדפיפיברוזיס, מצאנו שמחצית מתאי ה-HLA-G פלוס בשחמת אלכוהול המושרה על ידי אלכוהול הם תאי פיטום (טבלה 2) ורק 34 אחוז מתאי התורן הביעו HLA-G, עם שונות אינדיבידואלית גבוהה המוצגת על ידי סטיית התקן (טבלה 1) . בנוסף, ראינו חלוקה מובהקת לפי אזור ה-כָּבֵד,שבהם 63-92 אחוז מתאי HLA-G פלוס באזורים פיפיברוטיים היו תאי פיטום, בעוד שרק 3-23 אחוזים היו תאי פיטום בצמתים תאיים (טבלה 3). באופן דומה, נצפית דפוס שונה עבור תאי פיטום, שכן 92 אחוז מתאי התורן באזורים פיפיברוטיים הביעו HLA-G, בעוד שרק 23 אחוז ביטאו HLA-G בצמתים תאיים (לא מוצגים נתונים). לפיכך, הביטוי של HLA-G אינו מוגבל לאטיולוגיה הוויראלית שלכָּבֵדשַׁחֶמֶת. אכן, השגנו תוצאה דומה עבור ריאות. ב-IPF, 63 אחוז מתאי HLA-G פלוס באזורים פיפיברוטיים היו תאי פיטום, בעוד שרק 7 אחוזים מאלה שבצמתים היו תאי פיטום (טבלה 6). המקרים שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתפיברוזיס היו מיוחדים. כתוצאה ממספר הצינוריות הגדול, לא ניתן היה לספור כראוי את התאים באזורים הפיפיברוטיים מכיוון שתאי פיטום חדרו לצינוריות. ניתן היה לבצע רק תצפית מיקרוסקופית איכותית, המראה שמספר תאי HLA-G פלוס הם תאי פיטום, ללא יכולת להבדיל בין צינוריות מאזורים פיפיברוטיים (איור 3). לפיכך, נראה כי HLA-G מתבטא על ידי תאי פיטום במחלה פיברוטית דרך פני השטח של התא ומולקולות תוך ציטופלזמיות, ללא קשר לאיבר. הדגמנו בעבר שתאי פיטום אנושיים בתרבית היו מסוגלים לייצר צורות מסיסות של HLA-G במדיום המותנה במצב בסיסי ושההפרשה גדלה לאחר גירוי עם ציטוקינים, כולל IL-10 [10].

האחוז הגבוה יותר של תאי פיטום (יותר ממחצית) המבטאים HLA-G ב-כָּבֵדוריאות עשויים להיות מוסברים על ידי המרכיבים הדלקתיים של פיברוזיס. ואכן, כתאי חיסון מולדים, מספר תאי התורן גדל במצבי דלקת, והם יכולים גם לשחרר מתווכים פרו-דלקתיים [32]. מספר תאי התורן גדל במחלות פיפיברוטיות. אכן, צפיפות תאי הפיטום גבוהה יותר בריאות של חולים עם IPF מאשר אלו עם פתולוגיות ריאות אחרות [33] וריאות תקינות. באופן דומה, אנושימחלות כליותמלווים בעלייה במספר תאי התורן בשֶׁל הַכְּלָיוֹתקליפת המוח, במיוחד באזור פיפיברוזיס [34], שכן תאי פיטום נצפים לעתים נדירות בבריאיםכליות.

פרסומים קודמים ציינו כי תאי פיטום נעדרים או נמצאים רק בדלילות בכבד, ריאות וכבד אנושיים.כליות[35]. התקדמות הידע על תאי פיטום הראתה שתאי פיטום כתאי חיסון מולדים יכולים להיראות בכל הרקמות, אך הם נמצאים בשפע יותר באתרים החשופים לסביבה. יתר על כן, הם מציגים רפרטואר גדול של קולטנים המאפשר להם להגיב לגירויים ולקיים אינטראקציה עם תאים אחרים [36].שֶׁל הַכְּלָיוֹתתאי פיטום דומים מבחינה תפקודית לתאי הריאה. נתונים סותרים דווחו לגבי תפקידם של תאי פיטום בפיברוזיס. מספר מחברים הציעו שתאי פיטום מעורבים בפיברוזיס מכיוון שהם ממלאים תפקיד בדלקת חריפה וכרונית, אשר יוזמת אותה. בנוסף, תאי פיטום מסוגלים להפריש היסטמין, הפרין ו-IL-4, אשר מגבירים את התפשטות הפיפיברובלסטים. עם זאת, אחרים [37,38], כולל אותנו [39], הראו שתאי פיטום ממלאים תפקיד אנטי פיפיברוטי: למשל, במודלים של בעלי חיים, כגון עכברים וחולדות חסרי תאי פיטום. Okazaki et al. הראה כי פיברוזיס מושרה היה חמור יותר בחולדות חסרות תאי תורן מאשר בחולדות מסוג פרא [38].

יתרה מכך, תאי פיטום הוכחו כמקוטבים בסרטן, בדומה למקרופאגים [40]. תאי מאסט נוגדי דלקת מבטאים ציטוקינים, כגון IL-10, ומספרם קשור באופן הפוך לחומרת הדלקת, בעוד שתאי מאסט פרו-דלקתיים מתאימים למצב פרו-דלקתי. סביר להניח שתאי מאסט נוגדי דלקת מבטאים HLA-G, בפרט, מכיוון ש(i) הוכח קשר בכמה מודלים בין רמות IL-10 וביטוי HLA-G ו-(ii) HLA-G בעל פעולה אנטי דלקתית. תאי מאסט המבטאים HLA-G עשויים להיות נוכחים בשלב מוקדם של המחלה, בשלב הדלקתי, כדי לנטרל דלקת, שהיא התגובה הראשונה לנגע. בספרות, דווח כי Il-10, על ידי הפחתת התגובה הדלקתית, עשויה לעכב את התפשטות וסינתזת הקולגן של המיופיברובלסטים [41]. אכן, IL-10 עשוי למלא תפקיד מגן באלכוהוליסטיםמחלת כבד[42]. לעומת זאת, נמצאו רמות גבוהות יותר של IL-10 בחולים עם IPF מאשר בנבדקים רגילים, והרמה הגבוהה ביותר של IL-10 בשטיפה ברונכואלוואולרית הודגמה בחולים עם IPF בהשוואה לסרקואידוזיס או דלקת ריאות רגישות יתר. [43]. נוכל להסביר זאת לפי המרכיב הדלקתי הפחות חשוב. בשֶׁל הַכְּלָיוֹתפיברוזיס, הוכח במודל עכבר שחוסר ב-IL-10 החמירכִּליָהדלקת ופיברוזיס [44]. בבני אדם, טיפול באימונותרפיה מקומית של IL-10 הקשור ל-TGF-אנטגוניסט משפר את המחלה הכרוניתמחלת כליות [45].

תוצאה רלוונטית נוספת היא התבוננות בתאי HLA-G פלוס בצמתי תאים, ליד האזורים הפיפיברוטיים במקרים נדירים של שחמת אלכוהול. תאים אלה מאופיינים מורפולוגית על ידי מקבץ של תאים הניתנים לזיהוי בקלות בגודל קטן עד בינוני, מה שמרמז על צבירה לימפואידית. המאפיינים המורפולוגיים שלהם מרמזים על זקיקים, שהם מבנים שנוצרו בעיקר על ידי לימפוציטים B. אימונופלואורססנטיות מרובעת בצמתים אישרה השערה זו, שכן 68 אחוז מתאי HLA-G פלוס הביאו לידי ביטוי CD20, שהוא סמן ספציפי של לימפוציטים מסוג B (טבלה 3). מבנים דומים נצפו גם ב-IPF, עם תוצאה דומה, המראה כי 76 אחוז מתאי HLA-G פלוס בצמתים הם לימפוציטים B (טבלה 6). ניאוגנזה לימפואידית דווחה בפיפיברוזיס. לפיכך, בתנאים פתולוגיים מסוימים, כמו דלקת מתמשכת, האגרגטים התאיים עשויים להתפתח למבנה מאורגן מאוד הדומה לרקמה לימפואידית משנית, כלומר, איברים לימפואידים שלישוניים או זקיקים לימפואידים חוץ רחמיים [46]. זקיקים לימפואידים כאלה מכילים אזורים עשירים בתאי T וזקיקי תאי B מובהקים עם מרכזי נבט [47]. המנגנון שבאמצעותו תאי B החודרים מארגנים את הזקיק החוץ רחמי ומרכז הנבט נשלט על ידי לימפוטוקסין- 1 2 וכימוקינים לימפואידים, כגון CC-chemokine ligand 19 (CCL19), CCL21, CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12), וכן CXCL13, המווסתים את הביות של לימפוציטים. בנוסף ל-lym photoxin ו-chemokines, נדרש גם גירוי אנטיגני כדי לעורר ולשמור על היווצרות זקיקים. זקיקים כאלה לא נצפו בקבוצה שלנו של נגיף הפטיטיס C שנגרםכָּבֵדפיברוזיס ונמצאו רק באחד מתוך שלושה מקרים של אלכוהולכָּבֵדפיברוזיס, המצביע על שלב מובהק של המחלה. אכן, תפקודם של איברים לימפואידים חוץ רחמיים והמתאם שלהם עם דלקת ופיברוזיס עדיין לא ברור. מספר מחקרים הראו תפקיד חדשני ומפתיע לתאי B בוויסות פיברובלסטים בפיברוזיס, שבהם ההשפעה הפרופיברוטית שלהם מקבילה לזו של TGF- וגם מוגברת על ידי גורם מפעיל תאי B (BAFF) [48].

הרלוונטיות של המקור הסלולרי של HLA-G בפיפיברוזיס היא לא רק תיאורית אלא גם תפקודית. ל-HLA-G השפעה מעכבת על תפקודם של כל סוגי הלימפוציטים [49] והתאים הדנדריטים [20,50] באמצעות הקולטנים הספציפיים שלו, כגון ILT2 ו-ILT4. הנוכחות של HLA-G על תאי חיסון אלו, בנוסף להיותה סמן של דלקת, היא גם סימן לתגובה חיסונית מתאימה על ידי הפחתת הדלקת. אכן, ידוע כי HLA-G ממלא תפקיד מגן מפני תגובות דלקתיות מוגזמות, כפי שהוצג בעבר בהלם ספטי [51]. בנוסף, חקרנו בעבר את האינטראקציה ההדדית בין תאי פיטום ותאי סטלט כבד והראנו שהיא מובילה למשיכת תאי פיטום ולירידה משמעותית בייצור הקולגן על ידי תאי HSC באמצעות ייצור HLA-G [39]. בנוסף, הביטוי של HLA-G על ידי תאי B בזקיקים חוץ רחמיים עשוי גם לתרום לנטרול ההשפעה הפרופיברוטית של לימפוציטים B על מיופייברובלסטים על ידי עיכוב תאי B באמצעות מנגנון אוטוקריני.

חולים ושיטות

חוליםקבוצה של 41כָּבֵדנבדקו חולים מושתלים עם שחמת שחמת הנגרמת על ידי אלכוהול. המטופלים קיבלו מידע על הפרוטוקול, והתקבלה היעדר התנגדות (ועדת האתיקה של בית החולים, הודעה מס' 16.47). עשר דגימות בלוק פרפיפין שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתfifibrosis ו-10 של IPF (ועדת האתיקה של בית החולים, הודעה מס' 16.123), אנונימיים לחלוטין ובלתי הפיכים, נלמדו בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי. המאפיינים הקליניים והביולוגיים של שלוש העוקות מסוכמים בהתאמה בטבלאות 8-10.

מֵתוֹדוֹלוֹגִיָה

אימונוהיסטוכימיה ואימונופלוארסצנציהרקמות נגזרו מ-explantedכָּבֵדושֶׁל הַכְּלָיוֹתאו ביופסיה ריאתית. הוכנו חתכים סדרתיים משובצים ב-Paraffifin (4 מיקרומטר בעובי), ובוצעה צביעה היסטולוגית סטנדרטית, כלומר, צבע HES וסימון סיריוס אדום של קולגן. במקביל, בוצעו אימונוהיסטוכימיה ואימונופלוארסצנציה בחתכים סדרתיים של קטעים משובצים בפרפיפין מאותו בלוק בעקבות דה-פארפיפיניזציה ופרוטוקול של אחזור אנטיגן. נוגדנים ראשוניים (mAbs) היו כדלקמן: עכבר חד שבטי אנטי-אנושי HLA-G (Exbio, 4H84 2 מיקרוגרם/מ"ל או 1:100, Vestec, צ'כיה), ארנב רב שבטי אנטי-אנושי CD117/c-kit , מזהה תאי מיאלואיד ותורן (Dako, 1:200, קופנגן, דנמרק), טריפטאז תאי תורן של עכבר חד שבטי אנטי-אנושי (הום) (שיבוט AA1, Dako, 1:1000), ספציפי לתאי פיטום, CD3 אנטי-אנושי חד שבטי. (Thermo Scientifics, SP7, 1:500, Waltham, MA, ארה"ב), ספציפית עבור לימפוציטים T, ו-CD20 אנטי אנושי חד שבטי (Dako, M0755, 1:600), ספציפית עבור לימפוציטים B.

בקצרה, שקופיות עבור אימונוהיסטוכימיה הודגרו עם נוגדן ראשוני במערכת אוטומטית של Discovery Ultra (Roche, Meylan, צרפת). נוגדן ראשוני קשור התגלה באמצעות נוגדן משני לעז נגד עכבר או נגד ארנבות ביוטיניל (Vector, ABCYS, les Ulis, צרפת, 1:700) ודיאמינו-בנזידין (ערכת זיהוי DAB MAP, Roche , מיילן, צרפת), ואחריו צבע המטוקסילין מאייר. כדי לקבוע במדויק את האופי של תאי HLA-G פלוס, משולש (DAPI, CD117, טריפטאז תאי מאסט), מרובע (DAPI, HLA-G, CD117, טריפטאז תאי פיטום) וחמישיות (DAPI, HLA-G, CD3, לאחר מכן בוצעו צביעת CD20, תאי מאסט טריפטז) אימונופלואורסצנטית בשלושה מקרים מייצגים של שחמת הנגרמת על ידי אלכוהול ושני מקרים מייצגים של IPF. הגילוי בוצע באמצעות ערכות Discovery FAM, rhodamine, DCC ו-Cy5 (Ventana Medical systems, Illkirch, צרפת). לאחר הצביעה, תמונה של כל פני השטח של הקטע עברה דיגיטציה בהגדלה של 20× או 40× באמצעות סורק קונפוקאלי (פנורמי סורק, 3DHistech, בודפשט, הונגריה). אימונוהיסטוכימיה וצביעה מרובת אימונופלואורסצנציה נותחו באמצעות תוכנת ניתוח דיגיטלי HALO (V3.0.311). התוכנה הוכשרה לזהות פיברוזיס (Sirius Red) באמצעות מודול כימות שטח (V2.1.3), בעוד שמודול Fish-IF (v1.2.2) הוכשר עבור הדגימות המסומנות בצבעים. חלקים שלמים של כל דגימה נבחרו לניתוח עם האלגוריתם המתאים. הנתונים חולצו לתוכנת גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח.

סיכוםעבודה זו הקשורה לניסויי הנתונים הקודמים שלנו על התפקיד האנטי-מגן של תאי הפיטום באמצעות ביטוי HLA-G [39] מציעה שתאי פיטום ממלאים תפקיד אנטי-פיברוטי ומגן באמצעות הביטוי של HLA-G במצבים פיפיברוטיים. תפקיד זה מתחזק על ידי לימפוציטים B המבטאים HLA-G בזקיקים חוץ רחמיים. בסך הכל, ממצאים אלה מצביעים על תפקיד מגן עבור HLA-G המתבטא על ידי תאי פיטום באיברים פיברוטיים.