כימות של ניוון נויריטים עם דיוק ויעילות משופרים במודל חוץ גופי של מחלת פרקינסון חלק 2

תוצאות

הקמת מודל תרבית תאים של ניוון עצבי הקשור ל-PD

כדי לפתח שיטה לחקירת ניוון עצבים במודל תרבית תאים של PD, השתמשנו בתאי LUHMES מתורבתים, אוכלוסייה של תאים מנצפליים אנושיים שהונצחו על תנאי. עם התמיינות, תאי LUHMES הופכים לפוסטמיטוטיים, מאמצים פרופיל ביטוי גנים האופייני לנוירונים דופמינרגיים בוגרים, ומפתחים מורפולוגיה נוירונית עם נויריטים באורך של עד 500 מ"מ (איור 1A; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011; Kraemer et al., 2021).

ניוון עצבי, מצב שבו תאי עצב משתנים או מתים, קשור קשר הדוק לזיכרון. במודלים של תרבית תאים, אנו יכולים לשלוט בתנאי התרבית כדי להקל על הביטוי של ניוון עצבי ובכך לשפר את ביצועי הזיכרון.

מחקרים הראו שההומאוסטזיס של תאי עצב ממלא תפקיד חשוב בהישרדות התא ובתפקוד המערכת. אנו יכולים לשפר את יציבות התאים על ידי שליטה בגורמים כגון חומרי הזנה וגורמי גדילה במצע התרבות. יחד עם זאת, שימו לב לשמירה על הניקיון ובקרת הטמפרטורה של סביבת התרבית למניעת הפרעות ופגיעה בתאים מהסביבה.

בנוסף, במודל של תרבית תאים, אנו יכולים גם להזריק תרכובות או תרופות מסוימות לתאים כדי להפחית את הביטוי של נוירומודולציה, ובכך לשפר את שיעור ההישרדות וביצועי הזיכרון של התאים. טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב גם בחקר מחלות נוירודגנרטיביות.

בקיצור, לניוון עצבי יש השפעה חשובה על יציבות התא ותפקוד המערכת, וטכנולוגיית תרבית תאים היא שיטת מחקר מודל טובה, שיכולה לערוך חקר ומחקר מעמיקים על הקשר בין ניוון עצבי לזיכרון. אנו יכולים להקל על ביצועי נוירומודולציה על ידי טיפוח שליטה סביבתית, הזרקת תרופות לתאים וכו', כדי לשפר את הישרדות התא ואת ביצועי הזיכרון ולספק בסיס מקיף יותר לחקר מחלות ניווניות. ניתן לראות שעלינו לשפר את הזיכרון שלנו. Cistanche יכול לשפר משמעותית את הזיכרון שלנו, כי Cistanche יכול לווסת גם את איזון הנוירוטרנסמיטרים, כמו הגברת רמת האצטילכולין וגורמי גדילה, החשובים מאוד לזיכרון וללמידה. בנוסף, בשר יכול גם לשפר את זרימת הדם ולקדם אספקת חמצן, מה שיכול להבטיח שהמוח יקבל מספיק תזונה ואנרגיה, ובכך לשפר את החיוניות והסיבולת של המוח.

לחץ על יודע תוספי מזון כדי לשפר את הזיכרון

בגלל האיכויות האופטיות המעולות של זכוכית בהשוואה לפלסטיק, התרבויות הוקמו על שקופיות זכוכית המכילות שמונה תאי מדיה. בהתבסס על דיווחים קודמים (Lotharius et al., 2005; Scholz et al., 2011; Kurowska et al., 2014), ניסינו בתחילה לבסס תרבויות על שקופיות תא מצופה PLO ופיברונקטין; עם זאת, תרבויות כאלה הראו חסרונות הידבקות וכדאיות נמוכה. כתוצאה מכך, בדקנו האם ציפוי במצעים נוספים ישפר את הכדאיות של תרביות תאים LUHMES שהוקמו על משטחי זכוכית.

תרביות תאים LUHMES הוקמו על שקופיות שלא היו מצופות או מצופות ב-PLO ופיברונקטין, PDL ולמינין, או שילוב של כל ארבעת המצעים. ניתוח של גרעינים ברי קיימא על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית גילה שציפוי שקופיות השפיע באופן משמעותי על כדאיות התרבויות [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001], עם ניתוחי השוואה מרובים לאחר ניתוח שגילו כי שקופיות מצופה בשילוב של כל ארבעת המצעים הנ"ל מניב שיעור גבוה יותר משמעותית של תאים חיים בהשוואה לשקופיות המצופה רק ב-PLO ופיברונקטין (p= 0.0437; איור 1B, C).

לאחר זיהוי מצעי הציפוי האופטימליים לטיפוח תאי LUHMES על שקופיות זכוכית, הערכנו את ההשפעות של צפיפות התאים על התאמת התרבויות למדידות ניוון עצבים. תאי LUHMES תורבו במדיום התמיינות עם צפיפות ציפוי של 57,500 תאים לבאר, 115,000 תאים לבאר, או 230,000 תאים לבאר, וביום החמישי להתמיינות, התאים תוקנה עם 4% PFA והצטלמו במיקרוסקופ ניגודיות פאזה.

צפיפות של 57,500 תאים לבאר הביאה לתרביות עם עצבים נטולי רשת גרועים ומורפולוגיה של עצבים לא סדירה, בעוד שתרביות שנוצרו עם צפיפות ציפוי של 230,000 תאים, למרות שהן קיימות, הכילו צפיפות עצבים גבוהה מדי למדידה מדויקת של עצבים. צפיפות התאים הבינונית של 115,000 תאים לבאר סיפקה כדאיות גבוהה ומסלולי אקסונים מופרדים היטב שתורמו למדידות ניוון עצביות מדויקות (איור 1D).

כדי ליצור מודל של ניוון עצבי הקשור ל-PD במבחנה, חשפנו תאי LUHMES מובחנים ל-6-OHDA, נוירוטוקסין בשימוש נרחב שמקדם מתח חמצוני וניוון של נוירונים קטכולמינרגיים (Bové ו-Perier, 2012). חשיפה של תאי LUHMES מובחנים ל-6-OHDA קידמה עלייה תלוית מינון בניוון עצבי, כאשר 5.0 mM 6-OHDA ו-7.5 mM 6-OHDA גרמו לניוון עצבי בינוני וחמור, בהתאמה (איור .2F). כדי לכמת ניוון עצבי בתרביות של תאי LUHMES שנחשפו ל-6-OHDA, השתמשנו בשיטה שצוטטה בהרחבה שבה תמונות ניגודיות פאזה של תרבויות עוברות בינאריות, גופי תאים בתמונות מוסרים דיגיטלית ואלגוריתם מנתח החלקיקים של ImageJ מוחל למדידת השטח של שברי עצבים. לאחר מכן מסוכמים את אזורי הנויריטים המפוצלים ומחולקים בשטח הנויריט הכולל כדי לקבוע DI (איור 2A–E; Sasaki et al., 2009; Kraemer et al., 2014; Di Stefano et al., 2015; Hill et al. ., 2018; Geisler et al., 2019).

כצפוי, חשיפה של תאי LUHMES מובחנים ל-6- OHDA גרמה לעלייה תלוית מינון ב-DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374; איור 2G). עם זאת, במהלך הניתוחים של תאים שנחשפו ל-6-OHDA, ראינו כמה בעיות שנראה שהשפיעו לרעה על הדיוק והיעילות של מדידות DI. לפיכך, ביקשנו לייעל את השיטה הנפוצה הזו לביצוע מדידות DI, אשר מעתה אנו מתייחסים אליה כשיטת ה-DI המסורתית, כדי ליצור פרוטוקול המאפשר מדידה יעילה יותר של פיצול עצבי.

הפחתת פיצול מלאכותי הקשור לבינאריזציה של מיקרוגרפים

תוך כדי שימוש בשיטת DI המסורתית, ראינו לעתים קרובות בעיה שבה neurites שלמים בתמונות ניגודיות פאזה הופיעו מקוטעים בתמונה הבינארית המקבילה שלהם (איור 3A). פיצול מלאכותי זה השפיע בעיקר על נויריטים בעלי בולטות נמוכה. לפיכך, בדקנו האם ניתן להפחית את הבעיה על ידי הליכים המשפרים את ניגודיות התמונה. כדי לשפר את ניגודיות התמונה, צילמנו תחילה תמונות של neurites תוך שימוש במגוון עוצמות אור כדי לקבוע את רמת בהירות התמונה שתפיק ניגודיות אופטימלית.

תמונות שצולמו עם עוצמת האור האופטימלית עברו לאחר מכן שיפור ניגודיות נוסף על ידי שימוש ב-ImageJ להחלת LUT עם ערכי עוצמה מינימליים ומקסימליים של 90 ו-205, בהתאמה. שילוב של שיפורי ניגודיות אלה סיפק ייצוג מדויק יותר של neurites בתמונות בינאריות שנוצרו מתמונות ניגודיות פאזה (איור 3B). עם זאת, ניתוח כמותי של תמונות בינאריות של עצבים בריאים הצביע על כך ששיפורי הניגודיות לא הפחיתו באופן משמעותי את הפיצול המלאכותי (p=0.9999; איור 3D). לפיכך, לאחר מכן חקרנו האם שימוש בהדמיית אימונופלואורסצנטית ייצור תמונות עם ניגודיות מעולה ובכך יקל על ייצור של תמונות עצב בינאריות מדויקות יותר עם פיצול מלאכותי מופחת.

השקופיות המתוארות באיור 2, הכוללות תאי LUHMES קבועים שנחשפו לריכוזים שונים של 6- OHDA, צויינו לחלבון הציטושלד b III-tubulin, צולמו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ונותחו על ידי חוקר עיוור לצורך פיצול מלאכותי (איור .3C). ניתוח כמותי של תמונות בינאריות שהתקבלו ממיקרוגרפי פלואורסצנטי ומיקרוסקופ ניגודיות פאזה תואמים גילה שסוג המיקרוסקופיה השפיע על רמות של פיצול מלאכותי [פרידמן x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . באופן ספציפי, צילום מיקרוגרמים פלואורסצנטי יצרו תמונות בינאריות עם פיצול מלאכותי מופחת משמעותית בהשוואה לאלו ממיקרוגרפי ניגודיות פאזה (עמ'=0.0016; איור 3D).

כתוצאה מכך, תמונות של תרבויות בריאות הניבו ציוני DI נמוכים משמעותית כאשר נעשה שימוש במיקרוגרמי פלואורסצנציה במקום במיקרוגרמי ניגודיות פאזה (F(1,8)= 131.4, p=0.{{12} }001, R2=0.1442; איור 3E). יתרה מכך, מגמה כוללת בולטת היא שהשינוי בקפל בין ערכי DI ממוצעים הקשורים לתרביות בריאות (מטופלות ברכב) לבין תרבויות המציגות ניוון עצבי (5.0 או 7.5 מ"מ 6-מטופלות ב-OHDA) היו גדולים יותר כאשר נמדדו באמצעות מיקרוגרפי פלואורסצנציה מאשר כאשר מתקבל ממיקרוגרפי ניגודיות פאזה (איור 3E). זה התרחש למרות שצילומי מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תרביות עם ניוון עצבי מתון (הנגרמת על ידי חשיפה ל-5 mM 6-OHDA) בעלות ציוני DI נמוכים משמעותית מתמונות שלב מקבילות בגלל הפחתה בפיצול מלאכותי (p=0.0001 , ד=0.6312).

אופטימיזציה של פרמטרים עבור זיהוי עצבים מקוטעים וזיהוי עצבים מוחלטים
השיטה המסורתית לביצוע מדידות DI כוללת שימוש בתוסף Analyze Particles עבור ImageJ עם פרמטרים של גודל של 20 10,000 פיקסלים כדי לזהות שברי עצבים. עם זאת, ראינו שחלק גדול של שברי נויריט לא זוהה על ידי מנתח החלקיקים בעת שימוש בפרמטרים אלה שצוטטו בהרחבה (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. , 2020; Shin and Cho, 2020) למדידת ניוון עצבים במיקרוגרמי ניגודיות פאזה של תאי LUHMES שנחשפו ל-6-OHDA, שנוצרו כמתואר באיור 2.

לפיכך, ניתחנו מחדש תמונות מאותו מערך נתונים באמצעות מגבלות שונות של גודל מינימלי לזיהוי חלקיקים כדי לקבוע את הפרמטרים האופטימליים לזיהוי שברי עצבים. מהערכה איכותית של תמונות בינאריות שנוצרו ממיקרוגרפי ניגודיות פאזה, פרמטרים של גודל של 5-10,000 פיקסלים שיפרו את הזיהוי של שברי עצבים, אך היו קשורים גם לזיהוי שגוי של רעשי רקע, חפצי תמונה או חפצי תמונה קטנים אחרים. חומר לא עצבי כשברי עצבי. לעומת זאת, בהשוואה לפרמטרים הנפוצים של 20–10,000 פיקסלים, פרמטרים של 10–10,000 פיקסלים שיפרו את הזיהוי של שברי עצבים ללא עלייה גדולה בולטת בתוצאות חיוביות שגויות (איור 4A , שמאלה).

ניתוחים דומים בוצעו גם עם תמונות בינאריות שהתקבלו ממיקרוגרפי פלואורסצנטי של תאי LUHMES המסומנים אימונו ל-b III-tubulin. פרמטרים של גודל מנתח חלקיקים של 5-10,000 פיקסלים אפשרו את הזיהוי הרגיש ביותר של שברי עצבים, ומכיוון שצילומי הקרינה הציגו פחות פסולת קטנה, פרמטרים כאלה לא הגדילו באופן ניכר את הזיהוי השגוי של חומר שאינו עצבי כמו שברי עצבי. (איור 4A, מימין).

השיטה המסורתית לביצוע מדידות DI, על ידי שימוש בפרמטרים של גודל מנתח חלקיקים של 20-10,000 פיקסלים, מוציאה אובייקטים קטנים מ-20 פיקסלים מדידות של שברי עצבים.

עם זאת, אובייקטים קטנים כאלה נכללים בדרך כלל בטעות במדידות שטח העצב הכולל, מכיוון ששיטת המדידה המסורתית DI כוללת חישוב שטח עצבי הכולל על ידי סיכום כל הפיקסלים השחורים בתמונות הבינאריות. כדי להתגבר על בעיה זו, השתמשנו בתוסף Particle Remover עבור ImageJ, שנכתב על ידי מפתח ImageJ Wayne Rasband, כדי להסיר אובייקטים קטנים שאינם עצביים מתמונות בינאריות. יישום של תוסף זה בזמן ביצוע מדידות DI באמצעות מיקרוגרמי ניגודיות פאזה של תאי LUHMES שנחשפו ל-6-OHDA, שנוצרו כמתואר באיור 2, הביא לעלייה משמעותית במדידות DI בכל ריכוזי החשיפה לנוירוטוקסין (F(1) ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
יתר על כן, אינטראקציה משמעותית הצביעה על כך שהעלייה ב-DI הנגרמת על ידי השימוש במסיר החלקיקים התחזקה בריכוזים גבוהים יותר (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094; איור 4B, C). צילמנו גם את אותן שקופיות של תאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי והערכנו את ההשפעות של הסרת חלקיקים קטנים על מדידות DI שהתקבלו ממיקרוגרפי פלואורסצנטי. בעוד שהסרת חלקיקים קטנים מספקת ערכי DI שהם תיאורטית מדויקים יותר, ערכים כאלה בממוצע לא היו שונים באופן משמעותי מאלה שהושגו ללא שימוש בתוסף מסיר החלקיקים כאשר נמדדו באמצעות מיקרוגרפי פלואורסצנציה (F(1,8)=2. 613, p=0.1446, R2=0.0013; איור 4D).

אוטומציה של מדידות DI ממיקרוגרפי פלואורסצנטי

ביצוע מדידות DI בשיטה המסורתית מצריך עיבוד תמונה מייגע וגוזל זמן, שימוש בכלי החופשי להסרה דיגיטלית של גופי תאים בודדים ומדידה של אזורי עצביים מפוצלים וכלל אזורי עצבים מכל תמונה. לפיכך, ביקשנו לשפר את היעילות של השיטה על ידי כתיבת מאקרו האוטומציה מלאה של ניתוחי DI. כדי להפוך את הסרת הסומה לאוטומטית, המאקרו, שכותרתו ANDI, מבצע בינאריזציה של תמונות של גרעיני תאים, המסומנות באמצעות הכתם הגרעיני DAPI, ולאחר מכן שינוי של התמונה הבינארית כך שאזורים גרעיניים בעלי סף מוגדלים כדי להקיף את כל האזור של הסומה. תמונות כאלה עם גרעינים בינאריים ומוגדלים מופחתים לאחר מכן ממיקרוגרפי פלואורסצנטי מקבילים של נוירונים המסומנים באימונו ל-b III-tubulin, ויוצרים תמונה הכוללת עצבים בלבד (איור 5A, B).

כדי להתאים לגדלים גרעיניים משתנים הנגרמים על ידי הצטמקות או פיצול גרעיני הקשורים לניוון עצבי, התמונות הבינאריות של הגרעינים מוגדלות באמצעות שילוב של הרחבות ושחיקות המשלבות שברי גרעיניים ומרחיבות אזורים בינאריים כדי לכבוש שטח גדול יותר מהסומה של תאי LUHMES מובחנים. . לאחר מכן, תמונות המכילות neurites באופן בלעדי עוברות בינאריות ונתונות לניתוח DI באמצעות סדרה של פונקציות אוטומטיות (איור 5C, D). כדי להעריך את הדיוק של פעולות המאקרו הקשורות להסרת סומה מתמונות, השווינו את ציוני ה-DI שהתקבלו בעקבות הסרה ידנית של גופי תאים ממיקרוגרפי פלואורסצנציה באמצעות הכלי החופשי של ImageJ (כפי שתואר בעבר באיור 4D), לציוני DI נוצר מניתוחים של תמונות זהות בעקבות הסרה אוטומטית של גוף התא באמצעות פעולות הסרת סומא המופיעות ב-ANDI Macro. הניתוחים שלנו גילו שציוני DI שחושבו באמצעות הסרה אוטומטית של גוף תאים עמדו בקורלציה כמעט זהה למדידות DI שהתקבלו מתמונות שהועברו להסרה ידנית של סומא (r(34)=0.980, p, 0.0001; איור. 5E).

כדי להגביר את הדיוק של הניתוחים, שילבנו כמה מההתאמות שתוארו לעיל שמשפרות את מדידות DI ב-ANDI. המאקרו כולל פעולות לשיפור ניגודיות, שימוש בתוסף Particle Remover להסרת חומר לא-נוריטי מתמונות עצבים וחומר לא-גרעיני מתמונות של גרעינים, וזיהוי של שברי עצבים באמצעות פרמטרי גודל של 5-10,000 עבור התוסף Analyze Particles.

שיערנו כי, באופן קולקטיבי, השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, פעולות לשיפור ניגודיות, הסרת עצמים קטנים עם מסיר החלקיקים ופרמטרים מיטובים לזיהוי חלקיקים יתרמו למדידות מדויקות יותר של ניוון עצבים. כדי לבדוק השערה זו, תמונות ניגודיות הפאזה של תאי LUHMES שנחשפו לריכוזים שונים של 6-OHDA, שנוצרו כמתואר באיור 2, נותחו על ידי ניקוד עיוור וסובייקטיבי תוך שימוש בטווח ערכים שבין 0. 0 ו-1.0, עם ערכים המייצגים את הפרופורציה הנראית לעין של אזור עצבי מקוטע. לאחר מכן הערכנו את המתאם בין הציונים הסובייקטיביים ומדידות DI שהושגו בשיטה המסורתית, כמו גם את המתאם בין הציונים הסובייקטיביים למדידות DI שהושגו באמצעות מאקרו ANDI.

בעוד שמדידות DI שהתקבלו בשיטה המסורתית נמצאו בקורלציה עם ציונים סובייקטיביים (r {{0}}.7850, p,0.0001; איור 5F), מאקרו ANDI הניב מדידות המתואמות הרבה יותר עם דירוגים סובייקטיביים (r 2=0.978, p, 0.0001; איור 5G). השוואות סטטיסטיות ישירות גילו שציונים שהושגו באמצעות מאקרו ANDI היו בקורלציה משמעותית יותר עם דירוגים סובייקטיביים מאשר ציונים שהושגו בשיטה המסורתית (z=6.626, p, 0.0001; איור 5F, G). ניתוחים נוספים גילו שהמאקרו מקל על הביצועים של מדידות DI עם שיפור חזק ומשמעותי ביעילות הזמן. ניתוחי DI שבוצעו באמצעות מאקרו ANDI דרשו זמן ממוצע של 12.75 שניות לתמונה מנותחת, בהשוואה לזמן ממוצע של 5.27 דקות לתמונה שנותחה בשיטה המסורתית [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. בסך הכל, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-ANDI מניב יצירה מהירה של מדידות DI שבהשוואה לציונים המתקבלים בשיטה המסורתית, מקרוב יותר את הניוון שתופסים החוקרים מניתוח איכותי של תמונות עצביות.

לאחר קביעת הדיוק והיעילות של מאקרו ANDI למדידת ניוון עצבי בתאי LUHMES מובחנים שנחשפו ל-6-OHDA, הערכנו את התאמת המאקרו לניסויים הכוללים מודלים אחרים של תרבית תאים. מחקר פיילוט נערך לראשונה כדי להעריך את הדיוק של ANDI בביצוע מדידות DI באמצעות מיקרוגרפים של תרביות סימפטיות ראשוניות המסומנות אימונו ל-b III-tubulin ו-DAPI. עם זאת, מעניין שגופי התא של נוירונים סימפטיים גדולים יותר מאלו של תאי LUHMES מובחנים, ולפיכך הפעולות ב-ANDI הקשורות להסרת סומא אוטומטית לא הסירו את כל הסומה (לא מוצגים נתונים).

כדי להתגבר על בעיה זו, תיקנו את ANDI כך שתציג תיבת דו-שיח המאפשרת למשתמשים לבחור את גודל הסרת הסומה על-ידי שליטה במספר הפעמים שצילומי מיקרו-גרעינים בינאריים מורחבים. גרסה זו של ANDI, גרסה 1.1, שימשה לאחר מכן לביצוע מדידות DI מצילומי מיקרו המתארים נוירונים סימפטיים בריאים שטופלו ברכב או נוירונים סימפטיים מתנוונים שנחשפו למי חמצן. תמונות של נוירונים שנחשפו למי חמצן הניבו ציוני DI גבוהים משמעותית בהשוואה לתמונות של נוירונים שטופלו ברכב (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301; איור 6A, C). יתר על כן, השווינו את ציוני ה-DI הללו שהתקבלו באמצעות מדידות ANDI ל-DI שהתקבלו מאותו סט תמונות בעקבות הסרה ידנית של גופי תאים ממיקרוגרפי פלואורסצנציה באמצעות הכלי החופשי של ImageJ. לא היה הבדל משמעותי בציוני DI שחושבו בעקבות הסרת סומא ידנית בהשוואה לציונים שהושגו באמצעות ANDI (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0. 0000; איור 6A–C). בדיקות פוסט-הוק גם אישרו שציוני DI שהתקבלו באמצעות ANDI לא היו שונים באופן משמעותי הן במקרה של נוירונים לא מטופלים (p=0.0972) והן במקרה של נוירונים שנחשפו למי חמצן (p=0). 9986).

יתר על כן, ציוני DI שהופקו מ-ANDI עמדו בקורלציה כמעט זהה עם ציוני DI שהתקבלו בעקבות הסרה ידנית של גופי תאים מצילומי מיקרוסקופ מקבילים (r(34)=0.991, p, 0.0001). נתונים אלה מוכיחים ש-ANDI מתאים למדידת ניוון נוירונים בתרבויות של נוירונים ראשוניים, עם פעולות הסרת סומה שהמשתמש יכול להתאים אישית כדי להתאים לסוגי נוירונים שונים. בנוסף, זיהוי שברי עצבים בתרבויות שנחשפו למי חמצן מדגים את ישימות המאקרו לשימוש בניסויים הכוללים ניוון עצבי המושרה על ידי מקורות שאינם 6-OHDA. כדי לאמת עוד יותר את השימוש ב-ANDI בזיהוי ניוון של עצבים הקשורים לסיבות שונות, השתמשנו גם במאקרו כדי למדוד ניוון עצבי בצילומי מיקרו של תרבויות סימפטיות בריאות או תרבויות הנתונות לנסיגה מ-NGF. כצפוי, תמונות של תרביות שנתפסו לנסיגה מ-NGF הניבו ערכי DI גבוהים משמעותית בהשוואה לתמונות של תרביות בריאות (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958; איור 6D, E). ביחד, ממצאים אלה מוכיחים שניתן להשתמש ב-ANDI כדי לזהות ניוון עצבי הקשור למגוון הקשרים ביולוגיים.

מכיוון שצביעה עבור TH משמשת בדרך כלל כדי להמחיש נוירונים קטכולמינרגיים, הערכנו גם את ההתאמה של מיקרוגרפים המתארים צביעת TH למדידת ניוון עצבי באמצעות ANDI. תרבויות של נוירונים סימפטיים בריאים שטופלו בתמיסת כלי רכב או נוירונים סימפטיים מתנוונים שנחשפו למי חמצן תוקנה וטופלו לתיוג אימונופלואורסצנטי עבור TH ו-b III-טובולין, כמו גם צביעה נגדית עבור DAPI. תמונות Neurite המתארות צביעה עבור TH או b III-טובולין, ותמונות מתאימות של גרעינים עם תיוג DAPI, נלכדו אז בשדות ראייה דומים. ANDI הוצא להורג, והתמונות הכוללות צביעת TH או צביעת b III-tubulin נבחרו כתמונות הנויריט. הניתוחים שלנו גילו שציוני DI שהתקבלו באמצעות תמונות של צביעת TH מתואמים מאוד עם ציונים שהתקבלו מתמונות של צביעת b III-tubulin (r(28)= 0.962, p, 0.0001; איור 6F, G). נתונים אלה מצביעים על כך שניתן להשיג מדידות DI מדויקות על ידי ANDI תוך שימוש בהליכי צביעה אלטרנטיביים המסמנים את מכלול הנויריטים, כגון אימונולייבלינג עבור TH.

כדי להדגים את התועלת של השיטה המשופרת לביצוע מדידות DI בניסוי מדעי, השתמשנו בשיטה החדשה כדי להעריך את תפקידו של JNK בניוון עצבי הנגרם כתוצאה מלחץ חמצוני בתאי מנצפלי אנושיים. תאי LUHMES מובחנים טופלו מראש במשך שעה אחת עם מעכב JNK SP600125 או תמיסת רכב. לאחר מכן התאים טופלו במשך 24 שעות עם 6- OHDA כדי לגרום ללחץ חמצוני או עם תמיסת כלי רכב. תאים קבועים הועברו לסימון אימונו לצביעת b III-tubulin ו-DAPI, ו-ANDI שימש כדי להשיג מדידות DI ממיקרוגרפי פלואורסצנטי. בעוד שתרבויות חסרות טיפול מקדים עם מעכב ה-JNK הראו ניוון עצבי בעקבות חשיפה ל-6-OHDA, עיכוב JNK הביא להפחתה ניכרת ומשמעותית של 6- ניוון העצבים המושרה על ידי OHDA (p= 0.0001 , ד= 2.0209; איור 7). ממצאים אלה תומכים בתפקיד מפתח לאיתות JNK בניוון עצבי המושרה על ידי מתח חמצוני בתאי מינצפלי אנושיים, וחשוב מכך, מדגימים את התועלת של השיטה החדשה שלנו להפקת תגליות מדעיות על ידי הקלה על מדידה מהירה ומדויקת של ניוון עצבי.

דִיוּן

ניוון עצבי קשור למגוון מצבים נוירופתולוגיים, אך המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפירוק של עצבים נותרים לא מובנים לחלוטין. שיטות המאפשרות ניתוח מדויק ויעיל של ניוון העצבים חיוניות לזיהוי מוצלח של גורמים חדשים המסדירים את האירוע הסלולרי החשוב הזה. במחקר הנוכחי, אנו חושפים מספר מקורות שגיאה הקשורים לשיטה נפוצה לכימות ניוון עצבי. אנו מדווחים על נתונים ניסיוניים התומכים בשינויים פרוצדורליים שניתן ליישם כדי להפחית שגיאות בניתוח DI, ושינויים כאלה משולבים במאקרו ImageJ חדש כדי לספק כלי לניתוחי DI מהירים, מדויקים ואובייקטיביים באמצעות קוד פתוח ותוכנה חופשית. יתרה מכך, אנו מדגימים כיצד ניתן ליישם את השיטה המשופרת למדידת ניוון עצבים במודל תרבית תאים של PD, הפרעה שבה פיצול אקסונלי בנוירונים דופמינרגיים הוא אירוע בשלב מוקדם שלפני אובדן עצבי סופי (Tagliaferro and Burke, 2016) .

במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את התועלת של מאקרו ANDI במדידת ניוון עצבי במודל תרבית תאים של PD המורכב מתאי LUHMES מובחנים שנחשפו ל-6-OHDA.

אנו מדווחים על ממצאים ניסיוניים התומכים במצעים האופטימליים שעליהם יש להקים את התרבויות, וכן מדגימים את צפיפות הציפוי המתאימה ביותר לניתוח ניוון העצבים. לשימוש במערכת מודל זו לחקר ניוון העצבים יש מספר יתרונות. התאים מפתחים עצבים מרושתים היטב ובדרך כלל באורך 0.500 מ"מ, והתרבויות רגישות לניוון עצבי המושרה על ידי מודלים קלאסיים של נוירוטוקסינים של PD כגון 6-OHDA, 1-מתיל{{4 }}יון פנילפירידיניום (MPP1), ורוטנון (Lotharius et al., 2005; Zhang et al., 2014; Smirnova et al., 2016; Kraemer et al., 2021). יתר על כן, המקור האנושי של תאי LUHMES מגביר את יכולת התרגום של ממצאים הקשורים למודל, וההנצחה המותנית מקלה על יצירה והפצה מהירה של תרבויות (Scholz et al., 2011). לפיכך, יחד עם ניתוחים אוטומטיים המבוצעים באמצעות ANDI, ניתן להשתמש בתאי LUHMES כדי לגלות תגליות חדשות הקשורות לניוון עצבי הקשור ל-PD תוך מתן תפוקה גבוהה משמעותית בהשוואה לניתוחים לא אוטומטיים המבוצעים עם תרביות נוירונים ראשוניות.

קבוצות מחקר רבות ביצעו ניתוחי DI באמצעות תמונות ניגודיות פאזה כדי לקבל תובנה לגבי גורמים המווסתים ניוון העצבים (Press and Milbrandt, 20{{10}}9; Kraemer et al., 2014 ; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Geisler et al., 2019). כאן, אנו מדווחים על חיסרון חשוב הקשור בשיטה הנפוצה הזו למדידת ניוון עצבים: הבינאריזציה של תמונות ניגודיות פאזה גורמת לחלק ניכר מהנויריטים שלמים להיראות מפוצלים. בעוד שרמת הניגודיות שעשויה להיות מושגת בעת לכידת מיקרוגרפים משתנה בהתאם למערכת המיקרוסקופ הזמינה לחוקרים, סוגיה זו נפוצה בקרב קבוצות מחקר שונות, שכן DI של 0.2 מקובל בדרך כלל כסף שמעליו נחשבות תרבויות כנוונות. אקסונים, ורוב הדוחות המדעיים הכוללים מדידות DI ממיקרוגרפי ניגודיות פאזה דיווחו על ציוני DI עבור נוירונים בריאים בין 0.1 ל-0.3 (Sasaki et al., 2009, 2016; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Loreto et al., 2020). ניתוחי ה-DI שלנו שהתקבלו ממיקרוגרפי פלואורסצנציה, כמו גם ציונים סובייקטיביים של חוקרים עיוורים, מצביעים על כך שפיצול עצבי של 10-20% אינו שכיח בתרביות נוירונים בריאות. במקום זאת, תרבויות כאלה מציגות רק 2.5% פיצול עצבי בממוצע. לפיכך, הממצאים שלנו מדגישים את הצורך בשיטות המשפרות את הדיוק של ניתוחי ניוון העצבים על ידי הפחתת מקור נפוץ ומשמעותי זה של שגיאת מדידה.

בעוד שרוב המחקרים הכוללים מדידות DI השתמשו בתמונות ניגודיות פאזה לביצוע ניתוח ניוון העצבים, מספר קבוצות מחקר ביצעו לאחרונה מדידות DI באמצעות תמונות של נוירונים המסומנים אימונו עבור חוטים ציטו-שלד כגון פוליפפטיד בינוני נוירופילמנט או b-b-tubulin (Wakatsuki et al., 2011; Li et al., 2017; Pease-Raissi et al., 2017; Hernandez et al., 2018; Sundaramoorthy et al., 2020). עם זאת, איזו צורה של מיקרוסקופיה המתאימה ביותר למדידות ניוון העצבים נותרה לא ברורה, שכן נדרשו מחקרים כדי להבין האם שינויים בלוקליזציה של חלבוני השלד הציטוניים הללו במהלך ניוון העצבים מדגמים באופן מתאים את השינויים הכוללים במורפולוגיה של העצבים, וכן כדי להעריך את המידה שבה מדידות DI המתקבלות עם מיקרוגרפי פלואורסצנטי מתואמות למדידות דומות שהתקבלו ממיקרוגרפי ניגודיות פאזה. כאן, אנו מדגימים כי מיקרוגרפי פלואורסצנציה המתארים צביעת b III-tubulin לא רק מייצגים במדויק פיצול נויריטים, אלא גם מאפשרים מדידות DI מדויקות יותר בגלל הניגודיות המעולה שלהם והירידה ברגישות לפיצול מלאכותי בבינאריזציה. לפיכך, התוצאות שלנו מדגישות את התועלת של שימוש בצביעה b III-tubulin למדידת ניוון עצבי.

בין המחקרים שפורסמו הכוללים ניתוחי DI למדידת ניוון עצבים, הפרמטרים המדווחים של גודל ומעגליות המשמשים לאיתור שברי עצבים השתנו במידה ניכרת. לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה שכלל הערכה של ניוון עצבי בנוירונים מתורבתים בהיפוקמפוס השתמש בפרמטרים של גודל של 4-900 פיקסלים (Li et al., 2017), בעוד שמחקר שכלל נוירוני DRG מתורבתים השתמש בפרמטרי זיהוי של 0–10,000 פיקסלים (Wakatsuki et al., 2011). סיבה אפשרית אחת לשונות כזו היא שהיעילות של פרמטרים של גודל ניתוח חלקיקים באיתור שברי עצבי משתנה בהתאם לרזולוציית התמונה שכן פרמטרי הגודל לזיהוי חלקיקים קשורים ליחידות פיקסלים. למרבה הצער, רוב המחקרים שפורסמו הכוללים ניתוחי DI אינם כוללים תיאור של רזולוציית התמונה המשמשת לניתוחים. לפיכך, היה צורך בהקמת פרמטרי ניתוח סטנדרטיים באמצעות פרוטוקול החושף פרטים חשובים באופן מלא, כגון רזולוציית התמונה המומלצת. כאן, אנו מדווחים שהפרמטרים הנפוצים ביותר לזיהוי שברי עצבים, 20-10, 000 פיקסלים (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al., 2012; al., 2020; Shin and Cho, 2020), מביאים לכך ששיעורים גדולים של שברי נוירונים אינם מזוהים. הקטנת קריטריון הגודל המינימלי לזיהוי שברי עצבים משפרת את הרגישות של זיהוי שברים, ובו זמנית מגדילה את מספר חפצי התמונה ופסולת שאינה עצבית המתגלים בצורה שגויה כשברי עצבים. בחיפוש אחר פרמטרים שיאזנו בצורה הטובה ביותר בין רגישות זיהוי ושיעורי חיוביות כוזבת, זיהינו פרמטרים של ניתוח של 10-10,000 כמספקים את הזיהוי המדויק ביותר של שברי עצבים בתמונות בינאריות המתקבלות ממיקרוגרפי ניגודיות פאזה, בעוד פרמטרים של 5-10,000 מאפשרים את הזיהוי המדויק ביותר של שברי נויריטים בתמונות בינאריות המתקבלות ממיקרוגרפי פלואורסצנטי. אמנם קביעות אלה נעשו באמצעות רזולוציית תמונה של 1280 1024, אבל פרמטרים כאלה צריכים גם לאפשר זיהוי מדויק של שברי עצבים בתמונות שצולמו ברזולוציות אחרות בעלות גודל אנכי של 1024 פיקסלים, כמו רזולוציית המסך המלא הנפוצה של {{ 27}}, מכיוון שהנוירונים המתוארים בתמונות כאלה יהיו בגודל פיקסל דומה.

קבוצות מחקר רבות השתמשו בקריטריון של גודל מינימלי בעת הגדרת פרמטרים של ניתוח חלקיקים כדי למנוע שילוב של פסולת קטנה, שאינה עצבית, במדידות שברי עצבים (Shin et al., 2012; Cosker et al., 2013; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Li et al., 2017; Loreto et al., 2020; Shin and Cho, 2020; Sundaramoorthy et al., 2020). עם זאת, מחקרים כאלה כללו בטעות חומר קטן ללא קטע במדידות של שטח העצב הכולל, שכן מדידות כאלה מתקבלות על ידי סיכום השטח של כל הפיקסלים השחורים בתמונה. כאן, אנו מדגימים את התועלת של תוסף מסיר החלקיקים להסרת פסולת קטנה ללא קטע מהתמונה לפני ניתוח DI. ניצול התוסף העלה משמעותית את הרגישות של מדידות ניוון עצבים שהתקבלו מתמונות ניגודיות פאזה. לפיכך, התוצאות שלנו מדגישות את הערך של תוסף מסיר החלקיקים עבור חוקרים המבצעים ניתוחי DI באמצעות מיקרוגרפי ניגודיות פאזה. מעניין לציין כי מיקרוגרפי פלואורסצנציה הציגו פחות פסולת קטנה ולא נורית, ולפיכך ניתן היה להשתמש בקריטריון בגודל נמוך יותר של חמישה פיקסלים לזיהוי שברים. בעוד שהסרת חלקיקים של פסולת שאינה עצבית בגודל של פחות מחמישה פיקסלים לא השפיעה באופן משמעותי על מדידות DI שהתקבלו ממיקרוגרפי פלואורסצנטי, פעולות כאלה מספקות ערכים תיאורטית מדויקים יותר ולכן נכללו ב-ANDI.

מכיוון שניתוחי DI חייבים להתבצע באמצעות תמונות הכוללות עצבים בלבד, יישום שיטת הניתוח הוגבל בעיקר לשימוש עם מערכות תרבית הניתנות להסרה של גופי תאים, כגון תרביות explant שבהן ניתן לכרות גופי תאים פיזית (Catenaccio et al. , 2017; Shin and Cho, 2020) או תרבויות במכשירים מיקרופלואידיים המאפשרים הפרדה של תאי סומה ואקסונים (Cosker et al., 2013; Pease-Raissi et al., 2017; Tan et al., 2018). לחלופין, ביצוע ניתוחי DI עם תרבויות מנותקות יכולה להיות מושגת באמצעות עבודה מייגעת וגוזלת זמן הקשורה להסרה דיגיטלית של גופי תאים ממיקרוגרפים (Kraemer et al., 2014). במחקר הנוכחי, אנו חושפים כי ANDI מאפשר ביצוע של מדידות DI מצילומי מיקרו הכוללים תאי LUHMES אשר מפורקים ומופצים בפסיפס על פני מערכת תרבית דו-ממדית. הממצאים שלנו מוכיחים גם ש-ANDI מאפשר ירידה 24-פיפול בזמן הדרוש לביצוע הניתוחים, והפעולות ב-ANDI הקשורות להסרת סומא מניבות תוצאות ניתוח DI המתואמות 98% לניתוחים דומים שבוצעו לאחר הסרת סומא ידנית באמצעות כלי ביד חופשית של ImageJ. לפיכך, המאקרו מגביר באופן משמעותי את היעילות של הניתוחים על ידי ביצוע הסרת סומא אוטומטית באמצעות תהליך שאינו מוותר על דיוק, ופעולות כאלה מרחיבות את התאמת השיטה לניתוח תרבויות מנותקות עם גופי תאים המופצים בפסיפס.

בנוסף להקלה על הסרה אוטומטית של גוף תאים מתמונות, ANDI מציגה מספר תיקונים לשיטה המסורתית לביצוע ניתוח DI, כולל שימוש במיקרוגרפי פלואורסצנטי, פרמטרים מתוקנים של ניתוח חלקיקים ושימוש במסיר החלקיקים להסרת פסולת קטנה שאינה עצבית מתוך תמונות. הממצאים שלנו מצביעים על כך שהאופטימיזציות הללו מניבות יחד ערכי DI שמקרוב יותר את הערכים שהושגו באמצעות ניקוד עיוורון ונתון. לפיכך, בנוסף להפחתה משמעותית של הזמן הנדרש לביצוע הניתוחים, ANDI מאפשר מדידות DI שבהשוואה לשיטה המסורתית, משקפות בצורה מדויקת יותר את ניוון העצבים שלפי הדיווחים החוקרים צופים מניתוח תמונה איכותי.

חסרון אחד של השיטה המסורתית לביצוע ניתוחי DI הוא שניתוחים כאלה דורשים הכשרה בשימוש ב-ImageJ כך שהמשתמש יכיר מערך מייגע של פעולות ImageJ. יתרה מכך, כדי לבצע את הניתוחים בצורה יעילה, נדרשת הכשרה נוספת למשתמש לבצע ניתוחי אצווה או לכתוב סקריפטים כדי לבצע חצי אוטומציה של ביצוע שלבים מסוימים. על ידי אוטומציה מלאה של הניתוח, ANDI מאפשר מדידות DI בכמה שלבים בלבד הקשורים להורדה וביצוע המאקרו. כדי להגביר את הידידותיות למשתמש, המאקרו כולל קוד המספק ממשק לבחירת ספריות המכילות תמונות לניתוח, וכן כדי להקל על הפלט של תמונות תוצאות וטבלאות נתונים לספריה לבחירת המשתמש. יתרה מכך, הסקריפט מכיל תכונות רבות שנועדו למנוע אי דיוקים במדידה או טעויות משתמש, כולל ניקוי אוטומטי של תוצאות ImageJ קודמות; הסרה של מידע על קנה המידה של התמונה כדי להבטיח שהמדידות מבוצעות במדויק באמצעות יחידות פיקסלים; תצורה מתאימה של הגדרות צבע ImageJ, הגדרות מדידה ופרמטרים של מנתח חלקיקים; הצגת הודעת שגיאה אם ​​משתמשים בוחרים בטעות ספריות המכילות מספר לא שווה של תמונות המתארות צביעת b III-tubulin ו-DAPI; תיאורי יומן המציינים התקדמות הניתוח; וקידוד למניעת באגים הקשורים ליצירה אוטומטית של קבצי .ini על ידי Windows 10. בסך הכל, תכונות אלה הופכות את ניתוחי DI לידידותיים יותר למשתמש, מה שעשוי לעודד עניין במחקרים הקשורים לניוון העצבים.

כדי להדגים את התועלת שלו בניסוי, השתמשנו ב-ANDI כדי להעריך את התרומות של JNK לניוון עצבי בתרביות תאים LUHMES שנחשפו ל-6-OHDA. JNK הוא קינאז המופעל על ידי סטרס שדווח כמפתח לניוון עצבי בנוירונים היקפיים ממקור לא-פרימטי (Shin et al., 2012), אך נדרשים מחקרים נוספים כדי להבין את תפקידו של הקינאז בניוון עצביים בתאי אנושיים mesenphalic. . כאן, אנו מדגימים שעיכוב של JNK מגן באופן משמעותי על תאים מנצפליים אנושיים מפני ניוון עצבי הקשור ללחץ חמצוני. ממצאים כאלה לא רק חושפים תפקיד חשוב עבור JNK בניוון עצבי הקשור למודל של מחלה אנושית, אלא גם מדגימים את התועלת של ANDI לביצוע ניתוח תמונות אוטומטי ואובייקטיבי לגילוי תגליות מדעיות חדשות.

בעוד ש-ANDI תוכנן בתחילה כדי להקל על מדידה מהירה ומדויקת של ניוון עצבים בתרביות של תאי LUHMES מובחנים שנחשפו ל-6-OHDA, הממצאים שלנו גם מצביעים על כך שניתן להשתמש במאקרו כדי לזהות ניוון עצבי המושרה מסיבות אחרות, כגון חשיפה למי חמצן או גמילה נוירוטרופין. בנוסף, גרסה 1.1 של המאקרו כוללת תיבת דיאלוג המאפשרת לחוקרים להתאים אישית את פעולות הסרת הסומה עבור נוירונים בגדלים ספציפיים. הנתונים שלנו תומכים גם בכך שניתן להשתמש בשיטות צביעה אחרות מלבד סימון אימונו ל-b III-tubulin למדידה מדויקת של ניוון העצבים. למרות שאנו ממליצים להשתמש במחקרי פיילוט כדי לאמת את הדיוק של מדידות DI בעת שימוש ב-ANDI עם סוגי תאים או שיטות צביעה שלא נבדקו בעבר, ממצאים אלה תומכים בכך שהמאקרו הוא כלי רב-תכליתי למדידת ניוון עצבי בנוירונים מתורבתים. מכיוון ש-ANDI לא עבר אופטימיזציה למדידת ניוון עצבים ברקמה, אנו ממליצים כרגע להשתמש בו רק לניתוח ניוון עצבי הקשור לתאים מתורבתים. עם זאת, הקוד של ANDI זמין לציבור ולכן עשוי להיות שימושי גם עבור חוקרים המעוניינים לשנות את התסריט כך שיתאים למחקרים in vivo או ליישומים אחרים.

לסיכום, מאמר זה מציג נתונים החושפים מקורות שגיאה נפוצים הקשורים לשיטה בשימוש נרחב לכימות ניוון עצבי. נעשה שימוש בגישות ניסיוניות לשיפור השיטה, ושיפורים כאלה שולבו במאקרו ImageJ חופשי ופתוח שניתן להשתמש בו לביצוע ניתוח מהיר, מדויק ואובייקטיבי של מיקרוגרפי פלואורסצנציה עבור ניוון עצבים. הממצאים שלנו חושפים את היעילות של ANDI לכימות ניוון עצבים במיקרוגרפים המתארים מודל תרבית תאים של PD, וכן מספקים הוכחה לעיקרון שהמאקרו יכול לזהות ניוון עצבי הקשור להקשרים ביולוגיים אחרים. המאקרו הידידותי למשתמש יקטין את הזמן הנדרש לחוקרים ללמוד לכמת את פיצול העצבים תוך הגדלת התפוקה והדיוק של מחקרים שמעריכים גורמים העומדים בבסיס ניוון העצבים. מאקרו ANDI זמין בכתובת ה-URL הבאה: https://github.com/kraemerb/kraemerlab.

הפניות

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) ירידה קוגניטיבית במחלת פרקינסון. Nat Rev Neurol 13:217–231.

2. Adalbert R, Coleman MP (2013) סקירה: פתולוגיה של אקסון בהפרעות ניווניות הקשורות לגיל. Neuropathol Appl Neurobiol 39:90-108.

3. Bové J, Perier C (2012) מודלים מבוססי נוירוטוקסין של מחלת פרקינסון. מדעי המוח 211:51–76.

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017). Cell Death Dis 8: e3166.

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) נוירוטרופינים שמקורם במטרה מתאמים שעתוק.

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR, et al. (2015) עלייה במונונוקלאוטיד ניקוטינמיד מבשר NAD (NMN) לאחר פציעה מעודדת ניוון אקסון. מוות תאים ההבדל 22:731–742.

7. Fukui K (2016) מיני חמצן תגובתיים מעוררים ניוון עצבי לפני זירוז מוות של תאים. J Clin Biochem Nutr 59:155–159.

8. Geden MJ, Deshmukh M (2016) ניוון אקסון: ההקשר מגדיר מסלולים נפרדים. Curr Opin Neurobiol 39:108–115.

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) Vincristine ו- Bortezomib משתמשים במנגנונים שונים במעלה הזרם כדי להפעיל ניוון אקסון נפוץ1-תלוי ב-SARM תכנית. JCI Insight 4:e129920.

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) ניוון אקסונלי המושרה על ידי אקזיטוטוקסיות של גלוטמט מתווכת על ידי נקרופטוזיס. J Cell Sci 131:jcs214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com