ניתוחי פרוטאומיקה וציטוקינים מבחינים בין מקרי אנצפלומיאליטיס מיאלגי/תסמונת עייפות כרונית לבין בקרות חלק 1

תַקצִיר

רקע כללימיאלגי אנצפלומיאליטיס/תסמונת עייפות כרונית (ME/CFS) היא מחלה הטרוגנית מורכבת המאופיינת בעייפות מתמשכת בלתי מוסברת ומאפיינים אחרים, כולל ליקוי קוגניטיבי, כאבי שרירים, חולשה לאחר מאמץ וחוסר תפקוד של מערכת החיסון. ציטוקינים קיימים בפלזמה ומכוסים בשלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), אך היו רק כמה דיווחים על מאפייני EV ומטען ב-ME/CFS. מספר מחקרים קטנים תיארו בעבר חלבוני פלזמה או מסלולי חלבון הקשורים ל-ME/CFS.

Cistanche יכול לשמש כמשפר עייפות וסיבולת, ומחקרים ניסיוניים הראו שמרתח של Cistanche tubulosa יכול להגן ביעילות על הפטוציטים של הכבד ועל תאי האנדותל שניזוקו בעכברים שוחים נושאי משקל, להגביר את הביטוי של NOS3 ולקדם גליקוגן בכבד. סינתזה, ובכך מפעילה יעילות נגד עייפות. תמצית Cistanche tubulosa עשירה ב-Penylethanoid glycoside יכולה להפחית באופן משמעותי את רמות קריאטין קינאז בסרום, לקטאט דהידרוגנאז ולקטאט, ולהגביר את רמות ההמוגלובין (HB) והגלוקוז בעכברי ICR, וזה יכול למלא תפקיד אנטי עייפות על ידי הפחתת הנזק לשרירים ועיכוב העשרת חומצת החלב לאגירת אנרגיה בעכברים. Compound Cistanche Tubulosa Tablets האריכו באופן משמעותי את זמן השחייה נושא המשקל, הגדילו את מאגר הגליקוגן בכבד והפחיתו את רמת האוריאה בסרום לאחר פעילות גופנית בעכברים, מה שמראה את השפעתו נגד עייפות. המרתח של Cistanchis יכול לשפר את הסיבולת ולהאיץ את ביטול העייפות בעכברים מתאמנים, ויכול גם להפחית את העלייה של קריאטין קינאז בסרום לאחר אימון עומס ולשמור על מבנה האולטרה של שרירי השלד של עכברים תקין לאחר אימון, מה שמעיד על כך שיש לו את ההשפעות של שיפור כוח פיזי ואנטי עייפות. Cistanchis גם האריך משמעותית את זמן ההישרדות של עכברים מורעלים בניטריט והגביר את הסבילות נגד היפוקסיה ועייפות.

לחץ על עייפות קיצונית

למה נהיה עייפים? כיצד נוכל לפתור את בעיות העייפות?

【צור קשר】 דוא"ל: george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:008613632399501/Wechat:13632399501

שיטותהכנו שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מדגימות פלזמה קפואות מקבוצה של מקרים של מיאלגי אנצפלומיאליטיס/תסמונת עייפות כרונית (ME/CFS) ובקרות עם נתונים שפורסמו קודם לכן על ציטוקינים פלזמה ופרוטאומית פלזמה. תכולת הציטוקינים של השלפוחיות החוץ-תאיות שמקורן בפלסמה נקבעה על ידי בדיקת מרובה וההבדלים בין המטופלים והביקורות הוערכו. לאחר מכן ביצענו ניתוחים סטטיסטיים מולטי-אומיים שהתייחסו לא רק לנתונים החדשים הללו אלא לנתונים קליניים נרחבים המתארים את בריאותם של הנבדקים.

תוצאותבמקרים של ME/CFS הראו גודל וריכוז גדולים יותר של EVs בפלזמה. מבחני תכולת ציטוקינים במכוניות EV גילו כי IL2 היה גבוה משמעותית במקרים מסוימים. ראינו מתאמים רבים בין ציטוקינים EV, ציטוקינים פלזמה וחלבוני פלזמה מפרוטאומיקת ספקטרומטריית המונים. מתאמים משמעותיים בין נתונים קליניים ורמות חלבון מצביעים על התפקידים של חלבונים ומסלולים מסוימים במחלה. לדוגמה, רמות גבוהות יותר של הציטוקינים הפרו-דלקתיים Granulocyte-Monocyte Colony-Stimulating Factor (CSF2) ו-Tumor Necrosis Factor (TNF) נמצאו בקורלציה עם תסמיני פיזיים ועייפות גדולים יותר במקרים של ME/CFS. פרוטאז סרין גבוה יותר SERPINA5, המעורב בהמוסטזיס, נמצא בקורלציה עם ציוני בריאות כלליים גבוהים יותר של SF-36 ב-ME/CFS. מסווגים של למידת מכונה הצליחו לזהות רשימה של 20 חלבונים שיכולים להבחין בין מקרים ובקרות, כאשר XGBoost מספק את הסיווג הטוב ביותר עם דיוק של 86.1% וערך AUROC מאומת בין 86. {15}}.947. Random Forest הבדיל בין מקרים לבקרות עם 79.1% דיוק וערך AUROC של 0.891 תוך שימוש ב-7 חלבונים בלבד.

מסקנותממצאים אלו מוסיפים למספר המשמעותי של ההבדלים האובייקטיביים בביומולקולות שזוהו אצל אנשים עם ME/CFS. המתאמים שנצפו של חלבונים חשובים בתגובות חיסוניות והמוסטזיס עם נתונים קליניים מרמזים עוד יותר על הפרעה בתפקודים אלה ב-ME/CFS.

מילות מפתחאנצפלומיאליטיס מיאלגי/תסמונת עייפות כרונית, שלפוחיות חוץ-תאיות, פלזמה, פרוטאומיקה, ציטוקינים

רקע כללי

מיאלגי אנצפלומיאליטיס/תסמונת עייפות כרונית (ME/CFS) היא מחלה קשה שניתן לאבחן לאחר 6 חודשים של עייפות מתישה חדשה, חולשה לאחר מאמץ, שינה לא מרעננת, ואחד או שניהם משני התסמינים הנוספים, קושי קוגניטיבי או אי סבילות אורתוסטטית [ 1]. רוב החולים מדווחים כי הסימפטומים שלהם הופיעו לאחר מחלה דמוית ויראלית, אך זהות הזיהום הקודם כמעט תמיד אינה ידועה, אם כי משפחת האנטרוביראלית הייתה מעורבת לעיתים [2, 3]. לפני 2020, 65 מיליון אנשים ברחבי העולם היו סובלים מ-ME/CFS [4]. מאז מגיפת ה-SARS-COV2, תת-קבוצה של אנשים שסבלו מ-COVID{11}} ממשיכים לחוות תסמינים [5], וחלק מהקורבנות של נגיף הקורונה לטווח ארוך-19 ממלאים את האבחון של ME/CFS קריטריונים שתוארו לעיל [6]. באופן דומה, לאנשים שחווים מחלת מלחמת המפרץ יש תסמינים החופפים הן ל-COVID הארוך והן ל-ME/CFS [7]. עם זאת, מספר מבחנים, כגון הדמיה עצבית [8], מבחינים בין מחלת מלחמת המפרץ לבין ME/CFS. עדיין לא ידוע אם נגיף הקורונה הארוך ו-ME/CFS שאינם קשורים לזיהום ב-SARS-CoV-2 יובדלו גם הם באמצעות הדמיה או אמצעים אחרים.

חלבונים הקשורים למערכת החיסון המולדת ומעורבים במפל המשלים כמו גם במסלולים הקשורים לאיתות דופמין דווחו מועשרים בחולי ME/CFS בהשוואה לביקורות במחקרים שניתחו נוזל מוחי [9, 10 ]. באמצעות אנליזה של ספקטרומטריית מסה בפלזמה, דווחו הפרעות בוויסות באנרגיה, שומנים וחומצות אמינו מטבוליזם ב-ME/CFS [11-13]. אך לאחרונה, ניתוח פרוטאום פלזמה הקשור ל-ME/CFS תוך שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית אולטרה-ביצועית-ספקטרומטריית מסה טנדמית זיהה פרופילים שונים בין חולי ME/CFS, כמו גם תת-קבוצות ME/CFS (עם או בלי IBS), ובקרות ו קבוצה של חלבונים שעשויה לחזות את מצב ME/CFS ברמת דיוק גבוהה למדי (Area Under the Curve (AUC)=0.774–0.838) [14].

ידוע שתפקוד מערכת החיסון והתגובות הדלקתיות מווסתות על ידי ציטוקינים הפועלים כמאפננים ושהפרשתם יכולה להתרחש באופן הפרשה קלאסי או באמצעות אנקפסולציה בשלפוחיות חוץ-תאיות, תוך הגנה מפני אנזימים מתכלים [15]. EVs הם אחד המשתתפים העיקריים בתקשורת בין תא לתא ומניעים פתולוגיה של מחלות דלקתיות, אוטואימוניות וזיהומיות [16-19] ודוחות קודמים הראו מספר מוגבר של EVs במחזור, לא רק בסרטן ובמחלת אלצהיימר [17, 20–22], אבל גם ב-ME/CFS [23–25]. מחקר שנערך לאחרונה על EVs שבודדו מחולי ME/CFS ומנבדקים עם עייפות כרונית אידיופטית ודיכאון קליני הצליח להבחין בין שתי הקבוצות עם AUC של 0.802 אך ורק באמצעות מספרי EV במחזור, מה שאיפשר אבחנה נכונה ב-90-94% מהאנשים. מקרי ME/CFS [24].

יש צורך בדחיפות באפיון מולקולרי נוסף של ME/CFS כדי לספק תובנות לגבי ההפרעות המתרחשות במחלה. למחקרים מולטי-אומיים שבוצעו על אותה קבוצה של נבדקים יש פוטנציאל גבוה לספק השערות חדשות. יתרה מזאת, היכולת להבחין בין נבדקי ME/CFS מבקרים בריאים ברגישות ובספציפיות גבוהות תאפשר ניטור של ההשפעה של טיפולים ניסיוניים. ניצול דגימות דם להערכת הפרעות הקשורות ל-ME/CFS יהיה בעל ערך במיוחד בהשוואה לשיטות פולשניות או מסורבלות יותר.

במחקר זה, בודדנו שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מדגימות דם שנאספו לפני 2020 מנבדקי ME/CFS ובקרות בריאות ומדדנו את תכולת הציטוקינים שלהם. הנתונים החדשים שנוצרו יחד עם נתונים שכבר פורסמו מניתוח פרוטאומי פלזמה טנדם-ספקטרומטרי [14] וקביעת רמות ציטוקינים בפלזמה [26] על אותן דגימות שימשו יחד לניתוחים סטטיסטיים מרובים. זיהינו חבילה של ציטוקינים EV אשר שונים באופן משמעותי ברמות בין נבדקי ME/CFS ובקרה. ראינו קורלציות בין רמות של ציטוקינים EV שונים, בין רמות ציטוקינים בפלזמה, בין ציטוקינים EV וציטוקינים בפלזמה, ובין ציטוקינים וחלבוני פלזמה אחרים. כמו כן, זיהינו קשרים בין ציטוקינים בפלזמה לבין חומרת תסמיני ME/CFS מסוימים. בביקורות, רמות של ארבעה חלבוני פלזמה היו קשורות למדדים בריאותיים. חלבון המעורב בהמוסטזיס, SERPINA5, נמצא בקורלציה חיובית עם ציוני תפקוד SF-36 גבוהים יותר. באמצעות למידת מכונה, זיהינו את 20 החלבונים עם ערכי חשיבות התכונות הגבוהים ביותר. באמצעות 20 האנליטים הללו ו-XGBoost, נוכל להבחין בין ME/CFS ובקרה על נבדקים ברגישות ובספציפיות גבוהות במיוחד (AUC=0.947).

שיטות

אוכלוסיית המחקר

תת-אוכלוסיה של 49 מקרי ME/CFS ו-49 מקרי ביקורת בריאים מקבוצת ה-Chronic Fatigue Initiative [27] נותחו במסגרת המחקר הנוכחי. כל המקרים עמדו בקריטריונים של CDC Fukuda משנת 1994 [28] ו/או 2003 של הקריטריונים של קונצנזוס קנדי ​​עבור ME/CFS [29]. ביום איסוף הדם, התסמינים הקליניים ומצב הבריאות הבסיסי הוערכו באמצעות סקר בריאות קצר טופס 36 (SF-36) ​​[30] וסולם Multidimensional Fatigue Inventory (MFI) [31]. דם היקפי נמשך בצינורות הכנת תאים מסוג נתרן ציטראט BD VacutainerTM ובוצע בצנטריפוגה לכדוריות דם אדומות. דגימות פלזמה שהתקבלו התקבלו מארבעה מקומות מרופאים מפקחים כפי שמוצג: סולט לייק סיטי, יוטה (לוסינדה בייטמן), Incline Village, נבאדה (דניאל פיטרסון), מיאמי, פלורידה (ננסי קלימאס), וניו יורק, ניו יורק (סוזן Levine) ומאוחסן ב-80 מעלות ונשלח מאוניברסיטת קולומביה לאוניברסיטת קורנל על קרח יבש ואוחסן ב-80 מעלות לפני עיבוד לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות. התקבלה הסכמה בכתב מכל המשתתפים וכל הפרוטוקולים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית במרכז הרפואי Irving של אוניברסיטת קולומביה.

טיהור שלפוחיות חוץ תאיות

שלפוחיות תאיות (EVs) בודדו מדגימות פלזמה על ידי משקעים באמצעות ריאגנט ExoQuick™ (System Biosciences, פאלו אלטו, קליפורניה, ארה"ב) כפי שתואר בעבר [25]. בקצרה, דגימות פלזמה מכל נבדק הופשרו על קרח וצנטריפוגה ב-3000×g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר תאים ופסולת. תרומבין (611 U/ml) (System Bioscience, Palo Alto, CA, ארה"ב) נוסף ודגימות הודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר להסרת פיברינוגן, צנטריפוגה ב-10,000×g למשך 5 דקות, ו הסופרנטנט נאסף. לאחר מכן הדגימות הודגרו עם ExoQuick™ למשך 60 דקות ב-4 מעלות, עברו צנטריפוגה ב-12,000×g למשך 5 דקות, והגלולה שהתקבלה הונחה מחדש ב-250 ul של תמיסת מלח סטרילית 1X עם חציצה של פוספט, pH 7.4. דגימות בוצעו במנה לצורך כימות של ציטוקינים/כימוקינים וגורמי גדילה.

גודל וכימות שלפוחיות חוץ-תאיות

ריכוז והתפלגות גודל של EVs מבודדים נבדקו בדגימות באמצעות מכשיר NanoSight NS300 (Malvern, Worcestershire, בריטניה) במתקן המדע והטכנולוגיה של קורנל. דגימות הופשרו ודוללו ל-1:2000 ב-PBS 1X ו-1 מ"ל הוזרק דרך תא הלייזר (NanoSight Technology, לונדון, בריטניה). הקלטות עצים של 60 סרטונים דיגיטליים של כל דגימה נרכשו ונותחו על ידי תוכנת NanoSight NTA 2.3 כדי לקבוע את הגודל והריכוז של ננו-חלקיקים. ממוצע התוצאות נקבע יחד.

פרופיל חיסוני של פלזמה ושלפוחיות חוץ-תאיות

מולקולות חיסוניות בפלזמה נמדדו בעבר באמצעות 61-מבחן חיסוני מורכב המבוסס על חרוזים מגנטיים (מותאם אישית ProcartaTM immunoassay, Affymetrix) [26]. הפרופיל החיסוני של שלפוחיות חוץ-תאיות בוצע במעבדת השירות לכימיה תזונתית אנושית באוניברסיטת קורנל באמצעות ערכת חרוזים מגנטיים מבני אדם 48-(Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel, 48-plex, Bio-Rad ). לפני הניתוח, דגימות EV טופלו עם Triton 1% כדי לאפשר שחרור של ציטוקינים מכוסים [32]. כל דגימה נמדדה בשני עותקים במערכת MAGPIX® Multiplexing (Luminex Corp.). עבור כל באר, השתמשנו בעוצמת הקרינה החציונית של כל החרוזים שנמדדו עבור אנליט נתון והיצענו ממוצע של שני המשכפלים, והתוצאות התקבלו כאשר מקדם השונות (CV) היה מתחת ל-15%.

פרוטאומיקת פלזמה

פרופיל פרוטאומי פלזמה נערך באוניברסיטת קולומביה כפי שתואר קודם [14]. דגימות מ-49 מקרי ME/CFS ו-49 מקרי ביקורת שנכללו במחקר זה הופעלו בשתי קבוצות של 20 דגימות (11 מקרי ME/CFS, 9 ביקורת) ו-78 דגימות (38 מקרי ME/CFS, 40 ביקורת). 20 הדגימות במנה הראשונה נבחרו באקראי. המקרים והביקורות הותאמו בתדירות על אותם משתני התאמה כמו כלל אוכלוסיית המחקר. בסך הכל נמדדו 257 ו-279 חלבונים מוערים ב-20-ערכת דגימות הנושא וב-78-קבוצת הדגימות של הנושא, בהתאמה, עם חפיפה של 207 חלבונים מוערים בשתי קבוצות הדגימות.

ניתוח סטטיסטי

כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות R גרסה 4.0.2 (2020-06-22) באמצעות RStudio. עבור כל אנליט חלבון, ערכים בלתי ניתנים לזיהוי הוחלפו במחצית מערכם המינימלי. לאחר מכן, רמות החלבון עברו טרנספורמציה ביומן עם בסיס 2 ותוקננו לניתוח נוסף. ציוני Z וערכי P חושבו לניתוח חריגים. מבחני דרגה חתימה לא פרמטריים של Wilcoxon בוצעו כדי לבדוק את המשמעות של ההבדלים (p<0.05) between cases and controls for age, BMI, SF-36 survey scores, and EV sizes and concentrations. The robust linear regression was performed using the lm function in the MASS package for determining the significance of differences for each analyte in control and ME/CFS groups with age, BMI, Irritable Bowel Syndrome (IBS), and sex as confounding variables. Robust linear regression was performed to eliminate contamination with outliers or influential observations. Robust linear regression is a form of weighted least squares regression, and we chose M-estimation with Huber weighting [33, 34] for further analysis.

ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) שימש כדי לפשט את הנתונים ולהגדיל את יכולת הפרשנות על ידי הפחתת הממדיות של מערכי הנתונים של רמות החלבון. PCA בוצע באמצעות חבילת הנתונים הסטטיסטיים במקדמי מתאם הדירוג של R. Spearman נאמדו גם בתוך אנליטי חלבון ובין חלבונים והמטא נתונים (גיל, BMI, מין, ציוני SF-36, IBS). נעשה שימוש בקורלציות נקודתיות-ביסריאליות כאשר אחד המשתנים היה בינארי (למשל, נקבה לעומת זכר, עם לעומת ללא IBS). משתנים קטגוריים קוידו באופן הבא: Cohort: control=0; ME/ CFS=1; מין: נקבה=0; זכר=1; IBS: אין IBS=0; עם IBS=1. לאורך כל ערכי ה-p הותאמו להשערות מרובות באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg (FDR) [35, 36].

נעשה שימוש בגישת למידת מכונה כדי לזהות משתנים המבדילים בין שתי קבוצות הדגימות (בחירת תכונות). סיווג דגימות כ-ME/CFS או בקרות בריאות בוצע באמצעות שלושה אלגוריתמים למידה מפוקחים: יער אקראי [37] המיושם באמצעות פונקציית ה-Random Forest של R; XGBoost [38] באמצעות חבילת xgboost של R והעונש של Least Absolute Shrinkage and Selection Operator (LASSO) [39] שהוחל על רגרסיה לוגיסטית באמצעות פונקציית R glmnet. כמאפיינים, האלגוריתמים השתמשו בכל 353 האנליטים של חלבון, ציטוקינים EV, ציטוקינים בפלזמה ופרוטאומיקה פלזמה. חשיבות התכונה עבור כל מסווג חושבה. עבור LASSO, המקדמים של תכונות "לא חשובות" מתכווצים לאפס, ומכאן שניתן להעריך את חשיבות התכונה לפי "אחוז" (מתוך 250 איטרציות דגימה חוזרת אקראית של אימות צולב) שבהן אומדן הפרמטר של המנבא במודל המתאים ביותר אינו אפס. עבור יער אקראי, ה-"Mean Decrease Accuracy (MDA)" של תכונה היא הירידה בדיוק הסיווג עקב שינוי אקראי של הערכים באותה תכונה. עבור מנבאים לא חשובים, לתמורה אמורה להיות השפעה מועטה עד לא על דיוק המודל, בעוד שערכי התמורה של מנבאים חשובים אמורים להקטין אותה באופן משמעותי. לכן, ככל שחשיבותה של תכונה גדולה יותר, כך גדלה הירידה ברמת הדיוק כאשר ערכיה משתנים. לבסוף, עבור XGBoost, המדד "רווח" מציין את הרווח הממוצע בכל העצים שבהם נעשה שימוש בתכונה, המתאר את התרומה היחסית של כל תכונה.

חשיבות התכונה חושבה על ידי הממוצע של למעלה מ-250 שכפולים של אימות צולב פי חמישה. אנליטי חלבון שדורגו ב-20 המובילים במדידות חשיבות בכל שלושת המסווגים (טבלה 5) הותאמו שוב כמנבאים באותם מסווגים. עקומות מאפיין תפעול של מקלט (ROC) ושטח מתחת לעקומה (AUC) המשמשים לאופטימיזציה של בחירת תכונה חושבו באמצעות אריזת החבילה R. הנתונים שונו ביומן והותאמו אוטומטית לפני שנוצרו עקומות ROC. עונש לאסו משמש כאשר נבחרים מנבאים ומשתנים רבים שחשובים לחיזוי. מכיוון שהשתמשנו במשתנים שכבר נקבעו כחשובים, נעשה שימוש ברגרסיה לוגיסטית לא מסודרת במקום עונש הלאסו באיור. ביצועי חיזוי. חשיבות התכונה חושבה עבור כל אחד משלושת האלגוריתמים של למידת מכונה.

תוצאות

חקרו את מאפייני האוכלוסייה

בתוך אוכלוסיית המחקר, היו 41 נקבות ו-8 זכרים ו-40 נקבות ו-9 זכרים בקבוצת ה-ME/CFS והביקורת הבריאה בהתאמה (טבלה 1). כל החולים שנבחרו עמדו בהגדרה של פוקודה משנת 1994 ל-ME/CFS. הגיל הממוצע ואינדקס מסת הגוף (BMI) היו דומים בין ME/CFS ונבדקי ביקורת וגם בהשוואה בין המינים בין הקבוצות (טבלה 1). שבעים ותשעה אחוזים מחולי ME/CFS הצליחו לזהות מחלה חריפה, לעתים קרובות כמו מחלה שקדמה מיד להופעת המחלה, בעוד ש-20% לא היו מודעים לאירוע מתחיל וראו את הופעתו הדרגתי (טבלה 1), ו-45 מתוך 49 חולים סבלו מהמחלה במשך יותר מ-3 שנים. ציוני ה-MFI-20 מתארים את המגמה ההפוכה של מצבם של נבדקי ME/CFS בהשוואה לביקורות, כאשר ציון גבוה יותר משקף את הרמה התפקודית הנמוכה יותר של החולים בהשוואה לציון הקטן יותר של בקרות בתפקוד מלא (טבלה 1, p < 0.001 ). יתר על כן, גם ציוני הרכיבים הפיזיים וגם הנפשיים (PCS ו-MCS בהתאמה) שנגזרו מהסקר הקצר של SF-36 היו, כצפוי, גבוהים יותר בקבוצת הביקורת (p <0.001, טבלה 1).

ניתוח הרכיבים העיקרי המוצג באיור 1 בוצע על נתונים שהתקבלו משאלוני SF-36 ו-MFI-20. שני המרכיבים העיקריים הראשונים הסבירו 86.9% (PC-1 75.1%; PC-2 11.8%, איור 1a) ו-92.6% (PC-1 86. 89%; PC-2 5.73%, איור 1ב) מהשונות הכוללת בתוך מערך הנתונים עבור SF-36 ו-MFI-20 בהתאמה, ושני אשכולות משמעותיים נצפו, המפרידים בין קבוצת ME/CFS מקבוצת הביקורת. לא העונה ולא האתר שבו נאסף הדם הצליחו להבחין בקבוצות (קובץ נוסף 1: איור S1).

גודל וריכוז שלפוחיות חוץ-תאיות שונות בין ME/CFS ובקרות בריאות

שלפוחיות חוץ-תאיות טוהרו מדגימות פלזמה מחולי ME/CFS ואנשים בריאים על ידי משקעים וגודלם וריכוזיהם נותחו על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) כדי לחקור אם יש הבדלים בין הקבוצות הקליניות. כל הננו-חלקיקים שטוהרו היו קטנים מ-500 ננומטר, רובם בטווח גודל האקסוזום הטיפוסי של 30-130 ננומטר [40]. NTA גילה שממוצע הגודל של חלקיקי EV שונה בין אנשים בריאים (136.2±18.3 ננומטר, טווח 97-188 ננומטר) וחולי ME/CFS (145.3±16.6 ננומטר, טווח 113-177 ננומטר) (p=0.01 , איור 2א). הריכוז הכולל הממוצע של חלקיקים/מ"ל של פלזמה (בקרות: 8.0±3.8×108; ME/CFS: 10.5±3.9×108, p<0.001, Fig. 2b), the mean concentration of EVs that ranged from 30 to 130 nm in size (controls:4.3±1.8× 108,  ME/CFS:5.3±2.4× 108, p=0.05, Fig. 2c) and the mean concentration of particles greater than 130 nm (controls: 3.7±2.9× 108; ME/CFS: 5.6±2.7× 108, p<0.001, Fig. 2d) also exhibited a statistically significant difference between groups.

ניתוח חריג מביא להסרה של נתונים של נבדקים מסוימים משיקול נוסף

בדקנו את מספר האנליטים החריגים על פני מערכי נתונים. כל אנליט עם יותר ממחצית הערכים שאינם ניתנים לזיהוי הושלך, ולכן 6 מתוך 61 הציטוקינים בפלזמה הוסרו. ציון z חושב לכל נבדק ולכל אנליט. כל זוג נבדק/אנליט עם ערך q דו צדדי (ערך p מותאם ל-FDR) הנמוך מ-0.05 נחשב חריג. ערכי ה-q שהתקבלו הצביעו על כך ששני חולי ME/CFS הציגו פרופילים חריגים שלא נחשדו תחילה על פי המאפיינים הקליניים שלהם, ולכן יש להסירם ממערך הציטוקינים של EV מכיוון שהם ייצגו 43% ו-50% מהחריגים בהתאמה (21 ו-24 חריגים מתוך 48 ציטוקינים). עבור מערך הנתונים של ציטוקינים בפלזמה, לאף נבדק לא היה שיעור גבוה במיוחד של חריגים, ולגבי פרוטאומיקת פלזמה, חולה ME/CFS אחד הציג 35% חריגים (73 חריגים מתוך 208 חלבוני פלזמה) ולכן לא נעשה בו שימוש בניתוח נוסף.

רמות ציטוקינים מסוג EV וציטוקינים בפלזמה שונות בין ME/CFS וקבוצות ביקורת

חקרנו הבדלים ברמות האנליטים בין חולי ME/CFS ובקרה באמצעות בדיקות Wilcoxon בדרגה לא פרמטרית. בין הציטוקינים EV, רמות של Interleukin 2 (IL2) היו שונות באופן משמעותי בין הביקורת והחולים (ש=0.007) ו-16 הציטוקינים ה-EV הבאים הראו {{32} }.1 < q < 0.2: IL12P40, TNF, IL1, CXCL8, CXCL1, IL15, CCL7, IL17, IL4, GM-CSF/CSF2, IL3, CCL5, NGF, IL1, IL7, IL1R1. איור 3 מציג עלילות קופסאות של רמות החלבון שעבר טרנספורמציה של 17 הציטוקינים הללו. עבור ציטוקינים פלזמה [41] ופלסמה פרוטאומיקה [14], שום אנליט לא היה שונה באופן משמעותי בין מקרים ובקרות לאחר תיקון להשוואות מרובות (FDR < 0.2). ערכי p מפורטים, ערכי q והיחסים בין רמת אנליט חלבון ממוצעת עבור קבוצת ME/CFS לעומת בקרות ניתן למצוא בקובץ הנוסף 2: טבלאות.

בנוסף, השווינו סוגי מדגם בתוך נושאים עם ניתוח רכיבים ראשיים. בסך הכל נעשה שימוש ב-36 אנליטים נפוצים מה-48-plex EV ו-55-plex plasma immunoassays לניתוח זה. אחוז השונות שהוסבר על ידי כל מימד היה 46.2% עבור הציר הראשון ו-15% עבור הציר השני, ונצפו שני אשכולות משמעותיים (איור 4).

מתאמים רבים קיימים בתוך ובין מערכי נתונים של חלבונים

ניתוחי מתאם של Spearman בוצעו בין מערכי נתונים והם משורטטים כקורלוגרפים המציגים רק מתאמים מובהקים עם מקדם r גדול או שווה ל-0.6 (איור 5). סך של 316 מתאמים חיוביים משמעותיים נמצאו בנבדקי ME/CFS ו-300 בביקורות בין רמות ציטוקינים בדגימות EV (ש<0.01) and 88 and 73 had strong Spearman correlation coefcients (r ≥0.6) in the ME/CFS and control groups, respectively (Fig. 5a). Tirty-four of them were common to both groups (pink squares, Fig.  5a). When correlating plasma cytokines to each other, the ME/CFS cohort had 710 signifcant correlations including 327 at r ≥0.6 (q<0.01), and the control group had 394 with 146 at r ≥0.6 (q<0.01); 136 were common to both groups (Fig. 5b). In both EV and plasma cytokine correlation analysis, no signifcant negative correlations were found, and there was a higher number of positive correlations in the ME/CFS cohort as compared to the healthy individuals (Fig. 5a, b).

כמו כן, חקרנו מתאמים בין רמות הציטוקינים של 55 פלזמה ו-48 EV (קובץ נוסף 1: איור S2). לא נמצאו מתאמים שליליים ומעט חיוביים מובהקים בשתי הקבוצות (15 ו-13 עבור ME/CFS וביקורות בהתאמה ב-r גדול או שווה ל-0.5, כאשר 4 משותפים לשתי הקבוצות). בין המתאמים המשמעותיים הללו, רמות ה-LIF ב-EVs נמצאו בקורלציה עם 8 ציטוקינים בפלזמה ב-ME/CFS (CCL3, IL15, LIF, IL17, IL21, IFN, TGF ו-TGF) ו-5 בקבוצת הביקורת (CCL3, IL1, IL17, IL21, ו-IFN ) (איור משלים. 2).

עבור פרוטאומי פלזמה, נמצאו 160 ו-130 מתאמים חיוביים מובהקים בקבוצת ME/CFS וביקורת, בהתאמה, עם מקדם ספירמן r גדול מ-0.8 (q < 0.01) (איור 5c) ו-42 היו משותפים לשתי הקבוצות (ריבועים ורודים, איור 5c). שישה זוגות של חלבונים היו בקורלציה מובהקת ושלילי בקבוצת ME/CFS בלבד (ריבועים כתומים, איור 5c), כאשר 3 כוללים SERPINA7, ואחד ייחודי לקבוצת הביקורת (SERPINA1/KNG1, r=- 0.82 , q < 0.01, ריבוע כחול בהיר, איור 5c).

כאשר מנתחים קשרים בין מערך הנתונים של פלזמה פרוטאומיקה עם מערכי הנתונים של ציטוקינים EV או עם מערכי הנתונים של ציטוקינים בפלזמה, נמצא רק מתאם משמעותי אחד בין חלבון EV לחלבון שנבדק על ידי ספקטרומטריית מסה בקבוצת הביקורת (CXCL12-ev/PROZ , r=0.69, ש=0.014).

【צור קשר】 דוא"ל: george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:008613632399501/Wechat:13632399501