תכולת תרכובות פנוליות וגיוון גנטי ברמת אוכלוסיה על פני טווח התפוצה הטבעי של דובי (Arctostaphylos Uva-ursi, Ericaceae) בחצי האי האיברי

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

תַקצִיר:דובי (Arctostaphylos uva-ursi) הוא צמח מרפא המשמש באופן מסורתי לטיפול בדלקות בדרכי השתן עקב התוכן הגבוה שלארבוטין(hydroquinone -D-glucoside), המשמש כיום בעיקר כחומר טבעי להלבנת עור בקוסמטיקה. Bearberry הוצע גם כחומר טבעינוגד חמצוןתוסף עקב התוכן הגבוה של תרכובות פנוליות בעלים. חקרנו את השונות של תרכובות פנוליות ב-42 אוכלוסיות בר של דובי, במטרה להבהיר אם גורמים ביולוגיים, אקלימיים ו/או גיאוגרפיים מהותיים משפיעים על התוכן הפנולי על פני התפוצה הטבעית שלו בחצי האי האיברי. עלי הדוב נאספו במהלך הסתיו במשך תקופה של שלוש שנים (2014–2016) באוכלוסיות על פני שיפוע רוחב וגובה. תמציות מתנוליות הראו מגוון רחב של שונות בתכולת הפנולים הכוללת, ופרופילים פנולים שונים לגביארבוטין(רמות של מרכיב עיקרי זה השתנו בין 87 ל-232 מ"ג/גרם דר wt), אך גם תכולת קטכין ומיריסטין, שהושפעו מגורמים גיאוגרפיים ואקלימיים. רמות מתונות של שינויים בגודל הגנום - שהוערכו על ידי ציטומטריית זרימה - ובשני אזורי DNA פלסטידי זוהו גם בקרב אוכלוסיות. בידול גנטי וציטוגנטי של אוכלוסיות היה חלש אך קשור באופן מובהק למגוון פיטוכימי. גנוטיפים של דובי עילית עם גבוה יותרנוגד חמצוןקיבולת זוהתה לאחר מכן.

מילות מפתח: ארבוטין; שונות גנטית ופיטוכימית; גודל הגנום; הפלוטיפים; טבעינוגדי חמצון

cistanche הם נוגדי חמצון טבעיים

1. הקדמה

הסינתזה של מטבוליטים מיוחדים בצמחים משתנה בזמן (כלומר, אונטוגניה, פנולוגיה והגנות מושרות), ובמרחב, מכיוון שהיא ממלאת תפקיד מכריע בהסתגלות הצמח לתנאי הסביבה, בעוד שגם שונות גנטית אחראית למגוון כימי [1]. בין התרכובות הללו, לפנול יש מגוון מגוון של מבנים מונו ופולימריים הממלאים מגוון רחב של תפקידים פיזיולוגיים [2]. הביוסינתזה של מטבוליטים מיוחדים מושפעת במידה רבה מגורמים סביבתיים כגון טמפרטורה, משקעים או קרינת שמש, אשר בתורם נתונים לרוב לשיפועים רוחביים, אורכיים או גובהיים. במיוחד, הצטברות תרכובות פנוליות היא תגובה כללית לרמות מוגברות של קרינת UV-B (280-315 ננומטר). וריאציה ספציפית של תרכובות דווחה בצמחים הגדלים באזור הים התיכון במהלך הקיץ ובגובה רב, שם מתרחשת שכיחות גבוהה יותר של UV-B וחומצות קינמיות ופלבונואידים הראו את שיעורי ספיגת UV הגבוהים ביותר [3].

ארבוטין(hydroquinone -D-glucoside) היא תרכובת פנול פשוטה עם מופע מוגבל בעלים של מינים מסוימים השייכים לסוגים כגון Arbutus, Arctostaphylos, Pyrus או Vaccinium. המקור הטבעי העיקרי של ארבוטין, הדוב (Arctostaphylos uva-ursi) L.) Spreng.) שימש במשך מאות שנים לטיפול בדלקות בדרכי השתן ומחלות כליות אחרות [4], וניסוחים צמחיים עדיין מוכנים בימינו [5]. במהלך השנים האחרונות, קשת היישומים שלארבוטיןהתרחב, בעיקר כחומר טבעי להלבנת עור בתעשיית הקוסמטיקה [6] ובטיפולים קליניים בשלנוגד חמצון, תכונות אנטיביוטיות, אנטי דלקתיות ואנטי גידוליות [7]. כתוצאה מכך, יש עניין גובר במציאת מקורות טבעיים נוספים שלארבוטין, כמו גם תהליכים ביוטכנולוגיים שיכולים להחליף סינתזה כימית [8,9]. בהקשר זה, ייצור חוץ-גופני של ארבוטין באמצעות תרביות תאים אינוקסיה Datura הגיע לסולם הפיילוט [10].

בנוסף לארבוטיןתרכובות פנוליות אחרות תורמות למאפיינים הפעילים של A. uva-ursi, כגון פלבנואידים וטאנינים [11,12], שמהם קטצ'ין וקוריליאגין הם העלים הרלוונטיים ביותר, בהתאמה [13]. בתעשיית המזון תרכובות טבעיות כמו פנולים צמחיים מחליפות סינתטיותנוגד חמצוןחומרים משמרים [14]. A. uva-ursi שימש כתוסף, במיוחד במוצרי בשר [15-19] אך גם באריזות פעילות [20]. לבסוף, הפוטנציאל של A. uva-ursi כמקור לסוכני שיזוף לתעשיית העור הוצע לאחרונה [21].

המונוגרפיה "עלה דובי" של סוכנות התרופות האירופית [5] הציעה מינימום של 7 אחוזיםארבוטיןתוכן בעלים יבשים כדרישה לתכשירים צמחיים. מחקרים שבוצעו במהלך העשורים האחרונים תיארו את תכולת הארבוטין בעלים של דובים בטווח של 0 אחוזים עד 18 אחוזים, הוסברו על ידי הליכים אנליטיים, שונות טבעית, תנאי גדילה ותאריך הקטיף [4]. תוכן ארבוטין נקבע בדרך כלל על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים [4,12,22-24], ומחקרים קודמים זוהו גבוה יותרארבוטיןתכולה בצמחי דובי שנאספו בסתיו מאשר באלו שנאספו באביב [4]. תוארו כימוטיפים מגוונים של דובי דוב, הקשורים להפצה הגיאוגרפית ולהתמיינות תוך-ספציפית בתת-מינים של A. uva-ursi. השינוי הפיטוכימי הבולט ביותר שדווח הוא היעדר ארבוטין ב-A. uva-ursi subsp. stipitata Packer ודנפורד, אך גם הבדלים בתכולת מתיל-ארבוטין, חומצה אלגית או מיריסטין הופנו. קוורצטין קיים גם בעלים של דובי, שבהם שני האגליקונים, כמו גם 3-O-glycosides שלהם הם הפלבנואידים הנפוצים יותר [4]. עם זאת, רוב המחקרים הללו בוצעו לפני מספר עשורים, וכיום וריאציה תוך-ספציפית בדובי נחשבת כרציפה. 14 תת-המינים המתוארים, כולל אחד מספרד (A. uva-ursi subsp. crassifolius (Braun-Blanq.) Rivas Mart. ex Torre,Alcaraz ו-MB Crespo), הם כרגע שמות לא מקובלים ושם נרדף ל-A. uva-ursi [ 25]. לכן יש צורך במחקרים חדשים כדי לשפר את הידע שלנו על התרכובות המצויות בפועל בחומר הגלם שנקטף ממקומות שונים למטרות תעשייתיות, שכן הפרופיל הכימי של עלי A. uva-ursi תואר וכולל מערך מגוון של פנולים, טאנינים, ו-flavonoidsin מחקרים עדכניים יותר שבוצעו כדי לחקור הבדלים ברמה הבין-ספציפית [23,26,27].

מגוון גנטי (כולל ציטוגנטי) ברמת האוכלוסייה מקדם הסתגלות לתנאים סביבתיים שונים [28]. ההשפעות של פוליפלואידיזציה על ייצור מטבוליטים מיוחדים בצמחי מרפא וארומטיים נסקרו לאחרונה [29]. בהקשר זה, גודל הגנום הוא פרמטר בשימוש רב בהערכות שונות של צמחים, שכן השונות התוך-ספציפית מזוהה לעתים קרובות ([30], והתייחסויות בה), מתואמות עם תכונות ביולוגיות רבות אחרות, וממלאת תפקיד רלוונטי בתהליכים אבולוציוניים [31–35 ]. עם זאת, מחקרים העוסקים בקשר בין כמות ה-DNA הגרעיני (כלומר גודל הגנום) לבין המגוון הפיטוכימי הם נדירים מאוד [36,37]. הקשר בין מגוון פיטוכימי וגנטי הוערך באמצעות סמני DNA גרעיניים אך במיוחד פלסטידיים [38], במיוחד במיני צמחים רפואיים [39] ומתרבות [40].

ה-Bearberry מופץ באופן נרחב בכל השטח המקיף, אך רוב אוכלוסיות הבר הנאספות באירופה ממוקמות במדינות המזרח, אוסטריה, שוויץ, איטליה וספרד. Arctostaphylos uva-ursi גדל בחלק המזרחי האמצעי של ספרד, בהרים, ב גבהים הנעים בין 550 ל-2350 מ' מעל פני הים (מעל פני הים). זה נפוץ יותר בצפון מכיוון שאוכלוסיות הממוקמות בקווי רוחב נמוכים יותר הן שכיחות פחות ובדרך כלל יש פחות פרטים. המחקרים הקיימים לגבי השונות בתכולת ארבוטין בספרד התייחסו לערכים שנעו בין 8 אחוזים באוכלוסיות צפון-מזרחיות [41] ו-19 אחוזים בחומר צמחי ספרדי שהוערך במחקר שנערך בגרמניה [42]. המחקר שלנו נועד להבהיר גורמים, כולל גודל הגנום והמגוון הגנטי, המסבירים שונות פיטוכימית על פני התפוצה הטבעית של דובי ספרד. התוצאות שלנו יכולות לתרום לבחירת חומר צמחי לתעשיית התרופות, הקוסמטיקה והמזון.

מזון להלבנת עור: CISATNCHE

2. תוצאות ודיון

2.1. ניתוח גיוון כימי

עלי דובי שנדגמו בסך הכל מ-249 צמחים שגדלו ב-42 מקומות בספרד, ולאורך תקופה של שלוש שנים, 2014–2016 (איור 1, טבלה S1), הראו אחוזי משקל יבש (dr wt) שונים, החל מ 46.7 (LO) עד 55.1 אחוז (CP), עם ממוצע של 50.1 ± 2.7 אחוז (נתונים לא מוצגים). תמציות מתנוליות שהוכנו מדגימות שנאספו בשנים 2014 ו-2015 שימשו לקביעות כולל של פנולים וריכוז. ראינו מגוון רחב של וריאציות מתמשכות עבור שני הפרמטרים עם הבדלים משמעותיים (p < 0.001)="" בין="" צמחים.="" תמציות="" עלים="" של="" 80="" צמחים="" שנדגמו="" בסתיו="" 2014="" (איור="" 2א)="" הראו="" תכולה="" פנולית="" כוללת="" שנעה="" בין="" 103.3="" ±="" 4.8="" מ"ג="" gae/g="" dr="" wt="" (דגימה="" li-4)="" ל-206.4="" ±="" 6.5="" מ"ג="" gae/g="" dr="" wt="" (sr="" -2),="">ארבוטיןהתוכן השתנה מ-92.0 ± 3.0 mg/g dr wt (AN-6) ל-194.2 ± 5.6 mg/g dr wt (SE-8). ניתוח של תמציות שהוכנו מעלים שנאספו ב-2015 מ-94 צמחים (איור 2ב) הראה גם שונות פיטוכימית רחבה, מ-110.5 ± 3.6 מ"ג GAE/g dr wt(PI-4) ל-200.9 ± 9.8 mg GAE/g dr wt (LO-4) בסך התוכן הפנולי, בעוד שתכולת ארבוטין נעה בין 87.1 ± 0.4 mg/g dr wt (ET-2) לבין 211.5 ± 5.9 mg/g dr wt (LI) -2). יתר על כן, ללא קשר לשנת האיסוף, הבדלים משמעותיים בסך הפנולים וארבוטיןהתכולה זוהתה בין צמחי דובי הגדלים באותו מיקום עבור רוב האוכלוסיות (לא מוצגים נתונים). רמות ארבוטין היו בקורלציה מובהקת עם תכולת הפנולים הכוללת בתמציות עלי דובי, שכן הערכנו מקדמי פירסון משמעותיים של {{0}} .332 (עמ'=0.003) עבור 2014, ו-0.289 עבור נתוני 2015 (עמ'=0.005). תכולת הארבוטין של 48 הצמחים שנדגמו בשתי השנים לא השתנתה באופן משמעותי (p=0.380).

למרות השונות שנמצאה בתוך אוכלוסיות, וללא קשר לשנת הקציר, ניתוח השונות הראה שתכולת הארבוטין של תמציות עלי דובי תלויה גם היא (p < {0}}.00="" 1)="" מיקום="" האוכלוסייה="" (איור="" 3a,b),="" כפי="" שהתרחש="" עבור="" תוכן="" הפנולים="" הכולל="" של="" עלי="" דובי="" מנותח="" ב-2015="" (p="">< 0.001,="" איור="" 3b).="" לעומת="" זאת,="" לא="" נצפו="" הבדלים="" משמעותיים="" בתכולת="" הפנולים="" הכוללת="" (p="0.080)" בקרב="" 10="" האוכלוסיות="" שנדגמו="" ב-2014,="" שהיו="" ממוקמות="" באזור="" קטן="" יחסית,="" אך="" התפזרו="" בטווח="" רחב="" של="" גבהים,="" מ-424="" (ba="" אוכלוסיה)="" עד="" 1410="" מ'="" מעל="" החוף="" (אוכלוסיית="" הרשות="" הפלסטינית).="" וריאציה="" זו="" בגובה="" הייתה="" קשורה="" להבדלים="" בתנאי="" האקלים="" (טבלה="" s1),="" שכן="" מיקומים="" בגבהים="" גבוהים="" יותר="" אופיינו="" בטמפרטורות="" ממוצעות="" נמוכות="" יותר="" (מקדם="" המתאם="" של="" פירסון,="" r="-0.666," p="">< 0.001)="" ומשקעים="" שנתיים="" גבוהים="" יותר="" (="" r="0.485," p="">< 0.001),="" אשר="" הפנייה="" הביאה="" לרמות="" קרינה="" גלובליות="" נמוכות="" יותר="" (r="-0.390," p="">< 0.001).="" יתרה="" מזאת,="" ממערך="" נתונים="" זה="" הוכח="" מתאם="" חיובי="" נמוך="" אך="" מובהק="" בין="" כמות="" גשמים="" שנתית="" ותכולת="" הפנולים="" הכוללת="" של="" צמחי="" הדובים="" (מקדם="" spearman's="" rho="0.256," p="0.022)," ואילו="" ממערך="" הנתונים="" של="" 2015="" כאשר="" דגמנו="" אוכלוסיות="" באזור="" גדול="" יותר,="" זיהינו="" מתאם="" חיובי="" מובהק="" בין="" כמות="" גשמים="" שנתית="" לתכולת="" ארבוטין="" (rho="0.246," p="0.017)." מתאם="" משמעותי="" זה="" מצביע="" על="" כך="" שצמחי="" דובי="" הגדלים="" במקומות="" צפוניים="" ובגבהים="" גבוהים="" יחסית="" הראו="" לעתים="" קרובות="">ארבוטיןתוכן (rho=0.217, p=0.035 ו-rho=0.269, p=0.009, בהתאמה). כאמור, תכולות ארבוטין גבוהות יותר אלו היו בקורלציה מובהקת לתכולת פנולים כוללת גבוהה יותר של עלי דובי, שהיו דומות (בממוצע 154.4 ± 19.6 מ"ג GAE/g dr wt) לאלו שנמצאו בתמציות מימיות ממינים אחרים של צמחים המשמשים כ.נוגד חמצוןתוספים בתעשיית המזון [43], כגון אסרוזמרין (185.0 מ"ג GAE/g dr wt), תה (149.3 מ"ג GAE/g dr wt), או גויאבה (154.4 מ"ג GAE/g dr wt). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם הפניות קודמות ואוששו במחקר שבוצע על ידי Wrona et al. [20] באמצעות כמה מדגימות עלי הדוב הספרדי שנאספו ב-2015, עבורן גבוה יותרנוגד חמצוןקיבולת הייתה קשורה עם גבוה יותרארבוטיןתוכן. ניתן לזהות גם גנוטיפים עילית של דובי למטרה זו, כגון פרטים 1, 4, 7 ו-8 מאוכלוסיית ה-LO, אשר הצטברו בממוצע 183.3 ± 16.4 מ"ג GAE/g dr wt בשנתיים של המחקר.

על מנת להבהיר עוד יותר גורמים אקלימיים וגיאוגרפיים המשפיעים על דפוסי השונות הפנולית, ביצענו איסוף דגימות ממצה יותר בסתיו 2016: 140 צמחי דובי שגדלו ב-29 מקומות, וכימתנו חמש תרכובות פנוליות (איור S1a) שזוהו על ידי אלוציה משותפת עם תקנים בשיפוע אצטוניטריל/מים (איור S1b). ניתוח הראה טווחים רחבים של שונות מתמשכת עבור תכולת arbutin, חומצה קפאית, קטצ'ין, myricetin ו-quercetin glucoside, עם הבדלים משמעותיים בין צמחים שנצפו גם בדרך כלל בתוך אוכלוסיות (נתונים לא מוצגים). עבור המרכיבים הפנוליים העיקריים, מצאנו שתכולת הארבוטין נעה בין 91.1 ± 5.0 (LB{{10}}) ל-232.4 ± 2.8 מ"ג/גרם דר wt (PT{{15 }}), בעוד שתכולת הקטצ'ין נעה בין 4.1 ± 0.1 (AF{{20}}) ל-45.5 ± 1.4 mg/g dr wt (LB-5). לגבי שני הפלבונואידים האחרים שנקבעו, מיריצטין לא זוהה בחלק מהצמחים ממספר אוכלוסיות, בעוד שהגיע ל-21.2 ± 1.2 מ"ג/ג דר wt ב-PO{{30}}, וקוורצטין גלוקוזיד נע בין 3.8 ± 0.1 (CO -3) עד 22.8 ± 0.8 מ"ג/ג דר משקל (BT-3). תכולה נמוכה יותר של חומצה קפאית נקבעה בתמציות עלי דובי, שנעו בין 1.8 ± 0.0 (IZ-1) ל-7.1 ± 0.3 mgPlants /g dr wt (SI-4).

למרות השונות שנצפתה בין פרטים, הבדלים משמעותיים בין אוכלוסיות נאמדו גם עבור חמשת התרכובות הללו (מבחני Kruskal–Walis, p < {0}}.001,="" ו-p="0." 009="" תכולת="" חומצה="" קפאית).="" תכולת="" ארבוטין="" גבוהה="" יותר="" נקבעה,="" בממוצע,="" בצמחים="" מאוכלוסיות="" טבעיות="" ab,gu,="" ln="" ו-lo="" (איור="" 4a),="" אשר="" היו="" שונות="" באופן="" משמעותי="" (לאחר="" bonferronicorrection)="" מהתכולה="" הנמוכה="" שנמצאה="" בצמחים="" מאוכלוסיית="" lb="" (186.7="" ±="" 22.3,="" 193.9="" ±="" 12.1,169.5="" ±="" 10.0,="" ו-169.2="" ±="" 5.2="" מ"ג/גרם="" דר="" wt="" מול="" ל-111.8="" ±="" 16.0="" מ"ג/ג="" דר="" wt,="" בהתאמה).="">ארבוטיןהתוכן של צמחים שנדגמו גם ב-2015 לא השתנה משמעותית בין השנים (p=0.821). האוכלוסייה LB הראתה בתורה רמת קטצ'ין ממוצעת גבוהה יותר (איור 4ב), ששונה באופן משמעותי מהתכולה הממוצעת הנמוכה של הפלבנואיד הזה שזוהה באוכלוסיות AF ו-LC (32.8 ± 9.8 חזית ל-5.7 ± 1.9 ו-5.3 ± {{2{{62} }}}.5 mg/g dr wt, בהתאמה). תכולת הגלוקוזיד הממוצעת של מיריציטין וקוורצטין מוצגת באיור 4c, עם הבדלים משמעותיים בין אוכלוסיות AB, CG, LB ו-PO, עם תכולת מיריצטין גבוהה יותר (15.1 ± 4.0, 14.6 ± 5.7, 10 .7 ± 2.8, ו-17.2 ± 3.9 מ"ג/ג' דר wt, בהתאמה), בהשוואה לרמות הנמוכות שהצטברו בצמחים ממוצעים מאוכלוסיות CO ו-OD (1.2 ± 1.5 ו-2.4 ± 3.6 מ"ג/ג דר wt, בהתאמה) , וכן פירושו תכולת קוורצטין גלוקוזיד שנקבעה באוכלוסיות AA, BT, CP, IZ ו-LB (15.2 ± 3.7, 15.9 ± 4.6, 11.8 ± 2.3, 15.7 ± 3.4, ו-13.1 ± 4.6 מ"ג/ג'י שונה מובהקת, 4.6 מ"ג/גרם מזה באוכלוסיית CO (4.0 ± 0.1 מ"ג/ג' דר משקל). לעומת זאת, תכולת חומצת קפאית הממוצעת נדדה מ-2.1 ± 0.2 מ"ג/גרם דר wt באוכלוסיות AB, CE, PT ו-SA, ל-3.5 ± 1.2 מ"ג/ג דר wt באוכלוסיית AF או 3.4 ± 2.2 מ"ג/ג דר wt ב אוכלוסיית SI; לפיכך, הבדלים משמעותיים לא נצפו עקב שונות תוך-אוכלוסיה (תכולה ממוצעת 2.7 ± 0.8 מ"ג/גרם דר wt). תוצאות אלו משלימות את השונות במטבוליטים פנוליים שנצפו על ידי Wrona et al. [20], עבור שמונה מהמיקומים של bearberry שנדגמו בשנת 2015 אשר נותחו באמצעות טכנולוגיית UPLC®-ESI-Q-TOF withMSE.

בניגוד לתוצאות שהתקבלו בניתוח שבוצע עם דגימות דובי מ-2014 ו-2015,ארבוטיןהתוכן שנקבע ב-2{{10}}16 דגימות הראה מתאם חיובי נמוך אך משמעותי עם קרינה (rho=0.256, p=0.002), וטמפרטורות ממוצעות מקסימליות (rho{ {5}}.183, p=0.030), ולכן היו בקורלציה הפוכה לערכי גשם שנתיים (rho=−0.265, p=0.002). הבדלים אלה היו קשורים גם לשונות בגובה (rho=-0.192, p=0.023), אך המתאם השלילי הזה הוסבר על ידי הנמוך שהוזכרארבוטיןתכולת צמחים מאוכלוסיית LB שנמצאים ב-1720מ'. דפוס וריאציה דומה נצפה עבור תכולת מיריציטין מאחר ורמות גבוהות יותר של תרכובת זו היו קשורות באופן מובהק לצמחי דובי הגדלים במקומות תחת רמות קרינה גבוהות יותר (rho=0.226, p=0.{{1{{ 12}}}}07). הדפוס ההפוך לזה של ארבוטין נצפה עבור קטצ'ין, שכן נאמד מתאם חיובי בין הפלבנואיד הזה לכמות גשמים שנתית (rho=0.398,p < 0.0{{23="" }}1),="" ובהתאמה="" זוהו="" מתאמים="" שליליים="" עם="" קרינה="" ועם="" טמפרטורה="" ממוצעת="" מקסימלית="" (rho="−0.307," p="">< 0.001="" ו-rho="−0.470," p="">< 0.001,="" בהתאמה).="" וריאציה="" זו="" בגורמים="" אקלימיים="" הסבירה="" כי="" הן="" הגובה="" והן="" קו="" הרוחב="" השפיעו="" על="" תכולת="" הקטצ'ינים="" של="" עלי="" הדובים="" (rho="0.410" ו-0.490,="" בהתאמה,="" p="">< 0.001).="" ניתוח="" מרכיבים="" עיקריים="" שבוצע="" עם="" נתונים="" פיטוכימיים,="" אקלימיים="" וגיאוגרפיים="" התואמים="" ל-29="" המיקומים="" שנדגמו="" ב-2016,="" שבהם="" שני="" המרכיבים="" הראשונים="" הסבירו="" 60="" אחוז="" מהשונות="" הנצפית,="" אימת="" את="" התוצאות="" הללו="" (איור="" 5).="" לא="" זיהינו="" שום="" מתאם="" מובהק="" בין="" תכולת="" הגלוקוזיד="" של="" חומצה="" קפאית="" או="" קוורצטין="" בצמחי="" דוב="" לבין="" גורמים="" אקלימיים="" או="" גיאוגרפיים,="" אם="" כי="" הערכנו="" מתאמים="" קלים="" אך="" מובהקים="" בין="" תכולת="" הגלוקוזיד="" של="" מיריצטין="" וקוורצטין="" (rho="0.184," p="" {{31}="" }.030)ובין="" תכולת="" מיריציטין="" וחומצה="" קפאית="" (rho="−0.176," p="0.037)" של="" צמחי="">

דפוסי האקלים המנוגדים שנצפו של שונות בארבוטיןתכולת צמחי הדוב מציעה שלמרות שהביוסינתזה של מטבוליט זה ככל הנראה מוגברת בתנאים של קרינה וטמפרטורה גבוהים יותר, כנראה שמחסור במים הוא גורם מגביל עבור A. uva-ursi באזורי הים התיכון והדרום. Del Valle et al. [44] דיווח על דפוס רוחב של הצטברות פלבנואידים של Silene littorea (Caryophyllaceae) בספרד, שם נקבעו תכולות פלבנואידים גבוהות יותר באוכלוסיות דרומיות, שכן קו הרוחב נמצא בקורלציה שלילית עם קרינת UV-B וטמפרטורה, ובאופן חיובי עם משקעים. קרינה גלובלית מראה שיפוע רוחב ברור עם שכיחות גבוהה יותר בדרום ובמזרח חצי האי האיברי, ויש גם אפקט מובהק מאחר שההתמדה בענן מווסתת את שכיחות קרינה זו בגבהים גבוהים יותר. מפת קרינת UV של ספרד [45] מתאם גבוה שהופנה (r > 0.9) בין UV-B ונתוני קרינה גלובליים. לפי התייחסות זו, אוכלוסיות דובים שהראו ממוצע גבוה יותרארבוטיןהתכנים במחקר שלנו ממוקמים בעיקר באזורים מתחת לרמות קרינת UV-B של 2403-2451 J/m2.

התוצאות שלנו עבור וריאציה של קטצ'ין בדובי הראו דפוס גיאוגרפי (איור 5) והן מתאימות למחקרים שבוצעו במיני צמחים אחרים ממדינות צפון אירופה. תכולה גבוהה יותר של מטבוליטים מיוחדים, כגון פלבנואידים ואנתוציאנינים, דווחה בצמחים שגדלו בקווי רוחב גבוהים יותר, כנראה בגלל תקופות אור ארוכות יותר וטמפרטורות לילה נמוכות יותר [46]. לפיכך, תכולת פנולים מסיסים במחטי Juniperus communis גדלה עם קו הרוחב והגובה באוכלוסיית פינלנד [47], וגם תכולה פנולית גבוהה יותר ב-10-19 אחוזים נמצאה בקו רוחב גבוה יותר בפירות משלושת Ribes spp. זנים נותחו בשני מקומות בפינלנד [48]. מחברים אלה דיווחו על תכולת פנולים נמוכה יותר עם רמות גבוהות יותר של קרינה וטמפרטורה. תכולת פלבנואידים בפירות של שני מינים של Vaccinium (גם ממשפחת Ericaceae) הראתה שיפוע גיאוגרפי, עם כמויות גבוהות יותר של פלבנואידים בקווי הרוחב הצפוניים [49,50].

ביחס לשונות בגובה, רמות גבוהות יותר של פלבנואידים נקבעו באוכלוסיות של מיני Ericaceae אחרים, Calluna vulgaris, שגדלו בגבהים גבוהים יותר [51]. שיפועים גובהים השפיעו גם על חילוף החומרים המיוחד של אוכלוסיות ספרדיות של ארניקה מונטנה [52] ו-Quercus robur[53]. העבודה האחרונה התייחסה לקשר חיובי משמעותי בין ריכוז הפנולים הכולל של העלים והעלייה, בהיותו השיפוע תלוי רק בפלבנואידים, ובכך הצביעו על כך שאלו תרכובות הניעו את הקשר עבור סך הפנולים. תוצאות אלו מתאימות להערכות שלנו עבור דפוס התוכן של הקטצ'ין. לבסוף, שיפוע גשם היה קשור להבדלים משמעותיים בהרכב הפוליפנולים בשיח רפואי אפריקאי (Myrothamnus flabellifolia) שעבורו הבדלים מטבולומיים עולים בקנה אחד עם המבנה הגנטי של אוכלוסיות [54].

CISTANCHE CAN אנטי אייג'ינג

2.2. ניתוח נתונים של גודל גנום ורצף

ערכי גודל הגנום 2C של צמחי הדובים נעו בין 2.50 ל-3.15 פג' (טבלה 1). נמצאו הבדלים קלים בכמות ה-DNA הגרעיני בקרב אוכלוסיות (Kruskal–Wallis χ2=87.639, df=36,p=3.39 × 10−6). הבדיקה של דאן עם תיקון Bonferroni גילתה הבדלים מובהקים סטטיסטית בין: אוכלוסיות AL ו-SI (Z=−3.972, p=0.024), LE ו-SI (Z=−4.196, p {{ 21}}.009), ו-SE ו-SI (Z=−4.236, p=0.008). אוכלוסיית פונטיל (PO) היא היישוב הסוג של A. uva-ursi var.crassifolius, ששולב לאחר מכן כ-A. uva-ursi subsp. ל-crassifolius, וכיום אינו נחשב טקסונומית (ראה מבוא), יש ערך ביניים (2.88 עמודים), בטווח הערכים המתקבלים באוכלוסיות אחרות של המין. זהו המחקר האוכלוסייה המקיף הראשון של כמות ה-DNA הגרעיני במין ובכל הסוג, מאחר שהמידע הזמין היחיד עד כה מגיע מאוכלוסיה בלקנית אחת מאותו טקסון [55]. ערך ה-2C שדווח שם, 2.49 עמודים, ממוקם בדיוק בגבול התחתון של טווח השונות של מערך הנתונים שנחקר כאן. לא נמצא מתאם בין ערכי גודל הגנום לגובה האוכלוסייה. כמות ה-DNA של אנשים הראתה מתאם משמעותי חיובי חלש עםארבוטיןתוכן כאשר הושוו נתונים מ-158 צמחי דובי (rho=0.187, p=0.018), בעוד שלא נמצא מתאם משמעותי אחר בין גודל הגנום למשתנים אחרים. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם העליות המדווחות בייצור של מטבוליטים מיוחדים הנצפים בדרך כלל בצמחים רפואיים וארומטיים לאחר פוליפלואידיזציה [29].

רצפים חדשים שהופקו עבור rpl{0}}trnL ו-psbE-petN מרווחים בין-גניים היו מיושרים בשני מטריצות (המכילות 566 ו-874 bp בהתאמה) ששרשרו במטריצה ​​בודדת של 1440 bp.Moderate זוהו רמות שונות באזורי פלסטידים אלה (שישה החלפות נוקלאוטידים וארבעה אינדלים). נמצאו עשרה הפלוטיפים שונים עם מגוון הפלוטיפ הכולל (Hd) של 0.468 (טבלה 1). רוב האוכלוסיות (21) הכילו רק הפלוטיפ אחד, בעוד שחמש מהן הפגינו גיוון מסוים בין פרטים. ההפלוטיפ 1 השכיח ביותר הראה את השכיחות הגבוהה ביותר (71.4 אחוזים), ואחריו הפלוטיפ 2 (15.2 אחוזים), בעוד שהשאר הראו תדרים נמוכים בהרבה (0.04-0.01 אחוז). ההתפלגות הגיאוגרפית של הפלוטיפים מוצגת באיור 6. הפלוטיפ 1 נמצא ב-32 אוכלוסיות - הוא היה קבוע ב-18 מהן - מפוזרות על פני כל האזורים שנדגמו למעט היישובים הדרומיים ביותר. הפלוטיפ 2 נמצא בעשר אוכלוסיות והיה ההפלוטיפ הבלעדי בשתי האוכלוסיות הדרומיות ביותר (HU ו-LV) וכן ב-PR. הפלוטיפ 4 היה פרטי משלוש אוכלוסיות מהפירנאים, בעוד שהפלוטיפ 8 הופיע בשתי אוכלוסיות ממזרח חצי האי האיברי. לגבי הקשרים האבולוציוניים המוצגים ברשת הפרסימוניה (איור 6), רוב ההפלוטיפים מחוברים על ידי צעד אחד או שניים של מוטציה. הפלוטיפ 1 תופס מקום מרכזי, כאשר שבעה הפלוטיפים מחוברים אליו.

בדיקת Mantel בין מטריצות המרחק הזוגיות הגנטיות של pDNA והכימיות הראתה מתאם חלש אך משמעותי (r=0.301; p=0.048) בין הבידול הגנטי והריכוז של חמשת הרכיבים הכימיים שנמדדו עבור מערך נתונים של 2016. בדיקת Mantel לא גילתה שום מתאם מובהק בין מרחק גנטי וגיאוגרפי בקרב 25 האוכלוסיות שנדגמו ב-2016 (r=0.103, p=0.207) או בין המרחקים הכימיים והגיאוגרפיים הזוגיים בין אלה. 25 אוכלוסיות (r=0.191, p=0.050). השונות הפיטוכימית המדווחת כאן עבור אוכלוסיות בר דובי ברחבי ספרד משלימה אפוא על ידי רמות מתונות של וריאציה של הפלוטיפ של pDNA, בהיותה ההבחנה הגנטית מצפון לדרום שנמצאה באוכלוסיות דובי דוב דומה לדפוסים פילוגוגרפיים שנמצאו בצמחים אחרים (למשל, [56-58]. כל ההומוגניות הזו צפויה בצמחים בעלי יכולת רבייה נמוכה [59], כמו A. uva-ursi, המציג שיעורי נביטה ירודים ושיעורי תמותה גבוהים של שתילים צעירים. עם זאת, הבידול הגנטי הצנוע שהראה pDNA נמצא בקורלציה לביוכימית. מרחקים זוגיים נאמדים מפרופילים של חמישה פנולים איור 6. התפלגות גיאוגרפית של הפלוטיפים של pDNA על אוכלוסיות איבריות של Arctostaphylos uva-ursi. קודי האוכלוסייה תואמים לאלו בטבלה S1, ותרשימי עוגה מייצגים את אחוז הפרטים המציגים כל הפלוטייפ בכל אוכלוסייה. מלבן, רשת הפרסימוניות הסטטיסטית המציגה את הקשרים האבולוציוניים של ה-te n הפלוטיפים פלסטידיים שנמצאו באוכלוסיית A. uva-ursi מיוצגים. כל פס לאורך הקווים המחבר את ההפלוטיפים מצביע על שלב מוטציוני אחד באזורי ה-pDNA שנרשמו במחקר זה. בדיקת מעטפת בין מטריצות המרחק הגנטיות והכימיות של pDNA הראתה מתאם חלש אך משמעותי (r=0.301; p {{28 }}.048) בין התמיינות גנטית וריכוז חמשת הרכיבים הכימיים שנמדדו עבור מערך הנתונים של 2016. בדיקת Mantel לא גילתה שום מתאם מובהק בין מרחק גנטי וגיאוגרפי בקרב 25 האוכלוסיות שנדגמו בשנת 2016 (r=0.103, p=0.207) או בין המרחקים הכימיים והגיאוגרפיים הזוגיים בין 25 האוכלוסיות הללו ( r=0.191, p=0.050). השונות הפיטוכימית המדווחת כאן עבור אוכלוסיות פראי דובים ברחבי ספרד, משלימה אפוא על ידי רמות מתונות של שינוי האפלוטייפ של pDNA, בהיותה ההבחנה הגנטית מצפון לדרום שנמצאה באוכלוסיות דובי דוב דומה לדפוסים פילוגוגרפיים שנמצאו בצמחים אחרים (למשל, [56–58]). כל ההומוגניות הזו צפויים לצמחים בעלי יכולת רבייה נמוכה [59], כמו A. uva-ursi, המציג שיעורי נביטה נמוכים ושיעורי תמותה גבוהים של שתילים צעירים [4] עם זאת, הבידול הגנטי הצנוע שהראה pDNA נמצא בקורלציה למרחקים ביוכימיים בזוגיות שנאמדו מפרופילים של חמישה תרכובות פנוליות. דפוס זה של שונות גנטית ופיטוכימית (שכאמור לא היה קשור למרחקים גיאוגרפיים), כמו גם המתאם החלש אך המשמעותי בין גודל הגנום ותכולת הארבוטין, עשויים להצביע על כך ששונות גנומית טבעית משפיעה על התשואה של תרכובות פנוליות ב. A. uva-ursi. עם זאת, hypervariable מולקולרי m נחוצים בדגימת אוכלוסיה נרחבת יותר כדי לאשש את הדפוסים הפילוגיאוגרפיים הללו ואת הקשר בין שונות גנטית לביוכימית.

ל-CISTANCHE יש השפעות אנטי-אוקסידציה

3. חומרים ושיטות

3.1. חומר צמחי

לצורך ניתוח פיטוכימי, נדגמו בסך הכל 249 צמחי דוב הגדלים ב-42 אוכלוסיות בסתיו 2014, 2015 ו-2016, המייצגים את התפוצה הטבעית של מין צמח זה בחצי האי האיברי (איור 1 וטבלה S1). ראשית, בסתיו 2014, אספנו ניצנים מ-80 צמחים בעשר אוכלוסיות ספרדיות (AG, AN, BA, LI, LO, PE, PÁ, SR, SC ו-SE) הממוקמים בשטח קטן יחסית (80 × 50 ק"מ בערך) בצפון ספרד אך בטווח רחב של גבהים (424–1410 מ' מעל פני הים). שנית, בסתיו 2015, אספנו 48 צמחים משש מהאוכלוסיות הללו (AG, LI, LO, PA, SE ו-SR) ו-46 צמחי דובי משש אוכלוסיות הממוקמות בקווי רוחב נמוכים יותר (AL, CH, ET, HU, LV , ו-PI). עבור כל אוכלוסייה, דגמנו שמונה צמחים שהופרדו בטווח של לפחות 5 מ', למעט בהולנד, שם מצאנו רק שישה פרטים. שלישית, בסתיו 2016, נדגמו בסך הכל 140 צמחים ב-29 מקומות שונים (1-6 פרטים מכל אחד) כולל 26 יישובים ספרדיים חדשים (IZ, CE, BT, MO, AA, GU, SI, AF, SA, PT, AB, CG, OD, PS, LB, CO, LE, MA, CP, PO, MZ, AV, LC, AY,LN, and ZU). הדגימה שלנו משתרעת על טווח גובה שבין 534 ל-1750 מ'. בסך הכל, 42 האוכלוסיות מייצגות מגוון רחב של תנאי אקלים (טבלה S1): הטמפרטורה הממוצעת המקסימלית הראתה שינוי פי 2- (13-26 ◦C) ומשקעים שנתיים נעו מ-399 (ZU) ל-1589 מ"מ (PT). קרינה גלובלית נעה בין 4.2 ל-5.1 קוט"ש/מ"ר. שישה עד עשרה ניצנים סופניים (15-20 ס"מ באורך) נאספו עבור כל צמח כדי לקבל 6-15 גרם של עלים בריאים, אשר נכרתו לאחר מכן ויובשו ב-60 ◦C למשקל קבוע (3-4 ימים). לאחר קביעות משקל יבש, עלים הומוגגו באופן ידני במכתש ואוחסנו ב-4 ◦C עד לניתוח. חומר צמחי זה שימש לקביעות כולל של פנולים ו-HPLC.

חומרי עלים להערכות ציטומטריות זרימה התקבלו מעלים טריים של 178 פרטים השייכים לסך של 37 אוכלוסיות (טבלה 1). דגימות התקבלו מ-33 מהאוכלוסיות שהוזכרו לעיל, ומארבע אוכלוסיות חדשות (BE, JO ו-PR בספרד ו-EN באנדורה) שבהן נאספו עלים באביב 2017, ולכן לא נכללו בניתוח הפיטוכימי (איור 1 ו- טבלה S1). מאחד עד שישה אינדיבידואלים לאוכלוסיה נמדדו כפולים. חומרי עלים למיצוי DNA יובשו בסיליקה ג'ל ואוחסנו בטמפרטורת החדר. ניתוחי גיוון DNA בוצעו בסך הכל ב-105 צמחים מ-35 מקומות (טבלה 1).

שוברי צמחים של 46 אוכלוסיות הדובים שנחקרו מופקדים בעשבון לפני הספירה, של המכון הבוטאני של ברצלונה, בצמחייה BCN, של ה-Centre de Documentació de BiodiversitatVegetal, Universitat de Barcelona או בצמחייה JACA, של ה-Instituto Pirenaico de Ecología( CSIC).

3.2. הכנת תמציות עלים וקביעת סך פנולים

שלושה עותקים של תמציות עלי דובי הוכנו באמצעות 50 מ"ג של דגימה מיובשת ו-10 מ"ל של 80 אחוז מתנול. הצינורות הודגרו במשך 30 דקות באמבט אולטראסוני, ולאחר מכן סוננו התמציות (0.45 מ"מ) ואוחסנו ב-4 ◦C עד לניתוח. התוכן הפנולי הכולל נקבע בתמציות שהוכנו מדגימות שנאספו בשנים 2014 ו-2015. פעלנו לפי שיטת Folin-Ciocalteumethod [60,61] עם שינויים קלים: ל-0.1 מ"ל של תמצית, 0.4 מ"ל של מתנול (80 אחוז), 0.5 מ"ל Folin- נוספו ריאגנט Ciocalteu ו-8 מ"ל מים טהורים במיוחד. לאחר 5 דקות באמבט קולי, נוספו 1 מ"ל של Na2CO 3 20 אחוז (w/v). הדגימות הושארו בחושך למשך 30 דקות לפני מדידת ספיגה ב-760 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר גלוי UV (CARY 50 BIO, Varian, AgilentTechnologies). התוצאות באו לידי ביטוי בשווי חומצה גאלית (GAE); כלומר, מ"ג חומצה גאלית/גרם דר wt, תוך שימוש בעקומה סטנדרטית של חומצה גאלית (40-340 מיקרוגרם/גרם).

3.3. קביעת ארבוטין ומטבוליטים פנולים אחרים

התוכן הפנולי של תמציות מתנוליות של עלי דובי הוכמת על ידי RP-HPLC באמצעות מערכת HPLC-UV/Vis (LaChrom Merck Hitachi L-7400) עם Kinetex 5 µm-EVO C18(250 מ"מ × 4.6 מ"מ ) עמודה וספיגה נקבעים ב-280 ננומטר. תמציות מדגימות שנאספו ב-2014 וב-2015 הודללו 1:10 (v/v) והוזרקו עם שלב נייד של מתנול ואצטוניטריל. תוכנית הגרדיאנט כללה 0-5 דקות, 25 אחוזים של מתנול; 5-6 דקות, 100 אחוז; 6-10 דקות, 100 אחוז; ו-10-20 דקות, שוב 25 אחוז של מתנול. קצב הזרימה היה 1 מ"ל/דקה ונפח ההזרקה היה 20 μL. בתנאים אלה, זמן השמירה שלארבוטיןהיה 2.6 דקות, מה שמאפשר לנו לקבוע את הריכוז של תרכובת זו באמצעות עקומת כיול שנקבעה עם 6 דילולים של תקן, מ-40 ל-340 מיקרוגרם/גרם, עם מקדם מתאם של r=0. 9997. תמציות מדגימות שנאספו בשנת 2016 נותחו באמצעות שלב נייד של מתנול ומים עם תוכנית הגרדיאנט הבאה: 0-5 דקות, 10 אחוז מתנול; 5-6 דקות, 20 אחוז; 6-10 דקות, 20 אחוז; 10-11 דקות, 30 אחוז; 11-15 דקות, 30 אחוז; 15-16 דקות, 40 אחוז; 16-20 דקות, 40 אחוז; 20-21 דקות, 50 אחוז; 21-25 דקות, 50 אחוז; 25-26 דקות, 60 אחוזים; 26–30 דקות, 60 אחוז; 30–31 דקות, 10 אחוזים; ו-31-36 דקות, שוב 10 אחוזים של מתנול. בתנאים אלה, קבענוארבוטין ו4 תרכובות פנוליות אחרות: חומצה קפאית, קטצ'ין, מיריצין וקוורצטין-3-O-glucopyranoside באמצעות עקומות הכיול המתאימות שנקבעו עם 5 דילולים של תקנים (25-500 מיקרוגרם/מ"ל) ,שהראה מקדמי מתאם של {{10}}.9992 עבור קטצ'ין (זמן שמירה 12.0 דקות), 0.9924 עבור חומצה קפאית (זמן שמירה 13.4 דקות), 0.9981 עבור קוורצטין{{16} } O-glucoside (זמן שמירה 23.4 דקות), ו-0.9997 עבור myricetin (זמן שמירה 25.1 דקות).

מתנול ואצטוניטריל היו בדרגת HPLC ונרכשו מחברת Panreac (ברצלונה, ספרד). תקנים (טוהר גדול או שווה ל-98 אחוז) שלארבוטין, חומצה קפאית וחומצה גאלית, כמו גם ריאגנט Folin-Ciocalteu נרכשו מסיגמא-אלדריך (ברצלונה, ספרד). תקני קטצ'ין וקוורצטין-3-O-glucopyranoside נרכשו מ-Extrasynthese (Genay Cedex, צרפת), בעוד ש-myricetin נרכש מאלפא אייסר (קרלסרוהה, גרמניה).

תוצאות של קביעות כימיות נותחו באמצעות תוכנת SPSS v. 25 ו-R 3.5.2. לאחר בדיקת נתונים עבור תקינות והומוסקדסטיות, ביצענו את ניתוח השונות של קבוצות שונות של בדיקות הפרדת נתונים ואמצעים (Tukey ו-Tamhane) או בדיקות לא פרמטריות כמו Kruskal–Wallis, ו-Dunn מבחן השוואה מרובה עם תיקון Bonferroni. הערכנו גם מקדמי מתאם (פירסון או ספירמן תלוי אם הנתונים עקבו אחר התפלגות נורמלית) בין משתנים, כולל גודל הגנום.

ל-CISTANCHE יש השפעות אנטי-אוקסידציה

3.4. הערכות גודל הגנום ורצף DNA

גודל הגנום של צמחי דובי הוערך על ידי ציטומטריית זרימה ב-Centres Científicsi Tecnològics, Universitat de Barcelona (CCiTUB) בעקבות הנהלים שהוסברו ב-Pellicer et al. [62]. Petunia hybrida Vilm. 'PxPc6' (2C=2.85 pg) שימש כתקן פנימי. זרעים של התקן סופקו על ידי Plateforme de cytométrie d'Imagerie-Gif, CNRS-I2BC (Gif-sur-Yvette, צרפת). תוכן DNA גרעיני (2C) חושב על ידי הכפלת תכולת ה-DNA הידועה של התקן במנה שבין מיקומי שיא (מצב) של מיני היעד והתקן בהיסטוגרמה של עוצמות הקרינה, בהנחה של מתאם ליניארי בין האותות הפלורסנטיים מהגרעינים המוכתמים של הדגימה הלא ידועה, התקן הפנימי הידוע וכמות ה-DNA [63].

כ-20 מ"ג של רקמת עלים מיובשת סיליקה שימשו למיצוי DNA באמצעות פרוטוקול CTAB [64] עם שינויים קלים. איכות ה-DNA הכולל נבדקה עם NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר (ThermoScientific, Wilmington, DE, ארה"ב). האזורים הבין-גניים הפלסטיים rpl32-trnLand psbE-petN, כמו גם אזור ה-DNA הריבוזומי הגרעיני ITS, הוגברו ורצפו שלושה פרטים לכל אוכלוסייה. רצפים של ITS לא הציגו שונות בתוך 105 המנותחים, למעט כמה עמדות המציגות פולימורפיזמים אינטרגנומיים של נוקלאוטידים. לכן, אזור ה-DNA הריבוזמלי הגרעיני הזה לא נכלל בניתוח נוסף. אזורי DNA פלסטידיים אחרים (כלומר, ndhF; ndhF-rpl32; psbA-trnH; psbD-trnT; rps16; ו-trnL-trnF) נבדקו אף הם, אך הם נמחקו עקב שונות נמוכה או בעיות רצף. הליך ההגברה בוצע כמתואר ב-Vitales et al. [65]. רצף ישיר של מקטעי ה-DNA המוגבר בוצע עם Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (PE Biosystems, Foster City, קליפורניה, ארה"ב) ב-Unitatde Genòmica, CCiTUB, על מנתח DNA של ABI PRISM 3700 (PE Biosystems). רצפי rpl32-trnL וpsbE-petN הורכבו עם BioEdit גרסה 7.1.3.0 [66], מיושרים עם ClustalW MultipleAlignment v1.4 [67] והותאמו באופן ידני. מספרי ההצטרפות ל-GenBank מסופקים בטבלה S2.

3.5. גודל הגנום וניתוח גנטי

בדיקת Kruskal-Walis לא פרמטרית בוצעה כדי לבדוק הבדלים מובהקים סטטיסטית בערכי 2C בין אוכלוסיות. בדיקות ההשוואה המרובות של דאן בוצעו גם כדי לקבוע אילו אוכלוסיות הראו הבדלים משמעותיים ביניהן. תיקון Bonferroni הוחל כדי למזער את השגיאה מסוג I (חיובי שגוי).

פרמטרי גיוון גנטי (אתרים פולימורפיים, אתרים אינפורמטיביים, מספר ההפלוטיפים וגיוון ההפלוטייפ הכולל) נאמדו באמצעות DnaSP v6 [68]. הפלסטידים נקבעו במערך נתונים משולב שכלל גם את אזורי rpl32-trnL וגם את אזורי psbE-petN. Indels קודדו עם FastGap v.1.2 [69] וטופלו כאירועי מוטציה בודדת. הקשרים האבולוציוניים בין הפלוטיפים הושקו על סמך רשת חסינות שנבנתה באמצעות TCS [70] כפי שיושם ב- PopArt [71]. המספר המרבי של הבדלים הנובעים מהחלפות בודדות בין הפלוטיפים חושב עם גבולות ביטחון של 95 אחוזים.

כדי לנתח את הקשר בין נתונים גנטיים לכימיקלים בוצעה בדיקת Mantel. ראשית, הערכנו את המרחק הפנוטיפי בקרב 25 אוכלוסיות באמצעות נתונים מצמחי דובי שנאספו ב-2016, שנמדדו עבור חמישה מרכיבים פנוליים (כלומר.ארבוטין, קטצ'ין, חומצה קפאית, קוורצטין ומיריסטין). השתמשנו ב-R Commander כדי לתקנן את הנתונים הללו [72], ולאחר מכן, כדי לחשב את המרחק הכימי הנגזר מהמטריצה ​​הסטנדרטית עם הפונקציה "Dist" onR בהתבסס על מרחקים אוקלידיים. שנית, מטריצת המרחק הזוגית הגנטית של אוכלוסיית Nei חושבה בין 25 האוכלוסיות באמצעות DnaSP v6. לבסוף, חישבנו את המרחקים הגיאוגרפיים הזוגיים בקרב אוכלוסיות אלו באמצעות החבילה "גיאודיסט" ב-R. מתאמים זוגיים בין מטריצות מרחק חושבו באמצעות מבחן Mantel עם 10,000 תמורות עם הפונקציונליות הזמין בחבילת R "טבעונית" [ 73].

4. מסקנות

כל צמחי הדוב המנותחים הראוארבוטיןתכולה גבוהה מ-7 אחוזים; לכן, חומר צמחי זה מתאים לתכשירים צמחיים. הניתוח שלנו גילה תכולת ארבוטין גבוהה יותר מאלה (עד 9 אחוזים) שהופנו על ידי Parejo et al. [40], שניתחו ארבע אוכלוסיות הממוקמות בצפון-מזרח הפירנאים בגובה 1580-2030 מ' וזיהו הבדלים נמוכים בתכולת הארבוטין בין האוכלוסיות. יתר על כן, רוב הערכים שנקבעו כאן הם בטווח של החומר הצמחי שנבחר לגידול בפולין [74] ובהסכמה עם הגבוהארבוטיןתוכן של דגימות עלי דוב ספרדיים שדווחו על ידי Sonnenschein ו-Tegtmeier [42] בעת בחירת צמחים לגידול בגרמניה. גנוטיפים עילית של A. uva-ursi יכלו להיות מופצים וגטטיבית, אך רוב השיבוטים שהושגו נכשלו במהלך הקמת השדה, מה שהגביל את ניצול המשאבים הללו. תיארנו גם את השונות הקיימת בתוכן של שלושה פלבנואידים (קטצ'ין, מיריצ'טין וקוורצטינגלוקוזיד), כמו גם של חומצה קפאית, בקרב אוכלוסיות דוב ספרדיות, וכיצד גורמים אקלימיים (בעיקר קרינה גלובלית ומשקעים), המתואמים לרוחב ולגובה. שיפועים, משפיעים על השונות הזו. יחד עם זאת, למרות הרמות הנמוכות של השונות של הפלוטיפ וגודל הגנום שנקבעו ב-Iberian A. uva-ursi, התמיינות גנטית וציטוגנטית של אוכלוסיות הייתה חלשה אך קשורה באופן משמעותי לגיוון פיטוכימי. בסך הכל, תוצאות אלו מדגישות שיש לשקול את ההשפעה של גורמים גנטיים ואביוטיים כאחד כדי להסביר שונות פיטוכימית תוך-ספציפית שנמצאת בצמחים מאוכלוסיות בר.

השפעות CISTANCHE

הפניות

1. מור, BD; אנדרו, RL; Külheim, C.; Foley, WJ הסבר על מגוון תוך-ספציפי במטבוליטים משניים של צמחים בהקשר אקולוגי. פיטול חדש. 2014, 201, 733–750. [CrossRef] [PubMed]

2. Cheynier, V.; Comte, G.; דייויס, קמ; Lattanzio, V. פנוליות צמחים: התקדמות אחרונה על הביוסינתזה, הגנטיקה והאקופיזיולוגיה שלהם. צמח פיזיול. Biochem. 2013, 72, 1–20. [CrossRef]

3. ברנאל, מ.; לורן, ל.; Julkunen-Tiitto, R.; Badosa, J.; Verdaguer, D. שינויים בגובה ועונתי של תרכובות פנוליות בעלים ובציפורניים של Buxus sempervirens. צמח פיזיול. Biochem. 2013, 70, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

4. Upton, R. (עורך) Uva-ursi Leaf. Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. תקן של ניתוח, בקרת איכות וטיפול; פרמקופיה אמריקאית צמחים: Scotts Valley, CA, ארה"ב, 2008; 30p.

5. סוכנות התרופות האירופית. דוח הערכה על Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. פוליום. EMA/HMPC/750266/2016; סוכנות התרופות האירופית: אמסטרדם, הולנד, 2018.6. Kanlayavattanakul, מ.; Lourith, N. צמחים ומוצרים טבעיים לטיפול בהיפרפיגמנטציה של העור - סקירה. פלנטה מד. 2018, 84, 988–1006. [CrossRef]

7. מיגאס, פ.; Krauze-Baranowska, M. המשמעות של ארבוטין ונגזרותיו בטיפול ובקוסמטיקה.Phytochem. Lett. 2015, 13, 35–40. [CrossRef]

8. Seo, DH; יונג, JH; לי, JE; ג'ון, EJ; קים, ו.; Park, CS ייצור ביוטכנולוגי של ארבוטין (-ו-ארבוטין), חומרים להבהרת עור ונגזרותיהם. יישום מיקרוביול. ביוטכנולוגיה. 2012, 95, 1417–1425. [CrossRef]

9. ז'ו, X.; טיאן, י.; ג'אנג, ו.; ג'אנג, ט.; גואנג, סי; Mu, W. התקדמות אחרונה בייצור ביולוגי של -arbutin. יישום מיקרוביול. ביוטכנולוגיה. 2018, 102, 8145–8152. [CrossRef] [PubMed]

10. Davey, M. מטבוליזם משני בתרביות תאים צמחיים. ב-Encyclopedia of Applied Plant Sciences, מהדורה 2;Thomas, B., Murphy, DJ, Murray, BG, Eds.; Elsevier: לונדון, בריטניה, 2017; כרך 2, עמ' 462–467. [CrossRef]

11. קורקין, וירג'יניה; Ryazanova, TK; Daeva, ED; Kadentsev, VI מרכיבים של Arctostaphylos uva-ursi leaves.Chem. נאט. Compd. 2018, 54, 278–280. [CrossRef]

12. פנדה, א.; פטרוצ'י, ר.; Marrosu, G.; מולטרי, ג.; Romana-Gallo, F. HPLC-PDAESI-TOF/MS פרופיל מטבולי של Arctostaphylos pungens ו-Arctostaphylos uva-ursi: מחקר השוואתי של תרכובות פנוליות מתמצית מטבולית עלים. פיטוכימיה 2015, 115, 79–88. [CrossRef]

13. Olennikov, DN; Chekhirova, GV 60-Galloylpicein ותרכובות פנוליות אחרות מ-Arctostaphylos uva-ursi.Chem. נאט. Compd. 2013, 49, 1–7. [CrossRef]

14. Brewer, MS נוגדי חמצון טבעיים: מקורות, תרכובות, מנגנוני פעולה ויישומים פוטנציאליים. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2011, 10, 221–247. [CrossRef]

15. אמרוביץ, ר.; פג, RB; רחימי-מוגדאם, פ.; בר, ב.; Weil, JA יכולת ניקוי רדיקלים חופשיים ופעילות נוגדת חמצון של מיני צמחים נבחרים מהערבות הקנדיות. Food Chem. 2004, 84, 551–562. [CrossRef]

16. נגר, ר.; O'Grady, MN; O'Callaghan, YC; אובריאן, ניו יורק; קרי, JP הערכת הפוטנציאל נוגד החמצון של תמציות זרעי ענבים ותמציות דוב בבשר חזיר גולמי ומבושל. מדע בשר. 2007, 76, 604–610. [CrossRef][PubMed]

17. Mekini´c, IG; סקרוזה, ד.; לובנקוב, I.; קטליניק, ו.; Šimat, V. נוגדי חמצון ופוטנציאל אנטי-מיקרוביאלי של מטבוליטים פנולים מעשבי תיבול ותבלינים ים תיכוניים בשימוש מסורתי. Foods 2019, 8, 579. [CrossRef]

18. מוהד אזמן, נ"א; Galego, MG; סגוביה, פ.; עבדאללה, ש.; שערני, SM; Almajano, MP מחקר על התכונות של תמצית עלי דובי כנוגד חמצון טבעי במזונות מודל. נוגדי חמצון 2016, 5, 11. [CrossRef] [PubMed]

19. פג, RB; אמרוביץ, ר.; Naczk, M. פעילות נוגדת חמצון של פוליפנולים מתמצית עלי דובי (Arctostaphylos uva-ursi L. Sprengel) במערכות בשר. בתרכובות פנוליות במזונות ומוצרי בריאות טבעיים; Shahidi, F., Ho, CT, Eds.; האגודה האמריקנית לכימיה: וושינגטון הבירה, ארה"ב, 2005; עמ' 67–82. [CrossRef]

20. ורונה, מ.; בלסקו, ש.; בצריל, ר.; Nerín, C.; מכירות, ע.; Asensio, E. סמנים נוגדי חמצון ואנטי-מיקרוביאליים מאת UPLC®–ESI-Q-TOF-MSE של אריזה פעילה רב-שכבתית חדשה המבוססת על Arctostaphylos uva-ursi. Talanta2019, 196, 498–509. [CrossRef]

21. מאייר, מ.; Olbermann, AL; רנר, מ.; Weidner, E. הקרנה של עשבי מרפא אירופיים על תכולת הטאנין שלהם - סוכני שיזוף פוטנציאליים חדשים לתעשיית העור. Ind. Crop. לְדַרבֵּן. 2017, 99, 19–26. [CrossRef]

22. בורוס, ב.; Jakabová, S.; מדארש, ט.; מולנאר, ר.; גלמבוס, ב.; קילאר, פ.; פליגר, א.; Farkas, A. ValidatedHPLC שיטת לכימות בו-זמנית של bergenin, arbutin וחומצה גאלית בעלים של מינים שונים ברגניה. כרומטוגרפיה 2014, 77, 1129–1135. [CrossRef]

23. מיאו-לינג, סי; Chur-Min, C. קביעת HPLC סימולטנית של חומר הלבנה הידרופילי במוצר קוסמטי. ג'יי פארם. ביומד. אנאלי. 2003, 33, 617–626. [CrossRef]

24. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. שלב מיצוי יחיד בניתוח כמותי של עלי arbutinin bearberry (Arctostaphylos uva-ursi) על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. Phytochem. Anal.2001, 12, 336–339. [CrossRef]

25. כוח. צמחי העולם באינטרנט. זמין באינטרנט: http://www.plantsoftheworldonline.org/ (נגישה ב-29 באפריל 2020).

26. סאלם, א.; האריס, CS; אסים, מ.; קייריר, א.; מרטינו, ל.; חדד, נ.ב; ארנסון, שיטת JTRP-HPLC-DAD-APCI/MSD לאפיון של Ericaceae רפואיים המשמשים את Eeyou IstcheeCree First Nations. Phytochem. אנאלי. 2010, 21, 328–339. [CrossRef] [PubMed]

27. Stefanescu, BE; סאבו, ק.; מוקן, א.; Crisan, G. תרכובות פנוליות מחמישה עלים מסוג Ericaceae והזמינות הביולוגית והיתרונות הבריאותיים הקשורים אליהם. מולקולות 2019, 24, 2046. [CrossRef] [PubMed]

28. Onda, Y.; Mochida, K. חקר המגוון הגנטי בצמחים באמצעות טכניקות רצף תפוקה גבוהה. Curr. גנום. 2016, 17, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

29. Ianicelli, J.; גוארינילו, ג'; טוסיב, VE; Regalado, JJ; Di Ciaccioa, L.; ואן בארן, CM; Pitta Álvarez, SI;Escandón, AS "האפקט הפוליפלואידי" בגידול מינים ארומטיים ומרפאים. Sci. הורטיק. 2020,260, 108854. [CrossRef]

30. Leitch, IJ; Leitch, AR גיוון גודל הגנום ואבולוציה בצמחי אדמה. גיוון גנום בתוך הצמח כרך 2, מבנה פיזי, התנהגות והתפתחות של גנומים צמחיים; Leitch, IJ, Greilhuber, J., Doležel, J.,Wendel, JF, Eds.; שפרינגר: וינה, אוסטריה, 2013; עמ' 307–322. [CrossRef]

31. בנט, MD; Leitch, IJ כמויות DNA גרעיניות באנגיוספרמים - התקדמות, בעיות וסיכויים. בוט. 2005, 95, 45–90. [CrossRef]

32. גרגורי, TR (עורך) האבולוציה של הגנום; Elsevier: סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב, 2005.

33. Hoang, PN; שוברט, ו'; מייסטר, א.; פוקס, ג'; Shubert, I. שונות בגודל הגנום, נפח התא והגרעין, מספר הכרומוזומים ולוקוסי rDNA בקרב ברווזים. Sci. נציג 2019, 9, 3234. [CrossRef]

34. נייט, קליפורניה; מולינארי, נ.; פטרוב, DA השערת אילוץ הגנום הגדול: אבולוציה, אקולוגיה ופנוטיפ. אן. בוט. 2005, 95, 177–190. [CrossRef]

35. פליצר, י. Hidalgo, O.; דודסוורת', ש.; Leitch, IJ גיוון גודל הגנום והשפעתו על התפתחות צמחי היבשה. Genes 2018, 9, 88. [CrossRef]

36. קארב, א; Rušˇci´c, M.; Skoˇcibuši´c, M.; Maravic, A.; סילג'ק-יעקובלב, ש.; Politico, O. פיטוכימי וציטוגנטי אפיון של Centaurea solstitialis (Asteraceae) מקרואטיה. Chem. צוללנים ביולוגיים. 2017, 14, e1600213.[CrossRef]

37. Cole, IB; קאו, ג'; אלן, RA; Saxena, PK; Murch, SJ השוואות של Scutellaria baicalensis, Scutellarialateriflora ו- Scutellaria racemosa: גודל הגנום, פוטנציאל נוגד חמצון ופיטוכימיה. פלנטה מד. 2008,74, 474–481. [CrossRef]

38. Carvalho, YGS; ויטורינו, LC; דה סוזה, UJB; Bessa, LA מגמות אחרונות במחקר על המגוון הגנטי של צמחים: השלכות לשימור. גיוון 2019, 11, 62. [CrossRef]

39. ווי, ש.; יאנג, ו.; וואנג, X.; Hou, Y. מגוון גנטי גבוה בצמח מרפא בסכנת הכחדה, Saussureainvolucrata (Saussurea, Asteraceae), במערב הרי טיאנסאן, סין. שמר. ג'נט. 2017, 18,1435–1447. [CrossRef]

40. Chang, YJ; Cao, YF; ג'אנג, JM; טיאן, LM; דונג, XG; ג'אנג, י.; Qi, D.; Zhang, XS מחקר על מגוון chloroplastDNA של אגסים תרבותיים ופראיים (Pyrus L.) בצפון סין. עץ ג'נט. גנומים 2017, 13, 44.[CrossRef]

41. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. וריאציה של תכולת הארבוטין באוכלוסיות פרא שונות של Arctostaphylos uva-ursi בקטלוניה, ספרד. J. Herbs Spices Med. צמחים 2002, 9, 329–333. [CrossRef]

42. זוננשיין, מ.; Tegtmeier, M. ניסויים על ביות דובי (Arctostaphylos uva-ursi (L.)Spreng.). J. Med. צמחי תבלינים 2012, 17, 124–128.

43. חן, HY; לין, YC; Hsieh, CL הערכת פעילות נוגדת חמצון של תמצית מימית של כמה עשבי תיבול תזונתיים נבחרים. Food Chem. 2008, 104, 1418–1424. [CrossRef]

44. Del Valle, JC; Buide, ML; Casimiro-Soriguer, I.; Whittall, JB; Narbona, E. על הצטברות פלבנואידים בחלקי צמחים שונים: דפוסי שונות בין פרטים ואוכלוסיות בקמפיון החוף (Silene littorea). חֲזִית. Plant Sci. 2015, 6, 939. [CrossRef]

45. Martínez-Cadenas, C.; לופז, ש.; ריבס, ג.; פלורס, סי; García, O.; סביליה, א.; Smith-Zubiaga, I.;Ibarrola-Villaba, M.; פינו-יינס, מ"מ; Gardeazabal, J.; et al. סלקציה מטהרת בו-זמנית על האלל הקדמוני MC1R וסלקציה חיובית על אלל הסיכון למלנומה v60l בדרום אירופה.Mol. ביול. Evol. 2013, 30, 2654–2665. [CrossRef]

46. ​​Jakaaola, L.; Hohtola, A. השפעת קו הרוחב על ביוסינתזה של פלבנואידים בצמחים. סביבת תא צמחים. 2010, 33,1239–1247. [CrossRef]47. מרץ, פ.; פלטולה, ר.; פונטנה, ש.; Duval, RE; Julkunen-Tiitto, R.; Stark, S. השפעת קו הרוחב והגובה על הרכב הטרפנואיד והפנולי המסיס של מחטי ערער (Juniperus communis) והערכת הפעילות האנטיבקטריאלית שלהם באזור הבוראלי. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 9575–9584. [CrossRef]

48. יאנג, ב.; ג'נג, ג'; לאקסונן, או.; טהבונן, ר.; Kallio, H. השפעות של קווי רוחב ומזג אוויר על תרכובות פנוליות בזני דומדמניות (Ribes spp.). J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 3517–3532. [CrossRef][PubMed]

49. לאטי, א"ק; יאקולה, ל. Riihinen, KR; Kainulainen, PS Variation Anthocyanin ו-flavonol בגרגרי בוגביל (Vaccinium uliginosum L.) בפינלנד. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 427–433. [CrossRef] [PubMed]

50. לאטי, א"ק; Riihinen, KR; Kainulainen, PS ניתוח של שונות אנתוציאנין באוכלוסיות בר של אוכמניות (Vaccinium myrtillus L.) בפינלנד. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 190–196. [CrossRef]

51. מונשיין, מ.; איגלסיאס, י. קונרט, או.; Bucar, F. Phytochemistry של אברש (Calluna vulgaris (L.) Hull) ושינוי הגובה שלו. Phytochem. Rev. 2010, 9, 205–215. [CrossRef]

52. פרי, נ.ב; Burgess, EJ; רודריגס גויטיאן, MA; רומרו פרנקו, ר.; López Mosquera, E.; Smallfield, BM; Joyce, NI; Littlejohn, RP Sesquiterpene lactones in Arnica montana: Helenalin and dihydrohelenalinchemotypes בספרד. פלנטה מד. 2009, 75, 660–666. [CrossRef] [PubMed]

53. עבדאלה-רוברטס, ל.; אסמן, ש.; ברני-מייר, י. Terán, JC; Covelo, F.; גלוזר, ג.; Moreira, X. גורמים ביוטיים אנדביוטיים הקשורים לשונות בגובה בתכונות הצמח ואוכלי עשב במין אלון דומיננטי. ג'יי בוט. 2016, 103, 2070–2078. [CrossRef] [PubMed]

54. בנטלי, ג'יי; מור, JP; Farrant, JM Metabolomics כהשלמה לפילוגנטיקה להערכת גבולות תוך-ספציפיים בשיח הרפואי סובלני לייבוש Myrothamnus flabellifolia (Myrothamnaceae). Phytochemistry 2019, 159, 127-136. [CrossRef] [PubMed]

55. סילג'ק-יעקובלב, ש.; Pustahija, F.; Šoli´c, EM; Boguni´c, F.; Muratovic, E.; Basi´c, N.; Catrice, O.; Brown. Sci. Lett. 2010, 3, 190–213. [CrossRef]

56. גארידו, JL; Alcántara, JM; ריי, PJ; מדראנו, מ.; גויטיאן, ג'; Castellanos, MC; Bastida, JM; Jaime, R.;Herrera, CM מבנה גנטי גיאוגרפי של קולומבינים איבריים (גנר Aquilegia). Plant Syst. Evol. 2017,303, 1145–1160. [CrossRef

57. ליסל, ד.; פושלוד, פ.; Reisch, C. Phylogeography של ניצול סלע קשוח באדמות עשב יבשות באירופה. PLoS ONE 2017, 12, e0179961. [CrossRef]

58. אולדה, מ.; הררן, א.; אספינל, ש.; Goicoechea, P. White Oaks phylogeography בחצי האי האיברי.Ecol. ניהול 2002, 156, 89–102. [CrossRef]

59. בארט, SCH השפעות של שיבוט על רבייה מינית של צמחים. פרוק. נאטל. אקד. Sci. ארה"ב 2015, 112,8859–8866. [CrossRef] [PubMed]

60. סקוירה, מ.; פלגוארה, ו'; Galego, G.; פיירו, ש.; Almajano, MP ההשפעה של תמציות Perilla frutescens על היציבות החמצונית של תחליב מזון מודל. נוגדי חמצון 2014, 3, 38–54. [CrossRef] [PubMed]

61. פסקואל, א.; Quirantes-Pine, R.; פרננדו, אל.איי; אלכסופולו, E.; Segura-Carretero, A. הרכב פנולי ופעילות נוגדת חמצון של עלי קנאף. Ind. Crop. לְדַרבֵּן. 2015, 78, 116–123. [CrossRef]

62. פליצר, י. Garnatje, T.; מולרו, ג'; Pustahija, F.; סילג'ק-יעקובלב, ש.; Vallès, J. מקור ואבולוציה של מיני ארטמיסיה דרום אמריקאים (Asteraceae); עדויות מפילוגניה מולקולרית, DNA ריבוזומלי ונתוני גנומזה. אוסט. ג'יי בוט. 2010, 58, 605–616. [CrossRef]

63. Doležel, J. Flow ניתוח ציטומטרי של תכולת DNA גרעיני בצמחים גבוהים יותר. Phytochem. אנאלי. 1991, 2,143–154. [CrossRef]

64. דויל, JJ; Doyle, JL הליך בידוד DNA מהיר עבור כמויות קטנות של רקמת עלים טריים. Phytochem. בול.בוט. Soc. אמ. 1987, 19, 11–15.

65. Vitales, D.; פלינר, ג.נ.; Vallès, J.; Garnatje, T.; פירת, מ.; Álvarez, I. מחזור חדש של הסוג הים תיכוני Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae) המבוסס על סמני דנ"א פלסטידיים וגרעיניים. Phytotaxa 2018, 349, 1-17. [CrossRef]

66. Hall, TA BioEdit: עורך יישור רצף ביולוגי ידידותי למשתמש ותוכנית ניתוח עבור Windows95/98/NT. סימפטום חומצות גרעין סר. 1999, 41, 95–98.

67. Thompson, JD; היגינס, DG; Gibson, TJ CLUSTAL W: שיפור הרגישות של יישור רצף פרוגרסיבי באמצעות שקלול רצף, עונשי פער ספציפיים למיקום ובחירת מטריצת משקל. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 4673–4680. [CrossRef]

68. רוזאס, י. פרר-מאטה, א.; Sanchez-DelBarrio, JC; Guirao-Rico, S.; Librado, P.; Ramos-Onsins, SE;Sánchez-Gracia, A. DnaSP 6: ניתוח פולימורפיזם של רצף DNA של מערכי נתונים גדולים. מול. ביול. Evol.2017, 34, 3299–3302. [CrossRef] [PubMed]

69. Borchsenius, F. FastGap, גרסה 1.2; המחלקה למדעי הביו, אוניברסיטת ארהוס: Aarhus, דנמרק, 2009; זמין באינטרנט: http://www.aubot.dk/FastGap_home.htm (נגישה ב-1 ביולי 2019).

70. קלמנט, מ.; Posada, DCKA; Crandall, KA TCS: תוכנית מחשב להערכת גנאלוגיות גנים. אקול. 2000, 9, 1657–1659. [CrossRef] [PubMed]

71. Leigh, JW; Bryant, D. Popart: תוכנה מלאה לבניית רשת האפלוטייפ. שיטות אקול. Evol.2015, 6, 1110–1116. [CrossRef]

72. Fox, J. תחילת העבודה עם מפקד R: ממשק משתמש גרפי בסיסי-סטטיסטיקה ל-RJ Stat. Softw.2005, 14, 1–42. [CrossRef]

73. אוקסנן, י.; בלאנשט, FG; קינדט, ר.; Legendre, P.; אוהרה, RB; סימפסון, GL; סולימוס, פ.; Stevens, M.;Wagner, H. Vegan: Community Ecology Package. R Package גרסה 1.17-4. 2010. זמין באינטרנט: http://CRAN.R-project.org/package=vegan (נגישה ב-19 בספטמבר 2010).74. Malinowska, H. נבחרי הדובים (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.) מאוכלוסיות טבעיות בפולין. Acta Soc. בוט. פול. 1995, 64, 91–96. [CrossRef]