קרוודילול, חוסם אדרנרגי, מדכא את סינתזת המלנין על ידי עיכוב מסלול האותות CAMP/CREB במלנוציטים אנושיים ובתרבות העור האנושית Ex Vivo

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Myoung Eun Choi 1,†, Hanju Yoo 1,2,†, Ha-Ri Lee 2,3, Ik Joon Moon 1, Woo Jin Lee 1,Youngsup Song 3,*,‡ ו-Sung Eun Chang 1

תַקצִיר:קטכולאמינים פועלים באמצעות קולטנים מצמידים לחלבון G, וגורמים לעלייה ברמות התוך-תאיות של 30, 50-אדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP) בתאים שונים. קטכולאמיןביוסינתזה והקולטן -אדרנרגי קיימים במלנוציטים; לפיכך, קטכולאמינים עשויים למלא תפקידים קריטיים בפיגמנטציה של העור. עם זאת, פעולתם ומנגנוני התיווך של עור לא אנושי של מלנוגנזה טרם נחקרו. לכן, בדקנו את ההשפעה האנטי-מלנוגנטית הפוטנציאלית של קרוודילול, חוסם לא-סלקטיבי עם פעילות חוסמת 1- חלשה. Carvedilol הפחית את תכולת המלנין ואת פעילות טירוזינאז תאית מבלי לפגוע בכדאיות התא באדם רגילמלנוציטיםכמו גם במל-אב מלנוציטים של עכברים מונצחים. Carvedilol-downregulated microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase, tyrosinase-relatedprotein (TRP)-1 ו-TRP-2. טיפול ב-Carvedilol הוביל להורדת ויסות של phosphor-cAMPresponse element-binding protein (CREB). יתרה מכך, העלייה ברמות cAMP בטיפול בפורסקולין הפכה את הפעולה האנטי-מלנוגנית של קרוודילול. בנוסף, קרוודילול הפחית להפליא את מדד המלנין בתרביות עור אנושיות מוקרנות אולטרה סגול. ביחד, התוצאות שלנו מצביעות על כך ש-carvedilol מדכא ביעילות מלנוגנזה בבני אדםמלנוציטיםועור vivohuman לשעבר על ידי עיכוב איתות cAMP/protein kinase A/CREB. להשפעות האנטי-מלנוגניות של קרוודילול יש משמעות פוטנציאלית לעורהַלבָּנָהסוכנים.

מילות מפתח:קרוודילול; חוסם אדרנרגי;סינתזת מלנין; איתות cAMP/CREB

Cistancheמסוגל לעכב את סינתזת המלנין

1. הקדמה

למגוון רחב של הפרעות עור פיגמנטריות יש השפעה פסיכולוגית וחברתית משמעותית על המטופלים. שיטות טיפול שונות, כולל חומרים סיסטמיים ואקטואליים כמו גם טיפול בלייזר, פותחו [1-3]. עם זאת, התוצאות לרוב אינן משביעות רצון ותגובות שליליות, כגון היפרפיגמנטציה פוסט-דלקתית (PIH) והיפופיגמנטציה, מהטיפול הן שכיחות. בנוסף, הטיפול יקר וגוזל זמן [4-6].

קטכולאמינים, הכוללים דופמין, אפינפרין ונוראפינפרין, הם מולקולות איתות הפועלות כמוליכים עצביים והורמונים אנדוקריניים. בעור, הביוסינתזה והפירוק של קטכולאמינים מתרחשים בקרטינוציטים אנושיים, אך סינתזת קטכולמין במלנוציטים שונה במקצת [7-9]. קטכולאמינים פועלים באמצעות קולטנים מצמידים לחלבון G (GPCRs). הקישור של קטכולאמינים ל-GPCRs מעורר את ההפעלה של אדנילטציקלאז תוך תאי, המסנתז 30, 50-אדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP) מ-ATP [10]. ה-cAMP השני של המסנג'ר מפעיל את פעילותו על ידי קשירת תת-יחידת ה-R של חלבון קינאז A (PKA), וכתוצאה מכך זרחון של חלבון קשירת אלמנטים מסוג cAMP (CREB). GPCRs מופעלים על ידי אמינים ופפטידים, כולל גלוקגון, הורמון פארתירואיד, סיקטין וקלציטונין [10].

אנטגוניסטים לקולטן אדרנרגי כוללים אנטגוניסטים -קולטן ו-רצפטור. -אנטגוניסטים של הרצפטורים מסווגים בתת-סוכנים לא-סלקטיביים, 1-סלקטיביים ו2-סלקטיביים, בעוד שאנטגוניסטים -קולטן מסווגים כלא-סלקטיביים, 1-סלקטיביים ו-2-סלקטיביים סוכנים על סמך פעילות החסימה הסלקטיבית שלהם. שלא כמו אנטגוניסטים לא-סלקטיביים של קולטן מהדור הראשון, כגון פרופרנולול, טימולול ונדולול, קרוודילול הוא חוסם לא-סלקטיבי מהדור השלישי המציג פעולות מרחיבות כלי דם על ידי חסימת 1-אדרנורצפטורים (1-ARs) [11]. לכן, קרוודילול הוא חוסם אנונסלקטיבי עם 1-פעילויות חוסמות חלשות [12]. הוא משמש בעיקר כתרופה דרך הפה לשליטה בלחץ דם גבוה ומחלות לב, בדומה לחסמי חוסמי אחרים [12]. עם זאת, חוסמי הדור השלישי מציגים פעילויות אנגיוגניות, נוגדות חמצון, אנטי-פרוליפרטיביות, אנטי-היפרטרופיות ואנטי-אפופטוטיות הדורשות בירור נוסף [11]. בתחום הדרמטולוגי, בשל פעולותיו נוגדות החמצון והאנטי דלקתיות, קרוודילול משמש לעתים קרובות בתכשירים דרך הפה לטיפול ברוזציאה ריתמטו-טלנגיאקטטית [13,14]. יתרה מכך, הפעילות נוגדת החמצון של קרוודילול גורמת למניעת סרטן עור המושרה על ידי אולטרה סגול (UV), מה שהופך אותו לסוכן אטרקטיבי לניהול מחלות עור הקשורות ל-UV [15-18]. עם זאת, ההשפעות הכימו-מונעות של carvedilolare לא מתווך ישירות דרך ARs. [19] למרות שהמנגנון המדויק אינו ידוע יחסית, מסלול האיתות cAMP/PKA ו-PKC-δ יכול להיות קשור לתכונות של קרוודילול נגד גרורות בעור [20].

בשלבים הראשונים של חקירת פיגמנטציה, אנושימלנוציטיםנמצאו לבטא -1-אות AR לאחר אינדוקציה חוץ-תאית עם נוראדרנלין. עם זאת, -ARs לא נמצאו לאחר גירוי עם איתות אדרנרגי פנימהמלנוציטים[8]. לעומת זאת, Cillbro et al. מאוחר יותר הוכיח שקיים אות 2-AR פונקציונלי ספציפי במלנוציטים אנושיים וש2-גירוי AR מוביל לפיגמנטציה דרך המסלול 2-AR/cAMP [7]. לכן, הוצע תפקידם של קטכולאמינים בשליטה בפיגמנטציה, ו-cAMP נחשב לציר העיקרי לבקרת קטכולאמינים של מלנוגנזה.

מלנוגנזה היא תהליך מורכב הכולל מסלולים רבים. טירוזינאז, חלבון 1 הקשור לטירוזינאז (TRP-1), ו-TRP-2, הנקראים גם דופאכרום טאוטומראז (DCT), הם שלושת האנזימים העיקריים הספציפיים למלנוציטים המעורבים בסינתזת מלנין[21]. מלנוגנזה נגרמת או מעוכבת על ידי גורמים רבים, כולל הורמונים, ציטוקינים, נוירוטרנסמיטורים, גורמי גדילה ומיקרומולקולות [21-23].

הרגולטור החיובי החשוב ביותר הוא הקולטן למלנוקורטין-1 והליגנדים שלו, מלנוקורטינים והורמון אדרנוקורטיקוטרופי [23]. עם זאת, גורמים שונים המעורבים במלנוגנזה הם -אנדורפין, אסטרוגנים, אנדרוגנים, ויטמין D3 וקטכולאמינים [23]. עדויות מצטברות העלו כי L-tyrosine ו-L-DOPA, שהם מצעים ותוצרי ביניים של מלנוגנזה, פועלים כממריצים ומווסתים חיוביים של המסלול המלנוגני, בנוסף לווסתים של תפקודים תאים אחרים [24]. יתרה מכך, ג'ף האו ואחרים. הציע כי ההשראה והוויסות של מלנוגנזה על ידי L-tyrosine מתווכים על ידי הפעלה ישירה של קולטנים אדרנרגיים על ידי L-tyrosine, ולא על ידי התוצרים המטבוליים שלו כגון קטכולאמינים [25]. במחקריהם, נוראפינפרין ואפינפרין עוררו את פעילות טירוזינאז, אך השפעתם האינדוקטיבית עלסינתזת מלניןהיה נמוך יחסית מ-L-tyrosine [25].

קטכולאמינים עשויים למלא תפקידים חשובים במערכת הפיגמנטציה של העור; עם זאת, השפעתם על המלנוגנזה ביחס לפעולה של חוסם לא סלקטיבי מהדור השלישי טרם נחקרה. לכן, במחקר הנוכחי, מטרתנו הייתה לחקור האם קרוודילול משפיע על מלנוגנזה וחקרנו את מנגנוני הפעולה שלו בבני אדםמלנוציטיםועור אנושי ex vivo והשימוש הפוטנציאלי שלו בתור אהַלבָּנָהמוצר.

לעכב יצירת מלנין עםהרבה cistanches

2. תוצאות

2.1. קרוודילול מדכא מלנוגנזה

הציטוטוקסיות של קרוודילול נגד אדם נורמלימלנוציטים(NHMs) ותאי Mel-ab הוערכו על ידי בדיקת שגשוג תאי WST. ריכוז carvedilol של 10 מיקרומטר החל להראות ציטוטוקסיות כנגד תאי NHM ותאי Mel-ab (איור 1A, B). לכן, בהערכות נוספות, השתמשנו ב-8 µM של carvedilol, שאינו ציטוטוקסי ל-NHMs.

טיפול ב-carvedilol הפחית את תכולת המלנין באופן תלוי מינון מבלי להשפיע על הכדאיות של NHMs (איור 1C). תכולת המלנין ירדה ב-28.36 אחוזים לאחר טיפול ב-96 hof 8 µM carvedilol (איור 1C). תוספת של 100 מ"ג/מ"ל ארבוטין הפחיתה את תכולת המלנין במידה פחותה מאשר קרוודילול (איור 1C). לאחר 4 ימים של טיפול ב-carvedilol, תכולת המלנין ירדה באופן תלוי זמן (איור 1D). עם זאת, טיפול בפורסקולין (FSK) במשך 4 ימים לאחר טיפול מקדים ב-carvedilol גרם לעלייה בתכולת המלנין (איור 1E). FSK מגביר את השעתוק של MITF במידה הגבוהה ביותר ב-2 שעות ב-NHMs ומאמינים שהוא מתפקד באמצעות cAMP מסלול /PKA/CREB (איור 1F).

2.2. קרוודילול מעכב את הביטוי של MITF וגני המטרה שלו ומפחית את רמות הפוספו-CREB ב-NHMs

מכיוון ש-carvedilol הפחית את הצטברות המלנין, חקרנו את פעילות ה-tyrosinase הסלולרית. טיפול ב-carvedilol הפחית את פעילות ה-tyrosinase הסלולרית באופן תלוי-מינון ב-NHMs (איור 2A). פעילות טירוזינאז ירדה ב-28.48 אחוזים לאחר 96 שעות של טיפול ב-8 µM carvedilol (איור 2A). לאחר מכן קבענו האם קרוודילול משפיע על הביטוי של MITF, אשר ממלא תפקיד מכריע בוויסות של טירוזינאז וגנים מלנוגניים במורד הזרם. טיפול ב-FSK העלה את רמות cAMP תוך תאי והפך את הפעולות האנטי-מלנוגניות של קרוודילול. Carvedilol הפחית באופן משמעותי את רמות החלבון של MITF, גורם שעתוק מרכזי של מלנוגנזה, ב-72 שעות (איור 2B). יתר על כן, הביטוי של גני המטרה שלו, כגון טירוזינאז ו-TRP-1, ירד לאחר טיפול ב-carvedilol (איור 2B). תוצאות אלו מצביעות על כך ש-carvedilol מעכב מלנוגנזה על ידי הורדת איתות MITF.

לאחר מכן, חקרנו את מסלולי האיתות התוך-תאיים של מלנוגנזה, המווסתים את שעתוק MITF, על ידי מדידת רמות הביטוי של פוספו-CREB ופוספו-ERK. רמות הפוספו-ERK לא השתנו לאורך זמן בעקבות טיפול ב-carvedilol; עם זאת, רמות הפוספו-CREB פחתו (איור 2B). בהתאם לתצפיות קודמות, התוצאות שלנו גילו ש-carvedilolin מעכב מלנוגנזה על ידי עיכוב מסלול האיתות cAMP/PKA/CREB. יתרה מכך, טיפול ב-FSK הפך את הפעולה האנטי-מלנוגנית של קרוודילול על ידי הגדלת רמות cAMP.

2.3. אינדקס מלנין וצביעה אימונוהיסטוכימית בתרבות עור אנושי Ex Vivo

צפיפות המלנוציטים האפידרמיס ואינדקס המלנין בחתכים של תרבית עור אנושי לשעבר זוהו על ידי צביעה של Melan-A ו-Fontana-Masson, בהתאמה. Carvedilol לא השפיע על מספר Melan-A (פלוס)מלנוציטיםבדגימה שטופלה ב-Carvedilol בתוספת UVradiation (UVR) בהשוואה לזו בדגימה שטופלה ב-UVR בלבד (איור 3A). HMB45( פלוס ) מלנוציטים עשויים להצביע על כך שהפעילות המלנוציטית עלתה בטיפול ב-UVR והוסטה כלפי מטה לאחר טיפול ב-carvedilol (איור 3B). עם זאת, תכולת המלנין הופחתה משמעותית בדגימות שטופלו ב-carvedilol בתוספת UVR בהשוואה לזה בדגימות שטופלו ב-UVR בלבד (איור 3C). לחישוב אינדקס המלנין, שבריר השטח המוכתם של פונטנה-מאסון על פני השטח הכולל בין דגימה שנחשפת ל-UVR לבין זו ל-carvedilol בתוספת UVR חושב והושווה (איור 3D). ליזטים של תאים של כל דגימה נותחו על ידי Western blotassay, שחשף כי טירוזינאז, TRP1 ו-DCT הוגדלו על ידי UVR וטיפול מופחת על ידי קרוודילול (איור 3E). כתוצאה מכך, קרוודילול הפחית להפליא את מדד המלנין ואת החלבונים הקשורים למלנוגנזה, והראה את השפעתו האנטי-מלנוגנית על עור אנושי שטופל ב-UVR.

3. דיון

המלנין הוא הפיגמנט האחראי על צבע העור והשיער והוא מסונתז במלנוזומים על ידימלנוציטים. למרות שהמלנין האפידרמיס ממלא תפקיד מגן חשוב מפני UVR, ייצור יתר של מלנין והצטברות בעור גורמים להפרעות היפר-פיגמנטריות מטרידות בעור, כגון PIH, דיספיגמנטציה הקשורה להזדקנות, מלזמה ולנטיגין סולאריות [18,26]. לכן, עיכוב המלנוגנזה היה המוקד של טיפולים תרופתיים וקוסמטיים ליופי ובריאות העור. מאמצים ניכרים נעשו כדי לזהות חומרים אנטי-פיגמנטציה חדשים ויעילים. עם זאת, מנגנוני האנטי-מלנוגנזה של הסוכנים הספציפיים אינם ודאיים כיום, ובדרך כלל הוערכו בתאי עכבר, אשר מניבים תוצאות שאינן תמיד עקביות עם אלו של ניסויים בעור אנושי [27,28]. יתרה מכך, מכיוון שהמלנוגנזה של מלנוציטים מווסתת היטב על ידי קרטינוציטים ותאים שכנים אחרים, תאים אנושיים מתרבות או עור אנושי ex vivo הם הגדרות ניסוי אמינות יותר לחקר אפקטיביותהַלבָּנָהסוכנים [29]. רוב חומרי הלבנת העור, בין אם הם מקורם באופן טבעי או כימי, עלולים לגרום לרעילות או לגירוי בעור, אשר ניתן לחזות במידה מסוימת באמצעות מבחני כדאיות של תאים במבחנה עם מלנוציטים. במחקר שלנו, קרוודילול לא הראה ציטוטוקסיות בשימוש במינונים מתונים.

cistanche bienfaits

קרמים מקומיים של הידרוקינון יכולים לגרום להפרעות היפופיגמנטציה לא רצויות ורעילות עור [30-32]. יתר על כן, חלקםהַלבָּנָהלקוסמטיקה יש השלכות הרות אסון על ידי גרימת היפופיגמנטציה באמצעות פירוק חלבוני טירוזינאז [33-35]. ניתן להשתמש בחומרי הלבנה במינונים גבוהים יותר בהתאם למשתמש כדי למקסם את ההלבנה של נגעים היפרפיגמנטריים. לכן, המאמצים לגלות סוכני הלבנת עור בטוחים ובריאים נמצאים בבדיקה מתמדת.

לכן, המחקר הנוכחי תוכנן להתבצע בתאים אנושיים רגילים ובעור אנושי לשעבר. יתר על כן, בהתבסס על מנגנון הפעולה המבוסס של קטכולאמינים של איתות G, אשר מגביר את רמת ה-cAMP הסלולרית, האמנו שחוסם אדרנרגי יכול להפחית את רמות ה-cAMP ולעכב את מסלול האיתות UVR/cAMP/CREB, שהוא המנגנון העיקרי להיפר-פיגמנטציה של העור הנגרמת על-ידי UV. [36,37]. לכן, שיערנו כי חוסמי אדרנרגיים המפחיתים את רמות cAMP מפחיתיםסינתזת מלנין.

בנוסף, לפתח בטוחהַלבָּנָהיש לבצע במקביל מנגנונים אמינים וניתנים לשחזור של אנטי-מלנוגנזה. הגירוי המשמעותי ביותר מבחינה פיזיולוגית הוא UV, ובין איתות UVR לאפידרמיסמלנוציטיםציר CREB הוא המסלול המבוסס ביותר לוויסות המלנוגנזה באפידרמיס האנושי [29]. חשיפה ל-UV מפעילה ברציפות את ייצור cAMP, PKA ואת גורם השעתוק CREB, אשר, בתורו, גורם לביטוי של MITF וגנים מלנוגניים במורד הזרם [38,39]. בנוסף לזרחון CREB על ידי PKA, מחקרים עדכניים הוכיחו כי הגיוס של CREB-regulated transcription coactivator(CRTC) 3 למתחם השעתוק CREB נדרש גם עבור MITF מגורה cAMP. MITF מבצעת את התפקיד המהותי ביותר ברגולציה שלסינתזת מלניןוהתעתוק כתוצאה מכך של אנזימים מלנוגניים [26,40,41]. במהלך תהליך האיתות התוך תאי הזה, המלנוגנזה מווסתת על ידי אנזים מפתח, טירוזינאז וחלבונים אנזימטיים נוספים, כגון TRP-1 ו-DCT [1-4]. במחקר הנוכחי, קרוודילול הפחית ביעילות את הזרחון של CREB, אשר מצביע על כך שהוא הפחית את חלבוני MITF ו-tyrosinase על ידי עיכוב שעתוק MITF (איור 4). בהתחשב בכך שוויסות הגן של MITF mRNA נשלט בצורה מורכבת וניצול על ידי מולקולות איתות תוך-תאיות אחרות ומפעילי שיתוף פעולה, וויסות רמת התעתיק של MITF הוא אסטרטגיה מבטיחה לחקירת מרכיבים בריאים להלבנת עור מכיוון שתפקוד ההישרדות של MITF נשמר וניצול [1,38,40]. ואכן, כאשר חקרנו שעתוק MITF המושרה על ידי FSK, נמצא כי ל-MITF mRNA יש עקומת שיא תגובה משלו עבור מלנוגנזה והישרדות תאית עבור הומאוסטזיס תאי. הפונקציות הביולוגיות שלמלנוציטיםנראה היה מווסת באופן מהותי על ידי אותות משוב אחרים במלנוציטים אנושיים. יתרה מכך, ל-carvedilol יש סיכון נמוך יותר לתופעות לוואי של היפופיגמנטציה מכיוון שהוא מחליש את פעילות ה-tyrosinase הסלולרית לאורך זמן, ולא באופן פתאומי.

קטכולאמינים כוללים דופמין, אפינפרין ונוראפינפרין והם מסונתזים מטירוזין תזונתיים על ידי פעולת אנזימים [42]. הביוסינתזה והפירוק של קטכולאמינים מתרחשים במגוון רחב של תאים, כולל נוירונים של עצבים סימפטיים והמוח, תאים אדרנו-מדולריים, תאי אנדותל, נויטרופילים ותאים מונו-גרעיניים [43-45]. בעור האדם, סינתזה של קטכולאמינים מתרחשת בקרטינוציטים. לעומת זאת, מלנוציטים מבטאים גם mRNA ואנזימים לסינתזה אוטוקרינית של נוראפינפרין אך לא אפינפרין [7,42]. באדםמלנוציטים, -1-AR עשוי להיות חשוב בתגובה לנוראפינפרין, אבלסינתזת מלניןמושפע גם מ-2-ARsignaling פונקציונלי [7,8]. מעניין לציין שחולים עם ויטיליגו גדלו בצפיפות 2-AR בקרטינוציטים [46]. רמות מוגברות של נוראדרנלין נמצאות בשתן ובפלזמה של חולים עם ויטיליגו שאינו מקטע, מה שמרמז שחילוף החומרים של קטכולמין עשוי להיות קשור להתפתחות והתקדמות של ויטיליגו [47]. יתרה מכך, בנוסף לנוירוטרנסמיטורים של מתח קלאסי, מלנוציטים מייצרים נוירופפטידים והורמונים, כגון גורם משחרר קורטיקוטרופין ופרואופיומלנוקורטין. ייצור זה מעורר על ידי UVR וחומרים אחרים הפועלים בתוך המערכת הנוירואנדוקרינית של העור [48]. לכן, פעולת הקטכולאמינים והתפקוד המלנוציטי קשורות קשר הדוק במגוון מסלולים מורכבים. יתר על כן, קרוודילול עלול להפריע לתגובות הכימיות במסלול המלנוגני ויש להמשיך ולחקור אפשרות זו. ל-carvedilol עשוי להיות יתרונות שכן יש לו השפעות אנטי-דלקתיות בו-זמנית, שכן רוב ההפרעות ההיפר-פיגמנטריות הן PIH קלינית או תת-קלינית בחולים כהי עור. מכיוון שחדירתו של קרוודילול דרך העור נחקרה גם במבחנה וגם בחוץ, ניתן לפתח קרוודילול כחומר מקומיהַלבָּנָהסוכן בעתיד [49–51].

מתן סיסטמי של קרוודילול עלול לגרום לברדיקרדיה, סחרחורת, יתר לחץ דם, כאבי ראש וסחרחורת. המריחה המקומית של קרוודילול אינה גורמת בדרך כלל לתסמינים מערכתיים; עם זאת, עלינו לשים לב לתסמינים אלו כאשר אנו מיישמים אותו על חולים עם מחסומי עור פגומים, כגון אלו עם אטופיק דרמטיטיס. יתר על כן, אקזמה, גרד והתפרצות lichenoid מדווחים במקרים נדירים בעת נטילת קרוודילול. תופעות לוואי דרמטולוגיות אלו כמו גם מגע דרמטיטיס צריכות להילקח בחשבון בעת ​​מריחת קרוודילול כתרופה מקומיתהַלבָּנָהסוֹכֵן.

לסיכום, הראינו כי קרוודילול הפחית ביעילות את המלנוגנזה בבני אדםמלנוציטיםועור אנושי ex vivo על ידי עיכוב מסלול cAMP/CREB/MITF, מה שמצביע על השימוש הפוטנציאלי שלו כחומר הלבנה יעיל. בדיקה נוספת של המעורבות התפקודית של הרצפטור האדרנרגי על ידי קרוודילול במלנוציטים אנושיים צריכה להופיע.

4. חומרים ושיטות

4.1. חומרים

Carvedilol, 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA), כולרה טוקסין (CT) ו-12-Otetradecanoylphorbol-13-אצטט (TPA) נרכשו מ-Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, ארה"ב). Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ו-Dulbecco's phosphate-buffer saline נרכשו מ-WelGENE (Daegu, קוריאה). סרום בקר עוברי (FBS), אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיק, וטריפסין-EDTA נרכשו מ-Gibco (Grand Island, NY, ארה"ב). בינוני 254 (CascadeBiologics, פורטלנד, OR, ארה"ב) ו-FSK ([3R-(3 ,4a ,5 ,6 ,6a ,10 ,10a ,10b )]-5-(אצטילוקסי)-3-אתנילדודקהידרו{ {24}},10,10b-trihydroxy-3,4a,7,7,10a-pentamethyl-1H-naphtho[2,1-b]pyran-1-one ) נרכשו מ-Tocris Bioscience (בריסטול, בריטניה).

4.2. קווי תאים ותרבות תאים

NHMs ראשוני שהושג מ-Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב) נשמרו ב-Medium 254 (Thermo Fisher, Waltham, MA, ארה"ב) בתוספת תוסף גידול מלנוציטים אנושיים (תרמו פישר). תאי Mel-ab, קו תאי מלנוציטים שהונצח באופן ספונטני, התקבלו מבנק התאים הקוריאני (KCLB, סיאול, קוריאה) ונשמרו ב-DMEM בתוספת של 10 אחוז FBS, פניצילין-סטרפטומיצין, 100 ננומטר TPA ​​ו-1 ננומטר. CT. כל התאים נשמרו באופן שגרתי ב-37 ◦C בסביבה לחה של 5 אחוז CO2.

4.3. נוגדנים ו-Western Blots

התאים נשטפו פעם אחת עם PBS קר והוסרו במאגר תמוגה של חלבון (1 אחוז SDS ב-10 mMTris ו-5 mM EDTA, pH 7.4), ולאחר מכן דגירה ב-98 ◦C למשך 10 דקות. דגימות החלבון הופרדו על ידי אלקטרופורזה של ג'ל SDS-polyacrylamide של 8 אחוזים, נסגרו על גבי ממברנות ניטרוצלולוזה (GE Healthcare Life Sciences, שיקגו, IL, ארה"ב), ולאחר מכן נחסמו עם תמיסת מלח מבוקרת Tris המכילה 0.5 אחוז Tween 20 ו-5 אחוז BSA, ו נתון לאימונובלוטינג. נוגדני Tyrosinase ו-TRP-1 נרכשו מסנטה קרוז ביוטכנולוגיה (דאלאס, טקסס, ארה"ב), ו-MITF נרכש מ-Abcam (קיימברידג', בריטניה). -טובולין (Gentex, הולנד, MI, ארה"ב) שימש כבקרת טעינה פנימית.

4.4. תוכן מלנין

ההשפעה הציטוטוקסית של קרוודילול הוערכה באמצעות ערכת Ez-Cytox Cell Viability Assay (Dogen-Bio Co., Ltd., Seoul, קוריאה) בהתאם להוראות היצרן. תאי Mel-Ab ו-NHMs נזרעו בצלחות עם שש בארות בצפיפות של 6 × 105 ו-3 × 105 תאים/באר, בהתאמה. תאים טופלו ב-carvedilol, כפי שמוצג באיורים, במשך 3 או 5 ימים (ד). לפני מדידת תכולת המלנין, התאים נצפו תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה וצולמו (אולימפוס, טוקיו, יפן). התאים הומסו ב-550 µL של 1 N NaOH ב-100 ◦C למשך 30 דקות ועברו צנטריפוגה ב-13,{16}} סל"ד למשך 5 דקות. הספיגה של הסופרנטנטים נמדדה ב-405 ננומטר על ידי קורא מיקרו-לוחיות. תכולת המלנין התוך תאית הוצגה כאחוז ביחס לבקרת התאים הלא מטופלים. ארבוטין (100 מ"ג/מ"ל) שימש כביקורת חיובית.

4.5. פעילות טירוזינאז סלולרית

פעילות הטירוזינאז הוערכה על ידי מדידת קצב היווצרות הדופאכרום של L-DOPA. לאחר הדגירה עם קרוודילול, התאים נשטפו ב-PBS קר כקרח והוסרו במאגר תמוגה של טירוזינאז (חיץ פוספט, pH 6.8, המכיל 1 אחוז Triton X{ {5}}) עם מחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים. הליסאטים הובהרו על ידי צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד ב-4 ◦C למשך 10 דקות. לאחר כימת רמות החלבון של הליזאט והתאמת ריכוזי החלבון עם חיץ תמוגה, 90 μL של סופרנטנט מעורבב עם 10 μL של 10 mM L-DOPA במאגר תמוגה טירוזינאז הודגרה בטמפרטורה של 37 ◦C. ספיגת הטירוזינאז התאית נמדדה על ידי קריאת הפעילות של טירוזינאז. 475 ננומטר באמצעות microplatereader כל 10 דקות למשך שעה אחת לפחות. ארבוטין (100 מ"ג/מ"ל) שימש כחומר בקרה חיובי.

הרבה cistanches

4.6. ניתוח אימונוהיסטוכימי

רקמות עור אנושיות משובצות בפרפין נחתכו למקטעים בעובי 6-מיקרומטר והוצבעו עם Melan-A (נובוקסטר, ניוקאסל, בריטניה), ערכות פונטנה-מאסון (מעבדות מזהה, לונדון, ON, קנדה) ו-HMB45 (סנטה קלרה) , CA, ארה"ב), לפי הוראות היצרן. אינדקס המלנין נקבע על ידי מדידת אחוז השטח המוכתם לשטח הרקמה הכולל באמצעות תוכנת ImageJ 1.52a (המכונים הלאומיים לבריאות, Bethesda, MD, ארה"ב).

4.7. ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM), ומובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי מבחן t של סטודנט לא מזווג באמצעות תוכנת GraphPad Prism5 (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). במחקר זה, p < 0.05,="" p="">< 0.01,="" ו-p="">< 0.001="" נחשבו="" למובהקים="" סטטיסטית="" ומיוצגים="" על="" ידי="" *,="" **="" ו-***,="">

הפניות

1. גילברו, JM; Olsson, MJ המלנוגנזה והמנגנונים של חומרי הבהרת עור - גישות קיימות וחדשות. Int. ג'יי קוסמט. Sci. 2011, 33, 210–221. [CrossRef] [PubMed]

2. לי, YJ; שין, ח"י; לא, TK; צ'וי, ק"ח; Chang, SE Treatment of Melasma and Post-InflammatoryHyperpigmentation by a Picosecond 755-nm Alexandrite Laser בחולים אסייתיים. אן. דרמטול. 2017, 29,779–781. [CrossRef] [PubMed]

3. לי, YJ; פארק, JH; לי, DY; Lee, JH רכשה דיספיגמנטציה דו-צדדית בפנים ובצוואר: גישות מתאימות קלינית. J. Korean Med. Sci. 2016, 31, 2042–2050. [CrossRef] [PubMed]

4. Kang, HJ; Na, JI; לי, JH; Roh, MR; קו, JY; Chang, SE היפרפיגמנטציה פוסט-דלקתית הקשורה לטיפול ב-lentigines סולאריות באמצעות Q-Switched 532-nm Nd: YAG laser: A multicenter survey.J. דרמטולוג. טיפול. 2017, 28, 447–451. [CrossRef] [PubMed]

5. קאטו, ה.; עראקי, ג'; אטו, ה.; דוי, ק.; חיראי, ר.; קונו, ס.; היגאשינו, ט.; Yoshimura, K. מחקר מבוקר פרוספקטיבי-אנדומי של חומצה טרנקסמית דרך הפה למניעת היפרפיגמנטציה פוסט-דלקתית לאחר לייזר אודם עם Q-switch. דרמטול. Surg. 2011, 37, 605–610. [CrossRef] [PubMed]

6. טיילור, CR; אנדרסון, RR טיפול לא יעיל במלזמה עקשן והיפרפיגמנטציה פוסט-דלקתית על ידי לייזר אודם עם Q-switched. ג'יי דרמטול. Surg. אונקול. 1994, 20, 592–597. [CrossRef]

7. גילברו, JM; Marles, LK; Hibberts, NA; Schallreuter, KU ביו-סינתזה של קטכולמין אוטוקרינית ואות ה-thebeta-adrenoceptor מקדמים פיגמנטציה במלנוציטים אפידרמיס אנושיים. J. Investig. Dermatol.2004, 123, 346–353. [CrossRef]

8. Schallreuter, KU; קורנר, ג; Pittelkow, MR; סוונסון, NN; Gardner, ML האינדוקציה של מערכת התמרת האותות של-1-אדרנוצפטורים על גבי מלנוציטים אנושיים. Exp. דרמטול. 1996, 5, 20–23. [CrossRef]

9. סיוואמני, ר"ק; שי, ב.; Griffiths, E.; Vu, SM; לב-טוב, ח"א; דאהל, ש.; צ'יגברו, מ.; לה, TD; Mashburn, C.; Peavy, TR; et al. פציעה חריפה משנה את מסלול האיתות האדרנרגי הבטא2- ואת המסלולים הסינתטיים של קטכולמין בקרטינוציטים. J. Investig. דרמטול. 2014, 134, 2258–2266. [CrossRef]

10. אמרי, AC קולטני קטכולמין: אבות טיפוס לגילוי תרופות מבוסס GPCR. עו"ד פרמקול. 2013, 68,335–356.

11. Do Vale, GT; Ceron, CS; Gonzaga, NA; Simplicio, JA; Padovan, JC שלושה דורות של חוסמי בטא: היסטוריה, הבדלי מעמדות וישימות קלינית. Curr. יתר לחץ דם. Rev. 2019, 15, 22–31. [PubMed]

12. מקטאוויש, ד'; קמפולי-ריצ'רדס, ד'; סורקין, EM Carvedilol: סקירה של התכונות הפרמקודינמיות והפרמקוקינטיות שלו, והיעילות הטיפולית. סמים 1993, 45, 232–258. [CrossRef] [PubMed]

13. הסו, CC; Lee, JY הסמקה בולטת בפנים ואריתמה מתמשכת של רוזציאה טופלה ביעילות על ידי קרוודילול, חוסם בטא אדרנרגי לא סלקטיבי. ריבה. אקד. דרמטול. 2012, 67, 491–493. [CrossRef][PubMed]

14. Pietschke, K.; Schaller, M. ניהול ארוך טווח של שטיפת פנים ברורה ואדמית מתמשכת של רוזציאה על ידי טיפול ב-carvedilol. ג'יי דרמטולוג. טיפול. 2018, 29, 310–313. [CrossRef] [PubMed]

15. צ'אנג, א.; יונג, ש.; תאקר, א.; Huang, KM; ליו, מ.מ; Kanassatega, RS; פרסה, ג; Orlando, R.; Jackson, EK; אנדרסן, BT; et al. מניעת סרטן העור על ידי חוסם הבטא קרוודילול. סרטןPrev. מילון 2015, 8, 27–36. [CrossRef] [PubMed]

16. חן, מ.; ליאנג, ס.; שהיד, א.; אנדרסן, BT; Huang, Y. חוסם הבטא קרוודילול מנע נזקים בתיווך אולטרה סגול של תאי אפידרמיס מובנים ועור משוחזר תלת מימדי. Int. J.Mol. Sci. 2020, 21, 798. [CrossRef] [PubMed]

17. הואנג, ק"מ; ליאנג, ס.; יונג, ש.; אויימהונלן, ע.; קליבלנד, KH; פרסה, ג; אורלנדו, ר.; Meyskens, FL, Jr.;Andresen, BT; Huang, Y. Carvedilol מיושם מקומי מחליש קרצינוגנזה של העור כתוצאה מקרינה אולטרה סגולה. סרטן הקודם מילון 2017, 10, 598–606. [CrossRef]

18. ברנר, מ.; שמיעה, VJ תפקיד ההגנה של המלנין מפני נזקי UV בעור אנושי. Photochem.Photobiol. 2008, 84, 539–549.

19. קליבלנד, KH; ליאנג, ס.; צ'אנג, א.; Huang, KM; חן, ש; גואו, ל.; הואנג, י.; Andresen, BT Carvedilolin מונע היווצרות JB6 P פלוס בתיווך EGF באמצעות מנגנון בלתי תלוי באדרנורצפטורים. PLoS ONE 2019, 14, e0217038. [CrossRef]

20. דזונג, ג.; ז'ונגבינג, מ.; Qinye, F.; Zhigang, Y. Carvedilol מדכא הגירה ופלישה של תאי שד ממאירים על ידי השבתת Src הכוללת מסלול איתות cAMP/PKA ו-PKCdelta. J. Cancer Res. Ther.2014, 10, 998–1003.

21. רזפקה, ז.; בוסמן, ע.; בברוק, א.; Wrzesniok, D. מטירוזין למלנין: מסלולי איתות וגורמים המסדירים את המלנוגנזה. Postepy Hig. Med. דוסו. מקוון 2016, 70, 695–708. [CrossRef]

22. קים, י.; צ'ו, JY; אה, SW; קאנג, מ.; לי, SE; יונג, ע.; פארק, י"ש; Lee, J. Globular adiponectin פועל כאות מלנוגני במלנוציטים אפידרמיס אנושיים. בר. ג'יי דרמטול. 2018, 179, 689–701. [CrossRef][PubMed]

23. סלומינסקי, א.; טובין, DJ; שיבהרה, ש.; Wortsman, J. Melanin פיגמנטציה בעור היונקים והוויסות ההורמונלי שלו. פיזיול. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [PubMed]

24. סלומינסקי, א.; זמייבסקי, מ.א.; Pawelek, J. L-tyrosine ו-L-dihydroxyphenylalanine כמווסתים דמויי הורמונים של פונקציות מלנוציטים. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

25. Howe, J.; קוסטנטינו, ר.; Slominski, A. על המנגנון המשוער של אינדוקציה וויסות המלנוגנזה על ידי L-tyrosine. Acta Derm Venereol. 1991, 71, 150–152.

26. D'Mello, SA; Finlay, GJ; באגולי, לפני הספירה; Askarian-Amiri, ME נתיבי איתות במלנוגנזה. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef]

27. יונג, JA; קים, BJ; קים, MS; אתה, HJ; Yoon, ES; Dhong, ES; פארק, ש.ש; Kim, DW אפקט מגן של בוטולינום טוקסין נגד פיגמנטציה של עור הנגרמת על-ידי אולטרה סגול. פלסט. Reconstr. Surg. 2019, 144, 347–356.[CrossRef]

28. ג'ונג, י.מ; אה, WK; טראן, TL; קים, WK; סונג, ש; ביי, ק.; לי, ש; Sung, JH Aglycone of Rh4inhibits synthese melanin in melanin cells B16: Possible involvement of the protein kinase A pathway.Biosci. ביוטכנולוגיה. Biochem. 2013, 77, 119–125. [CrossRef]

29. קים, י"ח; קים, ד.; הונג, ארה"ב; קים, JH; יו, ה.; קים, ג'; קים, I.; קאנג, SW; Chang, SE; Song, Y.Therapeutic Potential of Rottlerin for Skin Hyperpigmentary Disorders by Inhibition the TranscriptionalActivity of CREB-Regulated Transcription Coactivators. J. Investig. דרמטול. 2019, 139, 2359–2367.e2.[CrossRef]

30. דאס, א.; גוש, א.; Kumar, P. לוקודרמה כימית עקב הידרוקינון: תופעה יוצאת דופן. J.Dermatol ההודי. Venereol. Leprol. 2019, 85, 567. [CrossRef]

31. ג'ו, ט.; Hantash, BM Hydroquinone-induced depigmentation: דוח מקרה וסקירה של הספרות. Dermatitis 2014, 25, e1–e5. [CrossRef]

32. קרסי, פ.; סטיבנסון, סי ג'יי ויטיליגו וחשיפה תעסוקתית להידרוקינון משירות מכונות צילום עצמי. צור קשר עם דרמט. 1981, 7, 285–287. [CrossRef] [PubMed]

33. סאסאקי, מ.; קונדו, מ.; סאטו, ק.; אומדה, מ.; קוואבאטה, ק.; טקאהאשי, י.; סוזוקי, ט.; Matsunaga, K.;Inoue, S. Rhododendron, תרכובת פנולית הגורמת לדה-פיגמנטציה, מפעילה ציטוטוקסיות של מלנוציטים באמצעות מנגנון תלוי טירוזינאז. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 754–763. [CrossRef] [PubMed]

34. יושיקאווה, מ.; סומיקאווה, י.; הידא, ט.; קמיה, ט; קאסה, ק.; אישי-אוסאי, י.; קאטו, ג'; קאן, י.; קמיה, ש.;סאטו, י.; et al. ניתוח קליני ואפידמיולוגי ב-149 מקרים של לויקודרמה הנגרמת על ידי רודודנדרון. דרמטול. 2017, 44, 582–587. [CrossRef] [PubMed]

35. האריס, JE ויטיליגו המושרה על ידי כימיקלים. דרמטול. קלינ. 2017, 35, 151–161. [CrossRef] [PubMed]

36. לי-שא, ג.; יי-ה, ג; נא-דן, ז; טנג, ז; Yue-Chun, L. השפעות של טיפול ב-carvedilol על ביטוי חלבון קושר אלמנטים בתגובת cAMP לבבית וזרחון ב-coxsackievirus B3-חריף המושרה בדלקת שריר הלב. BMC Cardiovasc. אי-סורד. 2013, 13, 100. [CrossRef] [PubMed]

37. ג'אנג, פ.; פולימורפיזמים של Steinberg, SF S49G ו-R389G של קולטן בטא(1)-אדרנרגי השפעת איתות דרך מסלולי cAMP-PKA ו-ERK. פיזיול. גנום. 2013, 45, 1186–1192. [CrossRef]

38. לי, AY; Noh, M. הרגולציה של מלנוגנזה אפידרמיס באמצעות מסלולי איתות cAMP ו/או PKC: תובנות לפיתוח תרופות היפופיגמנטיות. קֶשֶׁת. פארם. מילון 2013, 36, 792–801. [CrossRef]

39. גרסיה-בורון, ג'יי.סי; עבד אל מאלכ, ז; Jimenez-Cervantes, C. MC1R, מסלול ה-CAMP והתגובה ל-UV סולארי: הרחבת האופק מעבר לפיגמנטציה. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 699–720. [CrossRef]

40. לין, CB; Babiarz, L.; ליבל, פ.; רוידון פרייס, ע.; קיזוליס, מ.; Gendimenico, GJ; פישר, DE; Seiberg, M. Modulation of microphthalmia-associated transcription factor ביטוי גנים משנה פיגמנטציה של העור.J. תחקור. דרמטול. 2002, 119, 1330–1340. [CrossRef]

41. קים, JH; הונג, ארה"ב; קים, י"ה; יו, ה.; קאנג, SW; Chang, SE; Song, Y. JNK מדכא מלנוגנזה על ידי הפרעה לביטוי MITF-תלוי 3-בביטוי MITF-תלוי ב-CREB. Theranostics2020, 10, 4017–4029. [CrossRef] [PubMed]

42. ריוס, מ.; האבקר, ב.; סאסאוקה, ט.; אייזנהופר, ג.; טיאן, ה.; לנדיס, ש.; צ'יקראישי, ד'; Roffler-Tarlov, S.Catecholamine סינתזה מתווכת על ידי טירוזינאז בהיעדר טירוזין הידרוקסילאז. J. Neurosci. 1999,19, 3519–3526. [CrossRef] [PubMed]

43. קוסנטינו, מ.; מרינו, פ.; בומבלי, ר.; פרארי, מ.; לקיני, ש.; Frigo, G. סינתזה אנדוגנית של קטכולאמינים, חילוף חומרים, אחסון וספיגה בניוטרופילים אנושיים. Life Sci. 1999, 64, 975–981. [CrossRef]

44. מרינו, פ.; קוסנטינו, מ.; בומבלי, ר.; פרארי, מ.; לקיני, ש.; Frigo, G. סינתזה אנדוגנית של קטכולאמינים, אחסון חילוף חומרים וספיגה בתאים חד-גרעיניים בדם היקפיים אנושיים. Exp. המטול.1999, 27, 489–495. [CrossRef]

45. סורנטו, ד'; Santulli, G.; Del Giudice, C.; אנסטסיו, א.; טרימרקו, ב.; Iaccarino, G. תאי אנדותל מסוגלים לסנתז ולשחרר קטכולאמינים הן במבחנה והן במבחנה. יתר לחץ דם 2012, 60, 129-136. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Cucchi, ML; פראטיני, פ.; סנטאגוסטינו, ג'; פרדה, ש.; Orecchia, G. Catecholamines עלייה בשתן של ויטיליגו לא מקטעי במיוחד במהלך השלב הפעיל שלו. פיגמנט Cell Res. 2003, 16, 111–116. [CrossRef][PubMed]

47. זלצר, BA; Schallreuter, KU חקירה של מבנה האישיות בחולים עם ויטיליגו וקשר אפשרי עם מטבוליזם לקוי של קטכולמין. דרמטולוגיה 1995, 190, 109–115. [CrossRef][PubMed]

48. Slominski, A. פעילות נוירואנדוקרינית של המלנוציט. Exp. דרמטול. 2009, 18, 760–763. [CrossRef]

49. גנו, ר.; וישנו, י"ו; קישן, ו.; Rao, YM חדירה במבחנה של קרוודילול דרך עור חזיר: השפעת כלי רכב ומשפרי חדירה. PDA J. Pharm. Sci. טכנול. 2008, 62, 256–263.

50. כשירסגר, ש"י; בהלקר, MR; Mohapatra, SK פיתוח והערכה של מערכת אספקת תרופות טרנסדרמלית עמוסה ב-carvedilol: מחקר אפיון חוץ-גופני ו-in vivo. Drug Dev. אינד פארם. 2012,38, 1530–1537. [CrossRef]

51. טנוואר, י"ש; Chauhan, CS; Sharma, A. פיתוח והערכה של קרוודילול מדבקות טרנסדרמליות.Acta Pharm. 2007, 57, 151–159. [CrossRef] [PubMed]