PART1 A Cistanches Herba Fraction/𝛽-Sitosterol גורם להשראת חיזור רגיש של ניתוק מיטוכונדריאלי והפעלה של חלבון תלוי-אדנוזין מונופוספט תלוי-אדנוזין קינאז/רצפטור מופעל פרוקסיזום 𝛾 Coactivator{5} MyoPosphate{5} אפקט הפחתה

Hoi Shan Wong, Jihang Chen, Pou Kuan Leong, Hoi Yan Leung, Wing Man Chan, ו-Kam Ming Ko

החטיבה למדעי החיים, אוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה, קאולון, הונג קונג

Correspondence should be addressed to Kam Ming Ko; bcrko@ust.hk

התקבל ב-29 באוגוסט 2014; התקבל ב-14 בינואר 2015 עורך אקדמי: Man Li זכויות יוצרים © 2015

Hoi Shan Wong et al. זהו מאמר בגישה פתוחה המופץ תחת רישיון Creative Commons Attribution, המאפשר שימוש, הפצה ושכפול ללא הגבלה בכל מדיום, בתנאי שהיצירה המקורית מצוטטת כהלכה. מחקרים קודמים הוכיחו כי HCF1, חלק מטוהר למחצה שלCistanches Herba, גורם להפחתה במשקל בעכברים המוזנים בדיאטה רגילה ועתירת שומן. הפחתת המשקל הייתה קשורה באינדוקציה של ניתוק מיטוכונדריאלי ושינויים בפעילות האנזים המטבוליים בשרירי השלד של העכבר. כדי לחקור עוד יותר את המנגנון הביוכימי העומד בבסיס הפחתה במשקל המושרה על ידי HCF1-, נבדקה ההשפעה של HCF1 והמרכיב הפעיל שלו, 𝛽-sitosterol (BSS), על myotubes C2C12. דגירה עם HCF1/BSS גרמה לעלייה חולפת בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי (MMP), אולי על ידי נוזל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה. העלייה ב-MMP הייתה במקביל לעלייה בייצור מיני חמצן תגובתיים במיטוכונדריה (ROS). ROS מיטוכונדריאלי, בתורו, עורר אינדוקציה רגישה לחיזור של ניתוק מיטוכונדריאלי על ידי ניתוק חלבון 3 (UCP3). ניתוח ביוכימי הצביע על כך ש-HCF1 מסוגל להפעיל מסלול קו-פעיל-1 של פרוטאין קינאז/פרוליפרטור-פרוליפרטור-פרוליפרטור תלוי אדנוזין, ובכך הגביר את הביטוי של ציטוכרום c אוקסידאז ו-UCP3. מחקרים בבעלי חיים באמצעות מצמד מיטוכונדריאלי אישרו גם את התפקיד של ניתוק מיטוכונדריאלי בהפחתת המשקל המושרה1- של HCF. לסיכום, HCF1/BSS גורם להשראת חיזור רגישה של ניתוק מיטוכונדריאלי והפעלה של AMPK/PGC-1 ב-C2C12 myotubes, וכתוצאה מכך הפחתות במשקל הגוף ובשומן על ידי צריכת אנרגיה מוגברת.

למידע נוסף אנא צור קשר:Joanna.jia@wecistanche.com

ל- Cistanche deserticola השפעות רבות, לחץ כאן כדי לדעת יותר

1. הקדמה

השמנת יתר, המוגדרת כהצטברות חריגה של שומן בגוף, התגלתה כאיום על בריאות הציבור. ללא קשר למצבים בריאים מטבולית או לקויה מטבולית, נמצא כי השמנת יתר קשורה לסיכון מוגבר למחלות נלוות ולתמותה [1]. השמנת יתר מרכזית, חריגות בפרופילי כולסטרול ועליות ברמות הטריגליצרידים בפלזמה, כולם מאפיינים נפוצים של אנשים שמנים, תורמים לשכיחות הגבוהה של סוכרת סוג 2, מחלות לב וכלי דם, מוות לא קרדיווסקולרי וסרטן הקשור להשמנה בקרב אנשים שמנים. 2]. לכן, ירידה במשקל הגוף והשומן נחשבה כמפתח למניעת השלכות בריאותיות הקשורות להשמנה. ניהול ההשמנה שם דגש בעיקר על הקמת מאזן אנרגטי מיטבי על ידי הגדלת ההוצאה האנרגטית ו/או הפחתת צריכת האנרגיה. שינויים באורח החיים, כולל עלייה בפעילות גופנית ופיתוח דפוסי אכילה בריאים, נחשבים בדרך כלל לגישות בטוחות לגרימת ירידה במשקל. עם זאת, גישות כאלה נמצאו בדרך כלל כלא יעילות Hindawi Publishing Corporation Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume 2015, Article ID 142059, 12 pages http://dx.doi.org/10.1155/2015/1420592 Evidence-Based Complementary רפואה אלטרנטיבית להגדלת הוצאת האנרגיה או הפחתת צריכת האנרגיה [3]. לכן, אסטרטגיות המבוססות על שימוש בחומרים תרופתיים נמצאים כעת בחקירה פעילה. בהקשר זה, הממצא הקודם שלנו הוכיח כי HCF1, חלק מטוהר למחצה שלCistanchesהרבה(צמח שלם מיובש שלCistanche deserticolaYC Ma המאופיין כצמח ממריץ "יאנג" ברפואה הסינית המסורתית), הוכח כיעיל במניעת השמנה הנגרמת על ידי דיאטה והפרעות מטבוליות הקשורות אליה [4]. מתן פומי של HCF1 הביא להפחתה במשקל בעכברים שניזונו בדיאטה רגילה (ND-) ועתירת שומן (HFD-), אולי על ידי אינדוקציה של ניתוק מיטוכונדריאלי בשרירי השלד, וכתוצאה מכך עלייה בהוצאת האנרגיה [4 ]. עם זאת, המנגנון העומד בבסיס ניתוק המיטוכונדריה המושרה על ידי HCF{10}}(ומכאן הפחתת המשקל) נותר לא ברור. ניתוק מיטוכונדריאלי מפזר שיפועים פרוטונים על ידי החדרת מסלול מוליכות פרוטונים חלופי על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית (IMM), וכתוצאה מכך ירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ויצירת ATP המיטוכונדריאלי. מחזור חסר תועלת זה של הובלת פרוטונים צורך שיעור גבוה של אנרגיה מטבולית ברקמות שונות ואחראי לחלק ניכר מההוצאה האנרגטית היומית, עם עלייה שלאחר מכן בשימוש במולקולות דלק (כגון חומצות שומן), ובכך גורם לירידה במשקל. הפחתה בשומן [5, 6]. כדי לאשר את אפקט ניתוק המיטוכונדריאלי שנוצר על ידי HCF1, ההשפעות של HCF1 על ביטוי MMP ו-UCP3 נבדקו ב-C2C12 myotubes, שהם תאי שריר מובחנים שמקורם בשריר הירך של עכברי C3H. המטרה שלנו הייתה לחקור את המנגנון הביוכימי העומד בבסיס הפחתת המשקל שמעניק HCF1. 𝛽-סיטוסטרול (BSS), מרכיב פעיל של HCF1, נחקר גם הוא לשם השוואה. המעורבות האפשרית של ניתוק מיטוכונדריאלי בהפחתת משקל1-המושרה של HCF בעכברים שמנים שניזונו מ-HFD נחקרה עוד על ידי מתן משותף של HCF1 עם מצמד כימי, 6-ketocholestanol (kCh). חלבון קינאז תלוי אדנוזין מונופוספט (AMPK), קינאז סרין/תראונין-חלבון המבוטא בכל מקום, מהווה מרכז חשוב לבקרה על חילוף החומרים של האנרגיה התאית. עם ההפעלה, AMPK משלב אותות תוך/חוץ-תאיים ומעורר תגובות סלולריות באמצעות תיווך של מפלי איתות סלולריים שונים [7, 8]. AMPK מסוגל לווסת את חילוף החומרים התאי על ידי ויסות פעילות האנזים המטבולי באמצעות זרחון ישיר. AMPK מייצרת גם השפעות ארוכות טווח ברמת שעתוק באמצעות זרחון של הקולטן המופעל על ידי פרוקסיזום 𝛾coactivator-1 (PGC-1), מה שמוביל לשינויים אדפטיביים בביטוי הגנים הקשורים למטבוליזם האנרגיה ולתפקוד המיטוכונדריה [9, 10]. בהקשר זה, בדקנו גם את ההשפעה של HCF1/BSS על מסלול האיתות AMPK/PGC-1 ב-Myotubes C2C12.

cistancheהטבות דזרטיקה

2. חומרים ושיטות

2.1. מיצוי צמחי מרפא.

Cistanches Herba, הצמח השלם המיובש שלCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), נרכש מסוחר צמחי מרפא מקומי (Lee Hoong Kee). העשב אושר על ידי הספק ודגימת שובר (HKUST00301) הופקדה באגף למדעי החיים, אוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה (HKUST). אCistanchesתמצית הרבה הושגה על ידי מיצוי אתנול של חומר צמחי טחון על ידי חימום תחת ריפלוקס ב-78∘ C למשך 2 שעות, כפי שתואר קודם [11], כשהתשואה היא 14 אחוז (w/w). התמצית חולקה עוד יותר באמצעות כרומטוגרפיה של סיליקה ג'ל [12]. HCF1 הושג בתשואה של 1.14 אחוז (w/w). התמצית יובשה על ידי אידוי הממס בלחץ מופחת ב-50∘ C, והתמצית המיובשת אוחסנה ב-20∘ C לפני השימוש.

2.2. כימיקלים.

נוגדנים נגד 𝛽-אקטין, BSS (CAS 83-46- 5), קוקטייל מעכבי פרוטאז וקוקטייל מעכבי פוספטאז 3 נרכשו מסיגמא (סנט לואיס, MO). נוגדן אנטי-AMPK𝛼1/2, נוגדן אנטי-p-AMPK𝛼1/2, נוגדן אנטי PGC-1 (H-300), נוגדן אנטי-UCP3 (E-18), {{16} [4- (2-piperidine-1-yl-ethoxy)-phenyl)]-3-pyridin-4-yl-pyrrazolo[1,5-a ]-פירמידין (CC), ו-6-קטוכולסטנול (kCh) נרכשו מסנטה קרוז ביוטכנולוגיה (סנטה קרוז, קליפורניה, ארה"ב). נוגדן אנטי-COX נרכש מ-Cell Signaling (Danvers, MA). נוגדן Anti-lamin B1 נרכש מ- Abcam (Cambridge, MA). ריאגנט בדיקת Bio-Rad נרכש ממעבדות Bio-Rad (ריצ'מונד, קליפורניה, ארה"ב). כל שאר הכימיקלים נרכשו מ-Sigma (סנט לואיס, MO, ארה"ב).

2.3. תרבית תאים.

C2C12, תרבית מיובלסטים של שרירי השלד של עכבר C3H [13] מאוסף American Type Culture Collection (ATCC), סופקה בחביבות על ידי פרופסור Zhenguo Wu (החטיבה למדעי החיים, HKUST). שורת התאים תורבתה במדיום מסוג Eagle's שונה (DMEM) של Dulbecco (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY), בתוספת של 10 אחוז (v/v) סרום בקר עוברי (FBS), 100 IU/mL פניצילין ו-100 𝜇g / מ"ל ​​של סטרפטומיצין, ו-17 מ"ל NaHCO3. ההתמיינות של C2C12 myoblasts ל-C2C12 myotubes נגרמה על ידי החלפת מצע תרבות שלם עם מדיום בידול המכיל 2 אחוז (v/v) סרום סוס (HS) במקום 10 אחוז (v/v) FBS. תאים גודלו תחת אטמוספירה של 5 אחוז (v/v) CO2 באוויר ב-37 C.

Cistancheישאפקט ירידה במשקל

2.4. ניתוחים ביוכימיים ב-C2C12 Myotubes

2.4.1. MMP.

פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי נמדד באמצעות צבע קטיוני ניאון, 5,5 ,6,6 -tetrachloro- 1,1 ,3,3 -tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine jodide (JC- 1) [14]. תאים תורבו בצפיפות של 1.0 × 104 תאים ב96-צלחות מיקרוטיטר היטב. לאחר התקשרות יציבה, התאים נצבעו מראש ב-20 𝜇M JC-1 (מומסים במצע תרבות) ב-37∘ C למשך 10 דקות. לאחר הצביעה, התאים נשטפו פעמיים בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS), בתוספת של 0.1 אחוז אלבומין בסרום בקר (BSA). מדידת MMP התחילה על ידי הוספת מדיום המכיל HCF1/BSS. כמות ה-J-aggregate של מולקולות JC-1, שנוצרת בממברנה הפנימית של המיטוכונדריה בעלת פוטנציאל ממברנה גבוה, נקבעה על ידי ניטור הקרינה האדומה של JC-1 (Ex 485 nm/Em 580 nm) Evidence - רפואה משלימה ואלטרנטיבית מבוססת 3 בטמפרטורה של 37∘ C למשך שעה אחת. MMP נאמד על ידי הפחתת עוצמות הקרינה של דגימות ריקות (כלומר, המכילות מדיום בלבד) מעוצמות הקרינה של דגימות שנבדקו. ערכי ה-MMP של תאים שהודגרו ב-HCF1/BSS נורמלו עם ערכי הביקורת הלא-HCF1/BSS-מודגרים המתאימים והובאו כאחוז שליטה.

2.4.2. הפעלה של Adenosine Monophosphate-Dependent Protein Kinase (AMPK).

Myotubes C2C12 זרעו (1.5 × 105 תאים) ב6-צלחות מיקרוטיטר היטב. לאחר התקשרות יציבה, תאים הודגרו מראש עם מדיום המכיל HCF1/BSS למשך 8 שעות. לאחר מכן, התאים שהודגרו המוקדמים חולקו עם 300 𝜇L של חיץ תמוגה של סודיום דודציל סולפט (SDS-) (20 mM Tris-Cl, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 3 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1 אחוז (w/ v) Triton X- 100, 10 אחוז (w/v) גליצרול, 5 אחוז SDS, 1 mM dithiothreitol (DTT), קוקטייל מעכבי פרוטאז וקוקטייל מעכבי פוספטאז 3, pH 7.5). ה-lysate עבר צנטריפוגה נוספת ב-12000 ×g ב-4∘ C למשך 10 דקות כדי להסיר פסולת תאים. מידת ההפעלה של AMPK הוערכה מהיחס היחסי של זרחן-AMPK𝛼 (p-AMPK) ו-AMPK𝛼 על ידי ניתוח Western blot באמצעות נוגדן אנטי-p-AMPK𝛼1/2 ונוגדן אנטי-AMPK𝛼1/2 בעקבות ניתוח SDS-PAGE, עם ג'ל מפריד של 10 אחוז (v/v) אקרילאמיד. נטען תאי (20 𝜇g) ו- 𝛽- אקטין שימש כסמן התייחסות. רצועות החלבון הצבועות במערכת החיסון נותחו על ידי דנסיטומטריה (Quantiscan, Biosoft), והכמויות (יחידות שרירותיות) של p-AMPK𝛼 ו-AMPK𝛼 נורמלו בהתייחס לרמת 𝛽-אקטין (יחידות שרירותיות) בדגימה.

2.4.3. PGC-1 טרנסלוקציה גרעינית.

Myotubes C2C12 תורבו בצפיפות של 2.0×106 תאים בפלטות תרבית של 100 מ"מ. לאחר 8 שעות תאים קדם-דגירה של HCF1/BSS עברו טריפסין והודגרו עם 1 מ"ל חיץ היפוטוני קר כקרח (10 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ KCl ו-1.5 מ"מ MgCl2, pH 7.9) ב-4∘C למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, תאים נאספו על ידי צנטריפוגה ב-500 ×g ב-4∘ C למשך 10 דקות. התאים שנאספו הושעו מחדש במאגר היפוטוני של 300 𝜇L, בתוספת של 0.5 מ"מ DTT, 0.1 אחוז (w/v) נוניל פנוקסי-פוליאתוקסילתנול (NP-40), וקוקטייל מעכבי פרוטאז, כדי להקל על מיצוי חלבונים ציטוסוליים מסיסים . הליזאט שנוצר היה בצנטריפוגה ב-12000 ×g ב-4∘ C למשך דקה אחת כדי להניב שברים ציטוסוליים (סופרנטנט) וגרעיניים (גלולה). הבידוד של חלבונים גרעיניים הושג על ידי דגירה של הכדור עם חיץ היפרטוני קר כקרח של 25 𝜇L (20 mM HEPES, 25 אחוז (w/v) גליצרול, 400 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDMTA, 0.2 mM EDM, 0,5. קוקטייל מעכבי פרוטאז, pH 7.9) ב-4∘ C למשך 30 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב-12000 ×g ב-4∘ C למשך 5 דקות. מידת הטרנסלוקציה הגרעינית של PGC-1 נאמדה על פי היחס היחסי של רמת ה-PGC-1 בשברים ציטוסוליים וגרעיניים באמצעות ניתוח Western blot בעקבות ניתוח SDS-PAGE, כמתואר לעיל. שני חלקים ציטוסוליים וגם חלקים גרעיניים (20 𝜇g) הועמסו, כאשר 𝛽-אקטין ולמין B1 שימשו כסמני ייחוס ציטוסוליים וגרעיניים, בהתאמה. הכמויות (יחידות שרירותיות) של PGC-1 נורמלו בהתייחס לרמות 𝛽- אקטין ולמין B1, בהתאמה, (יחידות שרירותיות) במדגם.

2.4.4. ניתוק מיטוכונדריאלי חלבון 3 (UCP3) וביטוי ציטוכרום c אוקסידאז (COX).

Myotubes C2C12 נזרעו (2.0 × 106 תאים) בצלחות תרבית של 100 מ"מ. לאחר התקשרות יציבה, תאים הודגרו מראש עם HCF1/BSS המכיל מדיום ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר הסרת המדיום המכיל HCF1/BSS, התאים עברו טריפסין וסודרו על ידי תוספת של חיץ SDS-lysis של 300 מ"ל. ליזאט התא עבר צנטריפוגה ב-12000 ×g ב-4∘ C למשך 10 דקות כדי להסיר פסולת תאים. רמות UCP3 ו-COX בסופרנטנט נקבעו על ידי ניתוח Western blot באמצעות נוגדן אנטי-UCP3 (E- 18) ונוגדן אנטי-COX בעקבות ניתוח SDS-PAGE כמתואר לעיל. נטען תאי (50 𝜇g) ו- 𝛽-אקטין שימש כסמן התייחסות. הכמויות (יחידות שרירותיות) של UCP3 ו-COX נורמלו בהתייחס לרמת 𝛽-אקטין (יחידות שרירותיות) במדגם.

2.5. טיפול בחיות.

עכברי ICR (8 שבועות; 30 עד 35 גרם לזכרים ו-25 עד 30 גרם לנקבות) נשמרו במחזור חושך/אור של 12 שעות בסביבה מבוקרת אוויר/לחות בערך 22∘ C ואפשרו מזון ומים באופן חופשי. במתקני טיפול בבעלי חיים וצמחים (APCF) באוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה (HKUST). כל הליכי הניסוי אושרו על ידי ועדת מחקר (HKUST) (מספר אישור פרוטוקול בעלי חיים 2013049; תאריך אישור: 25 בספטמבר 2013; משך הניסוי: 3 שנים).

2.6. פרוטוקול טיפול.

כדי לבחון את ההשפעה של 6-keto-cholestanol (kCh) על ירידה במשקל המושרה על ידי HCF1- בעכברים שניזונו מ-HFD, בעלי חיים חולקו אקראית ל-6 קבוצות, עם 10-15 עכברים בכל אחת: (1 ) בקרת תזונה רגילה (ND, 13 אחוז אנרגיה המופקת משומן, נרכשה מ- LabDiet, מוצר מספר 5010); (2) ND פלוס kCh (במינון יומי של 9 מ"ג/ק"ג); (3) HFD (60 אחוז אנרגיה המופקת משומן; נרכש מחברת Research Diet Inc., מוצר מספר D12492) בקרה; (4) HFD בתוספת HCF1 (במינון יומי של 45 מ"ג/ק"ג); (5) HFD בתוספת kCh; ו (6) HFD בתוספת HCF1 בתוספת kCh. הוכח כי HCF1, במינון יומי של 45 מ"ג/ק"ג, מייצר ירידה משמעותית במשקל בעכברים זכרים [4], בעוד ש-kCh, במינון יומי של 9 מ"ג/ק"ג, נמצא כמבטל את ה-HCF1- אפקט ניתוק המושרה במיטוכונדריה מבודדים משריר השלד של העכבר (לא מוצגים נתונים). בעלי חיים ניתנו תוך קיבה kCh, HCF1, או HCF1/kCh, 5 ימים בשבוע, במשך 8 שבועות (כלומר, עבור סך של 40 מנות). עכברי בקרה קיבלו את הרכב (שמן זית) בלבד. משקלי הגוף וצריכת המזון של העכברים נבדקו מדי שבוע במהלך הניסוי. השינויים במשקל הגוף כומתו על ידי חישוב השטח מתחת לעקומה (AUC) של גרף המתווה אחוז משקל גוף התחלתי מול זמן (שבוע 1 עד 8) ומבוטאים ביחידות שרירותיות. העכברים הוקרבו על ידי נקע בצוואר הרחם 24 שעות לאחר המינון האחרון (עם kCh, HCF1 או HCF1/kCh) לאחר צום לילה. דגימות של שריר gastrocnemius נכרתו לצורך מדידת הנשימה המיטוכונדריאלית. כריות שומן (גונדאלי, רטרופריטונאלי ומזנטרי) נותחו ונשקלו. היחס בין משקל כרית שומן מסוימת למשקל הגוף הוערך והובע כ"מדד כרית שומן".

Cistancheהוא עשב טבעי עם אפקט ירידה במשקל

2.7. ניתוח ביוכימי בעכברים

2.7.1. הכנות לדוגמא.

רקמות שריר gastrocnemius קצוצות עורבבו עם תמיסה של 10 מ"ל קולגנאז (0.075 אחוז (w/v)) במאגר (100 מ"מ KCl, 50 מ"מ MOPS, pH 7.2), והתערובות היו דגירה ב-4∘ C למשך 20 דקות. תערובות הרקמה המעוכלות עברו צנטריפוגה ב-600 × גרם ב-4∘ C למשך 20 דקות. הסופרנטנט הוסר; הרקמות המעוכלות עורבבו עם 20 מ"ל של חיץ הומוגניזציה קר כקרח (50 מ"מ סוכרוז, 200 מ"מ מניטול, 5 מ"מ KH2PO4, 1 מ"מ EGTA ו-5 מ"ל MOPS, pH 7.2) והומוגגו על קרח עם הומוגנית מזכוכית טפלון. ב-4000 סל"ד ל-25 עד 30 פעימות שלמות. לאחר מכן בוצעו צנטריפוגה של ההומוגנטים ב-600 × גרם בטמפרטורה של 4∘ C למשך 10 דקות, והניב חלק נטול גרעין (סופרנטנט). כדורי מיטוכונדריה הוכנו ממומגנים של שרירים על ידי צנטריפוגה ב-9200 × גרם ב-4∘ C למשך 30 דקות. שברי מיטוכונדריה הושגו על ידי השעיית הכדורים במאגר המכיל 125 מ"מ KCl, 10 מ"מ Tris-Base, 2 מ"מ KH2PO4, 0.5 מ"מ EGTA ו-20 מ"מ MOPS, pH 7.5 [15].

2.7.2. נשימה מיטוכונדריאלית.

קצבי הנשימה במיטוכונדריה שבודדו משריר השלד של העכבר נקבעו כמתואר על ידי וונג וקו [12]. בקצרה, הנשימה המיטוכונדריאלית נמדדה באופן פולארוגרפי באמצעות אלקטרודה מסוג Clark (Hansatech Instruments, Norfolk) ב-30 C. שברים מיטוכונדריאליים (1 מ"ג חלבון/מ"ל) הודגרו במאגר הנשימה (3{{17} } mM KCl, 6 mM MgCl2, 75 mM סוכרוז, 1 mM EDTA ו-20 mM KH2PO4, pH 7.0). נוספה תמיסת מצע המכילה 15 מ"מ נתרן פירובט ו-5 מ"מ נתרן מאלאט. לאחר שיווי משקל, הנשימה במצב 3 הופעלה על ידי הוספת ADP (ריכוז סופי 0.6 מ"מ). כאשר כל ה-ADP שנוסף ליצירת ATP, הוסף אוליגומיצין כדי לגרום לנשימה במצב 4. יחס בקרת הנשימה (RCR) הוערך על ידי חישוב היחס בין שיעורי הנשימה במצב 3 למצב 4 [16].

2.7.3. ביטוי UCP3 מיטוכונדריאלי בשריר השלד של העכבר.

רמות UCP3 של המיטוכונדריה הוערכו על ידי ניתוח Western blot באמצעות נוגדן אנטי-UCP3 (E-18) בעקבות ניתוח SDS PAGE של חלק המיטוכונדריאלי, באמצעות ג'ל מפריד של 10 אחוז אקרילאמיד. חלקי מיטוכונדריה מבודדים משריר שלד של עכבר (~60 𝜇g) יושמו על הג'ל וציטוכרום c אוקסידאז (COX) שימש כסמן התייחסות. רצועות החלבון הצבועות בחיסוני נותחו על ידי דנסיטומטריה והכמויות (יחידות שרירותיות) של UCP3 נורמלו בהתייחס לרמת COX (יחידות שרירותיות) בדגימה.

2.8. בדיקת חלבון.

ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות ערכת בדיקת חלבון Bio-Rad. מנה (10 𝜇L) של דגימת ליסט מיטוכונדריאלי/תאים דולל ב-40 𝜇L מים. לאחר מכן הוספה מנה (10 𝜇L) של דגימה מדוללת לבאר של צלחת מיקרוטיטר 96-בבאר, ולאחר מכן הוספה של 200 𝜇L של מגיב מבחני Bio-Rad מדולל (דילול פי 5-). התערובת הורתה לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ולאחר מכן נמדדה הספיגה של תערובת התגובה ב-570 ננומטר. ריכוז החלבון נקבע מעקומת כיול באמצעות אלבומין בסרום בקר (BSA) כסטנדרט.

2.9. ניתוח סטטיסטי.

כל הנתונים הובאו כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM), אלא אם צוין אחרת. הנתונים נותחו על ידי ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA חד כיווני), אלא אם צוין אחרת, והבדלים בין קבוצות זוהו באמצעות מבחן טווח Tukey, עם 𝑃<>

Cistancheיש למדברטיקולההשפעות רבות

3. תוצאות

3.1. השפעות של HCF1/BSS על MMP ב-C2C12 Myotubes.

דגירה של המנתק הכימי, קרבוניל ציאניד {{0}} (טריפלואורומתוקסי) פנילהידרזון (FCCP), בריכוז של 1 𝜇M, גרמה להפחתה תלוית זמן ב-MMP, כאשר מידת ההפחתה הייתה 29 אחוז ב- סוף המדידה (איורים 1 ו-2). לעומת זאת, HCF1 ו-BSS, בריכוזים של 30 ng/mL ו-10 𝜇M, העלו את ה-MMP ב-5 ו-4 אחוזים, בהתאמה, ב-10 הדקות הראשונות של הדגירה של HCF1/BSS (איורים 1 ו-2) . העליות הראשוניות שנגרמו על ידי HCF1/BSS היו ואחריו ירידה הדרגתית ב-MMP ל-95 ו-93 אחוזים, בהתאמה, מהערך ההתחלתי בהתאמה בסוף המדידה (60 דקות דגירת HCF1/BSS) (איורים 1 ו-2). השינויים המושרים על ידי HCF1/BSS ב-MMP אופיינו בשימוש במעכבים ספציפיים. רוטנון (0.1 ננומטר), מעכב קומפלקס I של המיטוכונדריה, וכולסטרול (0.3 𝜇M), משפר את קשיחות הממברנה, דיכאו את השינויים שנגרמו על ידי HCF1/BSS ב-MMP לאורך כל מהלך המדידה (איורים 1 ו-2). מצד שני, שילוב עם מעכב ספציפי של UCPs, GDP, מצמד כימי, 6-ketocholestanol (kCh), או נוגד חמצון, dimethyl thiourea (DMTU), הפחית את ההפחתה המושרה של HCF{{34} MMP בזמן מאוחר יותר של הדגירה של HCF1 (איור 1). GDP, kCh ו-DMTU גם הפחיתו את ההפחתה הנגרמת על ידי BSS ב-MMP במועד מאוחר יותר של דגירת BSS, כאשר ערך ה-MMP היה 110 אחוז, בהשוואה לבקרה מותאמת זמן (איור 2)

3.2. השפעת HCF1/BSS על הפעלת AMPK ב-C2C12 Myotubes.

ההשפעה של HCF1 על AMPK נבדקה על ידי מדידת היחס בין AMPK𝛼 מזורחן (p-AMPK𝛼) לבין סך AMPK𝛼 (AMPK𝛼), מה שמעיד על מידת ההפעלה של AMPK. דגירה עם HCF1, בריכוזים של 30 ו-100 ng/mL, יצרה עליות תלויות זמן בהפעלת AMPK, כאשר היקף העליות הללו היה 32 ו-43 אחוזים ב-8 שעות של הדגירה של HCF1, בהתאמה, בהשוואה לזמן המתאים- בקרה מותאמת (איור 3). במקביל ל-HCF1, דגירה קדם עם BSS (10 𝜇M) הגדילה באופן משמעותי את היקף ההפעלה של AMPK ב-25 אחוזים, בהשוואה לבקרה הבלתי דגירה (איור 5). הפעלת AMPK המושרה על ידי HCF1/BSS ב-Myotubes C2C12 בוטלה לחלוטין על ידי שילוב עם kCh (מפרק) או DMTU (איורים 4 ו-5, טבלאות 1 ו-2 של חומר משלים זמין באינטרנט

3.3. השפעת HCF1/BSS על טרנסלוקציה גרעינית של PGC-1 ב-C2C12 Myotubes.

ניתן למדוד את ההפעלה של PGC-1 בעקיפין לפי מידת הטרנסלוקציה הגרעינית של PGC-1. דגירה קדם עם HCF1 ו-BSS הגדילה משמעותית את טרנסלוקציית הגרעין של PGC-1 ב-25 ו-28 אחוזים, בהתאמה, כפי שמעידים על יחס גבוה בין PGC-1 בגרעין לציטופלזמה (איורים 6 ו-7). מעכב ספציפי של AMPK, 6-[4-(2-piperidine-1-yl-ethoxy)-phenyl)]-3-pyridin-4-ylpyrrazolo[ 1,5-a]-pyrimidine (CC), בריכוז של 10 𝜇M עיכב את העלייה הנגרמת על ידי HCF1/BSS בטרנסלוקציה הגרעינית של PGC-1 ב-156 ו-235 אחוזים, בהתאמה, ב-C2C12 myotubes ( טבלאות 1 ו-2). הטרנסלוקציה הגרעינית המושרה על ידי HCF1/BSS של PGC-1 נמנעה גם על ידי שילוב עם kCh או DMTU (איורים 6 ו-7, טבלאות 1 ו-2 של חומר משלים).

3.4. השפעת HCF1/BSS על ביטוי מיטוכונדריאלי UCP3 ו-Cytochrome c Oxidase (COX) ב-C2C12 Myotubes.

כדי לקבוע את המשמעות של הפעלה המושרה על ידי HCF1/BSS במסלול AMPK/PGC-1, ההשפעות של HCF1/BSS על ניתוק המיטוכונדריה והביוגנזה, כפי שהוערכה על ידי רמות של UCP3 ו-COX (אינדיקטור אמין למסה המיטוכונדריאלית בתאים), בהתאמה, נחקרו. דגירה קדם עם HCF1/BSS העלתה משמעותית את רמות ה-UCP3 וה-COX המיטוכונדריאליות, כאשר היקף העליות הללו הוא 37 ו-23 אחוזים (במיוטיובים מודגרים של HCF1-) (איור 8) ו-52 ו-24 אחוזים (במיוטיובים המודגרים על ידי BSS) ) (איור 9), בהתאמה, בהשוואה לביקורת הבלתי דגירה בהתאמה. העליות שנגרמו על ידי HCF1/BSS ברמות UCP3 ו-COX נמנעו לחלוטין על ידי שילוב של HCF1 עם kCh, DMTU או

CC (טבלאות 1 ו-2 של חומר משלים). יש לציין כי הריכוזים של kCh ו-CC בשימוש בניסוי זה הותאמו ל-20 ו-1 𝜇M, בהתאמה, כדי למנוע את ההשפעות הציטוטוקסיות של kCh ו-CC על myotubes C2C12 (תצפית שלא פורסמה).

3.5. תפקידו של ניתוק מיטוכונדריאלי ב-HCF1-הפחתת משקל המושרה בעכברים שמנים המושרים על ידי HFD.

התפקיד האפשרי של ניתוק מיטוכונדריאלי בהפחתת משקל המושרה על ידי HCF1- נבדק עוד על ידי שימוש במצמד הכימי, kCh (טבלה 3 של חומר משלים). HCF1 גרם לניתוק מיטוכונדריאלי בשריר השלד של עכברים, כפי שמעידה הפחתה ביחס השליטה בנשימה המיטוכונדריאלית (RCR) והעלייה בביטוי UCP3 של המיטוכונדריה, בעכברים שניזונו מ-ND וגם ב-HFD. kCh כשלעצמו (במינון יומי של 9 מ"ג/ק"ג) העלה משמעותית את ה-RCR המיטוכונדריאלי ב-23 אחוז בעכברים שניזונו מ-ND (אך לא בעכברים שניזונו ב-HFD). ניתוק המיטוכונדריה המושרה על ידי HCF1- בעכברים שניזונו ב-HFD, עוכב לחלוטין על ידי טיפול משותף ב-kCh. HCF1 יצר הפחתת משקל בעכברים שניזונו מ-ND ו-HFD. השפעה זו הייתה קשורה לדיכוי העלייה הנגרמת על ידי HFD באינדקס השומן הקרביים. בניגוד ל-HCF1, kCh לא יצרה השפעה ניתנת לזיהוי על עלייה במשקל בחיות ND ו-HFD במהלך 8-השבוע של הניסוי. הניהול המשותף של kCh עם HCF1 ביטל את ההשפעות המדכאות1-הנגרמות על ידי HFD על עלייה במשקל הגוף ובאינדקס השומן הקרביים בעכברים (טבלה 3 של חומר משלים).