חלק Ⅰ הבנה מטבולית של חוסר ויסות גנטי במיקרו-סביבה של הגידול של קרצינומה של תאים צלולים של הכליה

תַקצִיר

חוסר ויסות מטבולי הוא סימן היכר של סוגי סרטן כולל KIRC, הנגרם במיוחד על ידי שינויים בגנים המטבוליים. נכון לעכשיו, קיים חוסר קונצנזוס בין חתימות מטבוליות במיקרו-סביבת הגידול. במחקר זה, צפינו במתאמים המשמעותיים של גנים מטבוליים (DEmGs) המבוטאים בצורה דיפרנציאלית בין KIRC לבין הדגימות הרגילות הקשורות. בקצרה, אספנו קבוצות של גנים מטבוליים באמצעות נתוני RNA-seq של KIRC ורקמות נורמליות מ-TCGA, ולאחר מכן זיהוי DEmGs הקשורים ל-KIRC. לאחר מכן, חולים סווגו לשלושה אשכולות, ובאמצעות WGCNA, זיהינו גנים מטבוליים המעורבים בהישרדות בין אשכולות שונים.

יתר על כן, חקרנו פרמטרים של הישרדות ופרמטרים קליניים יחד עם הסתננות חיסונית לאשכולות. במקביל, בנינו ואימתנו מודל חיזוי המבוסס על DEmGs אלה. ניתוחים אלו גילו כי המטופלים בעלי ביטוי גבוה של DEmGs הראו הישרדות גרועה, בעוד שחדירה של תאים פחות חיסוניים הייתה קשורה לגרורות של KIRC. בסופו של דבר, זיהינו את NUDT1 כגן רכז מכיוון שהוא הראה ביטוי גבוה משמעותית בדגימות KIRC וכן קשור להישרדות ולפרוגנוזה של החולים. ניתוח נוסף חשף את התפקיד האונקוגני של NUDT1 בתאי 786-O ו-ACHN. לפיכך, אנו מסיקים כי NUDT1 יכול להיות סמן אבחנתי ופרוגנוסטי פוטנציאלי עבור KIRC.

מילות מפתח

חוסר ויסות מטבולי; גנים מטבוליים בעלי ביטוי דיפרנציאלי (DEmGs); שיעור הישרדות; NUDT1;יתרונות Cistanche.

לחץ כאן כדי לדעתההשפעות של Cistanche

מבוא

קרצינומה של תאי כליה צלולים (KIRC) היא סוג של קרצינומה של תאי כליה (RCC), הנחשבת לאחד מסוגי הסרטן השכיחים המהווים 70-80 אחוז מהמקרים [1], מדורגת כגורם ה-16 בשכיחותו לתמותה הקשורה מסרטן. ברחבי העולם [2]. קרצינומה של תאי כליה (RCC) היא הסוג הנפוץ ביותר של סרטן הכליה ומהווה 90 אחוז ממקרי סרטן הכליות [3]. לאחרונה, זיהוי מבוסס ביואינפורמטיקה של הסמנים הפוטנציאליים בסרטן נמצא בשימוש נרחב אך רק מעט סמנים ביולוגיים אמינים של KIRC זוהו או שרוב הסמנים עד כה לא מאומתים במלואם. לפיכך, ניתוחי ביואינפורמטיקה יחד עם אימות ניסויים נחוצים כדי להבהיר את המנגנון הפוטנציאלי של הביוגנזה וההתקדמות של KIRC [4]. חקירה מעמיקה של המיקרו-סביבה של הגידול ופיתוח אימונותרפיה אפשרו לחקור את האינטראקציה בין גידולים למערכת החיסון [5]. עם זאת, רבים מהסמנים הביולוגיים שזוהו לא נחקרו על השפעתם על הפנוטיפ הסלולרי ועל המנגנונים המולקולריים הבסיסיים בהתאמה ב-KIRC [6]. עם זאת, הפרוגנוזה של חולי KIRC לא מובנת וההישרדות הכוללת של 5-שנה היא פחות מ-10 אחוזים לאחר האבחנה הראשונה [7, 8]. בדרך כלל, הרקמות הנורמליות מכילות בעיקר רמות גבוהות של גורמים אנטי-אנגיוגניים. ההפרעה ברמת הגורמים הללו עלולה להפעיל את הגורמים הפרואנגיוגניים אשר מגבירים עוד יותר את חלוקת התאים בקצב לא תקין המוביל להיווצרות גידול [9]. בתהליך זה, תאי גידול מבטאים רמה גבוהה של גורם גדילה פרואנגיוגני והשפעה זו תומכת בהתפתחות כלי דם חדשים בגידולים [10]; לפיכך, התפתחות הגידול מתחילה. מכאן שגורמים רבים אחרים מעורבים בהיווצרות הגידול, כולל חדירת תאי החיסון וביטוי של גנים מטבוליים שונים. ידוע היטב שנוכחותם של סוגים שונים של תאי חיסון במיקרו-סביבה של הגידול משפיעה במידה רבה על התקדמות הגידול ואימונותרפיה; לפיכך, שינויים בגנים הקשורים למערכת החיסון משפיעים גם על הפרופורציה והתפקוד של תאי מערכת החיסון במיקרו-סביבת הגידול [11]. לדוגמה, חדירת תאי חיסון למיקרו-סביבה של הגידול משפיעה באופן משמעותי על התפתחות גליומה [12]. למרות חוסר העניין בגנים מטבוליים המשפיעים על סרטן, המחקרים הנוכחיים חידשו את המודעות לסרטן כהפרעה מטבולית [13, 14]. מחקרים אלו מספקים את הבסיס להכללת תכנות מחדש מטבולי כסימן היכר חדש של טרנספורמציה ממאירה [15]. עם זאת, הביטוי של כל הגנים או המסלולים המטבוליים בין רקמות שונות כולל גידולים ורקמות נורמליות שונה זה מזה וזה ברובו לא נחקר, במיוחד ב-KIRC.

בסך הכל, קיים מספר קטן יותר של סמנים ביולוגיים אמינים לניבוי פרוגנוזה ותגובות אימונותרפיות ב-KIRC; לכן, קשה להשיג הצלחה קלינית מלאה. לכן, מחקרים ביואינפורמטיקה מקיפים יחד עם תיקוף ניסויים יכולים להבהיר את המנגנונים הפוטנציאליים של הביוגנזה וההתקדמות של KIRC. לפיכך, המחקר הנוכחי נועד להעריך באופן מקיף את ההשפעות של המסלולים המטבוליים על פרופילי התעתיק המטבוליים ב-KIRC בהשוואה לרקמות הנורמליות התואמות שלהם. כאן, הצלחנו לא רק להפריד בין אתרי המחלה השונים או תת-סוגים מולקולריים שונים של אותה מחלה, אלא גם חזינו את התגובה לטיפול ממוקד מטבוליזם. זה מייצג דרך חדשה לזהות מנגנון שבאמצעותו מסלולים מטבוליים מופרעים בממאירות ומציע מטרות חדשות להתערבויות קליניות.

Cistanche סטנדרטי

חומר ושיטות

1. רכישות נתונים.

נתוני רצף ה-RNA (FPKM) הרלוונטיים ל-KIRC הורדו ישירות מ-The Cancer Genome Atlas (TCGA). לאחר מכן, הנתונים עובדו בהתאם ליישומים הרצויים במורד הזרם. בנוסף, נתונים קליניים-פתולוגיים עבור חולי KIRC המקבילים, כולל מין, גזע, גיל, מיקום הגידול, סיווג היסטולוגי, דרגת בידול, שלב הגידול ומידע הישרדות, התקבלו מדפדפן הסרטן UCSC. כדי לקבל תובנות לגבי ההטרוגניות המטבולית של חולי KIRC, ערכות הגנים המטבוליות נלקחו מפרסומים קודמים [16, 17]. התקציר הגרפי של מחקר זה מוצג באיור משלים 1, וזרימת העבודה המפורטת של רכישת נתונים ומחקר תהליכים במורד הזרם מוצגת באיור משלים 2.

2. זיהוי הגנים המטבוליים (DEmGs) המובעים בצורה דיפרנציאלית.

קבוצות הגנים המטבוליים זוהו על ידי הצטלבות של שני מערכי נתונים ושימשו לניתוח DEG בין דגימות גידול ודגימות נורמליות. מאוחר יותר, זיהינו גם DEmGs באמצעות WGCNA, ובהתבסס על מצבי הישרדות, חולים סיווגו אותם לשלושה אשכולות. בקיצור, החולים חולקו לשלושה אשכולות, כלומר, אשכול C1, אשכול C2 ואשכול C3. כדי לזהות DEG, נעשה שימוש במודלים ליניאריים על ידי שימוש ב- R package limma. שיעור גילוי כוזב (FDR) מותאם p-value < 0.05 בשילוב עם ערך אבסולוטי בו-זמני של שינוי קיפול log2, logFC > 1 ו-logFC < −1 נקבעו כסף לזיהוי DEG. עלילות הר הגעש נעשו באמצעות ggplot2. הגנים עם logFC > 1 נחשבו כבעלי ויסות מוגברת, ואלו עם logFC < -1 הוקצו כגנים עם ויסות מטה.

3. ניתוחי העשרה תפקודית ואינטראקציה בין חלבון לחלבון.

ניתוחי ההעשרה לפי מונחי GO ו-KEGG בוצעו באמצעות פרופיל R package Cluster. מונחי ה-GO חולקו לשלוש קטגוריות כולל פונקציות מולקולריות (MF), רכיבים תאיים (CC) ותהליכים ביולוגיים (BP). כדי לקבוע את ההבדלים והמתאמים המשמעותיים של DEmGs בין רקמות גידול לרקמות נורמליות, השתמשנו בתוכנה חישובית GSEA (ניתוח העשרה של מערך גנים). ניתוחי העשרה של KEGG ו-GO (ג'ין אונטולוגיה) של ה-DEG בוצעו כדי לזהות מסלולים ותפקודים אפשריים. יתר על כן, יישום הציסטוסקופ שימש לבניית רשת האינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) של DEmGs. ה-PPI הראשוני התקבל ממסד הנתונים של STRING. מגבלת הביטחון הגבוהה ביותר הוגדרה ל-0.9.

4. ניתוח הישרדות.

הגנים המובעים בצורה דיפרנציאלית בחולי סרטן הכליה זוהו באמצעות חבילת Limma, והגנים המובעים בצורה דיפרנציאלית נותחו באמצעות חבילת WGCNA לביצוע ביטוי משותף, לבניית רשת ביטוי משותף שזיהתה בסך הכל 6 מודולים.=5 והרשת היא רשת נטולת קנה מידה. המשמעות הפרוגנוסטית של DEmGs שזוהו על ידי WGCNA במצב הישרדות נקבעה על ידי חלקות קפלן-מאייר (KM) עם מבחן ה-log-rank.

כדורי Cistanche

5. ניתוח הסתננות חיסונית.

תאי החיסון והסטרומה חושבו באמצעות חבילת R, "xCELL; " דגימות עם p < 0:05 נבחרו לניתוח נוסף. יתר על כן, תאי החיסון המכילים סמנים ביולוגיים נותחו על ידי חבילת R GSVA. יתרה מכך, כדי לנתח את טוהר הגידול, השתמשנו באלגוריתם ESTIMATE כדי להעריך את ציוני הסטרומה והחיסון של סדרה של רקמות KIRC.

6. בניית מודל החיזוי.

הגנים המטבוליים המובעים בצורה דיפרנציאלית התקבלו מנתוני רצף RNA של גידולי KIRC עם מידע על הישרדות, והחולים חולקו באופן אקראי לקבוצות אימון ובדיקות באמצעות חבילת R "caret; לאחר מכן, בוצע ניתוח הישרדות חד-משתני על ה-DEmGs. יתר על כן, ניתוח LASSO בוצע על ידי חבילת R "glmnet;" ועבור אופטימיזציה של מודל החיזוי, נעשה שימוש במודל של סיכונים פרופורציונליים צעדים.

7. תרבות תאים.

שורות תאי סרטן הכליה האנושיות 786-O ו-ACHN נרכשו מ-American Type Culture Collection (ATCC) (מנאסס, VA, ארה"ב). 786-שורות תאי O תופחו במדיום RPMI 1640 (מספר קטגוריה 11875093, Invitrogen, Carlsbad, CA, ארצות הברית) בתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי (קטגוריה מס' 04-001- 1ACS, תעשיות ביולוגיות, ישראל). שורות התאים של ACHN תורבו במדיום MEM (מספר קטגוריה 41500034, Invitrogen, Carlsbad, CA, ארצות הברית) בתוספת של 10 אחוז סרום בקר עוברי. כל התרבויות הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס ו-5 אחוז CO₂באינקובטור לח.

8. PCR כמותי בזמן אמת.

סך ה-RNA מקווי התאים והרקמות של KIRC בודד באמצעות TRIzol (מספר קטגוריה 9109; TaKaRa, טוקיו, יפן) לפי הפרוטוקולים של היצרן. RT-qPCR בוצע באמצעות QuantiNova SYBR Green PCR Kit (קטגוריה מס' 208054, QIAGEN, דיסלדורף, גרמניה). ביטוי גנים יחסי חושב על ידי ה-2^−ΔΔCtשיטה. רצפי הפריימר מפורטים בטבלה משלימה 1.

9. בדיקת כדאיות תאים.

הציטוטוקסיות לאחר טרנספקציה של NUDT1 siRNA ב-786-O ו-ACHN נקבעה באמצעות בדיקת ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8) (מספר קטגוריה C0038, Beyotime Biotechnology Co. Ltd., חרסינה). רצפי NUDT1 siRNA מסופקים בטבלה משלימה 1. הם סונתזו מ- GenePharma (שנחאי, סין). בקצרה, שני שורות התאים 786-O ו-ACHN בשלב הגדילה הלוגריתמי (24 שעות לאחר טרנספקציה של siRNA) נאספו וחולקו לתוך 96-צלחות תרבית תאים באר (1000 תאים/באר). למחרת, נוספו 10 ul של CCK-8 לכל באר. לאחר דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות, הצפיפות האופטית (OD) ב-450 ננומטר של תאים זוהתה באמצעות קורא מיקרו-לוחיות (Bio-Rad Laboratories, ריצ'מונד, קליפורניה, ארה"ב).

10. נדידת תאים, פלישה ובדיקת אפופטוזיס.

תאי KIRC {{0}}O ו-ACHN הועברו לטרנספקציה של ה-NUDT1 בתיווך siRNA. לאחר 24 שעות מהטרנספקציה, זרעו תאים לתוך 6-צלחות הבאר לצורך בדיקת ריפוי פצעים. לאחר שהתאים קיבלו 100 אחוז מפגש, הפצעים נוצרו בתאים כמונו-שכבה באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק. לאחר מכן התאים נשטפו עם PBS והורכבו במשך 48 שעות נוספות. המרחק של סגירת הפצע הוצג על ידי מיקרוסקופ וצולם למדידת ההשפעה של נוק-דאון NUDT1 על תאי KIRC 786-O ו-ACHN. נדידת תאים ופלישה בוצעו באמצעות לוחות טרנסוול 24-באר (קורנינג, ניו יורק, ניו יורק). בקצרה, מספר שווה של התאים תורבו במדיה נטולת FBS בחדר העליון, והגירה של התאים נצפתה בתא התחתון של ה-transwell שבו המדיה נוספה ב-10 אחוז FBS. תאי Transwell נשטפו בקפידה והוכתמו ב-0.2 אחוז סגול קריסטל, הוצגו וצולמו; מאוחר יותר, הבדלים בין תאים שהועברו בין בקרה שלילית ל-NUDT1 נוק-דאון נקבעו פשוט על ידי ספירת תאים. בדיקת אפופטוזיס בוצעה לאחר 72 שעות מהטרנספקציה, תאים נקצרו, נשטפו והושעו מחדש ב-PBS קר כקרח. לאחר מכן אותרו תאים על ידי ערכת זיהוי אפופטוזיס (מספר קטגוריה KGA1013, KeyGen BioTech, נאנג'ינג, סין) לפי הוראות היצרן ונבדקו באמצעות ציטומטריית זרימה (FACScan; BD Biosciences). כל הניסויים בוצעו בשלושה עותקים.

11. ניתוח סטטיסטי.

כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו בפריזמה של GraphPad (V7.0) ו-R (3.6.4), בדיקת Wilcox שימשה להשוואה בין חדירת תאי חיסון לרקמות נורמליות וגידוליות, לבין בדיקת ה-chi-square בוצע על מנת לחקור את המתאם בין חדירת תאי חיסון לבין פרמטרים פתולוגיים. ניתוח השונות שימש להשוואת ניקוד החיסון, ניקוד הסטרומה וטוהר הגידול בין שלושת האשכולות. עבור ניתוח ההישרדות, ערך ה-p חושב באמצעות מבחן ה-log-rank. ערך p של<0.05 was considered statistically significant.

תוספי Cistanche

הפניות

[1] V. Nerich, M. Hugues, T. Nai, et al., "השפעה קלינית של טיפולים ממוקדים בחולים עם קרצינומה של תאי כליה גרורתיים צלולים," Oncotargets and Therapy, vol. 7, עמ' 365–374, 2014.

[2] A. Znaor, J. Lortet-Tieulent, M. Laversanne, A. Jemal, and F. Bray, "וריאציות בינלאומיות ומגמות בשכיחות ותמותה של קרצינומה של תאי כליה," European Urology, vol. 67, לא. 3, עמ' 519–530, 2015.

[3] B. Ljungberg, L. Albiges, Y. Abu-Ghanem, et al., "European Association of Urology Guidelines on Renal Cell Carcinoma: The 2019 Update," European Urology, vol. 75, לא. 5, עמ' 799–810, 2019.

[4] W. Zheng, S. Zhang, H. Guo, et al., "ניתוח מולטי-omics של מאפייני אנגיוגנזה של הגידול ומנגנוני ויסות אפיגנטי פוטנציאליים בקרצינומה של תאים ברורים כליות," Cell Communication and Signaling: CCS, vol. 19, לא. 1, עמ'. 39, 2021.

[5] ג'יי גלאון וד. ברוני, "גישות לטיפול בגידולים חיסוניים חמים, משתנים וקרים עם אימונותרפיות משולבות," Nature Reviews Drug Discovery, vol. 18, לא. 3, עמ' 197–218, 2019.

[6] W. du, L. Zhang, A. Brett-Morris וחב', "HIF מניע שקיעת שומנים וסרטן ב-ccRCC באמצעות דיכוי של חילוף החומרים של חומצות שומן," Nature Communications, vol. 8, לא. 1, עמ'. 1769, 2017.

[7] A. Jemal, R. Siegel, E. Ward, et al., "Cancer Statistics, 2008," CA: A Cancer Journal for Clinicians, vol. 58, לא. 2, עמ' 71–96, 2008.

[8] I. Lucca, T. Klatte, H. Fajkovic, M. de Martino, and SF Shariat, "Erratum: Gender differences in the recreation and Results of urothelial and kidney cancer," Nature Reviews Urology, vol. 12, לא. 12, עמ'. 653, 2015.

[9] IJ Fidler, "אנגיוגנזה וגרורות סרטן", Cancer Journal, vol. 6, תוספת 2, עמ' S134–S141, 2000.

[10] C. Kut, F. Mac Gabhann, ו-AS Popel, "היכן נמצא VEGF בגוף? מטה-אנליזה של התפלגות VEGF בסרטן," British Journal of Cancer, vol. 97, לא. 7, עמ' 978–985, 2007.

[11] F. Ren, Q. Zhao, M. Zhao, et al., "פרופיל חדירת חיסון בסרטן הקיבה וההשלכות הקליניות שלהם," Cancer Science, vol. 112, מס'. 9, עמ' 3569–3584, 2021.

[12] X. Ge, Z. Wang, R. Jiang וחב', "SCAMP4 הוא סמן פרוגנוסטי חדש ומתאם עם התקדמות הגידול והחדרה החיסונית בגליומה," The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, vol. 139, 2021.

[13] MG Vander Heiden ו-RJ DeBerardinis, "הבנת הצמתים בין מטבוליזם וביולוגיה סרטנית," Cell, vol. 168, מס'. 4, עמ' 657–669, 2017.

[14] ד"ר ווישרט, "האם סרטן הוא מחלה גנטית או מחלה מטבולית?" ביו-רפואה, כרך. 2, לא. 6, עמ' 478-479, 2015.

[15] ד' חנן ור"א וינברג, "סימני הסרטן: הדור הבא", תא, כרך 15, 1999. 144, מס'. 5, עמ' 646–674, 2011.

[16] X. Peng, Z. Chen, F. Farshidfar, et al., "אפיון מולקולרי ורלוונטיות קלינית של תת סוגי ביטוי מטבולי בסרטן אנושי," Cell Reports, vol. 23, לא. 1, עמ' 255–269.ה4, 2018.

[17] S. Haider, A. McIntyre, RG van Stiphout, וחב', "שינויים גנומיים עומדים בבסיס שינוי מטבולי של סרטן הקשור להיפוקסיה של גידול," Genome Biology, vol. 17, לא. 1, עמ'. 140, 2016.

Junwei Xie,1,2,3,4,5 Lingang Cui,6 Shaokang Pan,1,2,3,4,5 Dongwei Liu,1,2,3,4,5 Fengxun Liu,1,2,3,4 ,5 ו-Zhangsuo Liu 1,2,3,4,5

1 המחלקה לנפרולוגיה, בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת ג'נגג'ואו, ז'נגג'ואו 450052, סין

2 מכון המחקר לנפרולוגיה, אוניברסיטת ג'נגג'ואו, ז'נגג'ואו 450052, סין

3 מרכז המחקר למחלת כליות, ז'נגג'ואו, 450052 הנאן, סין

4 מעבדת מפתח לאבחון וטיפול מדויקים במחלת כליות כרונית במחוז הנאן, Zhengzhou 450052, סין

יחידת 5 הליבות של המרכז הלאומי למחקר רפואי קליני למחלות כליה, Zhengzhou 450052, סין

6 המחלקה לאורולוגיה, בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת Zhengzhou, Zhengzhou 450052, סין