ההשפעות המגנות על הרינו של EphrinB2 (EphB2)

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

ז'ימין הואנג, סימנג ליו, אנה טאנג, לאית' אל-רבאדי, מארק הנקמאייר, פטריס נ. מימצ'ה ויופנג הואאנג

מבוא

מחלת כליות כרונית (CKD) מאופיינת בדלקת מתמשכת ועלייה הדרגתית בפיברוזיס כולל גלומרולוסקלרוזיס ופיברוזיס tubulointerstitial, מה שמוביל בסופו של דבר למחלת כליות סופנית(ESRD)ללא קשר להפרעה הבסיסית|1]. זה מצביע על מסלול משותף אחרון עבור ESRD. הבנה טובה יותר של המתווכים העיקריים של מסלול נפוץ זה עשויה להביא לתכנון של טיפולים ממוקדים יותר כדי למנוע או להפוך את התקדמות CKD.

Erythropoietin המייצר קולטן הפטוסלולרי (Eph) טירוזין קינאזות והליגנדים המקבילים ל-Eph-קולטן (Ephrin) יוצרים משפחה גדולה של חלבוני איתות מעוגנים בקרום שמורים מאוד השולטים באינטראקציות מגוונות של תא-תאים לאורך ההתפתחות ובחיים הבוגרים [2]. במגע בין תא לתא, אינטראקציות EphB-EphrinB בפרט גורמות לדימרים, טטרמרים וצבירי חלבונים מסדר גבוה יותר, מה שמוביל להפעלה של מפלי איתות דו-כיווני שמתפשטים לתוך התא המביע קולטן (אותות קדימה) והליגנד- תא מביע (אות הפוך)[3-5]. בהתחשב בכך שאיתות דו-כיווני Eph-Ephrin נחשב להשתתף במגוון רחב של אינטראקציות בין תאים, נדידה והידבקות במהלך התפתחות עוברית וגם במהלך תיקון רקמות פיזיולוגיות 2,6-10], אין זה מפתיע שחוסר ויסות מהמולקולות הללו היו מעורבים בפיברוזיס רקמות. ואכן, תפקידים לאיתות EphB-EphrinB בפיברוגנזה של רקמות נחשפו במספר מודלים של עכברים של כלי דם [11], לב [12], עור [13], ריאות [14], ופיברוזיס בכבד [15,16]. עם זאת, התפקודים הפוטנציאליים של הקולטנים והליגנדים הללו ביחס לפתופיזיולוגיה של הכליה אינם ידועים במידה רבה.

בגלומרולי הכליה הבוגרים, EphrinB1 ממוקם בסרעפת החריץ של הפודוציט בגלומרולי [17], EphrinB2 מתבטא בעיקר בתאי אנדותל גלומרולריים (ECs) ובשריר חלק עורקי [18], ואילו EphrinB3 בקושי ניתן לזיהוי19]. ביטוי או התפלגות גלומרולרית של קולטני Eph עדיין לא ברורים אם כי מחקרים מעטים הצביעו על כך שתא נדיר מבטא EphB4 בגלומרולי בוגר [18]. בצינוריות הכליה, EphrinB1 מזוהה בכל הנפרון ועלול להשפיע על הציטוארכיטקטורה של תאי אפיתל צינוריים [19]. מלבד ביטוי בתאי שריר חלק עורקי וב-ECs, EphrinB2 נמצא בשפע גם בצינוריות מקשרת ובצינורות איסוף קורטיקליים ומדולריים של כליות מתפתחות ובוגרות [18].EphrinB2 (EphB2נמצא כי הקולטן מתבטא בשפע בצינוריות של המדולה הפנימית והחיצונית, כולל הצינוריות הישרות הדיסטליות והאיבר הדק של הלולאה של Henle שם הוא מרוכז בצד הבסיסי של התאים. ביטוי EphB4 מוגבל לנימים במדולה. EphB6 מתבטא באופן מועדף בגופי הכליה ובצינוריות הכליה של הקורטקס ושל המדולה החיצונית, כולל הצינוריות הפרוקסימלית והדיסטלית. עם זאת, ל-EphB6 עצמו אין פעילות קטליטית ולא סביר שהוא יפעל כקולטן עצמאי אלא מאותת כחלק מתסביך איתות הטרו-אוליגומרי עם קולטני EphB אחרים in vivo [20].

בעבר דווח שאיתות הפוך של EphrinB2 מוגן מפני נזילות נימים ופיברוזיס לאחר פגיעה בכליות הנגרמת על ידי חסימה חד-צדדית של השופכה (UUO) או פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IR) שכן לעכברים חסרי EphrinB2- היה איתות תלוי PDZ חמור יותר פגיעה בכלי הדם ופיברוזיס מוגברת לאחר פגיעה בכליות [21]. עם זאת, ייתכן גם שחלבון EphrinB2 המת מ-PDZ פועל כליגנד חזק יותר כדי לעורר איתות קדימה של EphB, וזה עשוי להיות הגורם לפיברוזיס בכליות המוגזם שנצפה במחקר שלעיל. יתרה מכך, המחקר שלעיל לא קבע איזה, אם בכלל, קולטן EphB משתתף בפתולוגיה של הכליות לאחר פציעה. בהתחשב בתפקיד הפריפברוטי החשוב של EphB2 (EphB2)איתות שנצפה לאחרונה בפיברוזיס בכבד[15,16] והביטוי השכיח ביותר של EphB2 (EphB2)בתאי צינורי כליה[19], אנו משערים כי EphB2 (EphB2)כנראה מעורב בשֶׁל הַכְּלָיוֹתלַיֶפֶת. במחקר הנוכחי, בדקנו האם EphB2 מוגבר (EphB2)נצפה גם במחלות כליה שונות והאם ביטוי ואיתות של EphB2 (EphB2)מעורבים בפיתוח שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתאוטובוס EphB2 (EphB2)נוק-אאוט (KO) ועכברים שולטים בחבר המלטה כדי לקבל חד צדדישֶׁל הַכְּלָיוֹתפציעת IR. הראינו ש-EphB2 (EphB2)יכולת ההבעה והאותות מווסתות באופן משמעותי בעקבות פציעת IR במודל עכבר ובכליות ממודלים ניסיוניים של עכברי CKD עם יתר לחץ דם וסוכרת וחולים הסובלים מ-CKD. יתר על כן, אובדן גנטי של EphB2 (EphB2)בעכברי KO הגנו היטב על הכליות מפני פציעות IRשֶׁל הַכְּלָיוֹתנֵזֶק, תפקוד לקוי ופיברוזיס, ובכך מזהים תפקיד מכריע לקולטן זה בתיווך אירועים תאיים שליליים המשפיעים על הכליה במהלך התקדמות המחלה.

יתרונות גברים cistancheלכִּליָה

תוצאות

EphB2 (EphB2)מווסתת ומופעלת בכליה לאחר פציעה

תעתיקים של כל מולקולות EphB ו-Ephrin-B בכליה רגילה של עכבר בוגר הוערכו על ידי RT-PCR (איור משלים S1A), וחושפים שתוצרי ההגברה הבולטים ביותר היו EphB2 (EphB2), EphB4, EphrinB1 ו-EphrinB2. הוכח כי EphB4 מתבטא בעיקר על ECs וסקולרי ונדרש לשלמות המבנית של כלי הדם, ואינו מזוהה בתאי הכליה העיקריים המעורבים בפיברוזיס [21,26]. יתר על כן, הנתונים שלנו חשפו שתאי אפיתל צינורי של כליה ופיברובלסטים צינוריים מבטאים את ה-EphB2 (EphB2)קולטן וליגנים קשורים EphrinB1 ו-EphrinB2 (ראה איור משלים S1B). לאחר מכן חקרנו שינויים פוטנציאליים בביטוי בעקבות פציעת IR ומצאנו כי EphB2 (EphB2)רמות ה-mRNA והחלבון היו מווסתות באופן משמעותי בכליה הפגועה ב-WT IR בהשוואה לכליית הביקורת הלא פגועה (CTL) (איור 1A-C). בהתאם לכך, אימונובלוטים באמצעות נוגדן ספציפי לפוספו עבור EphB1/EphB2 (EphB2)המספק קריאה עבור הקולטן הפעיל טירוזין קינאז (p-EphB1/2) זיהה עלייה משמעותית בכליית העכבר הפגועה ב-IR (איור 1B, D). ניתוח IF של חתכי רקמה באמצעות אנטי-EphB2 (EphB2)נוגדנים אישרו עלייה בביטוי החלבון הקולטן בכליה הפגועה ב-WT IR, במיוחד בתאי האפיתל הצינורי ובתאי ה-tubulointerstitial (איור 1E). חשוב לציין, אין EphB2 (EphB2)אותות זוהו ב-immunoblots או IF בכליות מ-EphB2 (EphB2)עכברי KO(EphB2-/) המדגימים את הספציפיות של ריאגנטים הנוגדנים. לבסוף, עלייה משמעותית בביטוי חלבון EphrinB2 זוהתה גם בכליות פגועות IR מעכברי WT, אם כי באופן מעניין עלייה זו לא זוהתה בכליות פגועות מ-EphB2 (EphB2)עכברי KO (איור 1B, F).

EphB2 (EphB2) expression increases in the kidney

איור 1.EphB2 (EphB2)הביטוי עולה בכליות של עכברים בעקבות פגיעה ב-IR למשך שבועיים

(א) רמות mRNA של EphB2, EphrinB1, EphrinB2 נותחו בכליות של עכברים באמצעות RT-PCR בזמן אמת. התוצאות מוצגות כשינוי קיפול בהשוואה לכליות קונטרלטרליות (CTL). פסי שגיאה מייצגים ממוצע ± SD, n=5 חיות.

(ב) כתמים מערביים של EphB2, phosphor-EphB2 (pEphB21594), EphrinB2 ו-GAPDH מכליות של עכברי EphB2 plus/plus (WT ו-EphB2-/(KO). משקל מולקולרי סומן בצד ימין.

הגרפים מסכמים את התוצאות של מדידות צפיפות פס עבור EphB2(C), p-EphB2(D) ו-EphrinB2 (F).*P<0.05 vs.ephb2+/+="">

(ה) קטעי כליה קפואים מעכברי EphB2 plus / plus ו-EphB2-/- בעקבות פגיעה ב-IR נצבעו ב-EphB2 (אדום) וב-DAPI/DNA (כחול). הגדלה,×200. לא זוהה EphB2 ב-immunoblots או צביעת IF בכליות מעכברי EphB2 KO.

cistanche can treat kidney disease improve renal function

cistanche herbaיכול לטפלכִּליָהמַחֲלָהלְשַׁפֵּרתפקוד כליות

כדי לוודא אם הביטוי של EphB2 מווסת למעלה (EphB2)גנים ו-EphrinB יכולים להיראות גם במודלים אחרים של בעלי חיים של מחלות כליה, אנו נתנו כליות מעכברי db/db סוכרתיים מסוג 2 [27] ומלח דיאוקסיקורטיקוסטרון אצטט (DOCA) ואנגיוטנסין (Ang)II לעכברים עם יתר לחץ דם שהושררו [22] ניתוח RT-PCR. הנתונים מצביעים על כך ש-EphB2 (EphB2)תעתיקי EphrinB1 ו-EphrinB2 גדלו כולם באופן משמעותי בכליות בשני המודלים (איור משלים S2). לאחר מכן ביצענו צביעת IF עבור EphB2 (EphB2)בביופסיות כליה בחולי CKD עם אבחנה של lgA nephropathy (IgAN) עם גלומרולוסקלרוזיס, ניוון צינורי ופיברוזיס אינטרסטיציאלי כפי שנקבע על ידי צביעת PAS (איור 2A). בהשוואה לנבדקים רגילים, דפוס בולט של EphB2 מוגבר (EphB2)חלבון ואיתות קדימה (צביעה בנוגדנים p-EphB1/2) זוהה לא רק בגלומרולי החולה, אלא גם באזור הצינורי המעורב במחלה בכליות מחולי IgAN אלה, (איור 2B, C). צביעת אימונוהיסטוכימיה באמצעות אותו נוגדן אנטי-p-EphB2 המשמש לצביעה IF, גילתה עוד כי צביעה חזקה של p-EphB2 נראתה בעיקר בתאי צינורית וחלקם בתאי טובולו-אינטרסטיציאליים בחולי IgAN אלה (איור 2D). לעומת זאת, רק כמה תאים צינוריים נצבעו בצורה חלשה עבור p-EphB2 בכליה הרגילה (איור 2D). רמות הצפיפות המשולבות המשולבות למחצה עבור EphB2 (EphB2)או צביעת p-EphB2 באזור tubulointerstitial הכלייתי שנקבע על ידי ImageJ הוצגו בצד ימין בהתאמה. נתונים אלה מצביעים על כך שביטוי מווסת למעלה של EphB2 והפעלה פוטנציאלית של איתות העברה הם מאפיין בולט שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתלַיֶפֶת.

EphB2 (EphB2) expression increases in human kidney biopsy tissue with CKD compared with normal subjects

EphB2 (EphB2)-KO mice exhibit ameliorated renal function and atrophy and reduced tubular injury and tubulointerstitial fibrosis following IR injury

איור 2. EphB2 (EphB2)הביטוי עולה ברקמת ביופסיה של הכליה האנושיתעם CKD בהשוואה לנבדקים רגילים

קטעי ביופסיה של הכליה מהחלק הרגיל של הכליה (NC, n=3) ומחולי lgAN (אוקספורד פתולוגי מסוג T=1 [38]) (n=7) מהאוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג נצבעו ב-PAS (A), EphB2 (אדום)(B), ופוספור-EphB2 (p-EphB2) (אדום) (C). הגדלה, DNA מוכתם ×200.DAPI (כחול) שימש כבקרת צביעת גרעינים עבור צביעת IF (צביעת IF בוצעה כמתואר עבור רקמת עכבר). השימוש בחומר האנושי אושר על ידי ועדת הביקורת האתית המקומית. הגדלה ×200. החצים הצביעו על פיברוזיס באזור הגלומרולוס וה-tubulointerstitial. (ד) צביעת אימונוכימיה עבור p-EphB2 (מוכתם בחום) (באמצעות אותו נוגדן אנטי-pEphB2 כמו הנוגדן הראשוני המשמש לצביעה IF והאנטי-ארנב המצומד פרוקסידאז lgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) כמשני נוגדנים וצביעה חיובית פותחו על ידי שימוש ב-3,3'-diaminobenzidine) בוצעו בהמשך על קטעי 3-μm של רקמות ביופסיית כליות lgAN המוטבעות בפרפין והוצבע נגדי עם Hematoxylin. כביקורת שלילית, הנוגדן הראשוני הוחלף ב-lgG פרה-אימונית ולא צוין צביעה ספציפית. הגדלה ×400. צפיפות הפיקסלים המשולבת היחסית של צביעה של EphB2 או p-EphB2 במיוחד באזור tubulointerstitial הכלייתי, כפי שמכומתת על ידי ImageJ, הוצגה בצד ימין של כל תמונות מכתים.*P<0.05 vs.="" normal="" kidney="">

איור 3.EphB2 (EphB2)עכברי KO מציגים תפקוד כליות משופר וניוון ופגיעת צינורית מופחתת ופיברוזיס tubulointerstitial בעקבות פציעת IR

(AC) BUN בסרום (A), רמות Cr (B) ומשקל כליות (C) (n=5/קבוצה).*P<0.05 vs.ephb2+/+="" mice.="" (d,="" e)representative="" microscopic="" images="" showing="" pas="" staining="" (d)="" and="" masson's="" trichrome="" staining="" (e)="" of="" the="" kidney="" sections="" were="" used="" to="" detect="" tubular="" injury,="" inflammation,="" and="" collagen="" deposition="" (stained="" blue).="" magnification,×200.(f,="" g).="" the="" graphs="" summarized="" the="" results="" of="" tubular="" injury="" (f="" and="" collagen="" deposition="" (g)="" quantified="" by="" imagej.(h,="" d)="" mrna="" expression="" of="" tubular="" injury="" markers,="" ngal(h)="" and="" kim-1="" ()="" in="" the="" kidney="" following="" ir=""><0.05 vs.ephb2+/="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.ephb2+/+="" ir-injured="">

EphB2 (EphB2)KO מגן על הכליה מפני פציעות הנגרמות על ידי IR ופיברוזיס

במודל ה-IR של פגיעה בכליות ופיברוזיס, פרוטוקול 35-מיני איסכמיה בעכברי WT גרם לנזק כרוני חד צדדי חמור טיפוסי לכליות לאחר שבועיים, כולל פגיעה בתפקוד הכליות, כפי שמעידה עלייה ברמות BUN ו-Cr בסרום (איור 3A, ב) (למרות שרמות הסרום של BUN או Cr הנמדדות כאן משקפות רק באופן חלקי את התפקוד הלקוי של הכליה הפגועה ב-IR, הן רמות BUN בסרום והן רמות Cr בעכברי WT עם חד צדדיתפגיעה IR כלייתיתעלו משמעותית בהשוואה לעכברים רגילים ב-WT ללא כל פגיעה (BUNvs. Normal:26.81±4.25 לעומת 17.3±0.37 mg/dl; Cr:0.3{{1{12} }}}1±0.029 לעומת 0.158±0.064 מ"ג/דצילי ). מבחינה היסטולוגית, הכליה הפגועה ב-IR בעכברי WT הראתה חדירת תאים מונו-גרעיניים tubulointerstitial טיפוסיים ושקיעה של קולגן מצטבר, כפי שנקבע על ידי צביעת PAS וצביעת Trichrome של Masson (איור 3D-G). עכברי ה-EphB2-/-פצועי IR הראו ירידה חזקה ברמות BUN ו-Cr בהשוואה לעכברים שנפגעו ב-WT, ופחות ניוון בכליות, פגיעה בצינורית ופיברוזיס טובולו-בין-מערכתי. תמלול כליות של ליפוקלין (NGAL) ו-mRNA של מולקולת פגיעה בכליות-1(KIM-1) נבדקו גם הם מאחר ששניהם מאומתים כסמנים מנבאים מוקדמים של פגיעה בצינורית הכלייתית. הנתונים הצביעו על כך שבעוד ש-NGAL ו-KIM-1 באו לידי ביטוי גבוה מאוד בכליה שנפגעה מ-IR מעכברי WT, הביטוי שלהם הופחת באופן ניכר ב-77.2 וב-88.5 אחוזים, בהתאמה, בכליות הפצועות מ-EphB{{33} }/ עכברים מוטנטים (איור 3H-I). זה מצביע על כך שנזק צינורי בעקבות פציעת IR הצטמצם מאוד בעכברים שחסרו ביטוי של EphB2 (EphB2)קוֹלֵט.

EphB2 (EphB2)-KO mice have reduced tubular α-SMA staining and renal protein levels of fibrotic markers following IR injury

איור 4.EphB2 (EphB2)- לעכברי KO יש צביעה צינורית מופחתת - SMA ורמות חלבון כליות של סמנים פיברוטיים בעקבות פציעת IR

(א) קטעי כליה קפואים מעכברי EphB2 plus/plus t ו-EphB2-/- בעקבות פגיעה ב-IR נצבעו ב-SMA (אדום) וב-DAPI/DNA (כחול) ונותחו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הגדלה,×200.

(ב) הגרפים סיכמו את התוצאות של תצהיר -SMA בכימות על ידי ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2+/t="" contralateral="" kidney="">

(ג) כתמים מערביים של FN, -SMA, N-cadherin ו-GAPDH מ-CTL ו-IR כליות של עכברי EphB2 plus / plus ו-EphB2-/7-. משקל מולקולרי סומן בצד ימין.n=5 חיות/קבוצה.

(DF) הגרפים סיכמו את התוצאות של מדידות צפיפות הפס עבור FN (D), -SMA (E) ו-N-cadherin (F).*P<0.05 vs.="" ephb2+/+=""><0.05 vs.="" ephb2+/+="" ir-injured="">

acteoside in cistanche have good effcts to antioxidant

הטבות cistanche במדברעַלכִּליָה

-SMA עולה בדרך כלל במהלך ההתמיינות של תאים צינוריים לפיברובלסטים או הפעלה של פיברובלסטים למיופיברובלסטים או שיפוץ כלי דם. באמצעות ניתוח IF של קטעי כליה, זיהינו עלייה ניכרת בצביעה -SMA בתאי הצינורית בכליות שנפגעו מ-IR מעכברי WT, תגובה שבוטלה באופן דרמטי ב-EphB2 (EphB2)-/- עכברים (איור 4A, B). תצפית זו נתמכה עוד יותר על ידי ניתוחי אימונובלוט המראים הפחתה בולטת ברמות החלבון המוגברות של -SMA וכן בפנוטיפ מזנכימלי/פיברוטי המאופיין בביטוי של N-cadherin ו-FN בכליות שנפגעו מ- IR מ-EphB2 (EphB2)-/-עכברים בהשוואה לבקרות WT (איור 4C-F). ניתוח נוסף הראה רמות מוגברות של mRNA של הסמנים הפיברוטיים, כולל קולגן מסוג Iol(Col-Io1), Col-II 1, Col-IVcl ו-FN בכליה שנפגעה ב-IR, הופחתו משמעותית גם ב-EphB2 (EphB2)-/-מוטנטים (איור 5). נתונים אלה מצביעים על כך ש-EphB2 (EphB2)KO מגן על הכליות מפני IR-EMT צינורי ופיברוזיס.

Quantitative RT-PCR for gene expression analysis of the profibrotic and inflammatory markers

איור 5. RT-PCR כמותי לניתוח ביטוי גנים של הסמנים הפרופיברוטיים והדלקתיים

RNA כולל הוכן מכליות קונטרלטרליות (CTL) או נפגעות IR שלEphB2פלוס פלוס וEphB2-/- עכברים. הנתונים הם ממוצע ± SD, n=5 בעלי חיים לקבוצה.*P<0.05>EphB2פלוס / פלוס CTL, #P<0.05>EphB2פלוס / פלוס כליה פצועה IR.

EphB2 (EphB2)KO מקל על דלקת כלייתית חזקה, מתח חמצוני ותגובות שגשוג בעקבות פציעת IR

כמאפננים מרכזיים של פיברוזיס רקמות, TGF 1, מעכב פלסמינוגן-מפעיל מסוג 1(PAI-1), קולטן לגורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGFR) ומעכבי רקמות של מטאלופרוטאינז (TIMP1) ממלאים תפקיד חשוב בשֶׁל הַכְּלָיוֹתלַיֶפֶת. כצפוי, רמות ה-mRNA הכליות של TGF 1, PAI-1, PDGFR- ו-TIMP1 עלו בצורה ניכרת בכליות פגועות IR של עכברי WT, בהשוואה לכליה הפנימית ללא פציעה של CTL (איור 5). עם זאת, ביטוי mRNA של מאפננים פרופיברוטיים אלה הוקהה מאוד בכליות נפגעות IR של עכברי EphB2-7-. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם הפחתה שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתלַיֶפֶתצפינו בעכברי EphB2-7 בעקבות פציעת IR.

כדי לאמת עוד יותר את ההשפעה של EphB2 (EphB2)KO על מסלולי איתות תאיים קשורים במורד הזרם, ראינו שתעתיקי RNA כליות עבור NF-kB-p65, חלבון chemoattractant מונוציטים-1(MCP-1), אינטרלוקין (IL)-1B, ו Nox2 גדלו כולם בכליות פגועות IR של עכברי WT (איור 5). יתר על כן, ייצור חלבון כליות של NF-KB-p65, Nox2 והקו-פקטור שלו, p47Phox היה גדול בהרבה בכליות שנפגעו מ-IR של עכברי WT בהשוואה ל-CTLkidneys, מה שמצביע על הפעלה של מסלול דלקתי מתווך NF-kB ו-Nox2 ב-IR- כליה פצועה. עם זאת, רמות המתווכים הללו שופרו או התהפכו קרוב לרמות נורמליות בעכברי KO חסרי EphB2 (EphB2)ביטוי (איור 6A-D). הזרחון והאיתות של מסלולי סרין/תרונין קינאז (Akt) ו-MAPK/ERK גדלו בכליות נפגעות IR של עכברי WT, שהופחתו באופן דרמטי, והתקרבו לרמות נורמליות, בעכברי EphB2-/-(איור 6A, E, F). הנוגדן F4/80, הידוע כמסומן מקרופאגים, הראה עלייה משמעותית במספר המוחלט של תאי F4/80 פלוס באזור ה-tubulointerstitial בכליות נפגעות IR של עכברי WT, בעוד שתאי F4/80 פלוס היו דלילים בכלי הכליה ב כליות CTL, המעידות על הצטברות מקרופאגים ודלקת בכליות פגועות. עם זאת, מספר תאי F4/80 פלוס הצטמצם במידה רבה בעכברי EphB2-7-, והתקרב לרמות נורמליות שנצפו בכליות לא פגועות (איור 7A, B). יתרה מכך, בדקנו עבור Ki-67, חלבון גרעיני המשמש כסמן תאי של התפשטות. בהתאם להפעלה של Akt ו-ERK1/2 בכליה הפגועה ב-IR של עכברי WT, צביעת IF זיהתה עלייה דרמטית במספר התאים החיוביים Ki-67- באזור tubulointerstitial. לעומת זאת, עכברי EphB2-7- הפגינו מספר נמוך בהרבה ועוצמת צביעה פחותה של Ki-67 בכליות שנפגעו מ-IR שדמה יותר לכליה הרגילה הרגילה (איור 7C, D). נתונים אלה מצביעים על מחיקה של EphB2 (EphB2)מעכב דלקת מתווכת NF-kB, יצירה והפעלה של אוקסידאז בתיווך NADPH ו-Akt-ו-ERK1/2-תיווך שגשוג תאים בכליה הפגועה ב-IR בעכברים. לפיכך, EphB2 (EphB2)עשוי להידרש עבור המהותישֶׁל הַכְּלָיוֹתדַלַקתִיותגובות ריבוי התורמות לפיברוזיס.

Renal protein levels of inflammatory, oxidative stress, and proliferative markers

איור 6. רמות חלבון כליות של מתח דלקתי, מתח חמצוני וסמנים שגשוג.

(א) כתמים מערביים של NF-kBp65, Nox2,p47phox, p-Akt, pERK1/2,t-ERK1/2 ו-GAPDH מכליות קונטרה-צדדיות (CTL) וכליות פגועות IR שלEphB2 (EphB2)/ וEphB2-/-עכברים. משקל מולקולרי סומן בצד ימין. n=5 חיות/קבוצה.

(BF) הגרפים סיכמו את התוצאות של מדידות צפיפות הפס עבור NF-kB-p65 (B), Nox2 (C), p47Phox(D), p-Akt (E), pERK1/2/t-ERK1/2 (F) ), בהתאמה. *פ<0.05 vs.="">EphB2פלוס / פלוס CTL.#P<0.05 vs.="">EphB2*/ בתוספת כליה פגועה IR.

אפופטוזיס מופחת בכליה של EphB2 (EphB2)-/-עכברים בעקבות פציעת IR

כליות הנתונות לפגיעת IR מאופיינות גם באפופטוזיס נרחב של תאי אפיתל צינורי כלייתי. צביעת TUNEL הראתה עלייה משמעותית באפופטוזיס בקטעי כליה פגועי IR של עכברי WT, בהשוואה לכליות CTL (איור 8A, B), שהופחתה באופן דרמטי בעכברי EphB2-7. תוצאות אלו תומכות בתפקיד של EphB2 (EphB2)KO בדיכוי אפופטוזיס ומנגנוני תיקון בעת פגיעה כלייתית. השפעה נוספת כזו של EphB2 (EphB2)עשוי גם להסביר את הפיברוזיס המוגבלת שמתרחשת בעכברי EphB2-7- בעקבות פציעה כרונית הנגרמת על ידי IR.

to relieve the chronic kidney disease

costanche על הכליה

EphB2 (EphB2)מסלול פרופיברוטי הקשור לאיתות

בין 760 הגנים שנבדקו על ידי ביטוי גנים NanoString (מוצג באיור 9A, מפת חום של ביטוי גנים), היו עדויות לביטוי גנים דיפרנציאלי (מותאם P<0.05)in the="" ir-injured="" kidney="" of="" wt="" mice="" relative="" to="" the="" wt="" ctl="" kidney="" (wt-ir="" vs.="" wt-ctl)="" for="" 506="" genes(356genes="" were="" up-regulated="" and="" 150="" genes="" were="" down-regulated)with="" an="" estimated="" false="" discovery="" rate="" of="" 5%.="" the="" up-regulated="" 356="" genes="" include="" all="" molecules="" that="" we="" have="" observed="" in="" their="" rna="" expression="" or="" protein="" production="" using="" real-time="" rt-pcr="" or="" western="" blot="" assay="" described="" above="" and="" these="" genes="" encode="" for="" fibrotic="" markers="" such="" as="" col-iol,="" col-iiol,="" col-ivαl,="" and="" fn;="" emt="" markers="" such="" as="" α-sma="" and="" vimentin;="" inflammatory="" factors="" and="" oxidative="" enzymes="" such="" as="" nf-kb,="" mcp-1,="" il-1β,="" and="" nox2;="" growth="" factors="" and="" proliferation="" markers="" such="" as="" tgfβ1,="" pai-1,="" pgdfrβ1,="" timp-1,="" mek="" kinase,="" akt-1="" and="" ki-67,="" and="" caspase-3,="" -4,="" and-12="" that="" regulate="" inflammation="" and="" apoptosis.="" however,="" all="" those="" increased="" markers="" that="" were="" significantly="" attenuated="" in="" the="" ir-injured="" kidney="" of=""> (EphB2)עכברי KO בהשוואה לעכברי WT (KO-IR לעומת WT-IR) שנקבעו על ידי RT-PCR בזמן אמת או בדיקת Western blot שתוארו לעיל מאושרים גם על ידי מבחן ביטוי גנים של NanoString. הגנים המווסתים מטה כוללים סופראוקסיד דיסמוטאז 1(SOD1)[28], heme oxygenase 1(Hmox1)[29], ו- thioredoxin 1,2(Txn1,2)[30] שנראה שהם במשפחת נוגדי החמצון. הפחתה בגנים אלו קשורה לעקה החמצונית המוגברת שנצפה בכליה WT שנפגעה מ-IR. עם זאת, הפחתה כזו ב-SOD1 ו-Txn1, 2 לא התרחשה ב-EphB2 שנפגע מ-IR (EphB2)KO כליות. ככל הנראה, מבחן ביטוי הגנים של NanoString חשף בו-זמנית מספר גנים מועמדים המעורבים ב-IR המושרהשֶׁל הַכְּלָיוֹתפציעהופיברוזיס. יש לציין כי 230 מתוך 356 גנים מווסתים הופחתו (סה"כ 64.6 אחוזים, עם P מותאם<0.05)and 129="" of="" 150="" down-regulated="" genes="" were="" reversed="" to="" varying="" degrees（total="" 86%个,="" with="" adjusted=""><0.05）in the="" ir-injured="" kidney="" of="" ephb2-/-mice="" compared="" with="" wt="" mice(ko-ir="" vs.="" wt-ir).="" all="" those="" ameliorated="" molecules="" are="" involved="" in="" 50="" ameliorated="" annotated="" pathways="" (shown="" in="" figure="" 9b,="" a="" heatmap="" of="" pathway="" scores).="" among="" those,="" the="" common="" profibrotic="" pathways,="" shown="" in="" figure="" 9c,="" that="" will="" contribute="" to="" the="" development="" of="">שֶׁל הַכְּלָיוֹתלַיֶפֶת, כמו ה-EMT והמסלולים הדלקתיים והשגשוגיים, מופעלים או מווסתים בצורה ניכרת בכליה הפגועה ב-IR, אך משתפרים באופן משמעותי ב-EphB2 שנפגע מ-IR (EphB2)KO כליות. באופן מפתיע, ניתוח זה גם גילה כי מטבוליזם אנרגטי של תאי צינורי הכליה כגון דה נובו ליפוגנזה, גלוקונאוגנזה, מטבוליזם של כולסטרול, איתות הקולטן המופעל על ידי פרוקסיזום פרוליפרטור (PPAR), ובמיוחד חילוף החומרים של חומצות שומן בנוסף לירידה בביטוי mRNA של נוגדי חמצון (כמו רשום כמסלול מתח חמצוני במפת החום, איור 9B), שנהרס ברובו בכליה הפגועה ב-IR, נמשך באופן דרמטי ב-EphB2 שנפגע מ-IR (EphB2)KO כליות (כמתואר באיור 9D). תוצאות אלו מצביעות עוד על כך שרוב המולקולות שמעורבות בשֶׁל הַכְּלָיוֹתפציעהופיברוזיס מוסדרים על ידי או קשורים ל-EphB2 (EphB2)איתות. במיוחד, ה-EphB2 (EphB2)איתות עשוי להיות מעורב או מתווך במטבוליזם של אנרגיה מיטוכונדריאלית של תאי צינורי כליה כגון חמצון חומצות שומן מיטוכונדריאליות וליפוטוקסיות במחלות כליה.

EphB2 (EphB2) KO reduces macrophage infiltration and tubular cell proliferation in the kidney

EphB2 (EphB2) KO reduces tubular cell apoptosis in the kidney

איור 7.EphB2 (EphB2)KO מפחית את חדירת מקרופאגים ושגשוג תאי צינורי בכליה לאחר פגיעה ב-IR

קטעי כליה מעכברי EphB2 plus / plus ו-EphB2-7(n=5/כל אחד) בעקבות פגיעה ב-IR נצבעו ב-F4/80 (אדום)(A), Ki-67 (אדום) (C), ו-DAPI/DNA (כחול) ונותחו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הגדלה,×200. הגרפים סיכמו את התוצאות של תאים F4/80 פלוס (B) ו-Ki-67 פלוס (D) בכימות באמצעות ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2+/+="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.ephb2+/+="" ir-injured="">

איור 8.EphB2 (EphB2)KO מפחית אפופטוזיס של תאי צינורי בכליה לאחר פציעת איסכמיה-פרפוזיה (IR)

(א) קטעי כליה מעכברי EphB2 plus/plus ו-EphB2-7- ((n=5/כל אחד) בעקבות פציעת IR נצבעו ב-TUNEL (ירוק) וב-DAPI/DNA (כחול) ונותחו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הגדלה,×200. (ב) הגרפים סיכמו את התוצאות של תאים TUNEL בתוספת מכמתים על ידי ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2++="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.="" ephb2+="" ir-injured="">