חלק 3: קולטן קנבינואיד סוג 2 מקדם פיברוזיס בכליות באמצעות תזמור איתות B-catenin
Mar 06, 2022
איש קשר: emily.li@wecistanche.com
עם זאת, לעתים רחוקות דווח שיש קשר בין CB2 ל-catenin.
CB2 הוא חבר במשפחת GPCR. גילינו בעבר ש-CB2 מתבטא בתאים צינוריים, פיברובלסטים ומקרופאגים.' CB2 מתבטא גם בפודוציטים ובתאים mesangial.3התפקיד של CB2 ב-CKD היה שנוי במחלוקת בעבר. למרות הוויסות העל של CB2 mRNA והליגנד האנדוגני העיקרי שלו 2-AG במודלים של CKD, דווח בעבר כי אגוניסט CB2 יכול לשפר את פיברוזיס הכליה. "לעומת זאת, המחקרים הקודמים שלנו זיהו תפקיד מזיק של CB2 בפיברוזיס בכליות באמצעות ניסויי נוק-אאוט גנטיים ומבחנים עם האגוניסט ההפוך CB2 הסלקטיבי יותר XL-001, אגוניסט הפוך של CB2 חדשני. מפגין את זיקת הקישור החזקה ביותר לקולטן CB2, עם הסלקטיביות הטובה ביותר על פני הרצפטור CB1(2594-fold) ו-Ki של 0.5 nM. יש לציין, -קטנין והמטרות שלו מדוכאות על ידי אבלציה גנטית או עיכוב תרופתי של CB2. בהתחשב בכך ש-CB2 הוא חבר במשפחת GPCR, CB2 יכול לווסת -קטנין. עם זאת, יש לאמת השערה זו. במחקר זה, הראינו ש-CB2 מתווך הפעלת קטנין באמצעות גל אות GPCR.
המחקר שלנו גם מאשר את התפקיד המתהווה של המערכת האנדוקנבינואידית בפיברוזיס בכליות. מבין 2 האנדו-קנבינואידים העיקריים, לאננדמיד (N-arachidonoylethanolamine) יש זיקה גבוהה יותר ל-CBl, ואילו ל-2-AG יש זיקה דומה ל-CB1 ול-CB2 (הזיקה שלו ל-CB1 מעט גבוהה יותר). לפיכך, {{ 7}}AG הוא האגוניסט האנדוקנבינואידי העיקרי לקולטן CB2. במיוחד, הכִּליָהקליפת המוח מציגה רמות בסיסיות גבוהות באופן דומה של אננדמיד ו-2-AG; עם זאת, 2-רמות ה-AG מוגברות יותר בחסימותלַיֶפֶתשֶׁלהכִּליָה, מלווה בירידה ברמות האננדמיד, מה שגורם להפעלה של CB2 ו-CB1 כאחד. יש לציין, התפקיד המזיק של CB2 בפתוגנזה שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתלַיֶפֶתהוכח על ידי גישות גנטיות במחקר האחרון שלנו,'' ומאושש עוד יותר במחקר הנוכחי.
למרות שדוח קודם הראה כי CB2 מתבטא הן על ידי תאי דלקת והן על ידי פודוציטים ברמה בסיסית גבוהה, 8 CB2 והליגנד האנדוגני העיקרי שלו 2-AG מווסתים למעשה לאחר UUO ו- IRI.7 יש לציין כי בפיברוזיס כליות של עכברים ו מגוון רחב של נפרופתיות אנושיות, CB2 מתבטא בעיקר באפיתל צינורי כליה וכן בפיברובלסטים אינטרסטיציאליים ובלוקוציטים (איור 2; איור משלים S1), מה שמרמז על כך שהוויסות העל של CB2 הוא תכונה פתולוגית שכיחה בכליות הפיברוטיות. במחקרים שלנו בבעלי חיים, אימצנו הכלאה של CB2 עם פלואורסצנטי באתרו כדי לזהות את דפוס הביטוי שלו בגלל העלות הנמוכה שלו. הצביעה העלתה כי CB2 מתבטא בעיקר באפיתל צינורי. הסיבה מאחורי אי התאמה זו עשויה להיות טמונה ברגישות של טכניקת ההכלאה של הקרינה באתרו בזיהוי של mRNA בשפע ובזמן החשיפה להדמיה. צפינו ב-CB2 לא רק בקרום התא, אלא גם באזור הציטופלסמי הצינורי, מה שמרמז על הפנמת קולטן לתוך תאים תוך תאיים, כגון אנדוזומים וליזוזומים. נבדק בעכברי נוקאאוט CB2 (איור משלים S1). באופן מעניין, ראינו היווצרות הטרודימר של CB2 עם CB1 ב-UUO מושפעכליותותאי צינוריות המושרים על ידי גורם גדילה- -מתמר (איור משלים S4), מה שמצביע על כך שההשפעות המעוררות שלהם עשויות להיות סינרגטיות. עם זאת, ביטוי CB1 לא הושפע מ-AM1241 או XL-001, מה שמוסיף מורכבות נוספת למנגנונים. כפי שהוזכר קודם לגבי ההשפעות המעכבות הדדית של CB2 ו-CB1, יש לבצע מחקרים נוספים כדי לאמת את ההשפעות המקושרות ביניהם, חקירה מעבר להיקף המחקר הנוכחי. עם זאת, הממצאים הקודמים והנוכחים שלנו חושפים באופן עקבי שחסימה של CB2 היא אסטרטגיית התערבות טיפולית פוטנציאלית למניעת פיברוזיס בכליות. יחד עם הסברה לחולים עם CKD, הממצאים שלנו מספקים אזהרות בריאות לקבוצה הצומחת במהירות.
איור 10| קולטן קנבינואיד מסוג 2(CB2) הוא יעד במורד הזרם של -קטנין (-cat).(א) ניתוח ביואינפורמטיקה חשף את נוכחותם של אתרי קשירה משוערים של גורם T-cell (TCF) (TBSs) באזור המקדם של CB2 אנושי ועכבר גנים. הרצפים והמיקומים של ה-TBS המשוערים בגנים CB2 מודגשים (אדום), בעוד שרצף הקונצנזוס של TBS ניתן בתחתית הפאנל הזה. (ב) תוצאות ניסוי מייצגות של בדיקת כרומטין אימונופריציטציה (ChlP) המראות את הקישור של TCF או Lymphoid enhancer-binding factor (LEF) -1 לאזור מקדם הגן CB2. בן אנושכִּליָהתאים פרוקסימליים צינוריים (HKC)-8 הועברו עם פלסמיד ביטוי -catenin (pFlag- -cat) או pcDNA3 למשך 24 שעות. יסאטים של תאים הוזכרו עם נוגדן נגד TCF, LEF-1, היסטון H3 או lgG לא אימוני, ובדיקת השבבים בוצעה עבור מקדמי גנים CB2. סה"כ הליזאט המדולל שימש כ-DNA קלט גנומי הכולל. (ג) הצגה גרפית של רמת CB2 mRNA. תאי HKC-8 הועברו עם pFlag- -cat או פלסמיד pcDNA3. סך ה-RNA נותח על ידי תגובת שרשרת כמותית של פולימראז.*P<0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (d,e)representative="" western="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" overexpression="" of="" β-catenin-induced="" upregulation="" of=""><0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (f="" representative="" graphs="" show="" β-catenin="" induced="" the="" formation="" of="" a="" cb2/β-arrestin="" 1(β-arr1)/="" proto-oncogene="" src="" complex.="" cell="" lysates="" were="" immunoprecipitated="" (ip)="" with="" an="" antibody="" against="" cb2,="" followed="" by="" immunoblotting="" (b)="" with="" anti-β-arrestin="" 1(β-arr1),="" or="" anti-src.(g-i)representative="" westem="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" the="" expression="" of="" cb2,="" β-arrestin="" 1(β-arr1),="" and="" src.="" hkc-8="" cells="" were="" transfected="" with="" pflag-β-cat="" (or="" pcdna3)="" plasmid="" in="" the="" presence="" or="" absence="" of="" cb2="" small="" interfering="" rna=""><0.001 versus="" the="" pcdna3=""><0.001 versus="" the="" flag-β-catenin="" group="" alone="" (n="">של צרכני אנדוקנבינואידים, למטרות פנאי ורפואה כאחד. שימוש כרוני כבד עלול להוביל להפעלה מתמשכת של קולטני CB1 ו-CB2, דבר שעלול להיות בעל השפעות שליליות עלכִּליָהבְּרִיאוּת.
למרות שדוח קודם הראה ש-arrestin 1 ממלא תפקיד בפיברוזיס כליות והפעלה של -catenin,"אנו מבהירים עוד יותר את המנגנונים התפקודיים של מסלול ה-CB2/-catenin המתווך -arrestin 1-בפירוט. מצאנו -arrestin. 1 נמצא בשפע יותר מאשר -arrestin 2 בעכברי IRI (נתונים לא מוצגים). ידוע היטב ש-arrestin 1 אחראי על הפעלת GPCR והעברת אותות במורד הזרם באמצעות Src, AKT, חלבון קינאז חוץ-תאי מווסת אות (ERK1/2) , וקינאזות אחרות.2שהפעלה של Src יכולה לתווך מספר מסלולים פרו-פיברוזיס, כגון קולטן לגורם גדילה אפידרמיס ומתמר אותות ומפעיל שעתוק (STAT)3," לא יכולנו לשלול את האפשרות שמסלולים אלה הם גם המסלולים במורד הזרם של CB2. עם זאת, התצפיות שלנו מצביעות על כך שאיתות -קטנין מתווך על ידי קומפלקס -arrestin 1/Src המושרה על ידי CB2-. בנוסף, -arrestin 1 הוא מווסת נקודת ביקורת ראשונית, והוא משמש כחלבון פיגום כדי להתחיל את ההפעלה של - קטנין על ידי העברתו לגרעין. ממצא חדש נוסף הוא ש-CB2 הוא מטרה של -קטנין. מספר מטרות של -קטנין זוהו בעבר במחקר זה. לפיכך, ראוי לציין כי נראה שמסלול ה-CB2/-catenin הוא ליצור לולאת הפעלה הדדית המעודדת בשיתוף פעולה את הפתוגנזה של פיברוזיס בכליות.
לסיכום, התוצאות שלנו מצביעות על כך ש-CB2 שבא לידי ביטוי באופן חריג, מעורב באופן קריטי בפיברוזיס בכליות באמצעות הפעלת קטנין המושרה על ידי -arrestin 1-. -קטנין מפעיל את הביטוי של CB2, מה שמקל על הפעלת קולטן והעברת גל האות. תוצאות אלו (i) ממחישות מסלול חדשני של CB2/-catenin המקדם פיברוזיס כליות ו-(ii) מרמזות שעיכוב ממוקד של CB2 או -arrestin 1 עשוי להגן מפני פיברוזיס באמצעות עיכוב של לולאת ההפעלה ההדדית.
שיטות תמציתית
לשיטות מפורטות, ראה את השיטות המשלימות.
דוגמניות של בעלי חיים
עכברי C57BL/6 זכרים נרכשו ממרכז החיות הניסוי של האוניברסיטה הדרומית לרפואה (גואנגג'ואו, סין). עבור מודל IRI, pedicles דו צדדיים נחתכו על ידי מהדקי מיקרו מפרצת למשך 32 דקות ב-37.5 מעלות במהלך תקופת האיסכמיה והתאוששות. מודל UUO הוקם על ידי קשירה משולשת של השופכן השמאלי עם משי 4-0 לאחר חתך קו אמצע הבטן. עבור דגם ה-UIRI, הגבישים השמאליים נכרתו למשך 35 דקות באמצעות מלחציים של מיקרו מפרצת, והצד הנגדיכִּליָההוסר יום אחד לפני ההקרבה. עבור מודל הנפרופתיה הנגרמת על ידי חומצה פולית, עכברי C57BL/6 זכרים טופלו בחומצה פולית באמצעות זריקה תוך צפקית אחת של 25 מ"ג/ק"ג משקל גוף. ביטוי in vivo של Wnt1 או CB2 או ביטול של -arrestin 1 בעכברים בוצע על ידי גישת מסירת גנים מבוססת הידרודינמית."5 העיצובים הניסויים המפורטים מוצגים באיורים 5a, 7a ו-9a. הניסויים בבעלי חיים אושרו. על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים באוניברסיטת דרום רפואה, גואנגג'ואו, סין. זוגות רבייה של עכברי CB2 null(CB2/) בני 6-8 שבועות, ברקע C57BL/6N, נרכשו מ-Cyagen Biosciences (מספר מלאי KOCMP{ {19}}Cnr2; Cyagen Biosciences, גואנגג'ואו, סין). מחסור בקולטן CB2 אושר על ידי שיעתוק הפוך-PCR.
דגימות ביופסיה של כליה אנושית ותרבית תאים
בן אנושכִּליָהקטעים (3 מיקרומטר) התקבלו מביופסיות כליות שבוצעו בבית החולים Nanfang ובבית החולים העממי Huadu District, Southern Medical University, Guangzhou, סין. ביופסיות ביקורת תקינות נגזרו מחוסר גידולכִּליָהרקמותשל חולים עם קרצינומה של הכליה. המחקרים שכללו חתכים של כליה אנושית בוצעו בהסכמה מדעת של המטופל ואושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית בבית החולים ננפאנג ובבית החולים העממי של מחוז הואדו. תאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים אנושיים (HKC-8) סופקו על ידי ד"ר לוריין סי ראקוסן (אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, בולטימור, MD). חלקים גרעיניים וציטופלזמיים הופרדו עם ערכה מסחרית (BestBio, שנחאי, סין).
קביעת רמות קריאטינין בסרום וחנקן אוריאה בדם
רמות קריאטינין בסרום וחנקן אוריאה בדם נקבעו על ידי מנתח כימיה אוטומטי (AU480 Chemistry Analyzer, Beckman Coulter, Atlanta, GA).
הכלאה באתרו
בדיקות CB2 נרכשו מ-Boster Technology, ווהאן, סין.כִּליָהקטעים (8 מיקרומטר) תוקנו עם 4 אחוז פורמלדהיד והוערכו על ידי צביעה פלואורסצנטית של CB2 באמצעות ערכה מסחרית (MK2530, Boster Biological Technology, ווהאן, סין).
היסטולוגיה וצביעה אימונוהיסטוכימית ואימונופלואורסצנטית
משובץ פרפיןכִּליָהקטעים נצבעו באמצעות צביעת trichrome חומצה מחזורית-שיף ומאסון כדי לזהות צינוריות פצועות ולקבוע שקיעת קולגן. הנגעים כומתו באמצעות טכניקה בעזרת מחשב. צביעה אימונוהיסטוכימית ואימונופלואורסצנטית בוצעה בפרפין ובחתכים קפואים, בהתאמה. נוגדנים מתוארים בשיטות המשלימות.
