חלק 2: Verbascoside מגן על תאי הלבלב מפני ER-Stress
Mar 05, 2022
איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com
אלסנדרה גאלי 1, פלוס, פאולה מרציאני 1, פלוס, אלגרטה מרקו 1, סילביה גיסלנזוני 1, פדריקו ברטוצי 2, רפאלה רוסי 3, אלסיה די ג'יאנקמילו 3, מיקלה קסטנה 1 וקרלה פרגו 1,*
3.4 Verbascoside מווסת - פעילות מיטוכונדריאלית ודינמיקה של תאים
מבחני כדאיות MTT מציעים השפעה אפשרית שלverbascosideישירות על המיטוכונדריה מה שמבטיח את הצימוד של הפרשת אינסולין למצב התזונתי והישרדות התא בסוג תא זה. צורה ופוטנציאל ממברנה הם סמנים לבריאות המיטוכונדריה [42]. הערכנו תחילה את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית על ידי תיוג התאים עם MitoSpyw Orange CMTMRos, צבע חדיר שריכוזו תלוי בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלי הפנימי, בעוד MitoSpyw Green FM שימש לנרמל נתונים למסה המיטוכונדריאלית (איור 4A, B). פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה בverbascosideתאים שטופלו גדלו בהשוואה לבקרה הן במצב בסיסי והן במצבי לחץ. מעניין,verbascosideמטבוליטים הפעילו השפעות שונות. חומצת קפה לא שיפרה את הפוטנציאל המיטוכונדריאלי, ואילו הידרוקסיטירוסול גרם לפגיעה תלוית מינון בתפקוד המיטוכונדריאלי, בהסכמה לנתונים על כדאיות התא, השפעה כזו הייתה ברורה יותר לאחר חשיפה ל-H2O2 (איור S3).
מכיוון שהפונקציה קשורה אך ורק למורפולוגיה, מדדנו את הקוטר, השטח והמעגליות של המיטוכונדריה של הפרת. עקה חמצונית חריפה מעודדת ביקוע מיטוכונדריאלי נרחב, ובכך מביאה למיטוכונדריה מעגליות קטנות יותר [42]. בתנאי לחץ של H2O2, המיטוכונדריה של תאים שטופלו ב-verbascoside היו מוארכים יותר והראו משטח מוגבר מאשר אלה בקרה (איור 4C,D ואיור S4). המעגליות המיטוכונדריאלית הייתה נמוכה יותר בתאים שטופלו ב-verbascoside מאשר בביקורות וההבדלים היו ברורים יותר בתאים שטופלו ב-H2O2 (איור S3), מה שמאשר שוב את תפקיד ההגנה של הפוליפנול.
היכולת של האברונים הללו לשנות את צורתם בתגובה למצבי תזונה או מצבי לחץ נמצאת בשליטה של אירועי איחוי וביקוע ודורשת תנועתיות מיטוכונדריה [39]. מעקב אחר תנועות המיטוכונדריה הוביל אותנו לחשב את המרחק המצטבר שעברנו והניתוח גילה עלייה משמעותית בדינמיקה של המיטוכונדריה בתאים שטופלו ב-verbascoside בהשוואה לבקרה, כבר בתנאים בסיסיים (איור 4E, F וסרטונים S1-S4). ההשפעה הייתה בולטת יותר לאחר טיפול ב-H2O2, ואכן טיפול מקדים עם verbascoside החזיר כמעט לחלוטין את ההשפעה של מתח חמצוני על הדינמיקה המיטוכונדריה.
יחד נתונים אלה תומכים מאוד בתפקיד מפתח של verbascoside בהבטחת דינמיקה של המיטוכונדריה, שהיא חיונית כדי לקדם את ההסתגלות המהירה של אברון זה לתנאי לחץ.
3.5 השפעת Verbascoside על ההישרדות והתפקוד של האדם של לנגרהנס
בהתחשב בפוטנציאל התרגום שלverbascosideיישום בבריאות האדם, אימתנו את השפעתו על איים מבודדים של לנגרהנס, מודל רלוונטי יותר למחקרים פיזיופתולוגיים ותרופתיים על תאים. איים מבודדים טופלו ב-16 uM verbascoside במשך 5 ימים והוערך פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית. כפי שדווח באיור 5A, בעוד שפוטנציאל האברונים נפגע באיי הבקרה האנושיים לאחר חשיפה ל-H2O2, פוטנציאל הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה באיים שטופלו מראש בוורבסקוסיד לא ירד משמעותית, מה שתומך בהשערה של תפקיד מגן של verbascoside מפני ROS-מושרה - תפקוד לקוי של תאים. ניתוח של ביטוי סמני ER-מתח הראה הפחתה חשובה של חלק P-eIF2 בשני תכשירי האיים הנבדלים שנשמרו ב-16 uM verbascoside, מה שמאשר את הוויסות ההורדה של מסלול זה גם בדגימות אנושיות (איור 5D). ההשפעות המועילות של הטיפול בפוליפנול אושרו על ידי תכולת האינסולין המוגברת שנצפתה באיונים שטופלו בוורבסקוסיד בהשוואה לבקרות (איור 5B). פיזור הנתונים בניסויים שלנו לא אפשר להדגים כל הבדל משמעותי של הפרשת אינסולין מגורה בגלוקוז (GSIS) באיונים שטופלו בוורבסקוסיד, אם כי נראה שמגמה חיובית נראית בתנאי בסיס ומתח (איור 5C).
4. דיון
מתח חמצוני ודלקת הם הבסיס לתפקוד לקוי של תאים המתרחש במהלך T2D [43,44] ככאלה, מזון פונקציונלי, חומרים תזונתיים ופיטוכימיקלים נחקרו ככלים למניעת סוכרת מסוג 2 [45]. בעבודה זו, התמקדנו ב-verbascoside, הידוע כמפעיל פעילויות אנטי דלקתיות ונוגדות חמצון בנוירונים [18]. למרות המורכבות המבנית הגבוהה, verbascoside ו- isoverbascoside נמצאו בפלסמת הדם של חולדות שניזונו מתמצית Lippia citriodora יחד עם כמה מטבוליטים [20]. בנוסף, הצטברות תאים של verbascoside ו- verbascoside זוהתה בקו תאי סרטן השד SKBR3 [23] ומחקרים שנערכו על תאי Caco-2 מראים שכמויות מתונות של verbascoside ו- isoverbascoside נותרות שלמות ונגישות ביולוגיות לאחר עיכול חוץ גופי. תהליך. יתר על כן, Caco-2 יכול לקלוט את שתי המולקולות באמצעות הובלה מהירה וליניארית בטווח של 10 עד 100 uM [22]. לא דווחו נתונים לגבי זמינות ביולוגית של verbascoside בבני אדם, ובכל זאת המחקרים שהוזכרו לעיל מצביעים על כך שייתכן ו-verbascoside שאינו מחולק לחצות את מחסום המעי, להסתובב בפלסמה בדם ולהפעיל השפעות נוגדות חמצון על תאים אנדוקריניים של לַבלָב.
מצאנו תפקיד הגנה תלוי-מינון (0.8-16 uM) של verbascoside על תאים שיבוטים ואנושיים, הן בתנאי בסיס והן בתנאי לחץ. השפעה זו נובעת מ-verbascoside עצמו ולא ממטבוליטים שלו חומצת קפאין והידרוקסי-טירוסול, שנראים למעשה ציטוטוקסיים בריכוז של 16 uM. הריכוזים שהוכחו כפעילים בניסויים שלנו תואמים לאלה שתוארו בבעלי חיים שניזונו עם verbascoside [20].
למרות שאיננו יודעים אם verbascoside פועל חוץ-תאי על ידי קישור לקולטן ממברנה או מופנם על ידי אנדוציטוזיס ופועל תוך-תאי, הנתונים שלנו מאשרים כי ל-verbascoside יש תכונות נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות, ומגן על תאים מפני הפרעות בתפקוד הקשורות ל-ER-לחץ על ידי הפחתת UPR וקידום דינמיקה מיטוכונדריה.
ואכן, זיהינו ירידה משמעותית בתכולת ה-ROS בתאים שטופלו בוורבסקוסיד, אשר מאושרת עוד יותר על ידי הפחתת חמצון שומנים שנמדד באמצעות ביטויי HNE ואקרוליין. שלא כמו רוב הפוליפנולים הצמחיים, פעילות ניקוי ROS של verbascoside עוקבת בעיקר אחר מסלולים עקיפים (באמצעות ויסות-על של אנזימים מסירי ROS) ולא ישירים. למעשה, זה מגביר את שעתוק הגנים של כמה אנזימים נוגדי חמצון באמצעות הפעלה של מסלול Nrf2 (NF-E2-קשור לגורם 2) ובאמצעות מנגנון תלוי AhR (קולטן פחמימני אריל) [24,29]. ככזה, מצאנו ביטוי מוגבר של SOD1 בתאים שטופלו ב-verbascoside.
הומאוסטזיס ROS רלוונטי ביותר בפתולוגיה של תאים. בשל המחסור באנזימים נוגדי חמצון, לא ניתן לנטרל ייצור מוגבר של ROS וגורם ללחץ ER המעודד קיפול שגוי של חלבון. לחץ ER מוביל להפחתה של שעתוק אינסולין ותרגום באמצעות הפעלת ה-UPR [44,46]. למסלול זה המטרה העיקרית היא לשחזר את תפקוד ה-ER באמצעות תכנות מחדש של ביטוי גנים, אולם כאשר הוא מעורר גירוי יתר, הוא מעורר אפופטוזיס. הנתונים שלנו מצביעים על כך שפעולה חשובה של verbascoside היא להפחית את ה-UPR, ולאפשר את השינויים הדרושים לתיקון תפקוד לקוי של ER, מבלי לגרום לאפופטוזיס. על פי אפשרות זו, הביטוי של חלבוני BIP, HSP70 ו-PERK ירד בתאים שטופלו ב-verbascoside, והשפעול של מסלול PERK הוחלש בתגובה ללחץ ER המושרה על ידי tunicamycin. פעולה דומה דווחה עבור טירוזול בקו התאים אינסולינומה NIT-1 [47].
מעניינת במיוחד היא היכולת של verbascoside לווסת את ההפעלה של ענף PERK של UPR. ב-תאים מסלול זה נדרש כדי לשמור על ההומאוסטזיס הבסיסי של הפרשת תאים והישרדות של תאי, והוא מבוטל בצורה חמורה בסוכרת [41,48]. עוד יותר מסקרנים, גרסאות נפוצות ב-PERK תורמות לסיכון לטרום-סוכרת ולמוטציות רצסיביות בגן EIF2AK3 (המקודד ל-PERK) עומדות בבסיס הרגישות לתסמונת וולקוט-ראלסון המאופיינת בסוכרת קבועה של יילודים תלוית אינסולין [49,50].
הורדת ויסות של המסלול הדלקתי IKB -NFKB זוהה גם במערכת שלנו בנוכחות verbascoside. NFKB מייצג את המסלול הדלקתי העיקרי בתאים והפעלה מתמשכת שלו מתחילה מפל של אירועים שמגיעים לשיאם במוות של תאי. בתאים לחוצים, הפחתת ביטוי NFKB מגינה על תאי הלבלב מפני גורמים סוכרתיים [27,51], התומכת עוד יותר ביישום verbascoside במניעת סוכרת. מעניין לציין כי איתות PERK מפעיל את גורמי השעתוק NFR2 (המעורבים בהומאוסטזיס חיזור) ו-NFKB, ובכך מסבירים את ההשפעות נוגדות החמצון והאנטי דלקתיות של verbascoside [40,52].
הנתונים שלנו חושפים גם תפקיד חשוב של verbascoside בפעילות המיטוכונדריה ובדינמיקה.
הסמן של איכות הפעולה המיטוכונדריאלית הוא הדינמיקה שלהם, תהליך המאופיין במחזורים מתואמים של אירועי היתוך וביקוע המווסתים את המספר, התפלגות, המורפולוגיה והפוטנציאל של הממברנה המיטוכונדריה [39]. בהתאם לאפשרות זו, verbascoside משפר את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית של tc3 הן בתנאי בסיס והן בתנאי לחץ. שוב, ההשפעה נובעת מ-verbascoside ולא ממטבוליטים שלו, שכן חומצת קפאין אינה משפרת את תפקוד המיטוכונדריה והידרוקסי-טירוסול מקטין באופן משמעותי את פוטנציאל האברונים. דינמיקה מוגברת של המיטוכונדריה ושינויים במורפולוגיה שלהם נצפתה על ידי מעקב אחר תנועות המיטוכונדריאליות, ובכך מצביע על כך ש-verbascoside מקדם תוכנית מיטו-מורפוזה. עיצוב מחדש של רשת המיטוכונדריה התאית משפיע על ההרכבה של מתחמי העל של שרשרת הנשימה, ובכך משנה לא רק את חילוף החומרים של התא אלא גם את מצב החיזור שלו ומאפשר לתאים להתמודד טוב יותר עם מתח חמצוני ודלקת [5,37,39].
למרות שהמנגנון המולקולרי עדיין לא ידוע, אנו יכולים לשער ש-verbascoside, כמו פוליפנולים אחרים, מגן על ה-DNA המיטוכונדריאלי על ידי הפחתת ריכוז ROS [53] ומונע את פתיחת נקבוביות המעבר של חדירות המיטוכונדריה [54], מה שמבטיח את הפעילות המיטוכונדריאלית הפיזיולוגית. אפשרות מסקרנת נוספת היא ששינוי הדינמיקה והפעילות של המיטוכונדריה מתווכת שוב על ידי פעולתו של verbascoside על ה-UPR. ואכן, מחקר שנערך לאחרונה בתחום המיטוכונדריה מצביע על כך שאתרים של אינטראקציה בין ER-מיטוכונדריה ממלאים תפקיד מפתח בשליטה על הדינמיקה והפעילות של המיטוכונדריה בתגובה ללחץ חמצוני ו-PERK מעורב בתופעה [55]. רוב המחקרים במבחנה עם פוליפנולים בוצעו בשורות תאים, לרוב ממקור גידולי, אשר שונה מהתאים המקוריים מבחינת חילוף החומרים וייצור ROS. אנו מספקים כאן ראיות לכך ש-verbascoside מפעיל אפקט מגן גם על איים מבודדים אנושיים של לנגרהנס, היעד הסופי להתערבות בסוכרת. מעניין שהפוליפנול מפחית את הפעלת איתות PERK כבר בתנאים בסיסיים, ובכך מגדיל את תכולת האינסולין ומונע חוסר תפקוד המיטוכונדריאלי בתיווך עקה חמצונית. נותר להבהיר האם השפעת הפוליפנול על תכולת האינסולין משקפת את יכולתה של התרכובת למנוע מוות של תאים, להפחית מתח ER או לשלוט ישירות על ביטוי גן האינסולין, כפי שמוצג עבור תרכובות פוליפנוליות אחרות [56]. נתונים אלו רלוונטיים במיוחד בהתחשב בשימוש האפשרי ב-verbascoside כטיפול משלים בטיפול בסוכרת.
5. מסקנות
מחקרים במבחנה שדווחו כאן על תאים משובטים ואנושיים מצביעים על כך ש-verbascoside מפעיל השפעות הגנה מפני הפרעות בתפקוד הקשורות ל-ER-סטרס, ממתן את ההפעלה של ענף ה-PERK של UPR ומשפר את הדינמיקה של המיטוכונדריה. מכיוון שהפרעה של הומאוסטזיס ER גוררת נזק לתאים וסוכרת, נתונים אלה מספקים רציונל לשימוש אפשרי ב-verbascoside כחומר תזונתי במניעת מחלות ובטיפול. עם זאת, יש צורך לפתור בעיות רבות לצורך יישום קליני יעיל של verbascoside. למרות השפע של מחקרי מעבדה, מחקרים קליניים אמינים המאשרים את ההשפעות הבריאותיות של verbascoside in vivo מוגבלים. יתר על כן, הגדלת היציבות והזמינות הביולוגית שלה היא חובה ליישום עתידי של תרכובת זו בבריאות האדם. מנקודה זו, verbascoside הוא מולקולה מעניינת מכיוון שלפיגום שלה יש אתרים תגובתיים שונים שניתן לשנות על ידי כימיה משולבת. אנו מצפים שהמידע הנובע ממחקרים אלה יפתח אפנון טיפולי של עקה חמצונית ודלקת במצבים פתולוגיים על ידי שימוש בתרכובות טבעיות.
חומרים משלימים: הדברים הבאים זמינים באינטרנט בכתובת http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. איור S1: השפעות של חומצת קפאין והידרוקסי-טירוסול על כדאיות התא. איור S2: השפעות של verbascoside על מתח ER המושרה על ידי tunicamycin. איור S3: השפעות של חומצת קפאין והידרוקסיטירוסול על פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית. איור S4: ניתוחי תמונה כמותיים של מיטוכונדריה בתאים שטופלו בחומצת קפאין והידרוקסיטירוסול. סרטוני וידאו S1, S2: דינמיקה של מיטוכונדריה מתועדת בתנאים בסיסיים, בהיעדר (S1) או נוכחות (S2) של verbascoside. וידאו S3, S4: דינמיקה של מיטוכונדריה מתועדת בתנאי לחץ חמצוני, בהיעדר (S3) או נוכחות (S4) של verbascoside.
תרומות מחבר: המשגה, AG, PM ו-CP; אצור נתונים, AG ו-PM; ניתוח פורמלי, AG ו-PM; רכישת מימון, CP; חקירה, MC; מתודולוגיה, AM ו-SG; משאבים, FB, RR ו-ADG; פיקוח, CP; אימות, AM, SG ו-MC; הדמיה, AG ו-AM; כתיבה-טיוטה מקורית, א.ג; כתיבה - סקירה ועריכה, PM, AM, FB, RR, ADG, MC ו-CP כל המחברים קראו והסכימו לגרסה שפורסמה של כתב היד.
מימון: מחקר זה לא קיבל מימון חיצוני.
תודות: ברצוננו להודות לקרלו קורינו ולמריו Dell'Agli על הריאגנטים והדיון המועיל.
ניגודי עניינים: המחברים אינם מצהירים על ניגוד עניינים.
הפניות
1. Cho, NH; שו, JE; Karuranga, S.; הואנג, י.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. IDF Diabetes Atlas: הערכות גלובליות של שכיחות סוכרת לשנת 2017 ותחזיות לשנת 2045. Diabetes Res. קלינ. תרגול. 2018, 138, 271–281. [CrossRef]
2. לסלי, RD; פאלמר, ג'; שלוט, צפון קרוליינה; לרנמרק, א. סוכרת בצומת דרכים: הרלוונטיות של סיווג מחלות לפתופיזיולוגיה ולטיפול. Diabetologia 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarz, VL; מקדונלד, PE; Klip, A. ביולוגיה של התא של תפקוד אינסולין מערכתי. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; דא דאלט, ל.; פירילו, א.; גלי, א.; Catapano, AL; Norata, GD מטבוליזם של כולסטרול, תפקוד תאי הלבלב וסוכרת. ביוכים. et Biophys. Acta (BBA) מול. בסיס דיס. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]
5. גלי, א.; אלג'יריה, מ.; מרציאני, פ.; שולטה, סי; ליאונרדי, סי; מילאני, פ.; מאפולי, ע.; טדסקי, ג.; Perego, C. עיצוב התמיינות ותפקוד תאי הלבלב: השפעת מכנוטרנסדוקציה. Cells 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. אשקרופט, FM; רורסמן, פ' סוכרת והתא: עשר השנים האחרונות. תא 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]
7. רוזנגרן, AH; בראון, מ.; מהדי, ת.; Andersson, SA; טראוורס, ME; שיגטו, מ.; ג'אנג, E.; אלמגרן, פ.; Ladenvall, C.; אקסלסון, א.ס.; et al. מופחתת אקסוציטוזיס של אינסולין בתאים לבלב אנושיים עם גרסאות גנים הקשורות לסוכרת מסוג 2. סוכרת 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonsky, KS דינמיקה של הפרשת אינסולין בהשמנת יתר וסוכרת. Int. ג'יי אובס. 2000, 24, S29–S31. [CrossRef]
9. רודן, מ.; שולמן, GI הביולוגיה האינטגרטיבית של סוכרת מסוג 2. טבע 2019, 576, 51–60. [CrossRef]
