חלק 2 אפליה כימית וגנטית של Cistanches Herba על בסיס UPLC-QTOF/MS ו-DNA ברקודים

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

OPLS-DA וזיהוי סמן כדי לזהות סמנים כימיים פוטנציאליים להבחנה בין שני המינים, נוצרה חלקת S של OPLS-DA (איור 3). בתרשים S, כל נקודה מייצגת זוג יונים tR–m/z אחד. צירי X ו-Y מייצגים את התרומה והביטחון של היון, בהתאמה; ככל שהמרחק שזוג היון tR–m/z מצביע מאפס גדול יותר, כך התרומה/הביטחון של הסמל הזה גדול יותר להפרש בין שתי הקבוצות. לפיכך, היון tR–m/z המצביע על שני הקצוות של ה-'S' מייצג את הסמנים האופייניים עם הביטחון הגבוה ביותר בכל קבוצה. תוצאות OPLS-DA הראו שניתן להשתמש ב-UPLC-QTOF/MS כדי להבחיןCistanche מדבריתמCistanche tubulosa(איור 3). סך של שישה סמנים אמינים ומשמעותיים נקבעו כדי להקל על האפליה של קבוצות אלה (טבלה 3). זהותם של שלושה סמנים פוטנציאליים הוקצו באופן טנטטיבי. הרכיבים המתואמים עם שלושת היונים הללו זוהו באופן טנטטיבי כאיזומרים של קמפנאוזיד II, ציסטנוסיד C ו-Cistanoside A. ניתן להשתמש בתרכובות הסמן a, b ו-c כדי להבחין בין שני מיני הצמחים, כמו עוצמות היונים של a ו-b בCistanche מדבריתהיה גבוה יותר מאשר בCistanche tubulosa(איור 4A, 4B), וניתן לזהות סמן c בCistanche tubulosa, אבל לא בCistanche מדברית(איור 4C).

ברקוד DNA: מידע על רצף ויעילות זיהוי

מידע על הרצף הוצג בטבלה 4. המרחק הגנטי הממוצע של psbA-trnH (0.1732) היה גדול יותר משני האזורים האחרים (0.0740 , 0.1197) באופן משמעותי. תכולת ה-GC הממוצעת של psbA-trnH (20.64 אחוזים) הייתה קטנה יותר משני האזורים האחרים (55.00 אחוזים, 55.00 אחוזים). למרות ששיעור ההצלחה של ITS ו-ITS2 לא הושג במחקר זה, אזור psbA-trnH פעל היטב בהגברה וברצף PCR (100 אחוז, 87.23 אחוז). יעילות הזיהוי הושגה על ידי ניתוח BLAST1 ושיטת המרחק הקרוב, ובעיקר שיקפה את שיעור ההצלחה של הברקודים. אזור psbA-trnH היה גבוה בבירור משני הברקודים האחרים ביעילות הזיהוי בהתבסס על שתי שיטות. המחסור ברצפים הוא ככל הנראה הסיבה לכך שאזור ה-ITS הציג 100 אחוז יעילות זיהוי על בסיס שיטת BLAST1, ו-0 על בסיס שיטת המרחק הקרוב.

ניתוח של סטייה גנטית באמצעות שישה פרמטרים

שישה פרמטרים שימשו לניתוח וריאציה תוך-ספציפית והתבדלות בין-ספציפית באמצעות שלושה ברקודים (טבלה 5). ההבדל המשמעותי בין וריאציות בין-ותוך-ספציפיות היה מעיד על התועלת של ברקודי ה-DNA. כאן, המרחק הבין-ספציפי המינימלי של שלושה ברקודים היה כולם גבוה מהמרחק התוך-ספציפי המרבי. יתרה מכך, לאזור psbA-trnH היה מרחק תוך-ספציפי מרבי ומרחק בין-ספציפי ממוצע גדולים יותר משני הברקודים האחרים, מה שמצביע על כך שאזור psbA-trnH פעל היטב בהבחנה בין שני מקורות של Cistanches Herba.

ניתוח פער ברקוד לזיהוי

Cistanche מדבריתוCistanche tubulosaפער הברקוד מציג את השונות המדהימה של בין ובין-מינים ומדגים התפלגות נפרדות, לא חופפות בין דגימות תוך-ובין-ספציפיות. במחקר זה (איור 5), טווח המרחק נקבע ל-0–0.45, מכיוון שהמרחק K2P הגדול ביותר של psbA-trnH ביןCistanche מדבריתוCistanche tubulosaהיה קרוב ל-0.45. שלושת הברקודים הראו פערים ברורים בהתפלגות של וריאציה תוך-ובין-ספציפית. יתר על כן, הפער של psbA-trnH היה גדול משמעותית משני הברקודים האחרים. לכן, אזור psbA-trnH יכול להיות ברקוד אידיאלי להבחין בין שני מקורות שלCistanchesהרבה.

עץ הצטרפות שכן (NJ).

עץ NJ ממחיש את הקשר בין מינים ומקל על קביעת התקבצותם. במחקר זה, עץ NJ של שלושה ברקודים נבנה על בסיס מודל K2P (איור 6). התוצאות הוכיחו ששני מקורותיה של ציסטאנצ'ס הרבה התקבצו לשני קלידים בנפרד. לפיכך, עץ NJ הבחין בבירור ביניהםCistanche מדבריתוCistanche tubulosa.

דיון ומסקנות

Cistanches Herba הוא חומר רפואי חשוב המשמש בדרך כלל להזנת הקהילה האסיאתית [38]. עם זאת, שני המקורות שלCistanchesהרבה, Cistanche מדבריתוCistanche tubulosa, בעלי הרכבים כימיים ופעילויות פרמקולוגיות שונות בהתאמה. במקביל, שני המקורות שונים ביישום הקליני ובשוק הסחורות. הסיווג של Cistanche מבולבל ותחליפים ונואפים מאסיביים מציפים את השוק עקב המחסור במשאבים וסביבת גידול מיוחדת עבור Cistanches Herba. הסוג של Cistanche מקובל לכלול ארבעה מינים וגרסה אחת:Cistanche מדברית, Cistanche tubulosa, Cistanche סיננסיס, Cistanche סלסה, וCistancheסלסהvar. אלביפלורה [39]. חוקרים ביפן שקלו את המקור שלCistanchesהרבה כמוCistanche סלסה[40–43], בזמן שזה זוהה כCistanche מדבריתמאת טו [44–46]. לכן, הוא מבולבל בסיווג של Cistanche, וקשה להבחין בין שני המקורות של Cistanches Herba. שיטות מסורתיות לבקרת איכות של Cistanches Herba הן זיהוי מורפולוגי [47,48], זיהוי מיקרוסקופי [49] ו-TLC (Thin-Layer Chromatography) [50,51], FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) [14], HPLC (High). Performance Liquid Chromatography) [52,53]. השיטה המורפולוגית והמיקרוסקופית יכולה להבדיל בקלות בין מינים מזנים או משפחות שונות שיש להם הבדלים גדולים במאפיינים מורפולוגיים ומיקרוסקופיים, בעוד שקשה להבחין בין מינים של אחים. TLC ו-FTIR יכולים להבחין בבירור בין מינים שיש להם סוגים שונים של הרכבים כימיים, בעוד שקשה לקבוע את הרכיב הכימי ואת התוכן. HPLC משמש בעיקר להבחנה בין מינים עם תכולת יסודות כימיים שונים, עם זאת, זמן הניתוח ארוך יותר והרגישות נמוכה יחסית ל-UPLC. בהתאם, טכנולוגיית UPLC-QTOF/MS הייתה מהירה ומדויקת יותר בקביעת הרכב כימי משיטות כימיות אחרות. שיטות זיהוי מולקולריות מראות היטב באבחון המבוסס על השונות הגנטית, כגון SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) [54], AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [55,56]. עם זאת, שיטות מולקולריות אלו אינן קלות לתפעול ואינן אוניברסליות. בהתאם, ברקוד DNA יכול להבחין בין מינים באופן אוניברסלי, מהיר ומדויק יותר משיטות מולקולריות אחרות. עבור המינים מאותו סוג ומקשר גנטי קרוב, שיטות אלו לבדן עשויות לא להצליח בזיהוי.

כאן, שילבנו UPLC-QTOF/MS וברקוד DNA בזיהויCistanche מדבריתוCistanche tubulosaוהעריך את הסמנים הכימיים והמולקולריים שיאפשרו להפלות אותם. 23 שיאי מסה מתאימים זוהו ו-16 זוהו באמצעות UPLC-QTOF/MS, ושלוש תרכובות סמן פוטנציאליות נמצאו תחילה כמאפשרות את ההבחנה בין שני מקורות על ידי ניתוח PCA ו-OPLS-DA. יתר על כן, ארבעה אינדיקטורים הוערכו על ידי טכנולוגיית ברקוד DNA במונחים של יכולתם להבדיל בין שני מקורות: יעילות זיהוי, יעילות גנטית, פער ברקוד וניתוח עץ NJ. אזור psbA-trnH נתמך כברקוד DNA מתאים להבחנהCistanche מדבריתוCistanche tubulosa. לסיכום, ראשית הקמנו שיטה חדשה משולבת לניתוח מולקולרי וכימי להבחנה ובקרת איכות בשני מקורות של Cistanches Herba. ברקוד DNA יכול להבחין בין שני מקורות בשונות גנטית ולאמת מינים באופן אוניברסלי ומדויק; טכנולוגיית UPLC-QTOF/MS יכולה לנתח הרכב כימי כדי להעריך את איכות החומרים הרפואיים במהירות ובדייקנות. השיטה המשולבת של ברקוד DNA וטכנולוגיית UPLC-QTOF/MS מבטיחות זיהוי במספר מקורות של חומרים רפואיים בצורה מדויקת ומדעית יותר ועשויה לשמש שיטה לזיהוי מינים או סוגים מבלבלים אחרים בסיווג.

תרומות מחבר

הגה ותכנן את הניסויים: LFH SHZ LBW. ביצע את הניסויים: SHZ LBW. ניתח את הנתונים: SHZ LBW. ריאגנטים/חומרים/כלי ניתוח תרמו: LFH. כתב את המאמר: SHZ XJ LBW. בדוק את כתב היד: ZHW.

ל- Cistanche deserticola השפעות רבות, לחץ כאן כדי לדעת יותר

הפניות

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY, ועוד. (1996) השוואה על הזנת הכליות ויאנג המחזקת את היעילות של שלושה מינים שונים שלהרבהציסטנסים. Journal of Chinese Medicinal Materials 19: 420–421.

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) השוואה על תפקודי הזנת הכליות וחיזוק היאנג של שלושה מינים שונים שלהרבהציסטנסים. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171.

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) התקדמות במחקר של מרכיבים כימיים בצמחים שלCistancheנופף. et Link. תרופות סיניות מסורתיות וצמחיות 34: 473–476.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, et al. (2006) אמינוגליקוזידים פנילתנואידים ואוליגוסוגרים אצילים עם פעילות מרגיעת כלי דםCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 14: 7468–7475.

5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, et al. (2009) ההשפעות ההיפוכולסטרולמיות שלCistanchetubulosaתמצית, תרופה סינית מסורתית גסה, בעכברים. Am J Chin Med 37: 1125–1138.

6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, et al. (2010) השפעה מעכבת של אקטאוזיד מבודד מCistanchetubulosaעל שחרור מתווך כימי וייצור ציטוקינים דלקתיים על ידי תאי RBL-2H3 ו-KU812. פלנטה מד, 1512–1518.

7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) אמינוגליקוזידים פנילתנואידים אצילים עם פעילות מגוננת על הכבד מצמח המדברCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 18: 1882–1890.

8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et al. (2010) גליקוזידים אירידואידים ואציקליים מונוטרפן, קנקנוזידים L, M, N, O ו-P מCistanchetubulosa. Chem Pharm Bull (טוקיו) 58: 1403–1407.

9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) זיהוי וסקר של סמים גולמיים מסחריים של herba cistanche. כתב עת לחומרי רפואה סיניים 20: 117-122.

10. Zhu SY (2001) זיהוי פרמקוגנוסטי שלCistanchetubulosaמין מבולבל שלCistancheמדברית. כתב עת לחומרי רפואה סיניים 24: 24–25.

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, ועוד. (2013) זיהוי מיקרוסקופי של שלושההרבהציסטנסיםבשין ג'יאנג. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883.

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) זיהוי מיקרוסקופי של מסחריהרבהCistanchesבטכניקת הדמיה דיגיטלית. Journal of Chinese Medicinal Materials 27: 400–402.

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) מחקר על זיהוי שלהרבהציסטנסיםונואפים. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318.

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, et al. (2010) מחקרים ספקטרוסקופיים FTIR ו-2D-IR על מקורות שונים שלהרבהציסטנסים. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900.

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, et al. (2009) זיהוי שלCistancheמדבריתמ- Boschniakla rossica ו- Cynomorium solarium באמצעות FTIR וספקטרוסקופיה IR מתאם דו מימדי. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507.

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) מחקר על טביעת אצבע HPLC שלCistancheמדברית. Pharm Care & Res 8: 255–257.

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) טביעת אצבע כרומטוגרפית שלCistancheמדבריתעל ידי HPLC. תרופות סיניות מסורתיות וצמחיות 36: 268–271.

18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, et al. (2010) זיהוי שלCistancheמינים (Orobanchaceae) המבוססים על רצפים של האזור הבין-גני פלסטידי psbA-trnH. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130.

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) זיהוי שלCistancheמינים לפי כימיים ו-Inter-Simple Sequence Repeat Fingerprint. ביול. פארם. בול., 32: 142–146.

20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, et al. (2012) אפיון מבני וזיהוי של פנילתנואידים גליקוזידים מCistanchesמדבריתYC Maמאת UHPLC/ESI-QTOF- MS/MS. ניתוח פיטוכימי 23: 668–676.

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS Analysis of Alkaloids in Traditional Processed Coptis chinensis Franch. Evid Based Complement Alternat Med 2012: 942384.

22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) חקירת טכנולוגיית עיבוד של עלה Loquat (Eriobotrya japonica) על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה-ביצועית- Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry בשילוב עם כיממטריה. PLoS ONE 8: e64178.

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) ברקוד חיי בעלי חיים: ציטוכרום c oxidase subunit 1 הבדלים בין מינים קרובים. פרוק. R. Soc. לונד. B., 270 Suppl 1: S96–99.

24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) זיהויים ביולוגיים באמצעות ברקודים של DNA. Proc Biol Sci., 270: 313:321.

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) שימוש בברקודים של DNA לזיהוי צמחים פורחים. Proc Natl Acad Sci., 102: 8369–8374.

26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, et al. (2010) אימות של אזור ITS2 כברקוד DNA חדש לזיהוי מיני צמחי מרפא. PLoS One 5: ה8613.

27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et al. (2011) MEGA5: ניתוח גנטיקה אבולוציונית מולקולרית תוך שימוש בשיטות סבירות מרבית, מרחק אבולוציוני ושיטות חסינות מקסימלית. Mol Biol Evol 28: 2731–2739.

28. Meyer CP, Paulay G (2005) ברקוד DNA: שיעורי שגיאה המבוססים על דגימה מקיפה. PLoS Biol 3: e422.

29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studies on the ConstituentsCistancheהרבה.IV. בידוד ומבנים של שני גליקוזידים פנילפרופנואידים חדשים, Cistanosides C ו-D. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885.

30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the Constituents ofCistancheהרבה. VI. Isolation and Structures of a New Iridoid Glycoside, 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645–3650.

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) בידול שלהרבהCistanchesעל ידי טביעת אצבע עם כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים – זיהוי מערך דיודות – ספקטרומטריית מסה. Journal of Chromatography A 1216: 2156–2162.

32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, et al. (2012) אפיון מבני וזיהוי של פנילתנואידים גליקוזידים מCistanches deserticola YC Maמאת UHPLC/ESI–QTOF–MS/MS. Phytochem Anal 23: 668–676.

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, et al. (2008) בידוד וטיהור של phenylethanoid גליקוזידים מCistancheמדבריתעל ידי כרומטוגרפיה זרם נגדי במהירות גבוהה. Food Chemistry 108: 702–710.

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, et al. (2013) ניתוח כמותי שלCistanchesהרבהבאמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשילוב עם זיהוי מערך דיודות וספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה בשילוב שיטות כיומטריות. J Sep Sci 26: 1945–1952.

35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the ConstiuentsCistancheהרבה. V. בידוד ומבנים של שני גליקוזידים חדשים של פנילפרופנואידים, Cistanoside E ו-F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457.

36. Jiang Y, Tu PF (2009) ניתוח של מרכיבים כימיים בCistancheמִין. J Chromatogr A 1216:1970–1979.

37. Masssart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) טיפול בנתונים במדע וטכנולוגיה. כיממטריקה: ספר לימוד.

38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014) Ecotypes ofCistanche deserticolaמבוסס על רכיבים כימיים ותכונות מולקולריות. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328.

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) מחקר ופיתוח תעשייתי של הרבהציסטנסים. Journal of Chinese Pharmaceutical 46: 882–887.

40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, et al. (1987) phenylethanoid גליקוזידים חדשים מCistanchetubulosa(SCHRENK) הוק. ו. I. Chem Pharm Bull 35: 3309–3314.