איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

בבקשה, לחץ כאן לחלק 1

בבקשה, לחץ כאן לחלק 3

Cistanche יכול לשפר את הזיכרון

בהתחשב בממצאים אלה, בשלב הבא בדקנו אם הגדיל את ביטוי ההיפוקמפוס miR-466f-3p בעכברים לאחר למידה מרחבית וזיכרוןהיווצרות השפיעה גם על המורפולוגיה הנוירונית in vivo. באופן משמעותי, מצאנו שצפיפות עמוד השדרה הממוצעת של נוירוני ההיפוקמפוס של עכברי GLN הייתה גבוהה מזו של עכברי PLN, כפי שהתגלה על ידי הספגה של גולגי של הפירמידה.

איור 3. השפעות של שינוי ברמות הביטוי miR-466f-3p של ההיפוקמפוס על ביצועי MWM של עכבר

(א) ציר זמן ניסיוני של משימת MWM, ניתוח ביטוי או מדידת אלקטרופיזיולוגיה של מוחות העכבר לאחר הזרקת lentivirus.

(ב) לוחות שמאל: ביטוי של dsRed בהיפוקמפוס של עכבר. תמונות IF מייצגות בהגדלה נמוכה וגבוהה של היפוקמפוס מעכברים שנדבקו בנגיפים רקומביננטיים המבטאים dsRed בלבד כפקד (עמודה שמאל של תמונות) או miR-466f-3p בתוספת dsRed (מימין עמודת תמונות). האזורים המסודרים של שתי התמונות העליונות מוגדלים ומוצגים למטה. מוטות קנה מידה, 100 מ"מ. הקווים המקווקוים מציינים את הגבולות של DG. גרעינים נצבעו ב-DAPI. GCL, שכבת תאים גרגירים; ML, שכבה מולקולרית. היסטוגרמה ימנית, רמות ביטוי יחסיות של miR-466f-3p בהיפוקמפוס של עכבר הנגוע ב-lentivirus המביע שליטה או miR-466f-3p, כפי שנבדק על ידי RT-qPCR ( n=16 לקבוצה).

(ג) ביצועי MWM של עכברים שנדבקו בנגיפים רקומביננטיים שונים, ארוזים בשימוש בחמישה פלסמידים שונים המבטאים dsRed-only, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p, ו-miR/SCR-ספוגים, בהתאמה, לתוך ההיפוקמפוס שלהם (n=13, 26, 16, 19 ו-11 לקבוצה, בהתאמה). פאנל שמאלי: חביון בריחה במהלך האימון. חלונית ימנית: זמן אחזור פרטני במפגש השישי.

הנתונים המוצגים ב-(B) מוצגים כממוצע ± SD, והנתונים המוצגים ב-(C) מוצגים כממוצע ± SEM. מובהקות סטטיסטית הוערכה על ידי מבחן t לא מזווג (B), ANOVA דו-כיווני עם השוואה פוסט-הוקית של Bonferroni (C, פאנל שמאלי), או ANOVA אחד עם מבחן הפוסט-הוק של Tukey (C, פאנל ימני). הבדלים סטטיסטיים: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" ו-****p="">< 0.0001;="" *mir-466f-3p="" לעומת="" אחרים;="" #mir-ספוג="" לעומת="">

נוירונים בהיפוקמפוס עכבר GLN ו-PLN (איור S3). ממצאים אלו מוכיחים ש-upregulation של miR-466f-3p של ההיפוקמפוס מקדם גדילת עצבים ויצירת עמוד שדרה דנדריטי, דבר הדומה להשראת צפיפות עמוד השדרה שנצפתה בהיפוקמפוס של עכברי GLN ביחס לעכברי PLN.

miR-466f-3p מווסת באופן חיובי למידה מרחבית של עכבר וזיכרוןביצועים, כמו גם פלסטיות סינפטית

כדי לחקור אם miR-466f-3p מווסת באופן חיובי את הלמידה המרחבית של העכברזיכרוןהיווצרות, השתמשנו בגישה של זיהום lentivirus רקומביננטי כדי לבטא יתר על המידה את ה-miRNA בהיפוקמפוס העכבר. העכברים נותחו 7 ימים לאחר הזרקת lentivirus ל-DG (איור 3A). תמונות מייצגות של רמות ביטוי הירך של miR-466f-3p אכן היו מוגברות בקבוצת ביטוי היתר miR-466f-3p בהשוואה לקבוצת הביקורת (היסטוגרמה ימנית באיור 3B). מצאנו כי עכברים עם ביטוי יתר בהיפוקמפוס של miR-466f- 3p והיו נתונים למשימת MWM הפגינו חביון בריחה של 88 ± 5 שניות בפגישה הראשונה ו-19 ± 1 שניות במפגש השישי (אדום קו נקודות, איור 3C), שהיו טובים יותר מאשר לעכברי בקרת וקטור (קו שחור) או עכברי שליטה מוטנטיים (קו עיגול אדום) ודומים לאחביות הבריחה של עכברי GLN המתוארים באיור 1A. במקביל, בחנו את ההשפעה של אובדן תפקוד miR-466f-3p על למידה מרחבית וזיכרוןעל ידי עיכוב miR-466f-3p באמצעות ספוג miR. יש לציין שביצועי ה-MWM של עכברים שבהם היפוקמפוס miR-466f-3p נלכד על ידי ספוג ה-miR היו דומים לאלו של עכברי PLN, כלומר, הם לא למדו למצוא את הפלטפורמה אפילו על ידי הפגישה האחרונה (קו ריבוע ירוק ומוצק,

איור 3C). יתר על כן, נראה כי עכברים שהוזרקו עם lentivirus לא שיבשו את הפלסטיות ההומיאוסטטית, מכיוון שכמה עכברים בכל קבוצה למדו או לפחות היו בתהליך למידה במהלך הפגישה האחרונה (איור 3C, היסטוגרמה ימנית).

בהתחשב בכך שביטוי יתר של miR-466f-3p בהיפוקמפוס של עכברים שיפר את הלמידה שלהםזיכרוןיכולת, ניתחנו את האלקטרופיזיולוגיה ההשוואתית של נוירונים בהיפוקמפוס מתורבתים המבטאים רמות שונות של miR-466f-3p. הזרם הפוסט-סינפטי המיניאטורי המעורר (mEPSC) מנוירונים בהיפוקמפוס DIV14 המבטאים יתר על המידה miR-466f-3p או mut-miR-466f-3p, miR-sponge או בקרה היה הוקלט באמצעות מהדקי תיקון של תא שלם. בעוד שלא היו הבדלים משמעותיים באמפליטודת mEPSC, העלייה Tau או דעיכת Tau בין ארבע קבוצות הדגימות, תדירות ה-mEPSC של נוירונים המבטאים יתר על המידה miR-466f-3p הייתה גבוהה משמעותית בהשוואה ל קבוצות אחרות (איור 4A), המצביעות על כך שקולטנים גלוטמינרגיים פוסט-סינפטיים הופעלו חזק יותר לאחר ביטוי יתר של miR-466f- 3p.

לאחר מכן מדדנו פוטנציאל ארוך טווח (LTP) כדי לקבוע ישירות את התפקיד של miR-466f-3p בפלסטיות סינפטית in vivo. הזרקו את ההיפוקמפוס של עכברים עם וירוס רב-קומביננטי כמתואר באיור 3 ולאחר מכן גרם לחתיכות LTP בהיפוקמפוס על ידי גירוי טטני (שלוש רכבות של גירוי בתדר גבוה [3xHFS]) של מסלול העזר של Schaffer. מצאנו שהפרוטוקול שלנו גרם ל-LTP בכל הקבוצות, כפי שמעידה עלייה מתמשכת בפוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררי שדה (fEPSPs) באזור cornu ammonis 1 (CA1) (איור 4B, לוח שמאל). ה-LTP היה חזק יותר בפרוסות המבטאות יתר של miR-466f-3p (188 אחוז ± 2 אחוז מקו הבסיס ב-40-50 דקות לאחר הגירוי, ממוצע ± SEM) בהשוואה למוטציה (169 אחוז ± 1 אחוז) מהקו הבסיסי), ספוג SCR (173 אחוז ± 3 אחוז מקו הבסיס), ופרוסות נגועות בנגיף בקרה (159 אחוז ± 2 אחוז מקו הבסיס), כעיכוב miR-466f-3p על ידי ספוג miR הפחית את ה-LTP (128 אחוז ± 1 אחוז מקו הבסיס) ביחס לבקרות (איור 4B, לוח ימין). מדדנו גם את ה-LTP של קבוצות GLN ו-PLN לאחר האימון. הנתונים המתאימים גם חשפו הבדלים משמעותיים בשיפוע ה-fEPSP באזור CA1 בין קבוצות GLN ו-PLN (איור 4C). לפיכך, רמה מוגברת של miR-466f-3p משפרת את ה-LTP והפלסטיות הסינפטית שיכולה, בתורה, לקדם את הלמידה והזיכרוןיכולת של עכברים. יחד, הנתונים המוצגים באיורים 2, 3 ו-4 מוכיחים כי miR-466f-3p ממלא תפקיד חיובי קריטי בלמידה מרחבית וזיכרוןהיווצרות, ככל הנראה על ידי שיפור היווצרות עמוד השדרה, LTP וחוזק הפלסטיות הסינפטית.

Mef2a mRNA הוא יעד רגולטורי של miR-466f-3p

ערכנו ניתוח ביואינפורמטיקה כדי לזהות mRNA מטרה פוטנציאליים המווסתים על ידי קישור של miR-466f-3p ל-30 UTRs שלהם. בין המועמדים שזיהינו היה ה-mRNA Mef2a המקודד ל-MEF2A. מעניין לציין כי ביטוי MEF2A נמצא בעבר מווסת לאחר אימון MWM, וביטוי יתר של גורם זה השפיע לרעה על הביצועים של עכברים (Cole et al., 2012). לכן, השתמשנו ב-luciferase reporter assay כדי לבדוק אם miR-466f-3p מסדיר את התרגום של Mef2a mRNA על ידי קישור ל-30 UTR שלו. הכנסנו רצפי Mef2a 30 UTR מסוג פראי או מוטנטי במורד הזרם של SV40--cDNA מונע על ידי מקדם luciferase (Luc), וכתוצאה מכך נוצר פלסמיד הכתב psiCHECK2-MEF2A 30 UTR או psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (איור 5A). כפי שמוצג בהיסטוגרמה השמאלית של איור 5B, ביטוי משותף של miR-466f-3p החליש את הביטוי של לוציפראז שמכוון על ידי Mef2a 30 UTR. נראה שהאפקט הזה תלוי באינטראקציה בין miR-466f-3p ו-Mef2a 30 UTR מאז מוטציה של אתר הקישור החזוי של miR-466f-3p on ה-Mef2a 30 UTR (50-UGU- GUAU-30) או אזור הזרע של miR-466f-3p (50-AUACACA-30) זיהוי Mef2a 30 UTR ביטלה את ההשפעה המעכבת של miR-466f-3p על פעילות הלוציפראז (איור 5B, היסטוגרמה אמצעית). יתר על כן, ביטוי משותף של ספוג ה-miR, אך לא ספוג ה-CR, ביטל גם את ההשפעה המדכאת של miR-466f-3p על פעילות הלוציפראז (איור 5B, היסטוגרמה ימנית). יש לציין, לא לביטוי יתר של miR-466f-3p או ל-miR-ספוג לא הייתה השפעה כלשהי על רמות ה-mRNA של Mef2a בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס (איור 5C), אבל הם כן הפחיתו או הגדילו, בהתאמה, את רמת חלבון MEF2A (איור 5D). מצאנו גם שביטוי יתר של miR-466f-3p או miR-ספוג, בהתאמה, הוריד או העלה את רמת ה-mRNA של חלבון (Arc) הקשור לפעילות ציטו-שלד בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס (איור 5C) , שהיה יעד ידוע במורד הזרם המוסדר באופן חיובי על ידי MEF2A (Flavell et al., 2006)

ביצענו גם הכלאה של פלואורסצנציה במקום (FISH) כדי לזהות miR-466f-3p ושילבנו אותו עם תיוג IF של MEF2A בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס DIV14 ללא או עם טיפול בפורסקולין. ידוע כי פורסקולין מעורר LTP כימי ומפעיל אדניליל ציקלאז, ובכך מעלה את רמות ה-cAMP התוך תאי. צפינו בקולקליזציה גרעינית של MEF2A עם miR-466f- 3p, כפי שמודגם על ידי התמונות המייצגות באיור 5E. עם זאת, לאחר גירוי פורסקולין, האות miR-466f-3p עלה גם בסומה וגם בדנדריטים, בעוד שאות MEF2A ב-

הגרעין הצטמצם, כפי שמוצג על ידי השינויים ההדדיים של עוצמות האותות MEF2A ו-Fast Red, בהתאמה, של תאי העצב הבודדים (איור 5E). לסיכום, הנתונים באיורים 5A-5E מצביעים על כך ש-miR-466f-3p מווסת באופן שלילי את הביטוי של חלבון MEF2A על ידי קישור ל-30 UTR של Mef2a mRNA וכתוצאה מכך דיכוי התרגום שלו.

בהתאם לתוצאות שתוארו לעיל, מצאנו שרמות ההיפוקמפוס של חלבון MEF2A היו מווסתות בעכברי GLN לאחר אימון MWM, אך לא בעכברי PLN (איור 5F). יתר על כן, הרמות היחסיות של MEF2A בעכברי GLN בודדים (נקודות) ועכברי PLN (ריבועים) היו בקורלציה הפוכה לרמות miR-466f-3p (R=0.60, איור 5G). לפיכך, דפוסים הטרוגניים של למידה מרחבית וזיכרוןהיכולת מווסתת על ידי עליות סטוכסטיות של miR- 466f-3p hippocampal בעכברים בודדים וכתוצאה מכך ירידה של MEF2A עם גירוי של פעילות עצבית.

הפעלה סטוכסטית של CREB בהיפוקמפוס וכתוצאה מכך וויסות עליות תעתיק של אשכול ה-miR- 466-669 במהלך אימון MWM

חקרנו את המנגנונים שבאמצעותם ניתן להגביר את הוויסות הסטוכסטי של ה-MWM בהיפוקמפוס של עכבר. ישנם שלושה מבשרי miRNA המקודדים miR-466f-3p, כולם שייכים לצביר miR-466-669 הספציפי למכרסמים הממוקם באינטרון 10 של הגן המארח שלו, mSfmbt2 (Inoue et al. ., 2017) (איור 6א). מעניין שבניגוד ל-miR-466f-3p, לא היה הבדל משמעותי ברמות הביטוי של mSfmbt2 בין GLNandPLNgroups(איור 6B), מה שמרמז שאשכול ה-miR-466-669 עשוי לקודד תמליל נפרד במקום להיות חלק מהתמליל הראשי של mSfmbt2. בהתאם לכך, תכננו מספר קבוצות של פריימרים כדי לזהות את התעתיק הראשי המשוער של צביר miR-466-669 על ידי RT-qPCR. כפי שמתואר באיור 6A, קטע PCR ארוך (בתוספת 282 עד 2,381), יחד עם סדרה של פסי qPCR חופפים, כלומר A (בתוספת 282 עד 115), B (131 עד 406), C (388 עד 686), D ( 662 עד 1,028), E ( 1,004 עד 1,299), F ( 1,242 עד 1,629), G ( 1,605 עד 2,029), ו- H ( 2,005 עד 2,381), יכלו להיות מזוהים בהיפוקמפוס של עכבר, אך לא בחלק I (62, 306 עד 2, 2, 7 ) (נתונים לא מוצגים). נתונים אלו תומכים בכך שה-miR-466-669 קידד תמליל ארוך ליד כ-2,388 bp במעלה הזרם של מבשר ה-miRNA הראשון (כלומר, pre-mir-466m, מסומן בתוספת 1inFigure6A). באופן מדהים, בדומה למה שמצאנו עבור miR-466f-3p, הרמה הממוצעת של תמלול זה בהיפוקמפוס של עכברי GLN הייתה גבוהה יותר מאשר עבור עכברי PLN (איור 6C). לפיכך, למידה משופרת וזיכרוןהיכולת של עכברי GLN נובעת מהפעלה תעתיק של אשכול miR-466-669.

הפעלה של CREB גרעיני על ידי זרחון במהלך משימות MWM או בצורות אחרות של למידה היא צעד קריטי להמרת טווח קצר לטווח ארוך.זיכרון(Lisman et al., 2018; Rogerson et al., 2014). לכן, בדקנו אם הרמות המשתנות של miR-466f-3p בקרב עכברים בודדים שעברו את משימת MWM עשויות להיות מתואמות עם מצב ההפעלה של CREB. כדי לחקור רעיון זה, תחילה בחנו את רמות הזרחון של CREB בהיפוקמפוס בעכברים בודדים. כפי שמוצג באיור 6D, הפעלת CREB (על ידי זרחון בשייר S-133) הוגברה בעכברי GLN ביחס לעכברי PLN ו-HC. אישרנו גם ש-miR-466f-3p אכן בא לידי ביטוי יחד עם pCREB בנוירונים על-ידי ביצוע miRNA ISH בשילוב עם צביעת IF של pCREB ו-MAP2 בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס (איור S2A). יתרה מזאת, רמות התעתיק העיקריות של צביר miR- 466-669 היו בקורלציה חיובית עם pCREB בעכברי GLN (R=0.52), בעוד שהוא נמצא בקורלציה שלילית עם pCREB בעכברי PLN (R=0 .71) (איור 6ה). בדקנו מתאם בין רמות של גורם פעיל אחר, phos-pho-extracellular signal-regulated kinase (pERK), לבין רמות התעתיק הראשי של אשכול miR-466-669. מצאנו ששני הסוגים של עכברים מאומנים ב-MWM הציגו מתאמים חיוביים בין אות המקבץ miR-466-669 ו-pERK (R=0.59 ו-0.48, בהתאמה; איור S4A), ולא היה הבדל ב-pERK/ ביטוי tERK בין שתי הקבוצות הללו (איור S4B). כדי להבהיר עוד יותר את ההשפעה של הפעלת CREB על וויסות העלאת התעתיק של אשכול -466-669המיR, וכתוצאה מכך,

inductionofmiR-466f-3p,weusedaspecificCREBinhibitor,666- 15 (Xie et al., 2015), בשילוב עם טיפול בפורסקולין בנוירונים ראשיים בהיפוקמפוס DIV14. ידוע כי פורסקולין מפעיל זרחון CREB (Malhotra et al., 2015). מצאנו שטיפול מקדים של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס עם 666-15 חסם הפעלת CREB הנגרמת על ידי פורסקולין (איור 6F) והפחית את רמות ה-miR-466f-3p ו-miR-466-669 תמלול (איורים 6G ו-6H). במקביל, רמות ה-mRNA של גני היעד הידועים pCREB nurr1 ו- homer1a (Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017) הופחתו גם הם בטיפול 666-15 (איור 6H). ביחד, איור 6 מראה שהפעלה סטוכסטית של CREB בהיפוקמפוס של תת-אוכלוסיה של עכברים מגזעים שעוברים משימת MWM גורמת לשעתוק של צביר miR-466-669 וכתוצאה מכך, אינדוקציה של miR-466f{{23 }}p, ובכך לשפר את הלמידה המרחבית שלהם וזיכרוןיכולת לבצע טוב יותר במשימה.

דִיוּן

חקרנו את התפקיד האפשרי של miRNAs בוויסות היכולת המשתנה של למידה מרחבית וזיכרוןבין עכברי C57BL/6J הגזעים. אנו מציעים שהפעלה סטוכסטית של CREB וכתוצאה מכך וויסות עלייה של miR-466f-3p בהיפוקמפוס גורמים ללמידה מרחבית גדולה יותרזיכרוןיכולת של תת-קבוצה של עכברי הבדיקה שלנו, ככל הנראה עקב miR-466f-3p המתווך עיכוב תרגום של Mef2a mRNA המקודד אתזיכרוןרגולטור שלילי MEF2A. הממצאים שלנו מספקים תרחיש המדגים את התפקיד הפונקציונלי והאבולוציוני של מירנה ספציפית בוויסות הקוגניציה באמצעות אינדוקציה סטוכסטית של ציר CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A על ידי גירויים סביבתיים.

משימת MWM הייתה בשימוש נרחב כדי לבחון את היכולת המשתנה של למידה מרחבית וזיכרוןעבור מכרסמים. בתנאים רגילים, מכרסמים משתמשים ברמזים דיסטליים כדי להתמצא, מה שמאפשר להם ללמוד ולשנן את המיקום של הפלטפורמה המוסתרת במשימה. רוב עכברי ה-C57BL/6J הגזעים בניסוי שלנו (62 אחוזים) הפגינו דפוס נורמלי של חביון בריחה, ומצאו את הפלטפורמה תוך 30 שניות עד למפגשים השלישיים-6(איור 1A, GLN). לעומת זאת, קבוצה של עכברים (38 אחוז) לא למדה את המשימה אפילו במפגש השישי (PLN). יש לציין, שהעמדנו את העכברים גם לשתי בדיקות זיהוי אחרות. הראשון היה מבחן זיהוי אובייקטים חדשני (NOR), שהוא ניסוי יחיד המבוסס על חקר מולד ללא חיזוקים או לחץ כדי להניע התנהגות (Leger et al., 2013). המתאם בין משימות NOR ו-MWM במונחים של ביצועי עכבר הוא גרוע (R {{1{{20}}}}.13), דבר הדומה למתאם בין ביצועי NOR ורמות הביטוי ההיפוקמפוס של miR-466f-3p (R=0.01; נתונים לא מוצגים). בדיקת NOR לא גילתה הבדלים במדד ההבחנה בין קבוצות MWM GLN ו-PLN (0.36 ± 0.25 לעומת 0.29 ± 0.18; איור S1B). השני למידה מרחבית וזיכרוןמשימה תלויה שהחלנו היא מבוך בארנס (BM), שדומה ל-MWM. היא מבוססת על ההנחה שמכרסמים המוכנסים לסביבה סוררת צריכים ללמוד ולזכור את מיקומה של תיבת מילוט הממוקמת מתחת לפני השטח של הרציף. כפי שמוצג באיור S1C, מצאנו שביצועי העכבר בניסויי הבדיקה של BM נמצאים גם בקורלציה חיובית עם רמות הביטוי ההיפוקמפוס של miR-466f-3p. לפיכך, אינדוקציה של ציר CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A בהיפוקמפוס במהלך למידה וזיכרוןהיווצרות תלויה בהקשר מרחבי.