חלק 1:מיפוי יחסי הגומלין האפיגנומיים והתעתיקיים במהלך היווצרות הזיכרון והיזכרותו באנסמבל ההיפוקמפוס אנגרם

לעוד information:ali.ma@wecistanche.com

Pls לחץ כאן לחלק 2

אסף מרקו1,2,*, הירוי ס. מהרנה1,2, וישנו דיליפ1,2, רביקרן מ. ראג'ו1,4, חוסה דווילה- ולדריין3, איימי ז'אנג2, צ'ינקקארופאן אדייקקאן1,2, ג'ני ז. יאנג1,2, פאן גאו1, מנוליס קליס3,5, לי-הוי טסאי1,2,5,*

1מכון פיקובר ללמידה וזכרוןהמכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"ב.,

2מחלקה למדעי המוח והקוגניציה, המכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"ב.

3מעבדה למדעי המחשב ובינה מלאכותית, המכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"ב.

4מחלקה לרפואת יילודים, בית החולים לילדים בבוסטון, בית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב.

5מכון הרווארד ו-MIT, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"ב.

לחץ אלחנות הוויטמינים Cistanche ו- Cistanche לזיכרון

מופשט

הארכיטקטורה הגנומית האפיגנומית והתלת-ממדית (3D) מתגלות כגורמי מפתח בוויסות הדינמי של תוכניות שעתוק שונות הנדרשות לתפקודים עצביים. כאן אנו משתמשים במערכת תיוג תלוית פעילות בעכברים כדי לקבוע את המצב האפיגנטי, את ארכיטקטורת הגנום התלת-ממדי ואת הנוף השעתוק של תאי אנגרמה לאורך תוחלת החיים שלזכרוןהיווצרות והיזכרות. הממצאים שלנו חושפים כיזכרוןקידוד מוביל לאירוע פרימה אפיגנטי, המסומן בנגישות מוגברת של משפרים ללא שינויי שעתוק תואמים.זכרוןאיחוד מביא לאחר מכן לארגון מחדש מרחבי של מקטעי כרומטין גדולים ולאינטראקציות מקדם-משפר. לבסוף, עם הפעלה מחדש, נוירוני אנגרמה משתמשים בתת-קבוצה של אינטראקציות בטווח דנובולונג, שבהן משפרים ראשוניים הובאו במגע עם היזמים שלהם כדי לווסת את הגנים המעורבים בתרגום חלבונים מקומיים בתאים סינפטיים. באופן קולקטיבי, העבודה שלנו מבהירה את התמלול המקיף ומשתמשים רשאים להציג, להדפיס, להעתיק ולהוריד טקסט ונתונים - שלי את התוכן במסמכים כאלה, למחקר אקדמי, בכפוף תמיד לתנאי השימוש המלאים:http://www.nature.com/authors/editorial_policies/license.html#terms

*התכתבות עם: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

תרומת הכותבים:

א.מ. ול.-ה.ט. המשיג ועיצב את הפרויקט. A.M ו-A.Z ביצעו ניסויים התנהגותיים, ISH, אימונו-סטיילינג וניתוח MARIS. C.A ביצעה הזרקת וירוסים ומיומנויות חיסון. A.M ו- H.S.M ביצעו ניסויי ATAC-seq. A.M ו-A.Z ביצעו ניסויי RNA-seq גרעיניים. A.M, H.S.M ו-V.D ביצעו ניסויי PC-Hi-C ו-Hi-C. A.M, H.S.M, V.D, R.M.R ו- J.D.V. ביצעו ניתוח ATAC-seq. A.M, R.M.R, H.S.M, V.D ו- F.G ביצעו ניתוח RNA-seq גרעיני. A.M, V.D, H.S.M ו-R.M.R ביצעו ניתוחי pc-Hi-C ו-Hi-C. כל המחברים עזרו לפרש את הנתונים. א.מ., ה.ס.מ, ו.ד, ר.מ.ר, י.ז.י, מ.ק. ול.ה.ט כתבו את כתב היד עם משוב מכל המחברים. ל.ה.ת. סיפקה את הכלים ופיקחה על הפרויקט.

תחומי עניין מתחרים:

הכותבים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

הנוף האפיגנומי לאורך תוחלת החיים שלזכרוןהיווצרות והיזכרות בהיפוקמפוס אנגרמה אנסמבל.

היווצרותם ושימורם של זיכרונות ארוכי טווח תלויים בביטוי גנים מתואם ובסינתזה של חלבונים סינפטיים1. תהליכים מולקולריים אלה פועלים בתוך אוכלוסייה מסוימת של תאי עצב, המכונים תאי אנגרם 2–4. גישות עדכניות שהשתמשו בביטוי תלוי פעילות של כתבים סיפקו מסגרת לחקר אנסמבל האנגרמה5-8, אך המנגנונים המולקולריים השולטיםזכרוןאחסון ואחזור נשארים לא מובנים היטב. באופן ספציפי, שינויים אפיגנטיים וארכיטקטורה גנומית תלת-ממדית מתגלים כגורם מפתח בוויסות הדינמי של ביטוי גנים9- 17, ויש הערכה גוברת לחשיבותם בתפקוד העצבי, בהתפתחות ובמחלות14, 16, 18

כאן, השתמשנו במודל העכברים של רקומבינציה ממוקדת באוכלוסיות פעילות (TRAP) 5,6, שבו נוירונים פעילים המבטאים את הגן הקשור לפעילות מווסתת שלד Cytoskeleton, (Arc), מתויגים באופן קבוע באופן בלתי ניתן להשראה. תאי עצב פעילים במהלךזכרוןקידוד, איחוד והיזכרות מוינו והיו נתונים לריצוף RNA גרעיני (nRNA-seq), בדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז באמצעות ריצוף (ATAC-seq) ולכידת קונפורמציה של כרומוזומים (Hi-C). הנתונים שלנו מראים כיזכרוןקידוד מוביל לעלייה כלל-גנומית בנגישות הכרומטין, ללא שינויים צפויים בביטוי הגנים. יתר על כן, אנו מראים כי השלב המאוחר של איחוד הזיכרון היה קשור ללוקליזציה מחדש של מקטעי כרומטין גדולים (תת-תאים) מסביבות לא פעילות לסביבות מתירניות, ולארגון מחדש של נוף האינטראקציה בין מקדם-משפר. לבסוף, הפעלה מחדש של הנוירונים במהלךזכרוןrecall קשורה לאינטראקציות denovopromoter-enhancer, תוך שימוש בתת-קבוצה גדולה של המשפרים שהוכנו במהלךזכרוןקידוד. אינטראקציות אלה בין מקדם-משפר קשורות לשינוי משמעותי בביטוי של גנים המעורבים בסינתזת חלבונים מקומית ובמורפוגנזה סינפטית.

תוצאות

זיהוי זמני ומרחבי של תאי אנגרמה מופעלים ומופעלים מחדש

מעקב אחר פעילות עצבית לאורך זמן היה אחד האתגרים הגדולים בחקר תאי אנגרם, שכן הסמנים לפעילות העצבית, המכונים גנים מוקדמים מיידיים (IEGs), חוזרים לנקודת ההתחלה זמן קצר לאחר אינדוקציה1,2. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניצלנו את מודל TRAP5,6, הדורש שני טרנסג'נים, אחד שמבטא את CreERT2 ממקדם קשת תלוי פעילות ואחד המאפשר ביטוי של כתב החלבון הפלואורסצנטי הצהוב (eYFP), באופן תלוי Cre. מתן טמוקסיפן (TAM) לעכברי TRAP גורם לתווית eYFP קבועה בתאי העצב של Arc המופעלים. ללא TAM, CreERT2 נשמר בציטופלסמה ו- eYFP אינו מבוטא (נתונים מורחבים איור 1a). עכברי TRAP היו נתונים לפרדיגמה הקלאסית של התניית פחד הקשרי פבלובי (CFC) (איור 1a), שיטה נפוצה לחקר זיכרונות מרתיעים19. כ-1.5-2 שעות לאחר החשיפה ל-FS, נאספו מוחות כדי לזהות i) RNA קושר חלבון fox-1 homolog 3 (Rbfox3) הידוע גם בשם NeuN+ ו-eYFP+ מתויגים של נוירונים שהופעלו במהלך החשיפה הראשונית (מופעל-מוקדם), אשר ניתן להבחין ביניהם לבין ii) NeuN+/eYFP- נוירונים לא פעילים במצב בסיסי (Basal) (איור 1a). לאחר חמישה ימים, בהיעדר שליפה, אספנו 3) נוירוני NeuN+/eYFP+ שתויגו ביום האימון, המציינים לטווח ארוךזכרוןאיחוד (מופעל-מאוחר). ב

קבוצה שונה, עכברים נחשפו מחדש לגירוי המותנה וביטוי חלבון ARC אנדוגני לאחר מכן נבדק 1.5-2 שעות לאחר החשיפה מחדש. זה איפשר את הזיהוי של iv) נוירונים אנטיגרמיים חיוביים כפולים של NeuN+/eYFP+/ Arc+ אנדוגניים שהופעלו במהלך האימון והופעלו מחדש במהלך האימון והופעלו מחדש במהלךזכרוןrecall (הופעל מחדש). יש לציין כי למרות שרקומבינציה של דנ"א עשויה שלא להתרחש במלואה 1.5-2 שעות לאחר ה-FS, צפינו בלוקליזציה משותפת גבוהה (ממוצע של 84%) בין חלבון Arc אנדוגני לבין כתב Arc:eYFP (נתונים מורחבים איור 1b), שגם היא עלתה בקנה אחד עם דיווחים קודמים20.

כדי לאשרזכרוןקידוד והיזכרות במהלך CFC, התנהגות הקפאה נרשמה במהלך אימון וחשיפה מחדש לרמזים מעוררי פחד (נתונים מורחבים איור 1c). בהתאם לפרסומים הקודמים6,20, הנתונים שלנו הראו עלייה משמעותית במספר תאי העצב eYFP+ (מופעלים-מוקדמים ומאוחרים) בהיפוקמפוס, בהשוואה לעכברים שנשארו תמימים ל-CFC בכלוב הביתי שלהם (F (2, 70) = 240.3, P<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

היווצרות זיכרון קשורה לנגישות מוגברת של כרומטין, בעיקר על משפרים

כדי להבין טוב יותר את הכוחות המולקולריים השולטים בתוכניות שעתוק שונות, מדדנו שינויים כלל-גנומיים של נגישות הכרומטין בשלבים שונים שלזכרון. רקמות ההיפוקמפוס רוכזו וגרעינים מבודדים (נתונים מורחבים איור 2a, טבלה משלימה 1) היו נתונים להכנת ספריית ATAC-seq. ניתוח אזורים נגישים באופן דיפרנציאלי (DARs) (Diffbind, מצב DESeq2) בין כל האוכלוסיות (איור 2a) גילה כי רוב השינויים במצב הכרומטין מתרחשים במהלך השלב המוקדם של היווצרות הזיכרון, שבו 7,862 אזורים ברחבי הגנום מקבלים נגישות (Basal לעומת מוקדם, טבלה משלימה 2). לעומת זאת, ראינו שינויים מזעריים יחסית במצב הכרומטין בעת המעבר ממצב מופעל-מוקדם להפעלה-מאוחרת (582 DARs) ובין תאי עצב מופעלים-מאוחרים ונוירונים מופעלים מחדש (725 DARs), עם חפיפה של 48% ביניהם (נתונים מורחבים איור 2b). למרבה הפלא, זיהינו אחוז גדול (52%) מה-DARs שהושגו ביציבות והפכו לנגישים יותר ב-Activated-early ונשארו נגישים הן בתאי העצב המופעלים-מאוחרים והן בתאי העצב המופעלים-מאוחרים והן בתאי העצב המופעלים מחדש (איור 2b,c; טבלה משלימה 2). באופן מעניין, בעוד שגם שינויים מוקדמים (בסיסי לעומת מוקדם) וגם DARs שהושגו ביציבות הועשרו עבור אזורים אינטרגניים, שינויי כרומטין מאוחרים (מוקדם לעומת מאוחר ומאוחר לעומת מופעל מחדש) הועשרו בעיקר עבור אתרים מקדמים, (איור 2d).

תובנה פונקציונלית ניתנה על ידי הערכת האופן שבו DARs מסומנים על ידי שינויים שונים של היסטון. השתמשנו לראשונה ב-ChromHMM כדי לבסס מודל מצב כרומטין משני מחקרים עצמאיים שהשתמשו ברקמת ההיפוקמפוס בתפזורת לפני ואחרי הלם בכף הרגל 21,22. לאחר מכן, ביצענו ניתוח העשרה קיפול (שנצפה על פני התפלגות צפויה) של ה-DARs עבור מצבים שונים אלה וגילינו ששינויי כרומטין מוקדמים ו-DARs יציבים הועשרו עבור סימני משפרים (איור 2e; נתונים מורחבים איור 2ג, טבלה משלימה 3).

תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם פרסומים קודמים, והראו כי גירוי תרבית עצבית ראשונית גורם לפעילות משופרת ממושכת12,23. לאחר מכן, ניתחנו את החפיפה של לוקוסים יציבים בודדים עם H3K4me1 ו- H3K27ac21. שני סימני היסטון אלה מגדירים אוכלוסיות שונות של משפרים, אשר יכולים להיות 'ראשוניים' (רק H3K4me1), 'פעילים' (H3K4me1 ו- H3K27ac), או 'סמויים' (ללא סימנים)18. פסגות יציבות הראו התפלגות הן על פני משפרים ראשוניים והן על פני משפרים פעילים (Extended Data Fig. 2d), כאשר 47% מהאתרים הללו היו צפויים להיות 'סמויים' (אין חפיפה בין DARs לסימני היסטון21 שהושגו 1h לאחר FS). כדי לאשר את המודל שלנו, ביצענו מיצוי חיסוני של כרומטין (ChIP) עבור סמני היסטון H3K4me1 ו-H3K27ac, ולאחר מכן qPCR. ארבעה אתרים נבחרים נבחרו מתוך ניתוח מידול משפרי הפוטטיביים שלנו (Extended Data Fig. 2d; משפר 1 – חזוי ראשונים, משפר 2- חזוי פעיל, משפר 3 ו-4 – חזוי סמוי). בהסכמה עם המודל שלנו, זיהינו שני לוקוסים 'סמויים' במצב הבסיסי (משפרים 3 ו-4) שהפכו למצב 'פעיל' במהלךזכרוןהיווצרות (איור 2f). יתר על כן, המגביר הפוטטיבי 1 נמצא כ'ראשוני' במצב הבסיסי והפך לפעיל, שם חלה עלייה יציבה משמעותית בסמני H3K27ac במהלך השלב המאוחר וההיזכרות (איור 2f). יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שהרפרטואר של משפרים חדשים הנגישים הורחב בתאי העצב האנגרמיים העוצמתיים, שבהם אזורים חבויים או ראשוניים קיבלו את סימני H3K4me1 ו-H3K27ac ובכך הפכו למשפרים פעילים.

כדי להבין את התפקיד הפונקציונלי של אזורי מקדמים ומשפרים נגישים, ביצענו ניתוח העשרת מוטיבים (טבלה משלימה 4). הנתונים שלנו מצביעים על כך שרוב (70%) המוטיבים על מקדמים נגישים מועשרים באותה מידה וזוהו בכל השלבים שלזכרון(נתונים מורחבים איור 2e). לעומת זאת, רוב אתרי המשפרים הראו דפוסים ברורים של מוטיבים של קשירה של גורם שעתוק (TF) על פני שלבי זיכרון שונים. באופן מעניין, המוטיבים המובעים בכל מקום ממשפחת ה-TFs של ג'ון פרוטו-אונקוגן, Ap-1 Factor Factor (כלומר Jun-Ap1) ומשפחת ה-TFs Regulatory Factor X (Rfx), הועשרו באופן משמעותי רק לאחר השלב הראשוני של הקידוד (Extended Data Fig. 2e). בעבר דווח כי קומפלקס Jun-Ap1 ממלא תפקיד מרכזי בבחירת המשפרים ועשוי לשמש כחלוץ TF להגדרת אתרי משפרים במהלך התפתחות המוח ופעילות עצבית12,24. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם הנתונים שלנו שהראו אחוז גבוה של לוקוסים סמויים/ראשוניים במצב הבסיסי (איור 2f, נתונים מורחבים איור 2c,d). לפיכך, נראה שפעילות עצבית עשויה להפעיל את הקשירה של Jun-Ap1 למשפרים סמויים, אשר לאחר מכן מגייסים משנים כרומטינים המפעילים משפרים סמויים. באופן דומה, ההעשרה של גורם השעתוק Yin Yang 1 (Yy1) מוטיבים רק במשפרים מהמדינות המוקדמות והמאוחרות, מצביעה על כך שארגון משפר-מקדם הוא תהליך פעיל שלזכרוןהיווצרות, כפי שדווח לאחרונה כי Yy1 מקל על היווצרות של אינטראקציות ארוכות טווח זה25. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מצביעים על כך שהשלב הראשוני שלזכרוןהיווצרות משנה את נוף הנגישות של הכרומטין בתאי עצב פעילים, עם שינויים יציבים ארוכי טווח המתרחשים בעיקר באזורים משפרים.

שינויים דינמיים בארכיטקטורה גרעינית מרחבית ובנגישות הכרומטין במהלך הראשוניזכרוןהיווצרות תואמת לתדירות מוגברת של אינטראקציות מקדם-משפר במהלךזכרוןזוכר

ארכיטקטורה תלת-ממדית גרעינית מתגלה כגורם מפתח בוויסות הדינמי של ביטוי גנים, בפונקציות עצביות רבות26–28. לפיכך, היינו מעוניינים לתאר את השינויים המדויקים המתרחשים בארגון כרומטין מרחבי במהלךזכרוןהיווצרות ואיחוד. הפקנו נתוני Hi-C מתאי עצב מתויגים במצב בסיסי וב-eYFP+ (מוקדם ומאוחר, טבלה משלימה 5). הכרומטין מופרד לשני תאים תת-גרעיניים נפרדים מרחבית, 'A' ו-'B', המתאימים לכרומטין הפעיל והלא פעיל מבחינה שעתוקית, בהתאמה15, 16,26. עדויות מוקדמות מצביעות על כך שפעילות עצבית ואיתות חיצוני עשויים לגרום לארגון מחדש של ארכיטקטורת כרומטין תלת-ממדית14,27,28. ניתוח מצב התא שלנו15, 16,26 (איור 3a-c) חשף לוקליזציה מחדש של מקטעי כרומטין גדולים מסביבה לא פעילה (B) לסביבה מתירנית (A) (ולהיפך) במהלך השלב הראשוני והמאוחר שלזכרוןהיווצרות (212 מקטעים עברו מ-A ל-B, 127 מ-B ל-A, גודל ממוצע של כ-436Kbp). באופן מעניין, 52% מהאזורים בשלב המוקדם שעברו מ-B ל-A שמרו על מצב זה בשלב המאוחר (כלומר נשארו במצב A, איור 3b,c; טבלה משלימה 6). יתר על כן, כמעט כל האזורים הללו חפפו עם DARs שהושגו מניתוח ATAC-seq שלנו, המאשר את המעבר של תת-תא מסביבה לא פעילה לסביבה מתירנית (איור.3d). נתונים אלה מצביעים על כך שחלק מהמוקדים עוברים מיתוג תת-תאי על פני שלבי זיכרון שונים, ולכן עשויים לתרום לשינויים ארוכי טווח בתכונות ובתפקוד של תאי העצב לאחר ההפעלה הראשונית.

בעוד שנתוני Hi-C שלנו הציעו ארגון מחדש בקנה מידה גדול, עדיין לא היה ברור אם כיוון מחדש זה איפשר את האינטראקציה של רפרטוארים חדשניים של משפרי מקדם וכוונון עדין של תוכניות תמלול שונות (איור 3e). על ידי שימוש בטכניקת Hi-C (pc-HiC) של לכידת מקדם-לכידה, חקרנו את השינויים המדויקים המתרחשים באינטראקציות בין מקדמים למשפרים במהלך התהליך שלזכרוןהיווצרות והיזכרות. לצורך מחקר זה, השתמשנו ב"פיתיונות" שתוכננו בהתאמה אישית המכוונים לכ-5000 מקדמים29. בהסכמה עם פרסומים קודמים29, זיהינו כ-19,000 (לכל קבוצה) מקדמים-משפרים משמעותיים (67.5%) ומקדמים-מקדמים (46.2%) אינטראקציות (נתונים מורחבים איור 3א,ב).

מאחר שמקדמים במוח היונקים יכולים להיות תחת שליטתם של מספר אלמנטים רגולטוריים14,30,31, ניתחנו את החפיפה בין כל המשפרים המקיימים אינטראקציה לבין המקדמים שלהם. מצאנו שבמהלך כל אחד מהםזכרוןשלב, אותם מקדמים מתקשרים בתדירות גבוהה יותר עם תת-קבוצה מובחנת של משפרים (כלומר ייחודי, בסיסי – 3243, מוקדם - 7602, מאוחר - 7028, מופעל מחדש – 7244; איור 4a,b; נתונים מורחבים איור 3ג; טבלה משלימה 7). תוצאה זו עולה בקנה אחד עם פרסומים קודמים שהראו כי משפרים מרובים המקיפים מספר גנים (c-Fos ו-Arc) חיוניים להפעלתם ותדירות האינטראקציה שלהם עם המקדמים שלהם משתנה בתגובה לחומרים דפולריים שונים בתאי עצב בתרבית31. זיהינו גם תת-קבוצה קטנה יותר של אינטראקציות שבהן המקדמים קיימו אינטראקציה עם אותם משפרים על פני שוניםזכרוןשלבים (כלומר נפוצים, כ-31% מכלל האינטראקציות; טבלה משלימה 7). יתר על כן, נוירונים שהופעלו מחדש הציגו ציוני אינטראקציה חזקים יותר באופן משמעותי (כפי שחושב על ידי שיקגו, איור 4b; תאנת נתונים מורחבת.3d). לפיכך, למרות שמספר האינטראקציות הייחודיות היה דומה במצבים מוקדמים, מאוחרים ומחודשים, ציוני אינטראקציה חזקים יותר מצביעים על כך שאינטראקציות ספציפיות בין מקדם למשפר מתרחשות בתדירות גבוהה יותר במהלך הזיכרון

זוכר. רעיון זה אומת עוד יותר על ידי ניסויי 3C, עם פריימרים שנועדו למדוד את תדירות האינטראקציה בין משפר נבחר (E) לבין מקדמי גנים (P) המקודדים עבור גורם התחלת תרגום אאוקריוטי 3 תת-יחידה D (Eif3d) או קולטן גלוטמט, יונוטרופי, kainate 3 (Grik3) (איור 4c). הנתונים שלנו הראו כי לתאי עצב שהופעלו מחדש הייתה עלייה משמעותית בתדירות האינטראקציה בין מקדם Eif3d לבין המשפר שנבחר, בהשוואה לאוכלוסיות האחרות (איור 4c). באופן קולקטיבי, נתונים אלה מצביעים על כך שאינטראקציות בין מקדם למשפר מתרחשות בתדירות גבוהה יותר במהלךזכרוןזוכר.

לאחר מכן, שאלנו אם האינטראקציות הדינמיות ארוכות הטווח שזוהו באמצעות pc-HiC מתאימות לאזורי כרומטין שהופכים לנגישים יותר, כפי שנקבע באמצעות ATAC-seq. זה יאשר שלנגישות המוגברת יש השלכות פונקציונליות בהבאת אינטראקציות חדשניות בין מקדם למגביר. כדי להשיג זאת, השווינו את החפיפה בין משפרי אינטראקציה בכל אוכלוסיית תאים ל-DARs (נצפו) או קבוצה אקראית של מוקדים גנומיים נגישים (צפויים). הניתוח שלנו חשף חפיפה משמעותית בין שני ה-DARs שהושגו בתאי עצב פעילים-מוקדמים והן בין DARs שהושגו ביציבות עם משפרי האינטראקציה, בכל אוכלוסיות התאים (All Ps< 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 3e).="" in="" contrast,="" changes="" in="" chromatin="" accessibility="" that="" occurred="" during="" the="" late="" phase="" of="">זכרוןאיחוד והפעלה מחדש לא חפפו באופן משמעותי עם משפרי אינטראקציה (נתונים מורחבים איור 3e). יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שהשגת הנגישות במהלך קידוד הזיכרון היא אירוע ראשוני, ומוקדים ראשוניים אלה עוסקים באינטראקציות דה-נובו פונקציונליות של מקדם-משפר במהלך שלבים מאוחרים יותר שלזכרוןהיווצרות. הנוף הדינמי הזה מומחש על ידי הדמיית האזורים הגנומיים סביב הגן גורם התחלת התרגום האאוקריוטי 5 תת-יחידה A (Eif5a) (איור 4d). דיסקציה מולקולרית טמפורלית זו של תוחלת החיים האנגרמית מדגישה עד כמה ההזדקרות המתואמת של המצב האפיגנטי של התא במהלךזכרוןקידוד ואיחוד מקלים על אינטראקציות ארוכות טווח במהלך הפעלה מחדש.