חלק 1: זרימת מגנזיום מתאי קניון תסיסנית היא קריטית לזיכרון לטווח ארוך נורמלי ומשופר בתזונה

למידע נוסף:Ali.ma@wecistanche.com

בבקשה, לחץ כאן לחלק 2

Yanying Wu1, Yosuke Funato2, Eleonora Meschi1, Kristijan D Jovanoski1, Hiroaki Miki2, Scott Waddell1*

1Centre for Neural Circuits and Behaviour, אוניברסיטת אוקספורד, בניין טינסלי, אוקספורד, בריטניה; 2המחלקה לרגולציה סלולרית, מכון המחקר למחלות מיקרוביאליות, אוניברסיטת אוסקה, סויטה, יפן

תוספי מגנזיום תזונתיים מופשטים (Mg2 plus) יכולים לשפרזיכרוןבחולדות צעירות ומבוגרות.זיכרוןיכולת שיפור יוחסה במידה רבה לעלייה בצפיפות הסינפטית של ההיפוקמפוס וביטוי מוגבר של תת-יחידת ה-NR2B של הקולטן לגלוטמט מסוג NMDA. כאן אנו מראים שהאכלה של Mg2 פלוס גם משפרת לטווח ארוךזיכרוןבתסיסנית. רגיל ו-Mg2 פלוס - זבוב משופרזיכרוןמופיע ללא תלות בקולטני NMDA בגוף הפטרייה ובמקום זאת דורש ביטוי של טרנספורטר משומר מסוג CNNM Mg2 plus -eflux המקודד על ידי הגן הבלתי מורחב (uex). UEX מכיל תחום הומולוגיה קושר נוקלאוטידים מחזורי משוער והמוטציה שלו מפרידה בין תפקיד חיוני ל-uex לבין פונקציה ב-זיכרון. יתר על כן, לוקליזציה של UEX בתאי קניון בגוף הפטריות (KCs) השתנתהזיכרוןזבובים פגומים המכילים מוטציות בגנים הקשורים ל-cAMP. הדמיה פונקציונלית מצביע על כך שנדרשת זרימה תלויה ב-UEX לתחזוקה קצבית איטית של KC Mg2 plus. אנו מציעים כי זרימת Mg2 פלוס נוירונלית מווסתת היא קריטית עבור תקין ו-Mg2 פלוס משופרזיכרון.

לחץ כדיחנות ויטמינים Cistanche ו- Cistanche לזיכרון

מבוא

מגנזיום (Mg2 plus ) ממלא תפקיד קריטי במטבוליזם התאי ונחשב לקו-פקטור חיוני ליותר מ-350 אנזימים (Romani and Scarpa, 2000; Vink and Nechifor, 2011). כתוצאה מכך, שינויים ב-Mg2 פלוס הומאוסטזיס קשורים למגוון רחב של מצבים קליניים, כולל אלו המשפיעים על מערכת העצבים, כגון גלאוקומה (DeToma et al., 2014), מחלת פרקינסון (Hermosura et al., 2005; Hermosura ו- Garruto, 2007; Lin et al., 2014; Shindo et al., 2016), מחלת אלצהיימר (Andra´si et al., 2000; Andra´si et al., 2005; Cilliler et al., 2007; Durlach et al. ., 1997; גליק, 1990; Lemke, 1995; Chui et al., 2011; Vural et al., 2010), חרדה (Sartori et al., 2012), דיכאון (Whittle et al., 2011; Murck, 2002; Murck, 2013; Rasmussen et al., 1990; Ghafari et al., 2015), ומוגבלות אינטלקטואלית (Arjona et al., 2014).

אולי באופן מפתיע, הגדלת Mg2 פלוס במוח באמצעות דיאטה יכולה לשפר את הפלסטיות הנוירוניתזיכרוןביצועים של מכרסמים צעירים ומבוגרים, נמדד במגוון משימות התנהגותיות (Slutsky et al., 2010; Landfield and Morgan, 1984; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013). בנוסף, Mg2 מוגבר פלוס הפחיתו ליקויים קוגניטיביים במודל עכבר של מחלת אלצהיימר (Li et al., 2013) והגבירו את הכחדת זיכרונות הפחד (Abumaria et al., 2011). השפעות מועילות לכאורה אלו הובילו להצעה כי ל-Mg2 פלוס תזונתיים עשוי להיות ערך טיפולי עבור חולים עם מגוון שלזיכרון-בעיות הקשורות (Billard, 2011).

למרות מספר רב של אתרים פוטנציאליים של Mg2 פלוס פעולה במוח, הזיכרוןשיפור תכונה במכרסמים יוחסה במידה רבה לעלייה בצפיפות הסינפטית של ההיפוקמפוס ולפעילות של קולטני N-methyl-D-aspartate glutamate (NMDARs). Extracellular Mg2 plus חוסם את נקבוביות התעלה של ה-NMDAR ובכך מעכב מעבר של יונים אחרים (Mayer et al., 1984; digest הפתגם הפתגם 'אתה מה שאתה אוכל' מסכם בצורה מושלמת את התפיסה שהתזונה שלנו יכולה להשפיע הן על הנפש והן שלנו. בריאות גופנית. אנחנו יודעים שמזונות שטובים ללב, כמו אגוזים, דגים שמנים ופירות יער, טובים גם למוח. אנחנו יודעים גם שוויטמינים ומינרלים חיוניים לבריאות כללית. אבל האם יש ראיות כלשהן שהגדלת צריכת ויטמינים או מינרלים ספציפיים יכולה לעזור להגביר את כוח המוח שלך?

למרות שזה אולי נשמע כמעט טוב מכדי להיות אמיתי, יש כמה ראיות שזה המקרה של מינרל אחד לפחות, מגנזיום. מחקרים במכרסמים הראו שהוספת תוספי מגנזיום למזון משפרת את רמת הביצוע של בעלי החיים במשימות זיכרון. גם בעלי חיים צעירים וגם בעלי חיים מבוגרים נהנים מתוספת מגנזיום. אפילו מכרסמים קשישים עם מצב דומה למחלת האלצהיימר מראים פחותזיכרוןאובדן כאשר ניתן תוספי מגנזיום. אבל מה לגבי מינים אחרים?

וו וחב'. כעת מראים שתוספי מגנזיום גם מגבירים את ביצועי הזיכרון בזבובי הפירות. קבוצה אחת של זבובים הואכלה בקמח תירס סטנדרטי במשך מספר ימים, בעוד שהקבוצה השנייה קיבלה קמח תירס בתוספת מגנזיום. שתי הקבוצות אומנו אז לשייך ריח לתגמול מזון. זבובים שקיבלו את תוספת המגנזיום הראו טוב יותרזיכרוןעבור הריח כאשר נבדק 24 שעות לאחר האימון.

וו וחב'. להראות שמגנזיום משתפרזיכרוןבזבובים באמצעות מנגנון שונה מזה שדווח בעבר עבור מכרסמים. במכרסמים, מגנזיום העלה רמות של חלבון קולטן עבור כימיקל במוח הנקרא גלוטמט. בזבובי פירות, לעומת זאת, הזיכרוןהדחיפה הייתה תלויה בחלבון שמעביר מגנזיום מתוך נוירונים. זבובים מוטנטים שחסר להם טרנספורטר זה הראו ליקויי זיכרון. בניגוד לזבובים רגילים, אלו ללא הטרנספורטר לא הראו שיפור בזיכרון לאחר אכילת מזון מועשר במגנזיום. התוצאות מצביעות על כך שהטרנספורטר עשוי לסייע בהתאמת רמות המגנזיום בתוך תאי המוח בתגובה לפעילות עצבית.

בני אדם מייצרים ארבע גרסאות של טרנספורטר מגנזיום זה, כל אחת מקודדת על ידי גן אחר. אחד מהטרנספורטרים הללו כבר היה מעורב בהתפתחות המוח. הממצאים של Wu et al. מציעים שהטרנספורטרים עשויים לפעול גם במוח הבוגר כדי להשפיע על הקוגניציה. דרושים מחקרים נוספים כדי לבדוק אם הכוונה לטרנספורטר המגנזיום עשויה בסופו של דבר להיות הבטחה לטיפולזיכרוןליקויים.

Bekkers and Stevens, 1993; Jahr and Stevens, 1990; Nowak et al., 1984). חשוב לציין, דפולריזציה עצבית קודמת, המונעת על ידי קולטני משדר אחרים, נדרשת כדי לשחרר את בלוק Mg2 plus ב-NMDAR ולאפשר זרימה של Ca2 פלוס עם גלוטמט. ה-NMDAR, אם כן, ממלא תפקיד חשוב בפלסטיות עצבית כגלאי צירוף מקרים העברי פוטנציאלי. עלייה חריפה של ריכוז Mg2 פלוס חוץ-תאי ([Mg2 plus ]e) בטווח הפיזיולוגי (0.8-1.2 mM) יכולה לסתור אינדוקציה של פוטנציציה תלוית NMDAR לטווח ארוך (Dunwiddie and Lynch, 1979; Malenka et al., 1992; Malenka וניקול, 1993; סלוצקי וחב', 2004). לעומת זאת, הגדלת [Mg2 plus ]e במשך מספר שעות בתרביות נוירונים מובילה לשיפור הזרמים המתווכים ב-NMDAR ולהקלה על הביטוי של LTP (Slutsky et al., 2004). ההשפעות המשפרות של מוגבר [Mg2 plus ]e נצפו גם במוח של חולדות שניזונו עם Mg2 plus -L-threonate (Slutsky et al., 2010). מעגלים נוירונים בהיפוקמפוס עוברים פלסטיות הומיאוסטטית (Turrigiano, 2008) כדי להתאים את [Mg2 plus ]e המוגבר על ידי הגברת הביטוי של NMDARs המכילים תת-יחידות NR2B (Slutsky et al., 2004; Slutsky et al., 2010). הצפיפות הגבוהה יותר של סינפסות ההיפוקמפוס עם NR2B המכילות NMDARs מפצה על העלייה הכרונית ב-[Mg2 plus ]e על ידי שיפור זרמי NMDAR במהלך ירי מתפרץ. לתמיכה במודל זה, עכברים שהונדסו גנטית להביע יתר NR2B מציגים LTP משופרת והתנהגותית בהיפוקמפוס.זיכרון(Tang et al., 1999).

חוש הריחזיכרוןב-Drosophila כרוך במנגנון הטרו-סינפטי המונע על ידי חיזוק נוירונים דופמינרגיים, מה שגורם לדיכאון פרה-סינפטי של קשרים כולינרגיים בין תאי קניון (KCs) מופעלי ריח (KCs) ונוירוני פלט גוף פטריות במורד הזרם (MBONs) (Schwaerzel et al., 2003., 2003). ; Aso et al., 2010; Aso et al., 2012; Claridge-Chang et al., 2009; Burke et al., 2012; Liu et al., 2012; Plac¸ais et al., 2013; Owald et al. ., 2015; Hige et al., 2015; Barnstedt et al., 2016; Parisse et al., 2016; Aso et al., 2014; Oswald and Waddell, 2015). בנוסף, מידע חוש הריח מועבר ל-KCs על ידי שידור כולינרגי מנוירוני הקרנת ריח (Yasuyama et al., 2002; Leiss et al., 2009). למרות שניתן להעלות על הדעת שגלוטמט מועבר לרשת MB דרך נתיב שטרם זוהה, אין כרגע מיקום ברור עבור פלסטיות תלוית NMDAR בארכיטקטורה הידועה של שכבות הקלט או הפלט הכולינרגי (Barnstedt et al., 2016 ). הזבוב, לפיכך, מספק מודל פוטנציאלי לחקור מנגנונים אחרים שדרכם עשוי Mg2 פלוס לשפרזיכרון.

ההשפעות המחזקות של דופמין תלויות בקולטן הדופמין מסוג Dop1R D1- (Kim et al., 2007; Qin et al., 2012; Handler et al., 2019), המקושר באופן חיובי עם ייצור cAMP (Tomchik ודיוויס, 2009; Boto et al., 2014). יתרה מכך, מחקרים מוקדמים ב-Drusophila זיהו את ה-Dunce ו-Rutabaga המקודד cAMP phosphodiesterase וסוג I Ca2 פלוס-Adenylate Cyclase מגורה, בהתאמה, כחיוניים לחוש הריח.זיכרון(דודאי ואח', 1976; ביירס ואח', 1981; דודאי וצבי, 1984; חן ואח', 1986; ליווינגסטון ואח', 1984; לוין ואח', 1992). מחקרים בתאי יונקים הראו כי הורמונים או חומרים המגבירים את רמת ה-cAMP התאית מעוררים לעיתים קרובות שחול משמעותי ב-Na פלוס תלוי של Mg2 plus לחלל החוץ-תאי (Romani and Scarpa, 1990b; Romani and Scarpa, 1990a; Romani and Scarpa, 2000; Vink and Nechifor, 2011; Vormann and Gunther, 1987). עם זאת, לא ברור אם שחול Mg2 plus ממלא תפקיד כלשהו בעיבוד הזיכרון.

כאן אנו מדגימים כי תסיסנית לטווח ארוךזיכרון(LTM) ניתן לשפר עם Mg2 בתוספת תוספי מזון. אנו מוצאים שהגן הבלתי מורחב (uex) (Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010), המקודד לאורתולוג זבוב פונקציונלי של חלבוני היונקים Cyclin M2 Mg2 plus -eflux transporter (CNNM), הוא קריטי עבורזיכרון-הגברת המאפיין של Mg2 plus . פונקציית UEX ב-MB KCs נדרשת עבור LTM ושחזור פונקציונלי של uex מגלה שה-MB הוא אתר המפתח של שיפור זיכרון תלוי Mg2 plus. שינוי כרוני של חילוף החומרים של cAMP על ידי החדרת מוטציות בגנים dnc או rut משנה את הלוקליזציה התאית של UEX. יתר על כן, מוטציה של תחום ההומולוגיה המחזורית (CNBH) המשומרת ב-UEX מנתקת תפקיד חיוני ל-uex מהפונקציה שלו בזיכרון. זרימת Mg2 פלוס מונעת על ידי UEX נדרשת לתחזוקה קצבית איטית של רמות KC Mg2 פלוס, דבר המצביע על תפקיד פוטנציאלי לעיבוד Mg2 פלוס שטף בזיכרון.

תוצאות

האכלה של Mg2 פלוס משפרת את ה-LTM של זבובים מסוג בר

מחקרים קודמים דיווחו כי האכלת חולדות במזון המכיל ריכוז גבוה של Mg2 פלוס - שיפרה את יכולת הלמידה והזיכרון שלהן (Slutsky et al., 2010; Landfield and Morgan, 1984; Abumaria et al., 2011; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013). לכן, בדקנו האם השפעות דומות קיימות בזבובים על ידי האכלתם במזון המכיל ריכוז גבוה של Mg2 פלוס לפני האימון. באופן מפתיע, זבובים מסוג בר שניזונו במשך 4 ימים לפני האימון עם מזון בתוספת מגנזיום כלוריד (MgCl2) הפגינו ביצועי זיכרון משופרים משמעותית של 24 שעות. שיפור הזיכרון תלוי בריכוז והיה מקסימלי כאשר למזון נוספו 80 mM MgCl2 (איור 1A). ביצועי הזיכרון המיידי לא שופרו באופן ברור (איור 1B). ההשפעה המשפרת של MgCl2 נצפתה גם בזבובים שניזונו עם מגנזיום סולפט (MgSO4) אך לא סידן כלורי (CaCl2) (איור 1C). בנוסף, האכלת זבובים במשך 4 ימים עם מזון המכיל בין 5 ל-80 מ"מ סטרונציום כלוריד (SrCl2) הביאה לרמות גבוהות של תמותה וזבובים ששרדו האכלה של 5 מ"מ SrCl2 לא הראו ביצועי זיכרון משופרים מיידיים או 24 שעות (לא מוצגים נתונים) . לכן ניתן לייחס את ההשפעות המשפרות את הזיכרון באופן ספציפי לתוספי תזונה של Mg2 פלוס דו ערכי.

זיכרון משופר Mg2 plus אינו תלוי ב-NMDAR בגופי הפטריות

מכיוון שזיכרון משופר של מגנזיום-L-Threonate בחולדות נמצא בקורלציה עם וויסות-על של NMDARs המכילים תת-יחידות NR2B של ההיפוקמפוס (Slutsky et al., 2010), בדקנו שינויים בביטוי קולטן לגלוטמט בזבובים שניזונו ב-MgCl2. ניתוחי RT-qPCR לא גילו הבדל משמעותי בשפע של mRNA עבור קולטני NMDA המשוער (Nmdar1, Nmdar2), AMPA (GluRIA) או מסוג kainate (GluRIIA) בראשים שנלקחו מזבובים שניזונו במשך 4 ימים עם 80 mM MgCl2 לעומת אלה שניזונו ב-1 mM MgCl2 (איור 1D).

לאחר מכן בדקנו ישירות אם זיכרון משופר Mg2 פלוס מצריך תפקוד NMDAR, על ידי הפחתת הביטוי של הגנים Nmdar1 או Nmdar2 באמצעות הפרעות RNA המונעות על ידי UAS מהונדס.

איור 1. תוספי Mg2 בתוספת תזונתיים משפר את הזיכרון לטווח ארוך של תסיסנית. (א) זבובים מסוג פרא אומנו ונבדקו עבור זיכרון בתיאבון של 24 שעות לאחר 1-5 ימים של האכלה אד ליביטום ממזון בתוספת Mg2 פלוס. הזיכרון השתפר באופן משמעותי בזבובים שניזונו במשך 4 ימים עם 80 mM MgCl2, בהשוואה לאלו שהוזנו עם 1 mM. 80 מ"מ MgCl2 הפיק ביצועים גבוהים יותר מ-50 מ"מ או 100 מ"מ ולכן נחשב לאופטימלי (כוכביות מציינות p<0.05, t-test="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" groups="" for="" each="" time="" point,="" n="6–8)." (b)="" 4="" days="" of="" 80="" mm="" mgcl2="" food="" did="" not="" enhance="" immediate="" memory.="" (c)="" appetitive="" 24="" hr="" memory="" was="" enhanced="" by="" feeding="" wild-type="" flies="" for="" 4="" days="" with="" mgcl2="" and="" mgso4,="" but="" not="" cacl2.="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05, anova,="" n="6)" between="" mg2+="" fed="" and="" plain="" groups.="" (d)="" rt-qpcr="" showed="" no="" significant="" differences="" in="" glutamate="" receptor="" mrna="" expression="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" fed="" flies="" (t-test,="" n="5)." (e)="" c739-gal4;="" uas-magfret-1="" flies="" were="" fed="" for="" 4="" days="" on="" food="" supplemented="" with="" mg2+.="" brains="" were="" dissected="" and="" fixed="" and="" a="" fluorescence="" emission="" ratio="" measurement="" (citrine/cerulean)="" was="" taken="" as="" an="" indicator="" of="" [mg2+]i.="" the="" magfret="" signal="" was="" significantly="" greater="" in="" the="" ab="" lobes="" of="" flies="" fed="" with="" 80="" mm="" mgcl2="" than="" those="" fed="" with="" 1="" mm="" mgcl2=""><0.05, t-test,="" n="52–60)." unless="" otherwise="" noted,="" all="" data="" are="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" the="" mean="" (sem).="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05), individual="" data="" points="" displayed="" as="" open="">

הגרסה המקוונת של מאמר זה כוללת את תוספי האיורים הבאים עבור איור 1:

תוספת איור 1. פגיעה ב-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor (NMDAR) בגופי פטריות אינה פוגעת בזיכרון המוגבר של Mg2 plus.

(RNAi) בונה (Dietzl et al., 2007; Perkins et al., 2015). מבין שני קווי UAS-Nmdar1R-NAi העצמאיים וארבעה קווי UAS-Nmdar2RNAi שבדקנו, רק קו Nmdar1RNAi (BDSC 25941) אחד, כאשר הונע בכל הנוירונים על ידי Synaptobrevin (nSyb)-GAL4 הנוירוני, הראה ירידה משמעותית בביצועי זיכרון 24 שעות, כמו בהשוואה לזה של זבובי בקרה הטרוזיגוטיים (איור 1 - תוספת איור 1A). לעומת זאת, ביטוי סלקטיבי יותר של UAS-Nmdar1RNAi זה ב-KCs שרלוונטיים ל-LTM באמצעות c739-GAL4 לא פגע באופן משמעותי בביצועי זיכרון של 24 שעות (איור 1 - תוספת איור 1B). יתר על כן, זבובים המבטאים Nmdar1RNAi בנוירוני אב שמרו על זיכרון חזק של Mg2 בתוספת זיכרון משופר (איור 1 - תוספת איור 1C). תוצאות אלו מצביעות על כך שזיכרון משופר Mg2 פלוס אינו משנה את הביטוי של קולטני גלוטמט, או דורש תפקוד NMDAR ב-KCs ab.

ריכוז Mg2 פלוס בנוירוני אב מוגבר בזבובים המוזנים ב-Mg2 פלוס גבוה. השתמשנו ב-MagFRET, החיישן הניאון Mg2 פלוס הראשון המקודד גנטית (Lindenburg et al., 2013), כדי לבדוק אם האכלה של Mg2 פלוס שינתה את ריכוז Mg2 פלוס התוך תאי ([Mg2] פלוס ]i). בנינו זבובים המכילים טרנסגן UAS-MagFRET-1 ושילבנו אותו עם c739-GAL4 כדי לבטא MagFRET- 1 ב-ab KCs. השווינו את אותות FRET במוחות קבועים מ-c739; זבובי UAS-MagFRET-1 מוזנים במזון של 1 מ"מ או 80 מ"מ MgCl2 למשך 4 ימים. האות של MagFRET היה גבוה יותר באופן מובהק ב-a ו-b של ביטחונות ab KCs של זבובים שניזונו ב-80 mM, מאשר באלו שניזונו ב-1 mM (איור 1E). תוצאה זו מצביעה על כך שהזנת Mg מעלה את [Mg2 plus ]i עצבי. בהתחשב בזיקה של MagFRET-1 (Kd=148 mM) והעלייה של כ-50% באות FRET עם קישור Mg2 פלוס (Lindenburg et al., 2013), אנו מעריכים שהשיפור של ~8% של אות MagFRET שנמדד בזבובים שניזונו ב-80 mM MgCl2 תואם בערך לעלייה של 50 mM של ab KC [Mg2 plus ]i בממוצע.

לטרנספורטר המקודד הלא-מורחב מסוג CNNM Mg2 plus יש תפקיד בזיכרון

זיהינו בלתי מורחבת (uex; Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010) כ-LTM בעל תיאבון חוש ריח משנה גנים, מחוזק בתגמול סוכרוז. זבובים עם החדרת MiMIC uexMI01943 (Venken et al., 2011) הראו פגם חזק בזיכרון של 24 שעות, אך לא ניתן היה להבחין בביצועיהם מיד לאחר האימון מזה של בקרות מסוג פרא. ניתוח מפורט יותר של זבובי uexMI01943 גילה דעיכה מתמדת של הזיכרון שהפך לראשונה שונה באופן משמעותי לזה של זבובי פרא 12 שעות לאחר האימון (איור 2A). לא ניכר פגם בזיכרון בזבובי uexMI01943/ פלוס הטרוזיגוטיים, מה שמוכיח כי אלל המין המשוער הזה הוא רצסיבי.

uex משך את תשומת ליבנו מכיוון שזהו האורתולוג של זבוב יחיד של ארבעת הגנים האנושיים של CNNM המקודדים ל-Mg2 פלוס טרנספורטרים (Ishii et al., 2016), והוא מכיל גם תחום CNBH משוער שקשור מבחינה מבנית לאלו שנמצאים ב-Nucleotide-Gated מחזוריים. ערוצים (Zagotta et al., 2003; Flynn et al., 2007; Kesters et al., 2015). יישור רצף UEX של 834 חומצות אמינו עם CNNM1-4 מגלה שימור רצף גבוה במיוחד עם CNNM2 ו-CNNM4 בתחומים DUF21, CBS ו-CNBH (איור 2 - תוסף איור 1A-C). לפיכך, שיערנו כי ל-UEX יש פוטנציאל לקשר את ההשפעות משפרות הזיכרון של Mg2 פלוס תזונתיים עם פלסטיות נוירונית תלוית cAMP.

Although uexMI01943 is assigned to the uex gene, the MiMIC element is annotated to lie 17 kb downstream of the uex coding region (Venken et al., 2011; Figure 2B). RYa (Yoon et al., 2016) is the next nearest gene to uexMI01943 but is >230 קילובייט רחוק יותר. אישרנו לראשונה את מיקום MiMIC על ידי PCR הפוך (Attrill et al., 2016). חשוב לציין, לא זוהתה הכנסת MiMIC נוספת בזבובים אלה. לאחר מכן בדקנו אם uexMI01943 אחראי לפגם הזיכרון על ידי הסרה מדויקת של אלמנט ה-MiMIC על ידי כריתה בתיווך טרנספוזה של Minos (Arca` et al., 1997; איור 2 - תוספת איור 2A ו-B). הסרת MiMIC בזבובי uexMI01943.ex1 ו-uexMI01943.ex2 החזירה את ביצועי הזיכרון הרגילים של 24 שעות, מה שמוכיח שהחדרת MiMIC נדרשת עבור ה-uexMI01943זיכרוןפגם (איור 2C).

גם qRT-PCR של mRNA וגם אנליזה של Western blot של תמציות חלבון מראשי זבובים לא הצליחו לחשוף הבדל משמעותי בביטוי uex/UEX בזבובי uexMI01943. לכן, השתמשנו ב-CRISPR כדי להכניס קודון עצירה לאקסון הקידוד החמישי של מוקד ה-uex (איור 2B ואיור 2 - תוסף איור 2C). זבובים הומוזיגוטים למוטציית ה-uexD שהתקבלה לא היו ברי קיימא כמבוגרים, ומתים בשלב הזחל. לעומת זאת, זבובי uexMI01943/uexD הטרוזיגוטיים היו ברי קיימא, אך הם היו בעלי תיאבון במשך 24 שעותזיכרוןהיה פגום באופן משמעותי (איור 2D). נתונים אלה מוכיחים ש-uex הוא גן חיוני וש-uexMI01943 הוא אלל היפומורפי בר-קיימא של uex.

בדקנו גם את הרתיעהזיכרוןביצועים של זבובים מוטנטיים uexMI01943. זבובי uexMI01943 הומוזיגוטים הוצגו מידזיכרוןשלא ניתן היה להבדיל מזה של בקרות הטרוזיגוטיות וסוג בר (איור 2E). עם זאת, הזיכרון שלהם ל-24 שעות, שנוצר בעקבות חמישה ניסויים של אימון מרווח (Tully et al., 1994; Jacob and Waddell, 2020), או ניסוי אחד של אימונים מסייעים בצום (Hirano et al., 2013), נפגע באופן משמעותי. (איור 2E). ניסויים אלה מצביעים על כך שזבובי uexMI01943 נפגעים באופן כללי יותר ביכולתם ליצור LTM. אלא אם צוין אחרת, כל הניתוחים הבאים שלזיכרוןבמחקר זה השתמשו בהתניה מתגמלת סוכר בתיאבון.

איור 2. לזבובים מוטנטיים uexMI01943 יש פגמים לטווח ארוךזיכרון(LTM). (א) שימור זיכרון תיאבני נבדק בזמנים שונים לאחר האימון. זבובים הומוזיגוטים ל-uexMI01943 הראו פגם משמעותי בזיכרון מ-12 שעות לאחר האימון, בהשוואה לביצועים של זבובי שליטה הטרוזיגוטיים uexMI01943/plus וזבובים מסוג פרא (p<0.05, anova,="" n="6–10)." (b)="" the="" uex="" locus="" lies="" on="" chromosome="" 2r="" between="" 3,900,285="" and="" 3,949,425="" (light="" blue="" bar).="" the="" four="" alternate="" uex="" transcripts,="" uex-re,="" uex-rg,="" uex-rh,="" and="" uex-rf,="" all="" encode="" the="" same="" protein.="" the="" uexmi01943="" mimic="" (blue="" triangle)="" resides="" ~17="" kb="" downstream="" of="" the="" uex="" coding="" region.="" the="" crispr/cas9="" edited="" uexd="" allele="" replaces="" a="" 3047="" bp="" fragment,="" including="" exon="" 7="" of="" uex="" with="" a="" stop="" signal="" (termination="" codon="" in="" all="" three="" reading="" frames)="" and="" a="" gfp="" cassette,="" truncating="" the="" uex="" reading="" frame="" (dark="" blue="" bar).="" (c)="" precise="" excision="" of="" the="" uexmi01943="" mimic="" restores="" normal="" 24="" hr="" memory="" to="" uexmi01943.ex1="" and="" uexmi01943.ex2="" flies=""><0.05, anova,="" n="8–11)." (d)="" uexd="" fails="" to="" complement="" the="" 24="" hr="">זיכרוןפגם של uexMI01943 (עמ'<0.05, anova,="" n="6–8)." (e)="" flies="" homozygous="" for="" uexmi01943="" showed="" a="" significant="" defect="" in="" aversive="" ltm,="" as="" figure="" 2="" continued="" on="">

איור 2 המשיך

בהשוואה לביצועים של זבובי שליטה הטרוזיגוטיים uexMI01943/ plus וזבובי שליטה מסוג פרא (p<0.05, anova,="" n="8–12)." an="" ltm="" defect="" was="" also="" observed="" following="" five="" cycles="" of="" aversive="" spaced="" training="" and="" a="" 16="" hr="" fasting="" facilitated="" one-cycle="" training="" protocol.="" immediate="" aversive="">זיכרוןלא הושפע בזבובי מוטציה הומוזיגוטים uexMI01943.

הגרסה המקוונת של מאמר זה כוללת את נתוני המקור הבאים ותוספי איור עבור איור 2:

נתוני מקור 1. טבלה של בקרות סוכר וחדות חוש הריח עבור כל הניסויים ההתנהגותיים בכתב היד הזה.

תוספת איור 1. שימור UEX עם האורתולוגים שלו.

תוספת איור 2. תוכניות בנייה לכריתת uex Mino ויצירת האלל uexD.