חלק 1 בידוד וזיהוי של פנילתנואידים גליקוזידים מ- Aloysia Polystachya ופעילותו כמעכבי מונואמין אוקסידאז-A

מה הסיבה מדוע Cistanche Actosides יכולים לעכב את פעילות האנזים?

עקרון ההשפעה נוגדת החמצון של Cistanche

השתייכות

1 Departamento de Biotecnologia em Plantas Medicinais, Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP), Ribeirão Preto, SP, Brazil2 Departamento de Química, Faculdade de Filosofifia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Pauloeto, ארצות הברית , SP, ברזיל

מילות מפתח

aloysia polystachya, verbenaceae, פעילות נוגדת דיכאון, פנילתנואידים, מעכבי מונואמין אוקסידאז

תַקצִיר

Aloysia polystachya משמש כחומר הרגעה ונוגד דיכאון על ידי האוכלוסיות הילידיות של ארגנטינה ופרגוואי, אך התרכובות הקשורות לפעילויות אלו לא נקבעו. הפרדנו וזיהינו את המרכיבים העיקריים של התמצית ההידראו-אתנולית של A. polystachya על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים אולטרה-ספקטרומטריית מסה ואישרנו את נוכחותו של אקטאוזיד,איזואקטאוזיד, 6'-אצטילקטאוזיד, ו-4',4''',5,5''-tetrahydroxy-6,6'',3'''-trimethoxy-[C7–O-C7'']-biflavone לפי ספקטרוסקופיה של NMR. פעילויות מעכבות של התמצית ההידראו-אתנולית וגליקוזידים פנילתנואידים מטוהרים כנגד מונואמין אוקסידאז-A הוערכו באמצעות בדיקה פלואומטרית סטנדרטית. התמצית ההידרו-אתנולית עיכבה פעילות מונואמין אוקסידאז-A באופן תלוי מינון עם IC5{{20}} של 9.2 מיקרוגרם/מ"ל, בעוד המעכב מונואמין אוקסידאז הסלקטיבי קלורגילין הציג IC50 של 0.06 מיקרוגרם/מ"ל ( 0.22 מיקרומטר). אקטאוזיד היה המעכב החזק ביותר של מונואמין אוקסידאז-A (ערך IC50 של 5µM), בעודאיזואקטאוזידו-6'-אצטילקטאוזידהראה ערכי IC50 של כ-10 מיקרומטר. התוצאות הראו שלפנילאתנואידים מתמצית הידראו-אתנולית של A. polystachya נמצאה פעילות מעכבת נגד מונואמין אוקסידאז-A. סביר להניח שאופן הפעולה של האקטאוזידיםהוא רב-מיקוד, הכולל הורדת ויסות של מולקולות דלקתיות וניטרול תגובות חמצון וכן עיכוב של מונואמין אוקסידאז-A.

למידע נוסף אנא צור קשר:joanna.jia@wecistanche.com

ל- Cistanche deserticola השפעות רבות, לחץ כאן כדי לדעת יותר

מבוא

על פי דו"ח עדכני של ארגון הבריאות העולמי [1], יותר מ-320 מיליון בני אדם (4.4 אחוז מאוכלוסיית העולם) סובלים מדיכאון והפרעות חרדה, כאשר כ-800 אלף התאבדויות בשנה מבוצעות כתוצאה מבעיות נפשיות אלו. . למרות שקיים טיפול בתרופות נוגדות דיכאון סינתטיות, חולים רבים סובלים מתופעות לוואי כמו יובש בפה, עצירות, סחרחורת, טשטוש ראייה, תיאבון מוגבר, עלייה במשקל, נדודי שינה ובעיות בכליות [2]. מסיבה זו, נעשה שימוש בגישות המשתמשות ברפואה משלימה ואלטרנטיבית, לרבות פיטותרפיה, בטיפול במספר סוגים של הפרעות נפשיות [3].

מחקרים פרה-קליניים וקליניים שונים סיפקו עדויות התומכות ביתרונות של תרופות מבוססות צמחים בטיפול בהפרעות חרדה כלליות וספציפיות [4, 5]. מעניינות במיוחד חקירות על תכונות החרדה של Aloysia polystachya (Griseb.) Moldenke (Verbenaceae), מין ארומטי המצוי בעיקר בארגנטינה ובפרגוואי. על פי מחקרים אתנו-פרמקולוגיים, אוכלוסיות מקומיות משתמשות בצמח, המכונה בדרך כלל בוריטו, כחומר חיזוק עיכול, הרגעה ונוגד דיכאון [6, 7]. למרות שתכונות החרדה והנוגדות דיכאון של תמציות הידראו-אתנוליות מ-A. polystachya אושרו על ידי מחקרים פרה-קליניים [8-10], לא בוצעו חקירות פיטוכימיות במטרה לזהות את התרכובות הקשורות לפעילויות אלו. הוכח בעבר שפעילויות נוגדות דיכאון של כמה צמחי מרפא, למשל Hypericum perforatum L. (Hy-pericaceae) ו-Peganum harmala L. (Nitrariaceae), קשורות לעיכוב של מונואמין אוקסידאז-A (MAO-A). [11–13]. משפחת ה-MAO מופצת בכל מערכת העצבים המרכזית וההיקפית וביטוי יתר של אנזימים אלו מקדם את הדה-אמינציה החמצונית של מונואמינים עם הפחתה ברמות הנוירוטרנסמיטורים סרוטונין, נוראדרנלין ודופמין, מה שגורם להופעת הפרעות פסיכיאטריות. תהליכי דמינציה כאלה יוצרים גם חומרים כמו מי חמצן, רדיקלים נטולי חמצן ואלדהידים שאחראים ללחץ החמצוני של התאים. MAOs קיימים בשני איזופורמים עיקריים הנבדלים זה מזה לגבי התפלגות, סגוליות המצע ורגישות למעכבים. האיזופורם MAO-A ממלא תפקיד חשוב בהפרעות דיכאון וחרדה, בעוד MAO-B מעורב במחלות ניווניות עצביות [13-17]. לאור האמור לעיל, שיערנו כי התכונות החרדותיות והנוגדות דיכאון של A. polystachya נובעות, לפחות חלקית, מנוכחות מעכבי MAO-A. על מנת לבדוק השערה זו, זיהינו את העקרונות הפעילים הקיימים בתמצית ההידרו-אתנולית מעלים של A. polystachya והערכנו את ההשפעות של התמצית הגולמית והמרכיבים העיקריים המבודדים ממנה על פעילות MAO-A.

תוצאות ודיון

התמצית ההידרו-אתנולית מעלים של A. polystachya הועברה לכרומטוגרפיה-מסה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (UPLC-MS), והכרומטוגרמה שהתקבלה כך מוצגת באיור ▶. 1א. המרכיבים העיקריים של התמצית טוהרו על ידי כרומטוגרפיה עמודה וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים ב-Reversed Phase (RP-HPLC), וזוהו כאקטאוזיד (syn verbascoside), איזואקטאוזיד, 6'-אצטילקטאוזיד ו-4',4',5 ,5'-tetrahydroxy-6,6'',3'-trimethoxy-[C7–O-C7'']-biflavone בהשוואה של 1H- ו-13C-NMR, HSQC, HMBC שלהם (▶טבלה 1S, 2S, מידע תומך), ונתוני MS (▶איור 1b-e) עם ערכים שדווחו בספרות [18–20]. ריכוז האקטאוזיד בתמצית ההידראו-אתנולית, כפי שנקבע על ידי HPLC, היה 108.65 ± 1.3 מיקרוגרם/מ"ג של תמצית מיובשת. זה מייצג את התיעוד הראשון של המרכיבים של תמציות עלים מ-A. polystachya, אם כי השמן האתרי של הצמח נותח בעבר ונמצא שהוא מכיל את המונוטרפנים קרבון ולימונן כמרכיבים העיקריים [21]. התמצית ההידרו-אתנולית הגולמית מעלים של A. polystachya עיכבה פעילות MAO-A באופן תלוי מינון (▶איור 2a) עם IC50 של 9.2 מיקרוגרם/מ"ל, בעוד המעכב MAO הסלקטיבי קלורגילין הציג IC50 של 0.06 מיקרוגרם/מ"ל (0.22 מיקרומטר). המטוהריםאקטאוזידיםהפגינו גם פעילות מעכבת נגד MAO-A (▶איור 2b), כאשר אקטאוזיד מציג את ערך ה-IC50 הנמוך ביותר של 5µM (3.1µg/mL) ואחריואיזואקטאוזידעם IC50 של 10.1 מיקרומטר (6.3 מיקרוגרם/מ"ל) ו-6'-אצטילקטאוזידעם IC50 של 9.5 µM (6.3 µg/mL). עיכוב MAO-A מוביל לשיקום רמות הסרוטונין, הנוראפינפרין, הדופמין והטירמין, שהם נוירוטרנסמיטורים מרכזיים בשליטה על חרדה ודיכאון [16]. לפיכך, נוכחותם של מעכבי MAO-A מגוונים בעלים של A. polystachya מסבירה, לפחות חלקית, את הפעילות נוגדת הדיכאון והחרדה שדווחה בעבר של המין [8-10]. השימוש בתערובות צמחים מרובי רכיבים יכול להועיל בטיפול במחלות בעלות אטיולוגיה מורכבת כגון חרדה, דיכאון ומצבים נוירולוגיים אחרים. כיום, השימוש בתרופות פיטו בטיפול במחלות המשפיעות על מערכת העצבים מבוסס על הפרדיגמה של ליגנדים מכווני ריבוי מטרות, כלומר תרופות שיש להן פעילות מרובת מטרות הנובעת מנוכחות של חומרים כגון פוליפנולים עם אנטי- תכונות דלקתיות, נוגדות חמצון ומעכבות MAO המסוגלות להעניק הגנה עצבית [20,22-25]. עם זאת, ראוי לציין שהאופי הקוטבי של חומרים פוליפנולים עלול להפריע לאינטראקציות עם המטרות המולקולריות שלהם. עם זאת, מחקרים קליניים הוכיחו כי המגע בין פוליפנולים לבין מטבוליטים משניים לא קוטביים הקיימים בתמציות עשוי לשנות את החדירות של ממברנות התא ולהקל על קליטת תרכובות קוטביות [23]. לפיכך, תמציות צמחים מורכבות המכילות חומרים מרובי מטרות המקיימים אינטראקציה עם הקולטנים שלהם באופן פליאוטרופי מייצרות סינרגיזם תרופתי המשפיע על תהליכים רבים, כולל תנועת מטבוליטים קוטביים על פני ממברנות התא. בהקשר זה, Li et al. [26] השתמש במודל של דג זברה כדי להדגים שאקטאוזיד יכול לחדור את מחסום הדם-מוח, והציע שלגליקוזיד פנילטנואיד עשוי להיות השפעה טיפולית פוטנציאלית במחלת פרקינסון. נוירוטרנסמיטורים מונואמינרגיים הם המטרות העיקריות של תרופות נוגדות דיכאון מודרניות, שכן החסר שלהן אחראי לתסמינים המתישים של דיכאון. מחקר שנערך לאחרונה ב-vivo הראה שהתמציות האתנוליות והמימיות של Lippia citriodora (Verbenaceae) והמרכיב העיקרי שלהם אקטאוזיד הפגינו השפעות חרדה, היפנוטיות והרפיית שרירים, ותכונות אלו יוחסו, בין השאר, לאינטראקציה עם גמא מסוג A. קולטן חומצה אמינו-בוטירית (GABAA) [27]. מחקרים קליניים גילו שתרופות בעלות יכולת לחסום ציטוקינים דלקתיים, כגון TNF-, או מרכיבים אחרים של מסלול האיתות הדלקתי, למשל, cyclooxygenase-2 (COX-2), יעילות בהפחתת תסמיני דיכאון בחולים עם דלקת מפרקים שגרונית, פסוריאזיס וסרטן, כמו גם אלו הסובלים מהפרעות פסיכיאטריות עיקריות [28]. בהקשר זה, דווח כי אקטאוזיד יכול להחליש את הייצור והשחרור של מולקולות דלקתיות, כגון תחמוצת חנקן (NO), TNF- ואינטרלוקין 12 (IL-12) בליפופוליסכריד/אינטרפרון-גמא (LPS). מקרופאגים מגורים /IFN- ) [29], כמו גם היסטמין וחומצה ארכידונית בתאי RBL-2H3 מאסט [30]. בנוסף, אקטאוזיד מסוגל להפחית את רמות ה-TNF-, IL-1, IL-8, IL-6 ו-NO, ולהפעיל את הקספאז-1, גורם גרעיני -kappa-B

(NF-κB), NO סינתאז וחלבון אקטיבטור-1 [31] המושרה על ידי IL-32 ו/או LPS בתאי TH-1 ומקרופאגים [32]. חלק מהמתווכים הדלקתיים הללו, כגון IFNs, IL-6, IL-8 ו-IL-1 , נמצאו ברמות חריגות בדגימות רקמה היקפית ואחרי המוות מאנשים דיכאוניים. , והיו קשורים לתסמינים של דיכאון [33]. הפעלה של מולקולות אלו על ידי גורמי לחץ פסיכו-סוציאליים עשויה לקדם שינויים תפקודיים משמעותיים במוח, ולהוביל להתפתחות של התנהגות דיכאונית והפרעות פסיכיאטריות אחרות. IFNs, IL-1 ו-TNF-, למשל, עשויים להגביר את הביטוי והתפקוד של משאבות קולטני סרוטונין, נוראדרנלין ודופמין, ובכך להפחית את הזמינות של נוירוטרנסמיטורים אלו במסוע הסינפטי [28]. בנוסף, IFN-, IL-6, TNF- ועקה חמצונית יכולים להפעיל אינדולאמין 2,3 דיאוקסיגנאז (IDO), אנזים האחראי לפירוק הטריפטופן, ובכך להפחית את ריכוז המבשר העיקרי של סינתזת סרוטונין [34].אקטאוזיד, איזואקטאוזיד, ו-6'-אצטילקטאוזידמכילים חלקי הידרוקסי-פניל-אתיל וקפאואיל הידועים כקשורים לתכונות נוגדות חמצון [35, 36], ואקטאוזיד עצמו מפגין פעילות נוגדת חמצון ניכרת [37]. מחקרים הראו זאתאקטאוזידמעכב את ההצטברות של פפטיד -עמילואיד (A ) באופן תלוי מינון, מתפקד כחומר מגן עצבי ומשפר את הזיכרון, ותכונות אלו יוחסו לפעילות נוגדת החמצון של הסוכן [38,39]. בהתחשב בכך שמינים רבים עשירים בפנולים בעלי תכונות נוגדות חמצון משמשים בטיפול בהפרעות נוירולוגיות [15], הוצע כי ההשפעות נוגדות הדיכאון והחרדה שלפנילתנואיד גליקוזידיםמבודדים מ-A. polystachya עשויים לנבוע גם מפעילותם נוגדת החמצון. סברה זו נתמכה על ידי Xu et al. [40], שהציגו ראיות לגבי הקשר בין לחץ חמצוני מוגבר ודיכאון/חרדה. בהתבסס על האמור לעיל, אנו מסיקים כי ניתן להסביר את התכונות נוגדות הדיכאון של התמצית ההידראו-אתנולית מעלים של A. polystachya ושל הפנילאתנואידים המטוהרים המבודדים מהם, על ידי אופני פעולה מרובי מטרות הכוללים עיכוב של MAO-A, הורדת ויסות של מולקולות דלקתיות, וניטרול תגובות חמצון. לפיכך, התוצאות המוצגות כאן תומכות בהשערה המקורית שלנו שהפעילות החרדה והנוגדת דיכאון של התמצית ההידראו-אתנולית של A. polystachya נובעת, לפחות בחלקה, מעיכוב של MAO-A. עם זאת, קשר המבנה-פעילות של הגליקוזידים הפנילאתנואידים שזוהו במחקר זה דורש תשומת לב נוספת כדי שניתן יהיה לעצב מולקולות חדשות לטיפול בהפרעות נוירולוגיות ספציפיות.

חומרים ושיטות

חומר צמחי

עלים של A. polystachya נקצרו ב-Farmácia da Natureza da Terra de Ismael (Jardinópolis, SP, ברזיל) בינואר 2016. חומר צמחי זוהה על ידי ד"ר Lúcia Rossi (Instituto Botânico, São Paulo, SP, ברזיל) דגימת שובר הופקדה בצמחי מרפא ב-UNAERP עם מספר השובר

HPM-1213. ההרשאה להעריך את הפעילות הביולוגית של תמציות מצמחים ברזילאים ניתנה על ידי Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis ​​(מס' 02001.005074/2011-19).

הכנת התמצית ההידראו-אתנולית של Aloysia polystachya

עלים (1000 גרם) יובשו במשך 72 שעות בתנור אוויר במחזור בחום של 45 מעלות, נגרסו ועברו דרך מסננת רשת 40-. אבקת החומר הוטבלה במים: אתנול (20:80; v/v) למשך 7 ימים ולאחר מכן סונן דרך נייר סינון Whatman No. 41. התסנין הצטמצם ליובש במאייד סיבובי וליאופיל והניב 130.2 גרם של תמצית גולמית יבשה, וכתוצאה מכך יחס תמצית תרופה של 7.6:1.

פנילתנואיד גליקוזידיםבcistanche

לחץ כאן לחלק 2