השפעות מועילות של סך כל חלקי פנילתנואיד גליקוזיד מבודד מ- Cistanche Deserticola על מיקרו-מבנה העצם בחולדות שעברו ניתוח שחלות

לינגלינג יאנג, שוקין דינג, בו ג'אנג, ג'ינג'ינג ליו, יאנהונג דונג, קיוון טאנג, פינגפינג יאנג ו-שוקין מא.

1 המחלקה לניתוח פרמצבטי, בית הספר לרוקחות, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, סין

2 בית הספר לרפואה קלינית, Ningxia Medical University, 692 Shenli Street, Yinchuan 750004, סין

3 Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, משרד החינוך, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, סין

זהו מאמר בגישה פתוחה המופץ תחת רישיון הייחוס של Creative Commons, המאפשר שימוש, הפצה ושכפול ללא הגבלה בכל אמצעי בתנאי שהיצירה המקורית מצוטטת כהלכה.

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

תַקצִיר

המחקר הנוכחי נועד להעריך את הפעילות האנטי-אוסטיאופורטית של כלל חלקי הגליקוזידים של פנילתנואיד שבודדו מCistancheמדברית(CDP) על חולדות הנגרמות על ידי כריתת שחלות (OVX) וכן על המנגנונים הקשורים. לאחר 3 חודשים של מתן דרך הפה, הירידה בצפיפות המינרלים של העצם, Ca ו-P בסרום בחולדות OVX התאוששה והידרדרות במיקרו-ארכיטקטורת העצמות הטרבקולרית השתפרה בחלקה על ידי התערבות Cistanche deserticola (60, 120 ו-240 מ"ג/ק"ג), הפעילויות. של סמני ספיגת עצם הוסרו מטה, והאינדקס הביו-אקטיבי של יצירת העצם הווסרה; בינתיים, תכולת ה-MDA נדחתה, וה-GSH הוגדל על ידי טיפול ב-CDP. מבחינת הרכב, זוהו 8 תרכובות פנילאתנואיד גליקוזיד בCistancheמדברית(CDP), כאשר התכולה הכוללת מכומדת כ-50.3 אחוזים באמצעות שיטת HPLC. מבחינה מכאנית,Cistancheמדברית(CDP) ירידה ברמות של TRAF6, RANKL ו-RANK, ובכך דיכאה RANKL/RANK/TRAF6-הפעלה המושרה של מסלולי איתות NF-KB ו-PI3K/AKT במורד הזרם ובסופו של דבר מנעה פעילויות של חלבוני המפתח האוסטאוקלסטוגניים של NFAT2 ו-c -פוס. כל הנתונים לעיל מרמזים ש-CDP הפגין השפעות מועילות על מבנה העצם בחולדות שעברו ניתוח שחלות, והשפעות אלו עשויות להיות קשורות למסלולי האיתות NF-KB ו-PI3K/AKT שהופעלו על ידי הקישור של RANKL, RANK ו-TRAF6.

Cistanche tubulosaיש השפעות רבות, לחץ כאן כדי לדעת יותר

1. הקדמה

אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר, שבו 1 מכל 3 נשים מעל גיל 50 תסבול, הופך לסכנה הבריאותית העיקרית הפוגעת ביותר מ-200 מיליון נשים בכל רחבי העולם [1]. בגיל המעבר, הירידה החדה של רמת האסטרוגן מובילה בדרך כלל לספיגת עצם חריגה הנגרמת על ידי אוסטאוקלסטוגנזה מוגברת; לאחר מכן, האיזון בין היווצרות עצם הנגרמת על ידי אוסטאובלסט לבין ספיגת עצם הנגרמת על ידי אוסטאוקלסטים נשבש, וספיגת העצם המואצת גרמה לבסוף לאוסטאופורוזיס ואף לשבר בירך או בעמוד השדרה [2]. האמינו שההתמיינות של האוסטאוקלסט הופעלה כאשר מפעיל הקולטן של גורם גרעיני kappa B (RANK) נקשר ל-RANKL, הליגנד של RANK. עם זאת, השילוב של RANK ל-RANKL אינו יכול להיות מופעל אלא אם כן צורף בו פקטור 6 (TRAF6) הקשור לקולטן לגידול גידול חלבון [3], ואחריו גירוי של מסלולי איתות במורד הזרם כולל PI3K/AKT ו-NF-KB. ולבסוף, הביטויים של גורם גרעיני של תאי T משופעלים c2 (NFAT2) ו-c-Fos היו מווסתים [4] כדי לווסת את ההתמיינות של האוסטאוקלסט כמו גם את ספיגת העצם. לפיכך, הגורמים והוווסתים הקשורים במישרין או בעקיפין להפעלה והתמיינות של אוסטאוקלסט האמינו כיעדים חיוניים למניעת אובדן עצם.

אכן ישנן כמה תרופות לטיפול הורמונלי חלופי קליני וסינטטי כמו אסטרדיול ולרט אשר יעילות בטיפול באוסטיאופורוזיס לאחר גיל המעבר. למרבה הצער, חלק מאלה הגבירו את הסיכון לסרטן חמור כולל סרטן שד וסרטן רירית הרחם [5], מה שהגביל את היישומים הקליניים שלהם. לכן, יש צורך לבחור חלופות אחרות בעלות יעילות ותופעות לוואי מינימליות. תרופות סיניות מסורתיות (TCM), כמו גם התרכובות והשברים הביו-אקטיביים המבודדים [6-9], הוכחו כיעילים על מחלות שונות כולל אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר. בין הרכיבים והחלקים הביו-אקטיביים הללו, תרכובות פנילאתנואיד גליקוזיד (PhG) בעלות יעילות פוטנציאלית נחשבו כסוכנים מבטיחים לטיפול באוסטיאופורוזיס [10-12]. המבנים של PhGs מורכבים מאגליקון של חומצה קינמית, קבוצת הידרוקסיל פניל ​​אתיל המשולבת עם -glucopyranose, apiose, galactose, rhamnose, או xylose באמצעות קשר גליקוזידי. הם קיימים באופן נרחב במינים רפואיים של סוגCistanche[13]. CistancheמדבריתYC Ma הוא TCM רשמי שנרשם בפרמקופיה הסינית, ומלבד היותו TCM חשוב [14], C deserticola הוא גם עשב טוניק אנטי-אייג'ינג עם מעט תופעות לוואי אשר פותח למשקאות מרפא ונוזל תזונתי שאושר על ידי המזון הממלכתי ומנהל התרופות. בהתבסס על התיעוד של הפרמקופיה הסינית, C. deserticola שימש באופן מסורתי על ידי ילידים לטיפול בבעיות של חוסר תמצית כליות כמו חולשה בשרירים וחולשה מותנית, ותרכובות פנילתנואידים גליקוזידים כולל אכינאקוסיד ואקטאוזיד הן המרכיבים הביו-אקטיביים העיקריים בצמח זה. על פי תיאוריית ה-TCM של "כליה-מנהלת-עצם", מערכת העצמות נשלטת על ידי תמצית כליות [15], ובעיות הקשורות לעצם כמו אוסטאופורוזיס ניתנות להחלמה על ידי צמחי מרפא או תרכובות בעלות פעילות של הזנת תמצית הכליה. לכן, שיערנו שחלק ה-phenylethanoid glycoside הכולל שבודד מ-C. deserticola, לפחות בחלקו, היה מועיל בטיפול באוסטיאופורוזיס. לכן הניסוי הנוכחי תוכנן כדי לאמת את ההשערה שלנו על ידי שימוש במודל של חולדות עם שחלות (OVX); מלבד סמני ספיגת העצם ויצירת עצם שיש להעריך, מדד נוגד החמצון וכן RANKL/RANK/TRAF6- מסלולי איתות PI3K/AKT ו-NF-κB הושרו גם כדי לחקור את המנגנונים העיקריים של הפעילות הביולוגית האנטי-אוסטיאופורטית .

2. חומרים ושיטה

2.1. חומרים צמחיים והכנה.

סה"כ 30 ק"ג נובעים שלCistancheמדבריתY.C. מא נאספו ממחוז יונגינג בספטמבר של 2015 עם הקואורדינטות 106.026597 ו-38.262816, מחוז Ningxia, סין. העשב זוהה על ידי ד"ר לין דונג (המחלקה לפרמקוגנוסיה, Ningxia Medical University), ודגימה מתאימה (#201509{{40}}1) נשמר במחלקה לניתוח פרמצבטי. ראשית, 30.0 ק"ג של אבקת C. deserticola הופקו בשיטת ריפלוקס עם 70 אחוז אתנול כממס; היחס בין החומר לממס נקבע ל-1:10, וזמן הריפלוקס היה 2 שעות למשך 3 פעמים. לאחר מכן, כל התסננים אוחדו ועיכוב בלחץ מופחת ב-60 מעלות צלזיוס. שנית, עמודות שרף מאקרו-פורוזיות AB-8 שימשו להפרדה המקדימה, ויחסים שונים של אתנול במים (0 אחוז, 20 אחוז, 30 אחוז, 40 אחוז, 50 אחוז ו-60 אחוז, כל אחד 60 ליטר) הועסקו לפליטה. שלישית, 40 אחוז ו- 50 אחוזים שולבו וטיהרו עוד יותר על ידי שימוש בעמודות שרף מאקרו נקבוביות AB-8 חוזרות ונשנות עם eluents של 0 אחוז, 20 אחוז, 30 אחוז, 40 אחוז ו-50 אחוז אתנול במים, ו כל פלט היה 12 ליטר. לבסוף, החלק של 40 אחוז נאסף ועובה בלחץ מופחת לקבלת 150 גרם משקעים צהוב בהיר של פנילתנואיד גליקוזיד של C. deserticola (CDP, התשואה הייתה 0.5 אחוז). עבור ניסויים in vivo, 0.5 אחוז ממס CMC-Na הועסק כדי להמיס CDP; מתן אוראלי לבעלי חיים נקבע כ-1 מ"ל/100 גרם של משקל גוף; עבור ניתוח Western blot במבחנה, CDP הומס עם DMSO ולאחר מכן מדולל ב-DMEM כדי להשיג את הריכוזים הסופיים של 0.1 מ"ג/מ"ל, 0.01 מ"ג/מ"ל ו-0.001 מ"ג/מ"ל.

2.2. כימיקלים וממיסים.

Estradiol valerate (EV) היה מ- Delpharm Lille SAS, צרפת; פוספטאז אלקליין (ALP), gla-protein עצם (BGP), חומצה פוספטאז עמיד לטרטרטים (TRAP) ו-Deoxypyridinoline (DPD) ערכות ELISA צולבות מבית Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., שנחאי, סין, 201605; ערכות ריאגנטים של malondialdehyde (MDA, 20181221), super oxide dismutase (SOD, 20121218) וגלוטתיון (GSH, 20181221) מהמכון של נאנג'ינג Jiancheng להנדסה ביולוגית, נאנג'ינג, סין; ערכות ELISA צולבות של ELISA מבית Elabscience Biotechnology Co. Ltd., ווהאן, סין; ערכת ריאגנטים cathepsin K ELISA מבית BioVision, אמריקה, 1l300141; נוגדנים ראשוניים של RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 (Kinase p690) PI3 (2AC15 p690) , AKT 1 (AF05173234), -אקטין (17AV0411), ונוגדנים משניים של חזרת פרוקסידאז מצומדת עז נגד ארנבת IgG מ-ZSGB-BIO, סין, 136080; ערכת BCA pro tein assay total והערכה המסחרית לאיתור היווצרות אוסטה אוקלסט וסרום בקר עוברי ו-Dulbecco's modifified Eagle's medium (DMEM) מ-HyClone, Logan, UT, ארה"ב; ממברנת polyvinylidene flfluoride (PVDF) מ-Millipore Life Sciences, Billerica, MA, ארה"ב; פניצילין וסטרפטומיצין מ- Gibco, Rockville, MD, ארה"ב. כל שאר החומרים הכימיים בהם נעשה שימוש היו בדרגת AR.

2.3. כימות HPLC של Cistanche Deserticola P.

מכשיר HPLC Agilent 1220 הופעל כדי לזהות ולכמת את ההרכב של CDP. תנאי הכרומטוגרפיה היו כדלקמן: עמודה C18 (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 מ"מ, 5 מיקרומטר); דליית שיפוע הכילה ממסים A (אצטוניטריל) ו-B (מים המכילים 0.5 אחוז חומצה אצטית) (0-10 דקות: 17-20 אחוז A; 10-30 דקות: 20-25 אחוז A; ו 30-40 דקות: 25-30 אחוז A); אורך גל הזיהוי היה 333 ננומטר; טמפרטורת הסביבה; קצב הזרימה היה 1.0 מ"ל/דקה; נפח הזרקת הדגימה היה 5 μL. זוהו שמונה תרכובות PhG, כלומר, cistanoside F, echinacoside,6'-acetylacteoside, cistanoside C, cistanoside A, acteoside, 2'-acetylacteoside ואיזואקטאוזיד; על ידי שימוש בחומרי הייחוס המתאימים ושיטה חיצונית סטנדרטית, התוכן של 8 ה-PhGs לעיל נכומת על ידי ניתוח HPLC (איור 1).

2.4. פרוטוקול ניסויים בבעלי חיים.

סך של 60 חולדות בוגרות של נקבות Sprague-Dawley בנות 3 חודשים נועדו ממרכז הניסויים בבעלי חיים של Ningxia Medical University, עם משקל הגוף הראשוני הממוצע של כ-234 ± 25 גרם. החולדות שוכנו בסביבה סטנדרטית נטולת פתוגנים כדי להתאקלם במשך שבוע. לאחר מכן, כל החולדות הורדמו (כלורלי הידרט, 100 מ"ג/ק"ג, ip) בלבד או הוצאו שחלות דמה (SHAM), או ששתי השחלות הוסרו ולאחר מכן חולקו באופן אקראי ל-5 תת-קבוצות: טופלו דרך הפה עם כלי עזר (0.5 אחוז CMC- Na) נקבעה כקבוצת המודל (OVX), אסטרדיול ולרט (1 מ"ג/ק"ג/יום) כקבוצה החיובית (EV), ו-60, 120 ו-240 מ"ג/ק"ג/יום של CDP כמו נמוך (CDPL), קבוצות מינון בינוניות (CDPM), וגבוהות (CDPH), בהתאמה. כל החולדות ניתנו דרך הפה מדי יום והחזיקו מעמד במשך 3 חודשים כשהמינון מותאם כל שבועיים, תלוי בשינוי של משקל הגוף כולו. ביום האחרון של הניסוי בבעלי חיים, השתן של 24-שעה הושג באמצעות כלובים מטבוליים; סרום נאסף מעורק הירך של חולדות מורדמות; הפמורה הימנית, השוקה וכל האיברים נותחו ואוחסנו ב--80 מעלות C לניתוח נוסף. הניסויים בבעלי חיים שערכנו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של Ningxia.

2.5. קביעת צפיפות מינרלים בעצם וניתוח מיקרו-CT.

ראשית, נעשה שימוש במכונת ספיגה של קרני רנטגן עם אנרגיה כפולה (Lunar, ארה"ב) כדי להעריך את צפיפות המינרלים הכוללת של עצם הירך הימני של כל חולדה; שנית, אותה עצם הירך שימשה להערכת התמונה התלת-ממדית של מיקרו-ארכיטקטורת עצם טרבקולרית על-ידי שימוש במכשיר סורק מיקרו-CT (GE, אמריקה). הרזולוציה האיזוטרפית נקבעה ל-14 מיקרומטר כדי לקבל תמונה תלת מימדית אידיאלית; אזור העניין (ROI) נבחר על ידי הגדרת אותן קואורדינטות בצלחת הצמיחה של עצם הירך של כל דגימה; והפרמטרים המורפומטריים של העצם, כולל הפרדה טרבקולרית (Tb. Sp), מספר טרבקולרי (Tb. N), עובי טרבקולרי (Tb. Th), תכולת מינרלים בעצם (BMC), צפיפות מינרלים ברקמות (TMD), ותכולת מינרלים ברקמות (TMC) ) הושגו על ידי ניתוח ה-ROI.

2.6. בדיקה ביוכימית של סרום ושתן.

הפעילויות של cathepsin K, TRAP, SOD ו-GSH בסרום, כמו גם תכולת ה-PTH, calcitonin, ERR, MDA, BGP ו-DPD בשתן, נקבעו על ידי שימוש בערכות ריאגנטים מתאימות לפי הוראות היצרן, והן. רמת פוספטאז אלקליין (ALP) ותכולת הסידן בסרום ובשתן (Ca) וזרחן (P) נאמדו על ידי שימוש במכונה אוטומטית (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, ארה"ב).

2.7. Western Blot Analysis.

אוסטאוקלסטים הושרה על ידי שימוש בתאי RAW 264.7 שנוספו עם גורם מגרה של מושבות מקרופאגים (MCSF) ו-RANKL. בקצרה, 1 × 107 תאים RAW 264.7 תורבו בצלחת 6-באר בנוכחות 30 ננוגרם/מ"ל של MCSF ו-25 ננוגרם/מ"ל של RANKL. לאחר 6 ימים של אינדוקציה, התאים האוסטאוקלסטים המבשילים זוהו באמצעות שיטת ה-TRAP צבוע עם הערכה המתאימה, ולאחר מכן טופלו עם CDP (0.1, 0.01 ו-0.001 מ"ג/מ"ל , בהתאמה) למשך 24 שעות; לאחר מכן, התאים עברו lysis עם חיץ תמוגה המכיל 0.5 mmol phenylmethylsulfonyl fluoride, protease, ו-phosphatase inhibitors. לאחר מכן הליסט הופרד באמצעות 10 אחוז SDS-PAGE והועבר לממברנת PVDF, שנבדקה עם AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K-p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos ו-actin (1: 400) לאחר חסימה עם 5 אחוז חלב ללא שומן למשך שעתיים. אותם ממברנות הופשטו ונבדקו שוב עם 9 הנוגדנים המתאימים לעיל, בהתאמה, ואז זוהו על ידי תוכנת Image Lab בסוף. הניסויים חזרו על עצמם שלוש פעמים.

2.8. ניתוח סטטיסטי.

כל הנתונים שהתקבלו מניסויים in vivo ו-in vitro, המתוארים כממוצע ± SD, נותחו על ידי שימוש ב-ANOVA חד כיווני ואחריו הבדיקה של Dunnett (תוכנת SPSS 22.0, SPSS, ארה"ב); p < 0="" 05="" היה="" מובהק="">

תוצאות

3.1. הרכב כימי של Cistanche Deserticola P.

על ידי שימוש בשיטת HPLC, שמונהפנילתנואיד גליקוזידתרכובות נמצאו בשבר זה, כפי שמראה איור 1. על ידי שימוש בהתייחסויות סטנדרטיות ושיטת תקן חיצונית, התרכובות ותכולתן זוהו וכומתו באופן הבא: (1) אקטאוזיד F (3.6 אחוז), (2) אכינאקוסיד (8.8 אחוז), (3) ציסטנוסיד A (5.{ {9}} אחוזים), (4) אקטאוזיד (13.3 אחוז), (5) איזואקטאוזיד (3.3 אחוז), (6) אקטאוזיד C (3.6 אחוז), (7) 2'-אצטילקטאוזיד (9.9 אחוז) ו- (8) ) 6'-אצטילקטאוזיד (3.2 אחוזים). התוכן הכולל של שמונת הרכיבים הללו הוכמת כ-50.7 אחוזים.

3.2. השפעות של Cistanche Deserticola P על צפיפות מינרלים ומיקרו-ארכיטקטורה של Trabecula.

צפיפות מינרל העצם הכוללת של החולדות בתתי קבוצות שונות מוצגת באיור 2. מגמת ירידה בתכולת צפיפות מינרל העצם נצפתה בחולדות מקבוצת המודל OVX, אשר ירדה בכמעט 12.0 אחוזים לאחר 12 שבועות מהניתוח בהשוואה לחולדות מקבוצת SHAM (p < 0="" 001).="" כל="" החולדות="" שטופלו="" ב-cdp="" הפגינו="" צפיפות="" מינרלים="" מוגברת="" משמעותית="" של="" 11.2="" אחוזים,="" 12.0="" אחוזים="" ו-10.7="" אחוזים="" (p="">< 0="" 01),="" בהתאמה,="" בהשוואה="" לחולדות="" של="" מודל="" ovx="" קְבוּצָה.="" יתר="" על="" כן,="" בהתאם="" לנתוני="" צפיפות="" המינרלים="" הכוללת="" של="" העצם,="" שחזור="" מיקרו-ct="" וכן="" קביעה="" היסטומורפומטרית="" של="" עצם="" הירך="" הראו="" כי="" החולדות="" בקבוצת="" ovx="" הראו="" הידרדרות="" ברורה="" בארכיטקטורה="" הטרבקולרית,="" המעידה="" על="" ירידה="" ניכרת="" במספר="" ובשטח="" של="" טרבקולות.="" עלייה="" ניכרת="" ב-tb.="" sp="" בהשוואה="" לחולדות="" מקבוצת="" sham.="" טיפול="" עם="" cdp="" מנע="" את="" ההידרדרות="" הנגרמת="" על="" ידי="" ovx="" בארכיטקטורה="" טרבקולרית;="" כפי="" שמראה="" איור="" 3,="" bmc,="" tmc="" ו-tb.="" ערכי="" n="" עלו="" באופן="" משמעותי="" ושטח="" ה-tb.="" sp="" ירד="" באופן="" ניכר,="" בעוד="" הערכים="" של="" tmd="" ו-tb.="" נראה="" שהם="" לא="" הושפעו="" באופן="" משמעותי="" מפעולת="" ovx="" ומהתערבות="" ה-cdp="">

3.3. השפעות של Cistanche Deserticola P על הפרמטרים הביוכימיים של שתן וסרום.

כפי שמראה איור 4, זוהו מגמות ירידה משמעותית של רמת P בשתן ותכולת קלציטונין בסרום בחולדות מקבוצת המודל OVX, שהייתה כמעט 30 אחוז ו-60 אחוז פחות מחולדות SHAM (p < 0="" 001="" ),="" בהתאמה,="" בעוד="" שלא="" נצפתה="" מגמה="" ברורה="" של="" עלייה="" או="" ירידה="" ברמות="" השתן="" של="" ca="" ו-ca="" בסרום="" וכן="" בנסיוב="" p="" ו-pth="" בסרום="" בין="" קבוצות="" ovx="" ו-sham.="" טיפול="" ב-cdp="" מנע="" באופן="" מובהק="" אובדן="" של="" p="" ו-ca="" בסרום="" בחולדות="" ovx,="" עדות="" לכך="" שרמות="" ה-p="" ו-cה="" בסרום="" מווסתות="" באופן="" ניכר="" (p="">< 0="" 05)="" בהשוואה="" לחולדות="" של="" קבוצת="" המודלים="" של="" ovx.="" בנוסף,="" מגמות="" מוגברות="" אך="" לא="" מובהקות="" מבחינה="" סטטיסטית="" של="" קלציטונין="" נצפו="" בקבוצות="" המינון="" הנמוך="" והגבוה="" של="" cdp,="" בהשוואה="" לקבוצת="" המודל="">

3.4. השפעות של Cistanche Deserticola P על היווצרות עצם וסמני ספיגת עצם.

ההשפעות המיטיבות של CDP על אינדקס יצירת העצם, כמו גם השפעות עיכוב על סמני ספיגת עצם, תוארו באיור 5. לגבי סמני יצירת העצם, רמות ה-BGP בסרום לא הושפעו כמעט מהניתוח שבוצע בכריתת השחלה, המעיד על אי- שינויים משמעותיים שנצפו בכל הקבוצות שטופלו, בעוד שיפורים מובהקים סטטיסטית של ALP בסרום הושגו הן במינונים נמוכים (60 מ"ג/ק"ג) ובמינונים מתונים (120 מ"ג/ק"ג) של קבוצות התערבות של CDP כאשר בהשוואה לחולדות של קבוצת SHAM (p < 0="" 01).="" לגבי="" אינדקס="" ספיגת="" העצם,="" רמות="" ה-cathepsin="" k="" ו-dpd="" בסרום,="" כמו="" גם="" trap="" בחולדות="" מקבוצת="" המודל="" ovx,="" עלו="" משמעותית="" בכ-75.0="" אחוזים,="" 41.4="" אחוזים="" ו-21.0="" אחוזים,="" בהתאמה,="" בהשוואה="" לחולדות="" sham.="" ,="" וכאשר="" טופלו="" ב-cdp,="" במיוחד="" המינון="" הנמוך="" של="" 60="" מ"ג/ק"ג,="" המאפיינים="" של="" cathepsin="" k="" ו-dpd="" וכן="" trap="" בקבוצת="" המודל="" ovx="" עוכבו="" באופן="" ניכר="" ב-67.3="" אחוזים,="" 41.4="" אחוזים="" ו-25.9="" אחוזים,="" בהתאמה.="" בהשוואה="" לחולדות="" בקבוצת="" הדגמים="">

3.5. השפעות של Cistanche Deserticola P על הנרתיק והרחם וכן על משקל הגוף כולו.

הבדלים לא מובהקים במשקל הגוף המלא הראשוני של חולדות נצפו לפני הטיפול בשש קבוצות (איור 6). עם זאת, ניתוח כריתת השחלה הוביל לעלייה משמעותית במשקל הגוף הסופי של חולדות בקבוצת המודלים של OVX שהוא כמעט 36.0 אחוזים, בעוד שהמשקל הרטוב של הרחם והנרתיק ירדו באופן דרסטי בכמעט 9{{4 }}.0 אחוז ו-60.0 אחוז , בהתאמה, בהשוואה לחולדות ה-SHAM (p < 0="" 001).="" למרות="" שהתוכן="" של="" err="" לא="" הראה="" הבדל="" משמעותי="" בין="" קבוצות="" ovx="" ו-sham,="" כל="" קבוצות="" הטיפול="" כולל="" cdp="" ו-ev="" העלו="" משמעותית="" את="" רמת="" ה-err.="" יתר="" על="" כן,="" כאשר="" טופלו="" ב-ev,="" האמור="" לעיל="" עלה="" במשקלי="" הגוף="" כולו,="" כמו="" גם="" אובדן="" משקל="" הנרתיק="" והרחם="" של="" חולדות="" ovx,="" התהפכו="" בחלקן="" (p="">< 0="" 001)="" ​​אך="" לא="" הושפעו="" מהתערבות="">

3.6. השפעות של Cistanche DeserticolaP על רמות סרום MDA, SOD ו-GSH.

לא היה הבדל מובהק סטטיסטית בתכונות של SOD ו-GSH בסרום בין קבוצות המודל SHAM ו-OVX; כפי שמתאר איור 7, ניתן להבחין במגמת עלייה ב-GSH בין שתי הקבוצות לעיל. בנוסף, רמת ה-MDA בסרום הווסטה בצורה חדה בכמעט 50 אחוז בחולדות מקבוצת המודל OVX בהשוואה לחולדות SHAM. הפעילות של SOD לא הושפעה מטיפול ב-CDP, בעוד שהתכונה של GSH השתפרה באופן משמעותי על ידי התערבות CDP, ו-CDP הפחית באופן ניכר את רמת ה-MDA ב-33.9 אחוזים ו-42.4 אחוזים במינונים של 60 ו-240 מ"ג/ק"ג, בהתאמה ( p < 0="">

3.7. השפעות של Cistanche deserticola P על רמות ביטוי חלבון.

הנתונים שלנו, המוצגים באיור 8, הציעו שטיפול ב-CDP הפחית באופן משמעותי את רמות החלבון של TRAF6, RANK ו-RANKL בהשוואה לביקורת. מסלולי האותות במורד הזרם, כולל NF-κB, דוכאו, ו-PI3K/AKT גירוי על ידי התערבות CDP, עדות על ידי ביטוי של ויסות מטה של ​​NF-κB-p65, בעוד PI3K-p85 ו-AKT1 היו מווסתים. כתוצאה מכך, הביטוי של NFAT2 ירד באופן משמעותי, ו-c-Fos גדל לאחר טיפול ב-CDP בריכוז של 0.001-0.1 mg/mL. מנגנון מוצע מתואר באיור 9, שבו CDP הוריד את רמות RANKL ו-RANK, מה שהוביל להפחתת כמויות הקישור של ליגנד זה עם הקולטן שלו, והחיבור של RANKL עם RANK ירד עוד יותר על ידי הורדת הוויסות של TRAF6, ואחריו הדיכוי של המסלולים במורד הזרם כולל מסלול NF-κB בעוד שמסלול האות PI3K/AKT מגורה, מה שהוביל לבסוף לירידה בביטוי NFAT2 ולעלייה ברמת c-Fos.

4. דיון

גליקוזידים פנילתנואידים הם רכיבים מסיסים במים, הקיימים באופן נרחב בממלכת צמחי המרפא [11]. עד כה, התרכובות של phenylethanoid glycosides משכו יותר ויותר חוקרים בגלל תפקידן הברור בטיפול בתחלואים וחריגות אנושיות שונות [13]. מספרים של חלקים ותרכובות ביו-אקטיביות אנטי-אוסטיאופורוטיות, כולל פוליפנול וגליקוזידים פנילתנואידים, זוהו ובודדו מעשרות צמחי מרפא טבעיים [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola ידוע כ"ג'ינסנג של המדבר", מה שמרמז על פרופיל הבטיחות של TCM אכיל זה [18, 19]. כצמח טוניק כללי ומזון בריאות טבעי שנמצא בשימוש זמן רב במדינות אסיה, C. deserticola הפגין תפקוד מועיל לשיפור חוזק הכליות. נמצא ש-TCM, המשמש באופן מסורתי להמריץ ולשמירה על תמצית הכליות, שימש בדרך כלל לטיפול באוסטיאופורוזיס, הן במבחנה והן בנתונים שפורסמו in vivo הוכיחו את הפעילות האנטי-אוסטיאופורטית של C. deserticola [20-23], ומרכיבי פניל-אתנואיד גליקוזיד, כולל echinacoside ו-acteoside הם הרכיבים הביו-אקטיביים העיקריים הקיימים בצמח מרפא אכיל זה; כל אלה העלו כי לא רק אכינאקוסיד ואקטאוזיד עצמם אלא גם רכיבים אחרים של גליקוזיד פנילתנואידים הכלולים ב-C. deserticola נחשבו כאחראים לתכונה האנטי-אוסטיאופורטית של עשב זה. במחקר הנוכחי שלנו, נעשה שימוש בשרף מקרו-נקבי בטיחותי על מנת לבודד ולהעשיר את חלקיק הפנילאתנואיד גליקוזיד מ-C. deserticola, ובאמצעות שיטת HPLC, שמונה רכיבים עיקריים של גליקוזיד פנילטנואיד, כלומר, אקטאוזיד F, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, acteoside C, 2'-acetylacteoside ו-6'-acetylacteoside, נמצאו בשבריר הפנילטנואיד גליקוזיד המבודד, והתכולה הייתה 3.6 אחוזים, 8.8 אחוזים, 5.0 אחוזים, 13.3 אחוזים, 9.3 אחוזים, 9.3 אחוזים, 9.3 אחוזים, 9. ו-3.2 אחוזים, בהתאמה. Echinacoside, אחת התרכובות הפעילות העיקריות שתועדו ב-C. deserticola [14], הוכחה כבעלת פעילות אנטי-אוסטיאופורטית; עם זאת, המינון של 270 מ"ג/ק"ג היה כה גבוה שהגביל את היישום הקליני הנוסף שלו [24]. בניסויים הנוכחיים, נעשה שימוש בשבריר הפנילאתנואיד הגליקוזיד הכולל במינון נמוך יותר של 60-240 מ"ג/ק"ג משקל גוף/- יום על חולדות OVX, ותכולת המרכיבים שזוהו הייתה טהורה כמעט ב-50 אחוז בשבר זה על ידי שימוש שיטת HPLC.

זה היה ידוע היטב ש-OVX יכול לגרום לאוסטאופורוזיס, וחולדת OVX נחשבה כמודל קלאסי ומתאים לדמות אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר. במקביל, נצפתה ירידה משמעותית בצפיפות המינרלים של העצם, מיקרו-ארכיטקטורת עצם טרבקולרית, משקלים רטובים של הרחם והנרתיק, ורמת האסטרוגן, כמו גם השיפור הברור בספיגת העצם ומשקל הגוף, לאחר ניתוח כריתת שחלות, מתוכם ב חלק עקב איבוד אסטרוגן [25]. הנתונים שלנו, עד כה, הוכיחו בבירור ש-OVX אכן גרם לאוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר ומלווה תמיד בירידה החדה באיכות העצם, במיקרו-ארכיטקטורת העצם ובמשקל הרטוב של הרחם והנרתיק. מכיוון ש-EV הוא חומר תחליפי הורמונים כללי ששימש בפרקטיקה הקלינית, הוא שימש כבקרה חיובית בניסוי in vivo שלנו, והעלייה במשקל הגוף וניוון הרחם, כמו גם הידרדרות בצפיפות המינרלים של העצם ומיקרו-ארכיטקטורת העצם הטרבקולרית. , צפויים להתהפך על ידי תוספת EV. בשונה מהביקורת החיובית, הירידה במשקל הנרתיק והרחם, כמו גם העלייה במשקל הגוף של חולדות בקבוצת המודל OVX, לא הושפעו מטיפול CDP, מה שמרמז ש-CDP יכול לשפר את יצירת העצם מבלי לגרום לתופעות הלוואי על הגוף והרקמות האורגניות של הרחם. למרות שרמות ה-ERR הוסרו באופן משמעותי על ידי טיפול CDP, זה היה בדיוק כמו אפקט פיטואסטרוגן שלא נצפו תופעות לוואי על רקמות אורגניות של הרחם והנרתיק. בנוסף, טיפול ב-CDP חיזק משמעותית את איכות העצם בחולדות OVX שהידרדרו בניתוח כריתת שחלות.

בנוסף, רמות P ו-Ca בשתן ובנסיוב של חולדות OVX שימשו גם כדי לשקף את ההשפעה האנטי-אוסטיאופורטית, והריכוזים של Ca ו-P אנאורגני היו תלויים בדרך כלל ברמות של קלציטונין ו-PTH [26]. במחקר הנוכחי, למרות שלא התקבלו מגמות משמעותיות של ירידה או עלייה ברמת ההפרשה בשתן של Ca, בסרום P, בסרום Ca ו-PTH בחולדות מקבוצת המודל OVX, הרמות המשמעותיות בשתן של P וקלציטונין (p < {="" {1}})="" נצפו.="" בהתאם="" לנתונים="" שפורסמו="" כי="" מחסור="" באסטרוגן="" שנגרם="" על="" ידי="" ניתוח="" כריתת="" שחלות="" הוביל="" תמיד="" לירידה="" ברמת="" הקלציטונין="" בדם,="" ירידה="" זו="" בקלציטונין="" בסרום="" הובילה="" לבסוף="" לעלייה="" ברמת="" pth,="" כאשר="" האמינו="" כי="" ca="" הוא="" המווסת="" העיקרי="" של="" הפרשת="" pth.="" מכיוון="" שריכוז="" pth="" לא="" הראה="" הבדל="" משמעותי="" בין="" קבוצות="" ovx="" ו-sham="" במחקר="" הנוכחי,="" רמת="" ca="" בנסיוב="" ובשתן="" גם="" לא="" הראתה="" שינויים="" ברורים="" בין="" שתי="" הקבוצות="" לעיל.="" עם="" זאת,="" התקבלה="" נטייה="" משמעותית="" של="" ירידה="" ברמת="" הקלציטונין="" בין="" קבוצות="" ovx="" ו-sham,="" וכתוצאה="" מכך,="" תכולת="" ה-p="" בשתן="" של="" ovx="" ירדה="" בעוצמה.="" האמנו="" שהנתונים="" שלעיל="" עשויים="" להסביר="" את="" התופעה="" הסותרת="" מדוע="" הפרשת="" רמת="" ca="" בשתן="" בחולדות="" ovx="" לא="" הראתה="" שינוי="" ברור="" בהשוואה="" לחולדות="" sham,="" וייתכן="" שתופעה="" זו="" קשורה="" גם="" לשיעור="" המוגבר="" של="" תחלופה="" בעצמות="" [27]="" .="" לאחר="" טיפול="" ב-cdp,="" רמות="" ה-p="" ו-ca="" בנסיוב="" היו="" מווסתות="" בצורה="" ניכרת,="" ותכולת="" ה-p="" בשתן="" ירדה="" בוויסות="" בחולדות="" ovx,="" מה="" ששיקף="" ש-cdp="" יכול="" לא="" רק="" למנוע="" הפרשת="" יסודות="" מינרלים="" בעצם="" אלא="" גם="" לשפר="" את="" תכולת="" הסרום="" של="" אלה.="" אלמנטים,="" ובכך="" מדכאים="" בעקיפין="" אובדן="">

יתר על כן, סמני היווצרות וספיגת העצם, כמו גם האנזימים נוגדי החמצון כולל SOD ו-GSH, הופעלו גם כדי להסביר את המנגנונים האנטי-אוסטאופורוטיים הבסיסיים של CDP. בדומה לנתונים שפורסמו, רמת ה-ALP בחולדות מקבוצת המודל OVX הראתה מגמת עלייה לא מובהקת סטטיסטית, המעידה על קצב מואץ של תחלופה של עצם באוסטיאופורוזיס לאחר גיל המעבר [10]. עם זאת, לאחר טיפול ב-CDP (60, 120 ו-240 מ"ג/ק"ג ליום), התכונה של ALP הוגברה באופן משמעותי. זה היה ידוע היטב ש-OVX גרם לירידה חדה ברמות האסטרוגן, מה שבדרך כלל מוביל לספיגת עצם מוגזמת ולחץ חמצוני [28], עדות לרמות של TRAP, cathepsin K ו-DPD וכן MDA שהוסרו במיוחד בחולדות של קבוצת דגמי OVX. עם זאת, ההידרדרות הללו השתפרו בחלקה על ידי התערבות CDP. בנוסף, טיפול בחולדות OVX עם CDP (60 ו-240 מ"ג/ק"ג) הדגים עלייה משמעותית בפעילות של GSH (p < 0="" 05).="" התוצאות="" שלעיל="" מרמזות="" ש-cdp="" הפגין="" השפעה="" טיפולית="" על="" אוסטאופורוזיס="" המושרה="" על="" ידי="" ovx="" והשפעות="" אלו="" היו="" הן="" על="" ידי="" שיפור="" היווצרות="" העצם="" ודיכוי="" ספיגת="" העצם="" וכן="" שיפור="" מערכת="" נוגדי="" החמצון="">

הפעלה של RANK על ידי הליגנד שלו RANKL עוררה את הביטויים של NFAT2 ו-c-Fos באמצעות איתות PI3K/AKT ו-NF-kB [29]. הוכח כי NF-kB חיוני לאוסטאוקלסטוגנזה מכיוון שההפרעה של NF-kB עלולה להוביל להתמיינות אוסטאוקלסטית לקויה עם פנוטיפ אוסטאופורוטי, ו-NF-kB הגביר את ה-c-Fos והוריד ביטויי NFAT2 במהלך אוסטאוסטוגנזה המושרה על ידי RANKL/RANK/TRAF. כדי להעריך את ההשפעה המיטיבה של CDP על אוסטאוקלסטוגנזה בתיווך NFAT2 ו-c-Fos, נותחו רמות הביטוי של RANKL ו-RANK. כצפוי, CDP עיכב באופן משמעותי את NFAT2 ועורר את רמות c-Fos על ידי הורדת הביטויים של RANKL ו-RANK. בינתיים, ל-RANK עצמו חסרה תכונת קינאז מהותית אלא אם כן הצטרף על ידי TRAF6 כדי להפעיל את האיתות במורד הזרם [3]. CDP גם הוריד את הביטוי של TRAF6, מה שהוביל להפחתה משמעותית של כמויות הקישור של RANKL ו-RANK. מנגנון אנטי-אוסטאופורוטי משוער של CDP על חולדות OVX כיסה את מסלולי האיתות הנ"ל, והווסת תוארו באיור 9. בתמציתיות, CDP ירד ברמות TRAF6, RANKL ו-RANK, ובכך דיכא את מסלולי האיתות במורד הזרם כולל PI3K/AKT ו-NF-κB אשר מופעלים על ידי RANKL/RANK, ולבסוף הפחיתו את הביטויים והפעילויות של חלבוני המפתח האוסטאוקלסטוגניים NFAT2 ו-c-Fos. לכן, רמזים מרובים של נתונים מרמזים על ההשפעה המיטיבה של CDP על חילוף החומרים של העצם של חולדות OVX בעיקר באמצעות מסלולי PI3K/AKT ו-NF-κB בתיווך RANKL/RANK/TRAF6-.

5. מסקנה

לסיכום, סך הגליקוזידים של פנילאתנואידים, שבודדו מ-C. deserticola, הראו השפעות מועילות משמעותיות על אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר של חולדות OVX, והפוטנציאל הטיפולי בדיכוי אובדן עצם היה בעיקר באמצעות גירוי יצירת עצם ועיכוב ספיגת עצם וכן שיפור נוגד החמצון של העצם מערכת; המנגנונים עשויים להיות קשורים להפעלת NF-κB המושרה על ידי RANKL/RANK/TRAF6- ואינאקטיבציה של PI3K/AKT, כמו גם גירוי c-Fos ודיכוי NFAT2, ולבסוף, הבידול של אוסטאוקלסט עוכב.

קיצורי מילים

AKT: חלבון קינאז B

ALP: פוספטאז אלקליין

BGP: חלבון GLA של עצם

BMC: תכולת מינרלים בעצמות

CDP: Phenylethanoid glycoside חלקיק של C. deserticola

CK: קתפסין ק

CT: קלציטונין

DPD: Deoxypyridinoline

ERR: קולטן אלפא הקשור לאסטרוגן

EV: אסטרדיול ולרט

GSH: Glutathione l-PTH: parathorone שלם

MCSF: גורם מגרה מושבה מקרופאג

מד"א: מלונדיאלדהיד

NFAT2: גורם גרעיני של תאי T משופעלים c2

NF-κB: גורם גרעיני-קאפה B

OPG: אוסטאופרוטגרין

OVX: ניתוח שחלות

PhGs: פנילתנואידים גליקוזידים

PI3K: Phosphoinositide 3-קינאז

דרגה: מפעיל קולטן של גורם גרעיני-קאפה B

RANKL: מפעיל קולטן של גורם גרעיני-קאפה

B ligand ROI: אזור של עניין

SOD: Superoxide dismutase

שַׁחֶפֶת. N: מספר טרבקולרי

Tb.Sp: הפרדה טראבקולרית

Tb.Th: עובי טרבקולרי

TCM: רפואה סינית מסורתית

TMC: תכולת מינרלים ברקמות

TMD: צפיפות מינרלים של רקמות

TNF: גורם נמק גידול

TRAF6: גורם 6 הקשור לקולטן לגורם נמק לגידול

מלכודת: פוספטאז חומצה עמיד לטרטרטים.

זמינות נתונים

הנתונים המשמשים לתמיכה בממצאי מחקר זה זמינים מהמחבר המקביל לפי בקשה.

ניגוד עניינים

לכותבים לא היה ניגוד עניינים.

תרומות מחברים

XM עיצב ופיקח על הניסויים; SD ו-LY ביצעו את רוב הניסויים וניסחו את כתב היד; BZ ו-JL ביצעו את ניתוח הכתם המערבי והשתתפו בניסויים בבעלי חיים; YD ניתח את הנתונים; QT ו-PY ​​תיקנו את כתב היד. כל המחברים סקרו את כתב היד. לינגלינג יאנג ושוקין דינג תרמו באותה מידה לכתב היד.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הטכנולוגית המדע להשכלה גבוהה של Ningxia (NGY2017090), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 81560684), תוכנית המחקר והפיתוח העיקרית של Ningxia (2018BHF2001), מחקר המפתח של Ningxia ו תוכנית המצאות לשיתוף פעולה במדע וטכנולוגיה של המזרח והמערב (מס' 2017BY084 ו-2017BY079), וקרן West Light של האקדמיה הסינית למדעים - מדענים צעירים של המערב 2017.

הפניות

[1] LJ Melton III, EA Chrischilles, C. Cooper, AW Lane, ו-BL Riggs, "פרספקטיבה. לכמה נשים יש אוסטיאופורוזיס?", Journal of Bone and Mineral Research, vol. 7, לא. 9, עמ' 1005–1010, 1992.

[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham, ו-SL Kates, "ה1-תמותה בשנה של חולים שטופלו בתוכנית שברי מפרק הירך עבור קשישים," Geriatric Orthopedic Surgery & Rehabilitation, vol. 1, לא. 1, עמ' 6–14, 2010.

. 32, לא. 4, עמ' 846–860, 2017.

[4] JH Kim and N. Kim, "Regulation of NFATc1 in osteoclast differentiation," Journal of Bone Metabolism, vol. 21, לא. 4, עמ' 233–241, 2014.

[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu et al., "Antiosteoporotic activity and constituents of Podocarpium podocarpus," Phytomedicine, vol. 22, לא. 1, עמ' 94–102, 2015.

[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon, et al., "חומצה פרוטוקטכואית מחלישה אובדן עצם טרבקולרי בעכברים שעברו שחלות," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, מזהה מאמר 7280342, 11 עמודים, 2018.

[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby, et al., "רוטין מבודד מ- Chrozophora tinctoria משפר את שגשוג תאי העצם וסמני התאבנות," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018, מזהה מאמר 5106469, 10 עמודים, 2018.

[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon, ו-T. Tong-un, "תמצית עלי Morindacitrifolia L. מגן מפני איסכמיה מוחית ואוסטאופורוזיס במודל ניסיוני in vivo של גיל המעבר," רפואה חמצונית ואריכות ימים סלולרית, כרך. 2018, מזהה מאמר 1039364, 13 עמודים, 2018.

[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura, ו-W. Thukham-mee, "אפקט אנטי-סטאופורוטי של תמצית משולבת של Morus alba ו-Polygonum odoratum," רפואה חמצונית ואריכות ימים סלולרית, כרך. 2014, מזהה מאמר 579305, 9 עמודים, 2014.

[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao, ו-X. Ma, "Syringin מונע אובדן עצם בעכברים שעברו ניתוח שחלתי באמצעות עיכוב בתיווך TRAF6 של NF-κB וגירוי של PI3K/AKT "Phytomedicine, vol. 42, עמ' 43–50, 2018.

[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin ו-SJ Wang, "Echinacoside, מרכיב פעיל של Herba Cistanche, מדכא פעילות אפילפטיפורמית בנוירונים פירמידליים CA3 בהיפוקמפוס," The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, vol. 22, לא. 3, עמ' 249–255, 2018.

[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao ו-X. Ma, "השפעה טיפולית של cistanoside A על חילוף החומרים של העצם של עכברים שעברו שחלות," Molecules, vol. 22, לא. 2, עמ'. 197, 2017.

[13] K. Alipieva, L. Korkina, IE Orhan, and MI Georgiev, "Verbascoside – סקירה של התרחשותו, סינתזה (ביו) ומשמעות פרמקולוגית", Biotechnology Advances, vol. 32, לא. 6, עמ' 1065–1076, 2014.

[14] ועדת העריכה של פרמקופאה סינית, פרמקופיה של הרפובליקה העממית של סין, עיתונות מדעית וטכנולוגיה רפואית בסין, בייג'ינג, סין, מהדורה 10, 2015.

[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li וחב', "השפעות של תכשיר צמחי מרפא סינית מסורתית על אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים", Maturitas, vol. 61, לא. 4, עמ' 334–339, 2008.

[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong, ו-Q. Zhao, "Cynomorium songaricum מונע ספיגת עצם בחולדות שעברו ניתוח בשחלות באמצעות דיכוי RANKL/RANK/TRAF6 של PI3K/AKT ו- מסלולי NF-κB," מדעי החיים, כרך. 209, עמ' 140–148, 2018.

[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang, et al., "Kaempferitrin מונע אובדן עצם בחולדות עם שחלות", Phytomedicine, vol. 22, לא. 13, עמ' 1159–1162, 2015.

[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang ו-YW Cheng, "הערכת בטיחות של מוצר המזון הבריאותי Cistanche tubulosa Memoregain®: גנוטוקסיות ובדיקת רעילות 28-במינון חוזר של יום," Food and Chemical Toxicology , כרך . 118, עמ' 581–588, 2018.

[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng ו-F. Chen, "סקר שיטתי של פעילות נוגדת חמצון של 30 צמחי מרפא סיניים תוך שימוש במבחן כוח נוגד חמצון מפחית ברזל," Food Chemistry, vol. 97, לא. 4, עמ' 705–711, 2006.

[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu, et al., "Cistanche deserticola polysaccharide מחליש אוסטאוקלסטוגנזה וספיגת עצם באמצעות עיכוב איתות RANKL וייצור מיני חמצן תגובתי," Journal of Cellular Physiology, vol. 233, מס'. 12, עמ' 9674–9684, 2018.

[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang ו-W. Liang, "Cistanches Herba תמצית מימית המשפיעה על BGP ו-TRAP בנסיוב ועל מח עצם Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA ו-TIEG1 רמות ביטוי mRNA במחלת אוסטאופורוזיס," Molecular Biology Reports, vol. 40, לא. 2, עמ' 757–763, 2013.

[22] TM Li, HC Huang, CM Su וחב', "תמצית Cistanche deserticola מגבירה את יצירת העצם באוסטאובלסטים," Journal of Pharmacy and Pharmacology, vol. 64, לא. 6, עמ' 897–907, 2012.

[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong, and Z. Huang, "השפעת תמצית מימית של Cistanches Herba על אובדן עצם בחולדה שעברה שחלה", International Journal of Molecular Sciences, vol. 12, לא. 8, עמ' 5060–5069, 2011.

[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang, et al., "פעילות אנטי-סטיאופורטית של אכינאקוסיד בחולדות שעברו שחלות," Phytomedicine, vol. 20, לא. 6, עמ' 549–557, 2013.

[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian ו-LL Xu, "פעילות אנטי-סטיאופורטית של icariin בחולדות שעברו שחלות," Phytomedicine, vol. 16, לא. 4, עמ' 320–326, 2009.

[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed, ו-M. Marzok, "מנגנון אנטי-אוסטיאופורוטי אפשרי של תמצית Cicer arietinum בחולדות שעברו שחלות," International Journal of Clinical and Experimental Pathology, vol. 8, לא. 4, עמ' 3477–3490, 2015.

[27] R. Swaminathan, "סמנים ביוכימיים של מחזור עצמות," Clinica Chimica Acta, vol. 313, מס'. 1-2, עמ' 95–105, 2001.

[28] S. Muthusamy, I. Ramachandran, B. Muthusamy, et al., "כריתת שחלות גורמת ללחץ חמצוני ופוגעת במערכת נוגדי חמצון העצם בחולדות בוגרות," Clinica Chimica Acta, vol. 360, לא. 1-2, עמ' 81–86, 2005.

[29] WJ Boyle, WS Simonet ו-DL Lacey, "התמיינות והפעלה של אוסטאוקלסטים", Nature, vol. 423, מס'. 6937, עמ' 337–342, 2003.