חלק 1 השפעות דמויות תרופות נוגדות דיכאון של תמצית Cistanche Tubulosa על חולדות מתח כרוניות בלתי צפויות באמצעות שיקום הומאוסטזיס של מיקרוביוטה במעיים

Yang Li1, Ying Peng1, Ping Ma1, Hanlin Yang1, Haiyan Xiong1, Mengyue Wang1, Chongsheng Peng1, Pengfei Tu2 ו-Xiaobo Li1*

בית ספר אחד לרוקחות, אוניברסיטת שנגחאי ג'יאאו טונג, שנגחאי, סין, 2 מעבדות מפתח ממלכתיות לתרופות טבעיות וביומימטיות, בית הספר למדעי התרופות, אוניברסיטת פקין, בייג'ינג, סין

עדויות הולכות וגדלות מראות שהפרעות נוירו-פסיכיאטריות, כגון דיכאון, קשורות למיקרוביום המעי דרך ציר המעי-מוח.Cistanches Herbaידועה בטיפול במחסור ב"כליות-יאנג" ברפואה הסינית המסורתית (TCM) ומשמשת לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות בשנים האחרונות. במחקר זה, הוקם מודל הדיכאון המושרה על ידי מתח כרוני בלתי צפוי (CUS) כדי לחקור את ההשפעה שלCistanche tubulosaתמצית (CTE) על בדיקות התנהגותיות, נוירוטרנסמיטורים מונואמין וגורמים נוירוטרופיים בהיפוקמפוס ובמעי הגס, הרכב המיקרוביוטה של ​​המעי וייצור חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs). יתרה מכך, ניתוח מתאם שימש להערכת הקשר התפקודי בין מיקרוביוטת מעיים שונה, נוירוטרנסמיטורים ונוירוטרופינים שהשתנו בהיפוקמפוס ובמעי הגס, וריכוז מופרע של SCFAs. CTE שיפר באופן משמעותי התנהגויות דמויות דיכאון אצל חולדות תחת CUS. רמות המוח של 5-הידרוקסיטריפטמין (5-HT) וביטוי של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF) בחולדות CUS שוחזרו על ידי CTE. השפע היחסי של מיקרוביוטה במעיים וריכוזי אצטט וחומצה הקסנואית יכולים להיות מווסתים גם על ידי טיפול CTE. עוד הראינו שהיישום של CTE בחולדות CUS הוביל למתאם חזק בין שיבושים בהרכב המיקרוביוטה של ​​המעי, רמות הנוירוטרנסמיטר בהיפוקמפוס וייצור של SCFAs מטבוליטים נוירואקטיביים. בסך הכל, תוצאות אלו מזהות CTE כטיפול פוטנציאלי לתסמיני דיכאון על ידי שחזור הומאוסטזיס של מיקרוביוטה במעיים עבור הפרעות מיקרוביוטה-מעי-מוח, מה שפותח אפיקים חדשים בתחום הנוירופסיכופרמקולוגיה.

מילות מפתח: Cistanche tubulosa, נוגד דיכאון, מתח כרוני בלתי צפוי, מיקרוביוטה במעיים, ציר מיקרוביוטה-מעי-מוח

למידע נוסף אנא צור קשר:Joanna.jia@wecistanche.com

ל- Cistanche deserticola השפעות רבות, לחץ כאן כדי לדעת יותר

מבוא

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong בסינית) מתועד באופן רשמי כגבעולים עסיסיים מיובשים שלCistanche deserticola(י.כ מא) וCistanche tubulosa(שרנק) בוועדת הפרמקופיה הסינית (2015). זוהי רפואה סינית מסורתית ידועה (TCM) לטיפול במחסור בכליות, אימפוטנציה, אי פוריות נשית, לוקורריאה חולנית, מטרורגיה שופעת,

ועצירות סנילית (ועדת הפרמקופיה הסינית, 2015). מחקרים קודמים חשפו כמה מרכיבים כימיים עיקריים שלCistanches Herba, כולל phenylethanoid glycosides (PhGs), אירידואידים וגליקוזידים אירידואידים, ליגנאנים, אלדיטולים, אוליגוסכרידים ופוליסכרידים. ניתוח פרמקולוגי הראה ש-Cistanches Herba מציג מגוון רחב של פעילויות נוירו-פרוטקטיביות, אימונומודולטוריות, אנטי-דלקתיות ומגן על הכבד (Jiang and Tu, 2009; Fu et al., 2017). PhGs נתפסו כמרכיבים הפעילים העיקריים של Cistanches Herba בעלי פעילויות פרמקולוגיות שונות, כגון נוירו-פרוטקטיביות, אימונומודולטוריות, אנטי דלקתיות, מגן על הכבד, נוגד חמצון וכו' (Jiang and Tu, 2009; Fu et al., 2017).Cistanches Herbaתועד במקור בספר הרפואה הקלאסי של הצמחים ("Shennong Bencao Jing" בסינית), ספר ידוע על צמחי מרפא שנכתב בין 200 ל-250 לספירה בערך, כ"עשב גבוה" שיכול לווסת "חמישה זנים (קרביים) ושבע (אכילת יתר, כעס, לחות, קור, דאגה, רוח וגשם ופחד) ליקויים" (Huang, 1982). כיום Cistanches Herba מקובל באופן נרחב כטוניק צמחי לחולשה כללית (Fu et al., 2017).C. tubulosaכמוסות גליקוזיד (Memoregain®) נמצאות בשימוש לטיפול במחלת אלצהיימר (Guo et al., 2013). מערכת דופמינרגית לא מתפקדת היא אחת הפתוגנזה המרכזית של השערת המונואמין של דיכאון (Duman et al., 1997; Krishnan and Nestler, 2008). Echinacoside (אחד מה-PhGs) ו-PhGs מסלסת סיסטאנצ'הנמצאו כמגנים על נוירונים דופמינרגיים מפני רעילות עצבית של דופמין (DA) הנגרמת על ידי 1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרה-הידרופירידין (MPTP) שעלול להגביר את ה-DA רמות בסטריאטום של עכברי C57 (Tian and Pu, 2005; Geng et al., 2007). בנוסף, קטלפול וג'ניפוזיד הם שני אירידואידים מייצגים ב-Cistanches Herba, ונמצא שהם משפרים התנהגות דמוית דיכאון הנגרמת על ידי מתח כרוני (CUS) באמצעות שיקום הפרעות בתפקוד ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-אדרנל (HPA) וקטלפול יכול להגביר את הוויסות של המוח. ביטוי של גורם נוירוטרופי (BDNF) (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). יתרה מכך, הפרסום האחרון נותן עדות רעננה לכך שמרתח של Cistanches Herba הפחית באופן משמעותי את תקופת חוסר התנועה במבחן מתליית זנב העכבר, מה שמצביע על כך ש- Cistanches Herba הוא בעל תכונות דמויות נוגדות דיכאון פוטנציאליות (WangD. et al., 2017).

הרפואה הסינית המסורתית מושכת תשומת לב גוברת כטיפול בדיכאון בגלל תופעות הלוואי המתונות יחסית שלה (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). סוגים שונים של TCMs, כגון תרכובות בודדות מהתרופה הגולמית (ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg3 ו-Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang GL et al., 2017 ), חומרים רפואיים סיניים בודדים (שורש ג'ינסנג Panax, קנה שורש Acorus tatarinowii ו-Morinda officinalis) (Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016), ומרתח TCM (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan ו- Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016) נחקרו והוכחו לעומק. כדי להפוך או להפחית תסמינים דמויי דיכאון. לדוגמה, נמצא כי Kai-Xin-San מקל בצורה ניכרת תסמינים של חולדות דיכאוניות הנגרמות על ידי CUS על ידי הגדלת כמות הנוירוטרנסמיטורים, גורמים נוירוטרופיים והקולטנים המתאימים להם, וקידום הביטוי של סינפטוטגמין וצפיפות עמוד השדרה הדנדריטי (Yan et al. ., 2016).

עם זאת, מחקרים קודמים של TCM מסתמכים על תוצאות בבדיקות התנהגותיות דמויות דיכאון ומתמקדים במנגנון הפעולה התרופתי המקובל. הקשר בין היעילות נוגדת הדיכאון של TCM במתן דרך הפה לבין מיקרוביוטה של ​​המעיים אינו מובן היטב. עדויות הולכות וגדלות תומכות שמיקרוביוטה של ​​המעי ממלאת תפקיד מכריע בוויסות תפקודי המוח, במיוחד דיכאון והפרעות אחרות הקשורות ללחץ (Foster and Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). לדוגמה, מתח כרוני גורם לחוסר ויסות של המבנה החיידקי של מעי החולדות, עם ירידה ביחס Firmicutes/Bacteroidetes, וליתר דיוק, ירידה בשפע היחסי של Lactobacillus ועלייה ב-Oscillibacter (Meng et al., 2017). יתר על כן, השתלת צואה של מיקרוביוטה לא מווסתת מחולים מדוכאים לעכברים נטולי חיידקים העניקה פנוטיפ דמוי דיכאון בבעלי חיים אלה, מה שמעיד על כך שמיקרוביוטה לא מווסתת של המעי גורמת לתסמינים התנהגותיים ופיזיולוגיים של דיכאון וחרדה (Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016). בניסויים בבעלי חיים, נמצאו כמה מאפננים של מיקרוביוטה כגון פרוביוטיקה ופרה-ביוטיקה משפרים התנהגות דמוית דיכאון בעכברים בלחץ כרוני על ידי שיפור המיקרוביוטה של ​​המעי (Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017 ).

בהתחשב בקשר בין מיקרוביוטה במעיים והתפתחות מחלות, כמו גם הפלסטיות של מבנה המיקרוביוטה של ​​המעי, החלטנו לחקור את ההשפעות של מיקרוביוטה במעיים לתיווך דיכאון משכה את תשומת ליבנו ונחקרה (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). כדי להשיג זאת, בוצע ריצוף גנים של 16S rRNA משולב ניתוח Meta סטטיסטיקה (White et al., 2009) כדי לנתח את הרכב המיקרוביוטה של ​​המעיים. במחקר הנוכחי,C. tubulosaנבחרה להעריך את השפעותיו דמויות תרופות נוגדות דיכאון מכיוון שיש לה רמה גבוהה יותר של PhGs בהשוואה לC. deserticola. מודל דיכאון המושרה ב-CUS הוקם כדי לחקור את ההשפעה שלC. tubulosaתמצית (CTE, המורכבת מ-48.6 אחוזים PhGs, 6.9 אחוזי גליקוזידים אירידואידים ו-20.0 אחוזים סך סכרידים) על בדיקות התנהגותיות, נוירוטרנסמיטורים מונואמינים וגורמים נוירוטרופיים בהיפוקמפוס ובמעי הגס, הרכב המיקרוביוטה של ​​המעי וקצר- ייצור חומצות שומן בשרשרת (SCFA). יתרה מכך, הקשר התפקודי בין מיקרוביוטת מעיים השתנתה שינה נוירוטרנסמיטורים ונוירוטרופינים הן בהיפוקמפוס והן במעי הגס, ונבדק ריכוז מופרע של SCFAs. ניתוח מתאם שימש כדי לבסס ראיות לכך ש-CTE מתמקד במיקרוביוטה של ​​המעי לטיפול בדיכאון על ידי אפנון ציר המיקרוביוטה-מעי-מוח.

Cistancheיכול לשפר חסינות

חומרים ושיטות

חומרים

Fluoxetine (FLX) נרכש מחברת Aladdin Industrial Inc. (שנחאי, סין). ערכות 5-hydroxytryptamine (5-HT), נוראדרנלין (NE) ו-BDNF ELISA נרכשו ממכון הביו-הנדסה של נאנג'ינג Jiancheng (נאנג'ינג, סין). אצטוניטריל בדרגת HPLC נרכש מ- Merck (Darmstadt, גרמניה). מים דה-יונים הוכנו ממים מזוקקים באמצעות מערכת לטיהור מים Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, ארצות הברית). כל שאר הריאגנטים והכימיקלים שבהם נעשה שימוש היו בדרגה אנליטית.

גבעולים מיובשים שלC. tubulosaנאספו ממחוז הטיאן (שינג'יאנג, סין). דגימות דגימת השובר אושרו על ידי פרופ' שיאובו לי והופקדו בעשבייה של בית הספר לרוקחות, אוניברסיטת שנגחאי Jiao Tong (שנחאי, סין). האבקה ההומוגניתC. tubulosaהגבעולים הושעו בפי עשרה מ-70 אחוז אתנול, ועברו ריפלוקס בחום שלוש פעמים, כל אחד במשך שעה אחת ב-100 מעלות. התמציות סוננו באמצעות גזה, התאדו תחת ואקום ב-65 מעלות וליאופיל. הדגימה הומסה מחדש ולאחר מכן הופרדה על ידי שרף מאקרופורוס D101. לאחר הספיחה, הושלך החלק שנחלף במים. CTE התקבל לאחר שחיקה עם 40 אחוז אתנול, ולאחר מכן התאדה תחת ואקום ב-65 מעלות וליאופיליזציה.

ניתוח ההרכב הכימי של CTE

התוכן היחסי של PhGs ב-CTE נקבע על ידי ספקטרופוטומטריית UV ב-330 ננומטר באמצעות echinacoside כסטנדרט. התכולה היחסית של אירידואידים וגליקוזידים אירידואידים נמדדה על ידי ספקטרופוטומטריית UV בשיטת אורך גל כפול כדי למנוע הפרעות ספקטרליות מ-PhGs (237 ננומטר שימש לכימות ספקטרוסקופי, נקודה איזובסטית 280 ננומטר שימשה עבור אורך גל ייחוס), נעשה שימוש בגניפוזיד. כסטנדרט. תכולת הפחמימות הכוללת של CTE נקבעה בשיטה הקולורימטרית של חומצה פנול-גופרית עם גלוקוז כסטנדרט (Chow and Landhausser, 2004).

המרכיבים הכימיים העיקריים של CTE אופיינו על ידי UPLC-Q-TOF-MS. ניתוח UPLC-Q-TOF-MS בוצע על מערכת Waters ACQUITY UPLC (Waters Corp., Milford, MA, ארצות הברית) עם עמודה ACQUITY UPLC BEH C18 (100 מ"מ x 2.1 mm id, 1.7 段m, Waters Corp., ארצות הברית) על ידי פליטת שיפוע באמצעות 0.1 אחוז חומצת פורמי אצטוטריל (A) ו-0.1 אחוז חומצה פורמית במים (B) ב- קצב זרימה של 0.4 מ"ל לדקה. פרופיל השיפוע היה: 0-5 דקות (A: 5-20 אחוז), 5-7.5 דקות (A: 20-30 אחוז), 7.5-10 דקות ( ת: 30-70 אחוזים ), 10-11 דקות (א: 70-100 אחוזים ), והוחזק למשך 1.5 דקות. השיפוע מוחזר ל-5 אחוזים תוך 0.5 דקות והוחזק למשך 2.5 דקות לריצה הבאה. נפח ההזרקה היה 3 [il. הטמפרטורה של תנור העמוד הוגדרה ל-35 מעלות.

ספקטרומטרית מסה בוצעה באמצעות ספקטרומטר מסה Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, ארצות הברית). יינון בוצע במצב אלקטרוספריי שלילי (ESI). הפרמטרים של MS היו כדלקמן: מתח נימי, 2.0 kV; מתח חרוט, 20 וולט; טמפרטורת מקור, 120 מעלות ; טמפרטורת ההשמדה, 500 מעלות; זרימות גז של קונוס ו-desolvation, 50 ו-1,000 ליטר/שעה, בהתאמה. למדידת מסה מדויקת, לאוצין-אנקפאלין שימש כמסת הנעילה ליצירת יון [MH]- (m/z 554.2615). ניסוי MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) בשתי פונקציות סריקה בוצע באופן הבא: פונקציה 1 (אנרגיה נמוכה): m/z 50-1,000, זמן סריקה של 0.25 שניות, עיכוב בין סריקה של 0.02 שניות , אנרגיית התנגשות של 6 eV; פונקציה 2 (אנרגיה גבוהה): m/z 50-1,000, זמן סריקה של 0.25 שניות, עיכוב בין סריקה של 0.02 שניות, רמפה של אנרגיית התנגשות של 20-45 eV. הנתונים עובדו באמצעות תוכנת UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, ארצות הברית).

ניסויים בבעלי חיים

חולדות ספראג-דאולי ממין זכר (200 土 20 גרם) נרכשו מחברת Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (בייג'ינג, סין), ושוכנו במרכז לחיות המעבדה של אוניברסיטת שנגחאי Jiao Tong (שנחאי, סין). החיות אוכסנו בקבוצות תחת טמפרטורת חדר מבוקרת (25 × 2 מעלות, 55 × 10 אחוז לחות יחסית) עם מחזור אור-חושך של 12:12 שעות. החולדות הורשו גישה חופשית לחולדות מעבדה רגילות למזון ולמים למשך שבוע. המתקנים והפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת שנגחאי ג'יאאו טונג (שנחאי, סין).

לאחר שבוע של התאקלמות, 40 חולדות תמימות עברו תקופה של 72 שעות אימון סוכרוז ובדיקות בסיס סוכרוז. חולדות חולקו לחמש קבוצות (n=8) על סמך העדפת הסוכרוז שלהן במבחן הבסיס של הסוכרוז (איור משלים S1). קבוצת הביקורת וקבוצת ה-CUS קיבלו תמיסת מלח (10 מ"ל/ק"ג). עבור שלוש הקבוצות האחרות, CTE במינון גבוה (CTEH) (400 מ"ג/ק"ג), מינון נמוך (CTEL) (200 מ"ג/ק"ג) ו-FLX (10 מ"ג/ק"ג) ניתנו תוך קיבה שעה אחת לפני הליך CUS (8:00 בבוקר עד 9:00 בבוקר) במהלך 4 שבועות.

מתח כרוני בלתי צפוי פותח כמתואר קודם (Willner, 1997; Xue et al., 2013), מלבד קבוצת הביקורת ללא לחץ, סדרה של גורמי לחץ הוחלו על החולדות: תאורה סטרובוסקופית בעוצמה נמוכה למשך לילה (120 הבזקים/ דק'), רעש לבן (100 dB) למשך שעה אחת, מניעת מים למשך 24 שעות, בקבוקי מים ריקים למשך שעה (לאחר מניעת מים), מניעת מזון למשך 24 שעות, שחיה מאולצת (5 דקות), ריסון פיזי ({{11 }} שעות), כלוב מלוכלך למשך 24 שעות (200 מ"ל מים במצעי נסורת של 100 גרם), צביטה בזנב (דקה), הטיית כלוב ב-45 מעלות למשך 24 שעות, הלם למשך 30 דקות, ותאורת לילה (12 שעות). גורמי לחץ יושמו באופן רציף ואקראי במשך 4 שבועות, שפרטים עליהם מתוארים בטבלה משלימה S1. מזון ומים היו זמינים באופן חופשי לחולדות הביקורת ללא לחץ, שנותרו ללא הפרעה בחדר אחר, למעט תקופת החסך של 14 שעות לפני כל בדיקת סוכרוז. חולדה אחת מתה במהלך הליך CUS. מבחן שחיה מאולץ (FST) בוצע לאחר

מתן אקוטי של 4 ימים ולאחר 28 ימים של לחץ, בוצעו בדיקת העדפת סוכרוז (SPT) (יום 29), בדיקת שדה פתוח (OFT) (יום 31) ומבחן האכלה מדוכאת (NSFT) (יום 33). המתאר של עיצוב עבור CUS ובדיקות התנהגותיות מוצג באיור משלים S2.

בוצעה בדיקת שחייה כפויה כפי שתואר קודם (Porsolt et al., 1978). ההליך כלל מפגשי בדיקה מקדימים ובדיקות, תוך שימוש באותם מכשיר ותנאים (קוטר 20 ס"מ, גובה 45 ס"מ, המכילים 25 ס"מ של מים שנשמרו על 26 מעלות). במהלך הפגישה המקדימה, חולדות נאלצו לשחות במשך 15 דקות; 24 שעות מאוחר יותר, חולדות הוכנסו לאותו מכשיר למשך 5 דקות של בדיקת שחייה. התנהגות השחייה בפנים

5 דקות נצפו במצלמת וידאו, ומשך חוסר התנועה נמדד ונותח.

עבור SPT, חולדות אומנו לראשונה לצרוך 1 אחוז (v/v) תמיסה של סוכרוז במשך 72 שעות לפני ה-SPT. בדיקת הבסיס של סוכרוז לפני הליך ה-CUS וה-SPT בסוף ה-CUS בוצעו כמתואר קודם לכן (Xue et al., 2013).

בדיקת שדה פתוח בוצעה בסוף הליך CUS, המנגנון והשיטה היו זהים למפורט קודם לכן (Xue et al., 2013). נעשה שימוש במערכת מעקב וידאו (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) כדי לתעד את המרחק הכולל שעבר.

בדיקת האכלה מדוכאת הוערכה כפי שתואר קודם (Xue et al., 2013) וזמן האחזור להתחיל לאכול תוך 5 דקות תועד ונותח.

מדידת נוירוטרנסמיטורים וגורמים נוירוטרופיים

לאחר בדיקות התנהגותיות, התקבלו לפחות ארבעה כדורי צואה מכל חולדה, הונחו בצינורות חרוטים סטריליים והוקפאו מיד ב-80OC לניתוח קהילת חיידקים ו-SCFAs. לאחר מכן, חולדות הוקרבו; ההיפוקמפוס והמעי הגס בודדו ונשקלו מיד. דגימות רקמות נשטפו עם מי מלח, הוקפאו במהירות בחנקן נוזלי, ונשמרו ב -80OC לאחסון. לאחר הפשרה רציפה ב-20OC ו-4OC, דגימות הרקמה הומוגגו בתמיסת מלח ועברו צנטריפוגה למשך 25 דקות ב-2,500 סל"ד/4OC. הסופרנטנט שהתקבל נאסף ואוחסן ב-4OC עד לשימוש. הרמות של 5-HT בהיפוקמפוס ובמעי הגס, NE בהיפוקמפוס ו-BDNF בהיפוקמפוס נקבעו על ידי ערכות ELISA מסחריות לפי הפרוטוקולים של היצרן (Hou et al., 2017).

Cistancheיכול להקלכִּליָהמַחֲלָה

ניתוח פרופיל קומפוזיציוני של מיקרוביוטה במעיים

ה-DNA הכולל של מיקרוביוטה של ​​המעי מדגימות צואה הופץ כפי שתואר קודם (Wei et al., 20{{20}}4). כל דגימת צואה (0.2 גרם) עורבבה ב-1 מ"ל PBS, והומוגזה במלואה פעמיים, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-200 גרם למשך 6 דקות. לסופרנטנט הוסיפו 20 ± 20 אחוז PVP וצנטריפוגה ב-300 גרם למשך 6 דקות. לאחר מכן הסופרנטנט שנוצר היה בצנטריפוגה ב-12,000 גרם למשך 6 דקות וכדורי תאים נקצרו. כדורי תאים נשטפו על ידי PBS ולאחר מכן הושעו מחדש ב-300 μl lysates I (150 מ"מ NaCl, 100 מ"מ EDTA・Na2・2H2., pH 8.0). התרחיף היה מעורבב עם תמיסת ליזוזים של 100 ¼ (100 מ"ג/מ"ל) ו-20 ± 1 אחוז RNase, 37OC ברחצה חמה במשך 30 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 300 μl lysate II (100 מ"ל NaCl, 500 מ"ל Tris בסיס, pH 8.0) . תרחיף התאים היה מעורב בעדינות עם 50 ~ 20 אחוז SDS, שטוף בקרח במשך 5 דקות. לאחר מכן טוהר ה-DNA על ידי מיצוי רציף עם 1 אחוז PVP, פנול מאוזן טריס וכלורופורם-איזואמיל אלכוהול (נפח/נפח/נפח/כרך, 3.125:25:24:1), וכלורופורם-איזואמיל אלכוהול (נפח/נפח, 24) :1) ואחריו משקעים ב-20OC למשך 2 שעות עם שני כרכים של אתנול ו-50 [il 3 M NaAc. ה-DNA נאסף בצנטריפוגה, מיובש באוויר והומס ב-100 IL מים סטריליים. טוהר חומצת הגרעין נבדק באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארצות הברית). לאחר מכן הועבר DNA גנומי הכולל להגברת PCR באמצעות פריימרים ספציפיים לאזורי V3-V4 של הגן rRNA 16S: פריימר קדימה 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') והפריימר ההפוך 806R (5 '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). אמפליקוני PCR טוהרו עם חרוזי Agencourt AMPure (בקמן קולטר, אינדיאנפוליס, אינדיאנפוליס, ארצות הברית) וכומתו באמצעות ערכת ה-PicoGreen dsDNA Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA, ארצות הברית). לאחר שלב הכימות הפרטני, אמפליקונים אוחדו בכמויות שוות, ורצף 2 x 300 bp בקצה הזוגי בוצע באמצעות פלטפורמת Illumina MiSeq עם MiSeq Reagent Kit v3 ב- Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, סין). קריאות קצה זוגיות הורכבו באמצעות תוכנת FLASH (גרסה 1.2.7), קריאות רצף גולמיות נחתכו באיכות באמצעות תוכנת QIIME (גרסה 1.8.0) כדי להסיר ברקודים ורצפים שאינם תואמים מתחת לספי האורך. לאחר מכן, הרצפים המסונננים קובצו ליחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs) עם סף של 97 אחוז דמיון רצף באמצעות QIIME עם UCLUST. גיוון בטא בוצע ב-QIIME עבור ניתוח קואורדינטות עיקריות משוקלל של UniFrac (PCoA). לבסוף, נעשה שימוש בתוכנת Meta Stats כדי להשוות את ההבדלים בהרכב הטקסונומי של חיידקי המעי בין קבוצות שונות.

ניתוח ריכוזי SCFAs

הריכוז של SCFAs (כולל אצטט, פרופיונאט, בוטיראט, איזובוטירט, חומצה ולרית, חומצה איזובלרית וחומצה הקסנואית) בדגימות צואת חולדות נקבע על ידי כרומטוגרף גז GC {{0}} (שימאדז'ו, יפן), מצויד עם עמודת DB-FFAP (30 mx 0.25 מ"מ x {{10}}.25 ס"מ, Agilent, ארצות הברית). תמיסות סטנדרטיות של אצטט, פרופיונאט, בוטיראט, איזובוטיראט, חומצה ולרית, חומצה איזוולרית וחומצה הקסנואית הוכנו ב-1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0.01 ו-0.005 מ"ג/מ"ל עם אתר (כולל חומצה מתיל ולרית 2- 0.1 מ"ג/מ"ל כתקן פנימי), בהתאמה. כל דגימת צואה (0.2 גרם) עורבבה ב-0.8 מ"ל מים מפושטים על ידי מערבולת וצנטריפוגה ב-5,000 סל"ד למשך 20 דקות ב-4OC, 450 il of supernatant הוספו על ידי 50 il 50% H2SO4 ו-500 il תקן פנימי תמיסה, מערבולת במשך דקה אחת וצנטריפוגה ב-12,000 סל"ד למשך 10 דקות, ואז התערובת הונחה ב-4OC למשך 30 דקות. הסופרנטנט נלקח לניתוח GC. הניתוח של SCFAs בוצע כפי שתואר קודם (Wang et al., 2016).

ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים הוצגו כאמצעים 土 SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות תוכנת SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, United States) עם ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן Dunnett או Student's t-test. נתונים לא נכללו בניתוחים אם היו גדולים משתי סטיות תקן מהממוצע. ערכים של p < 0.05="" נחשבו="" מובהקים="" סטטיסטית.="" ניתוח="" המתאם="" של="" פירסון="" הופעל="" כדי="" להעריך="" את="" הקשר="" בין="" השפע="" היחסי="" של="" מיקרוביוטה="" במעיים,="" scfas,="" רמות="" היפוקמפוס="" 5-ht,="" ne="" ו-bdnf="" ורמות="" המעי="" הגס="">

Cistancheיכול לשפר חסינות ולהוריד לחץ דם

תוצאות

ניתוח ההרכב הכימי של CTE

ההרכב הכימי של CTE נותח לראשונה באופן מקיף. כפי שמוצג בטבלה 1, PhGs היו המרכיב העיקרי של CTE, עם תכולה יחסית של 48.6 אחוזים, אירידואידים וגליקוזידים אירידואידים היו 6.9 אחוזים, וסך הסכרידים היה 20.0 אחוזים. אלה

לאחר מכן אופיינו רכיבי CTE באמצעות UPLC-Q-TOF-MS. בסך הכל זוהו וזוהו 27 מרכיבים, כולל 20 מרכיבים של PhG, חמישה אירידואידים וגליקוזידים אירידואידים ושני אוליגוסכרידים. מידע מפורט כולל זמן שמירה, MS מדויק ו-MS/MS fragment יונים מפורטים במידע תומך (טבלה משלימה S2). כרומטוגרמת יונים כוללת UPLC-Q-TOF-MS (TIC) של CTE מוצגת באיור משלים S3.

CTE שיפרה את ההתנהגויות הדיכאוניות בחולדות CUS

בחולדות CUS, זמן חוסר התנועה הכולל ב-FST והשהייה לאכילה ב-NSFT ירדו באופן משמעותי על ידי טיפול ב-CTE, והעדפת סוכרוז ב-SPT והמרחק הכולל שכוסה ב-OFT עלו.

איור 1A ממחיש את ההשפעות האקוטיות של CTE על זמן חוסר תנועה ב-FST בחולדות CUS. בהשוואה לקבוצת מודל CUS, מתן אוראלי חריף של CTE של 3- ימים הפחית באופן משמעותי את זמן חוסר התנועה הכולל ב-FST [ANOVA חד כיווני, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. ניתוח פוסט-הוק נוסף חשף את הממשל הזה

טבלה 1|הרכב כימי של תמצית C. tubulosa. של CTE עם קבוצת מינון גבוה (מבחן Dunnett, p < 0.05)="" וקבוצת="" מינון="" נמוך="" (מבחן="" dunnett,="" p="">< 0.05)="" הראו="" ירידה="" ניכרת="" ב="" זמן="" חוסר="" התנועה="" הכולל="">

ההשפעות של CTE על העדפת סוכרוז ב-SPT בחולדות CUS מוצגות באיור 1B. הליך מאמץ של עשרים ושמונה ימים גרם לירידה משמעותית בהעדפת סוכרוז בקבוצת המודלים של CUS בהשוואה לחולדות הביקורת ללא לחץ [ANOVA חד כיווני, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; מבחן Dunnett, p < 0.05],="" המצביע="" על="" כך="" שמודל="" ה-cus="" פותח="" בהצלחה.="" כביקורת="" חיובית,="" קבוצת="" flx="" העלתה="" באופן="" משמעותי="" את="" העדפת="" הסוכרוז="" בחולדות="" cus="" [anova="" חד="" כיווני,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" מבחן="" dunnett,="" p=""><0.05], המדגים="" את="" תקפות="" הניבוי="" של="" מודל="" cus.="" מתן="" אוראלי="" כרוני="" של="" cte="" בקבוצת="" מינון="" גבוה="" הראה="" השפעות="" מפתח="" על="" העדפת="" סוכרוז="" [anova="" חד="" כיווני,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" הבדיקה="" של="" דאנט,="" p="">< 0.01],="" שהחזירה="" אותו="" לרמות="" נורמליות="" בחולדות="" cus.="" cte="" עם="" קבוצת="" המינון="" הנמוך="" הראתה="" מגמת="" עלייה="" אך="" ההשפעה="" לא="" הייתה="" מובהקת="" סטטיסטית="" (מבחן="" dunnett,="" p="">

כפי שמוצג באיור 1C, המרחק הכולל שכוסה ב- OFT שימש גם כדי להעריך את ההשפעות של CTE על חולדות CUS. בהשוואה לחולדות שאינן במתח, קבוצת המודלים של CUS הראתה מרחק כולל קצר בהרבה [ANOVA חד כיווני, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}}01; הבדיקה של דאנט, p < 0.001]="" לאחר="" חשיפה="" של="" 4-שבוע="" ל-cus,="" וטיפול="" הביקורת="" החיובית="" flx="" הגדילו="" את="" המרחק="" הכולל="" בחולדות="" cus="" [anova="" חד="" כיווני,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" מבחן="" דנט,="" p="">< 0.05].="" מתן="" אוראלי="" יומי="" של="" cte="" עם="" מינון="" גבוה="" ומינון="" נמוך="" הראה="" השפעה="" ברורה="" על="" המרחק="" הכולל="" בחולדות="" cus="" [anova="" חד="" כיווני,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" מבחן="" dunnett,="" p="">< 0.01="" לקבוצת="" מינון="" גבוה,="" p="">< 0.001="" לקבוצת="" מינון="" נמוך,="" בהתאמה].="" איור="" משלים="" s4="" מציג="" את="" מפת="" מסלול="" הפעילות="">

איור 1D מציג את ההשפעות של CTE על זמן האכילה ב-NSFT בחולדות CUS. הליך הלחץ של 28 ימים גרם לעלייה משמעותית בחביון להתחיל לאכול בקבוצת מודל CUS בהשוואה לחולדות הביקורת ללא לחץ [ANOVA חד כיווני, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19; מבחן Dunnett, p < 0.05],="" המצביע="" על="" כך="" שמודל="" ה-cus="" פותח="" בהצלחה.="" מתן="" פומי="" ארוך="" טווח="" של="" cte="" עם="" מינון="" גבוה="" הראה="" השפעות="" ברורות="" על="" חביון="" להתחיל="" לאכול="" בהשוואה="" לקבוצת="" cus="" (מבחן="" t="" של="" תלמיד,="" t="2.759," p="">< 0.05),="" בעוד="" מינון="" נמוך="" של="" cte="" הראה="" ללא="">

CTE שיחזר את רמת הנוירוטרנסמיטורים והגורמים הנוירוטרופיים בחולדות CUS

ההשפעות של CTE על רמות {{{{10}}}}}HT ו-NE בהיפוקמפוס של חולדות CUS מוצגות באיורים 2A,B. הליך מאמץ של ארבעה שבועות גרם להפחתה משמעותית של 5-HT [ANOVA חד כיווני, F(4,34)=17.13, p=0.0001; מבחן Dunnett, p < 0.001]="" ו-ne="" [anova="" חד="" כיווני,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006;" הבדיקה="" של="" דאנט,="" p="">< 0.001]="" ריכוז="" בהיפוקמפוס="" של="" חולדות="" cus="" בהשוואה="" לזה="" בקבוצת="" הביקורת,="" והתרופה="" נוגדת="" הדיכאון="" flx="" שיקמו="" באופן="" משמעותי="" את="" רמות="" 5-ht="" בהיפוקמפוס="" [anova="" חד="" כיווני,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001;" מבחן="" דנט,="" p="">< 0.001].="" לאחר="" מתן="" פומי="" של="" cte="" בקבוצת="" מינון="" גבוה,="" נצפתה="" עלייה="" משמעותית="" ברמת="" 5-ht="" [חד="">

ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0001; הבדיקה של Dunnett, p < 0.001]="" בעוד="" שריכוזי="" ה-ne="" לא="" שונו.="" באופן="" דומה,="" ביטוי="" bdnf="" הופחת="" משמעותית="" בקבוצת="" המודלים="" של="" cus="" בהשוואה="" לחולדות="" שאינן="" לחוצות="" (מבחן="" t="" של="" תלמיד,="" t="4.171," p="">< 0.01)="" (איור="" 2c).="" גם="" מתן="" אוראלי="" ארוך="" טווח="" של="" cte="" עם="" מינון="" גבוה="" (מבחן="" t="" של="" תלמיד,="" t="2.548," p="">< 0.05)="" וגם="" flx="" (מבחן="" t="" של="" תלמיד,="" t="2.263," p="">< 0.05="" )="" הגברת="" ביטוי="" bdnf="" בהשוואה="" לקבוצת="" מודל="" cus.="" cte="" עם="" מינון="" נמוך="" לא="" הראתה="" השפעה="" משמעותית="" על="" ביטוי="">

רמת ה-{{0}}HT במעי הגס של חולדות CUS הייתה שונה מזו שבהיפוקמפוס, ולהליך הלחץ של 4-שבוע לא הייתה השפעה על המעי הגס 5-HT (איור 2D ). לעומת זאת, מתן אוראלי של CTE עם מינון גבוה גרם לגירוי 5-רמות HT במעי הגס בהשוואה לקבוצת המודלים של CUS (מבחן t של תלמיד, t=2.173, p < 0.05).="" cte="" עם="" מינון="" נמוך="" לא="" הראתה="" השפעה="" על="" רמת="" 5-המעי="">

CTE הסדיר את הרכב החיידקים במעיים של חולדות CUS

ההשפעה של CTE על הרכב החיידקים במעיים של חולדות CUS הוערכה על ידי שיטת 16S rRNA מבוססת רצף גנים. נמצא כי 28 ימים של מתן אוראלי של CTE שינו את הרכב החיידקים במעיים של חולדות CUS והשפיעו על שונות

רמות טקסונומיות מיקרוביאליות בקרב קבוצות חולדות (רמה 1, דרגת סדר 1, רמה משפחתית 1, סוג רמה 8 ומין רמה 2). זה מצביע על כך שקהילת החיידקים במעיים יכולה למלא תפקיד בהשפעות האנטי-דיכאוניות של CTE. מידע מפורט על טקסיות חיידקים במעיים שהשתנו באופן משמעותי ברמות טקסונומיות שונות מוצג בטבלה 2.

רצף ה-MiSeq הניב סך של 2,132,980 קריאות גולמיות, לאחר תהליך בקרת איכות, דה-noising והסרת כימרה. לאחר מכן, הקריאות קובצו לתוך OTUs, אשר הוקצו לטקסות מרמת הפילום לרמת המין. המחקר של ניתוח גיוון בטא בוצע כדי לחקור את הדמיון של דפוסי קהילת חיידקים בין חמש קבוצות החולדות. PCoA המבוסס על מרחקי UniFrac משוקלל של מיקרוביוטת מעיים מחמש קבוצות המחקר של חולדות מוצג באיור 3A. ניתוח גיוון בטא על ידי PCoA הראה הפרדה ברורה של קהילת החיידקים מקבוצת הביקורת וקבוצת מודל ה-CUS, בעוד שקבוצת ה-CTE עם מינון גבוה נטה להיות קרוב יותר לקבוצת הביקורת בהשוואה לקבוצת ה-CUS.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 אחוז. כפי שמוצג באיורים המשלימים S5A, B, הליך מאמץ של 4 שבועות גרם למגמה לא מובהקת לעלייה ברמת Firmicutes ולירידה לא מובהקת של Bacteroidetes בקבוצת מודל CUS בהשוואה לקבוצת הביקורת. לאחר מתן יומי של CTE עם מינון גבוה ומינון נמוך, השפע היחסי של Firmicutes ו- Bacteroidetes חזר לרמות דומות של קבוצת הביקורת, אם כי ללא מובהקות סטטיסטית. ולמרות שנצפו שינויים דומים ביחס Firmicutes/Bacteroidetes בקרב קבוצות החולדות, לא הוצגו הבדלים סטטיסטיים (איור משלים S5C). מגמה לא מובהקת לירידה ברמה של phyla Cyanobacteria נמצאה בקבוצת מודל CUS בהשוואה לחולדות הביקורת ללא לחץ; ואילו מתן CTE במינון גבוה הביא לעלייה משמעותית בשפע היחסי של Cyanobacteria בהשוואה לקבוצת CUS (איור משלים S5D).

ברמת הסוג, Bacteroides ו-Ruminococcus היו שניים מהמכסים החיידקיים הנפוצים ביותר, שהיוו כ-30 אחוז שפע יחסי בכל חמש קבוצות החולדות. הליך לחץ של ארבעה שבועות גרם להפחתה משמעותית בשפע היחסי של Bacteroides ולעלייה משמעותית של Ruminococcus בקבוצת המודל CUS בהשוואה לחולדות הביקורת ללא לחץ (איורים 4A, B). מתן CTE לטווח ארוך הביא לעלייה משמעותית בשפע של Bacteroides וכן לירידה משמעותית של Ruminococcus בהשוואה לחולדות CUS. בנוסף, שישה סוגים של Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weisella, Trichococcus ו- Brachybacterium הראו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין קבוצת המודל CUS לקבוצת הביקורת (איורים 4C-H). לאחר 28 ימי טיפול ב-CTE, השפע היחסי של ששת הסוגים שהוזכרו לעיל השתנה בהתאמה לרמות דומות לקבוצת הביקורת.

שכיחות נמוכה של Deinococcus ברמות טקסונומיות שונות, כולל רמת הכיתה (Deinococci), רמת הסדר (Deinococcales), רמת המשפחה (Deinococcaceae) ורמת הסוג (Deinococcus) זוהתה בקבוצת החולדות CUS, בעוד שלא הצליחו לזהות אותו בביקורת. הקבוצה וקבוצות הניהול (איורים 5א-ד).

ברמת המין, Weissella beninensis היה נמוך בהרבה בקבוצת CUS מאשר בקבוצת הביקורת, ונצפתה עלייה משמעותית בשפע היחסי לאחר מתן CTE במינון גבוה (איור 5E). לעומת זאת, מתן CTE הפך את העלייה המשמעותית בשפע היחסי של קונגלומרט Brachybacterium שנצפה בחולדות CUS (איור 5F).

SCFAs עם מודול CTE בחולדות CUS

ריכוזי ה-SCFAs (כולל אצטט, פרופיונאט, בוטיראט, איזובוטירט, חומצה ולארית, חומצה איזוולרית וחומצה הקסאנואית) בדגימות צואת חולדות נותחו על ידי GC ומוצגות באיור 6. רמות האצטט [ANOVA חד כיווני, F( 4,32)=2.721, עמ'=0.0467; מבחן Dunnett, p < 0.05]="" וחומצה="" הקסנואית="" [anova="" חד="" כיווני,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" הבדיקה="" של="" dunnett,="" p="">< 0.05]="" עלתה="" משמעותית="" בחולדות="" בקבוצת="" מודל="" cus="" בהשוואה="" לקבוצת="" הביקורת.="" לאחר="" מתן="" ארוך="" טווח="" של="" cte="" עם="" מינון="" גבוה,="" אצטט="" (מבחן="" t="" של="" תלמיד,="" t="2.182," p=""><0.05) וחומצה="" הקסנואית="" [anova="" חד="" כיווני,="" f(4,30)="3" .028,="" p="0.0328;" מבחן="" dunnett,="" p="">< 0.05]="" ריכוזים="" ירדו="" בעיקר="" בהשוואה="" לקבוצת="" cus,="" מה="" שמעיד="" על="" כך="" ש-cte="" עשוי="" להפעיל="" את="" הפעילות="" האנטי-דיכאונית="" שלו="" באמצעות="" מווסת="" המטבוליט="" הנוירואקטיבי="" הפרוע="" scfas.="" מתן="" cte="" עם="" קבוצת="" מינון="" נמוך="" הראה="" מגמת="" ירידה="" אך="" ללא="" השפעה="" יוצאת="" דופן="" על="" ריכוזי="" האצטאט="" וחומצה="">

ניתוח מתאם של מיקרוביוטה של ​​המעי, נוירוטרנסמיטורים ונוירוטרופינים בהיפוקמפוס, 5-HT במעי הגס ו-SCFAs

כדי לחקור את הקשר התפקודי של שינוי במיקרוביוטה של ​​המעי ברמת הסוג, השתנו נוירוטרנסמיטורים ונוירוטרופינים בהיפוקמפוס ובמעי הגס, והריכוז המטריד של SCFAs, פותחו מקדמי המתאם של פירסון (Meng et al., 2017). מתאמים ביניהם (r > 0.4 או r < -0.4,="" p="">< 0.05)="" מוצגים="" באיור="" 7.="" המקדמים="" הצביעו="" על="" מתאם="" חזק="" בין="" שינוי="" בהרכב="" המיקרוביוטה="" של="" ​​המעי="" ברמת="" הסוג,="" הריכוז="" של="" שבעה="" סוגים="" של="" scfas,="" ונוירוטרנסמיטורים="" מונואמין="" הקשורים="" לדיכאון="" (5-ht="" ו-ne).="" השפע="" של="" ruminococcus="" הראה="" מתאם="" שלילי="" מובהק="" עם="" 5-ריכוז="" ht="" בהיפוקמפוס,="" מה="" שאומר="" שהליך="" cus="" מוביל="" לעלייה="" בשפע="" היחסי="" של="" ruminococcus="" ולירידה="" בריכוזי="" 5-ht.="" לאחר="" טיפול="" ב-cte,="" השפע="" היחסי="" של="" ruminococcus="" הצטמצם="" לרמה="" של="" קבוצת="" הביקורת,="" ונמצא="" שיפור="" ברמות="" ה-5-ht.="" יתרה="" מכך,="" השפע="" היחסי="" של="" bacteroides="" היה="" בקורלציה="" חיובית="" עם="" רמת="" 5-ht="" בהיפוקמפוס,="" וקשור="" שלילי="" לריכוז="" של="" בוטיראט,="" איזובוטירט,="" חומצה="" ולרית,="" חומצה="" איזוואלרית="" וחומצה="" הקסאנואית;="" השפע="" של="" parabacteroides="" הראה="" מתאם="" חיובי="" מובהק="" עם="" רמת="" 5-ht="" בהיפוקמפוס="" ובריכוז="" הפרופיונאט,="" בעוד="" שהוא="" הראה="" מתאם="" שלילי="" עם="" ריכוזי="" איזובוטיראט="" וחומצה="" איזובלרית;="" נצפה="" גם="" קשר="" חיובי="" מובהק="" בין="" השפע="" היחסי="" של="" butyricimonas="" ורמת="" ne="" בהיפוקמפוס,="" והשפע="" היחסי="" של="" deinococcus="" נמצא="" בקורלציה="" חיובית="" עם="" ריכוז="" אצטט.="" זה="" הוכיח="" ש-cte="" עשוי="" להפעיל="" את="" פעילותו="" האנטי-דיכאונית="" על="" ידי="" שינוי="" הרכב="" המיקרוביוטה="" של="" ​​המעי,="" הפרעה="" ברמות="" הנוירוטרנסמיטר="" של="" ההיפוקמפוס="" ושיקום="" מטבוליטים="" נוירואקטיביים="" scfas.="" נתונים="" מפורטים="" של="" ניתוח="" מתאם="" מוצגים="" בטבלה="" משלימה="">