מנגנוני עיכוב מלנוגנזה הנגרמת על ידי N-(4-methoxyphenyl) קפאמיד

רקע כללי:

הנגזרת של קפאין מציגה פעילות נוגדת חמצון ואנטי טירוזינאז. הפעילות והמנגנון של N-(4-methoxyphenyl) קפאין (K36E) על מלנוגנזה נחקרו.

שיטות:

תאי B16F0 טופלו בריכוזים שונים של K36E; תוכן המלנין והעברת אותות קשורה נחקרו. בדיקת Western blotting הוחלה כדי לקבוע את ביטוי החלבון, ובוצעה ספקטרופוטומטריה כדי לזהות את פעילות ה-tyrosinase ואת תכולת המלנין.

תוצאות:

התוצאות שלנו הצביעו על כך ש-K36E הפחית את תכולת המלנין ופעילות טירוזינאז המושרה על ידי-מלנוציטים (-MSH) בתאי B16F0. בנוסף, K36E עיכב את הביטוי של phospho-cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-response element-binding protein, microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase וחלבון הקשור ל-tyrosinase-1 (TRP{{14} }). K36E הפעיל את הזרחון של חלבון קינאז B (AKT) וגליקוגן סינתאז קינאז 3 בטא (GSK3), מה שהוביל לעיכוב פעילות שעתוק MITF. K36E מוחלש -MSH-induced pathways, תורם להיפופיגמנטציה.

במקביל, במחקר, מצאנו גם יישום חדש של סך הגליקוזידים של Cistanche deserticola או התמצית המכילה phenylethanoid גליקוזידים של Cistanche deserticola וראינו את ההשפעה המעכבת של סך הגליקוזידים של Cistanche deserticola על טירוזינאז על ידי שימוש בשיעור טירוזינאז דופא. שיטת חמצון. טירוזינאז הוא האנזים המגביל את הקצב העיקרי בביוסינתזה של מלנין בעור, והוא קומפלקס של נחושת וחלבון. זה יכול לעשות הידרוקסילציה של טירוזין, חומר הגלם העיקרי לייצור המלנין בגוף, לייצר L-dopa, ולאחר מכן לחמצן את הדופא לדופאקינון. Dopaquinone עובר סדרה של תהליכים מטבוליים, מסדר מחדש ומפילמר, ולבסוף משתלב עם שילוב חלבון לייצור סדרה של מלנין הגורמת להשחמה, כך שמצאנו של-Cistanche deserticola יש השפעה משמעותית על ויסות מטה על טירוזינאז.

לחץ על היתרונות הבריאותיים של מוצר cistanche

מסקנות:

K36E מווסת את סינתזת המלנין על ידי הפחתת הביטוי של חלבונים במורד הזרם כולל p-CREB, p-AKT, p-GSK3, tyrosinase ו-TRP-1, והפעיל את גורם השעתוק, MITF. ל-K36E עשוי להיות פוטנציאל להתפתח כחומר להלבנת עור.

מילות מפתח:

N-(4-methoxyphenyl) קפאין, מלנוגנזה, פרופוליס, גורם שעתוק הקשור למיקרופתלמיה, חלבון קושר אלמנטים בתגובת cAMP, גליקוגן סינתאז קינאז 3 בטא.

רקע כללי

מלנין ממלא תפקיד מרכזי במניעת פוטו-דאג' ופוטוקרצינוגנזה של העור; עם זאת, הצטברות חריגה של מלנין גורמת להפרעות היפרפיגמנטציה כגון כתמי גיל ומלזמה [1, 2]. מלנוגנזה היא סדרה של תהליכים מורכבים עם הרבה גורמים משתתפים. רקע גנטי הוא הגורם המכריע ביותר לפיגמנטציה של העור; יותר מ-150 גנים נמצאו המווסתים את הביוסינתזה של מלנין [3-5].

יתרה מכך, גורמים לא גנטיים, כגון תרופות, שינויים הורמונליים, דלקת, הזדקנות וחשיפה לקרינה אולטרה סגולה (UV), משפיעים על פיגמנטציה של העור [4, 5]. מלנוגנזה מווסתת על ידי חלבונים ואנזימים שונים, כולל טירוזינאז, גורם שעתוק הקשור למיקרופתלמיה (MITF), חלבון הקשור לטירוזינאז-1 (TRP-1), וחלבון הקשור לטירוזינאז-2 (TRP) -2) ​​[4, 6–8]. קרינת UV מעוררת הפרשת הורמון מגרה -מלנוציטים (-MSH) בקרטינוציטים, הנקשר לקולטן מלנוקורטין 1 (MC1R) ומזרז המרת אדנוזין טריפוספט לאדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP) [9]. cAMP ממריץ חלבון קינאז A (PKA), ו-PKA עובר לגרעין ומפעיל חלבון קושר אלמנטים בתגובת cAMP (CREB) [10, 11]. Phospho-cAMP-response element binding protein (p-CREB) מגביר את הביטוי של MITF כדי לגרום לביטוי של טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2. טירוזינאז עובר הבשלה והפעלה באמצעות מנגנונים מרובים, כולל קשירת נחושת, גליקוזילציה וזרחון, וכתוצאה מכך סינתזת מלנין [12].

מחקר מהותי חקר את הרגולציה של ביוסינתזה של מלנין לפיתוח חומרים היפופיגמנטים. כדי לעכב את פעילות טירוזינאז ולהפחית את סינתזת המלנין, פותחו מספר מעכבי טירוזינאז המונעים היפרפיגמנטציה באמצעות סינתזה או בידוד ממקורות טבעיים [1, 2, 7, 13]. N-(4-methoxyphenyl) קפאין (K36E; איור 1) הוא אנלוגי של חומצת קפאית phenethyl ester, מרכיב פעיל של פרופוליס. במחקר הקודם שלנו, נגזרת של קפאין הציגה תכונות נוגדות חמצון, מנעה את הפירוק של קולגן העור לאחר חשיפה ל-UVB, ועוררה סינתזת קולגן בפיברובלסטים של עור אנושי ועכברים חסרי שיער [14, 15]. נגזרת קפאין אחרת הפגינה פעילות אנטי-מלנוגנית על ידי עיכוב פעילות וביטוי טירוזינאז [16].

יתרה מכך, נגזרות של חומצה קפאית כגון טרנס-N-קפאואיל טירמין וטרנס-N-דיהידרו-פ-הידרוקסי-צינמויל-טירמין עיכבו את פעילות טירוזינאז במלנוציטים [17]. לפיכך, שיערנו ש-K36E מעכב מלנוגנזה. במחקר הנוכחי, חקרנו את ההשפעה של פעילות K36E על סינתזת המלנין בתאי B16F0, שהוא מודל מבוסס היטב לחקירה של חומרי הלבנת עור [18-20]. בנוסף, בדקנו האם הפעילות האנטי-מלנוגנית של K36E תלויה בוויסות של TRP1, AKT/גליקוגן סינתאז קינאז 3 בטא (GSK3)/CREB ו-MITF.

שיטות

חומרים וכימיקלים

K36E סונתז וזוהה על ידי פרופסור YuehHsiung Kuo בטוהר של 99.9 אחוז [21]. -MSH נרכשה מ- Merck (Darmstadt, גרמניה). ארבוטין, 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA), DL-dithiothreitol, H-89 dihydrochloride hydrate, phenylmethanesulfonyl fluoride ו-L-tyrosine נרכשו מ-Sigma-Aldrich Chemical Co. ( St. Louis, MO, ארה"ב). סרום בקר עוברי (FBS), המדיום של Dulbecco modified Eagle's (DMEM) ו-Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) נרכשו מ-GIBCO Invitrogen Corporation (NY, ארה"ב). נוגדן המזהה MITF הושג מ-Abcam (Cambridge, MA, ארה"ב). נוגדנים המזהים p-CREB ו-CREB נרכשו מ- Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, ארה"ב). נוגדנים המזהים phospho-AKT, AKT ו-phospho-glycogen synthase kinase 3 beta (p-GSK3) התקבלו מ- GeneTex, Inc. (CA, ארה"ב). נוגדנים המזהים אקטין, GSK3, TRP-1 ו-tyrosinase התקבלו מ-Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, ארה"ב).

השפעת K36E על עיכוב טירוזינאז פטריות

הפעילות של טירוזינאז פטריות נקבעה ספקטרופוטומטרית עם שינויים קלים להליך שתואר קודם [7, 21-23]. ארבוטין (2 מ"מ) היה ביקורת חיובית. דגימת הבדיקה ו-L-tyrosine במי מלח חוצץ פוספט (PBS) נוספו ל-96-microplate (Nunc, דנמרק), ונוספה טירוזינאז פטריות. לאחר הדגירה, כמות הדופאכרום שנוצרה בתערובת התגובה נקבעה בצפיפות אופטית של 492 ננומטר על ידי שימוש בקורא מיקרו-לוחיות (Tecan, Grodig, אוסטריה).

תרביות תאים

תאי B16F0 נרכשו ממרכז האיסוף והמחקר של Bioresource בטייוואן ותופחו ב-DMEM בתוספת של 10% FBS ו-100 יחידות/מ"ל של פניצילין וסטרפטומיצין ב-37 מעלות ב-5% CO2.

בדיקת כדאיות תאים

ניסויי צמיחת תאים בוצעו באמצעות בדיקת 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) עם שינויים קלים ב- הליך שתואר בעבר [7, 8, 24, 25]. מי חמצן שימש כביקורת חיובית. התאים תורבו בן לילה וטופלו בריכוזים שונים של K36E במשך 48 שעות, ולאחר מכן נוספה תמיסת MTT לכל באר. לאחר הדגירה נוספה תמיסת סודיום דודציל סולפט (SDS), הממיסה את גבישי הפורמזן המיוצרים בתאים. הצפיפות האופטית נמדדה ב-570 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחיות (Tecan, Grodig, אוסטריה).

תכולת מלנין סלולרית

תכולת המלנין בתאי B16F0 נמדדה באמצעות שיטה ששונתה ממחקרים קודמים [7, 8, 23]. תאי B16F0 נזרעו בצלחות של 6-בארות בצפיפות של 7 × 104 תאים לבאר והודגרו למשך הלילה. התאים נחשפו למדיום המכיל -MSH ו-K36E למשך 48 שעות. ארבוטין (1 מ"מ) היה ביקורת חיובית. NaOH (2 N) נוספה לכל באר כדי לרזות את התאים, שבוצעו לאחר מכן בצנטריפוגה. תכולת המלנין בסופרנטנט נמדדה ב-405 ננומטר באמצעות קורא ELISA (Tecan, Grodig, אוסטריה).

בדיקת פעילות טירוזינאז תאית

פעילות טירוזינאז של תאי B16F0 לאחר טיפול ב-K36E נמדדה בשינוי קל לשיטה שתוארה במחקרים קודמים [7, 26, 27]. תאי B16F0 צופו 24-בכלים מרובים והודגרו למשך הלילה. התאים טופלו בריכוזים שונים של K36E והודגרו למשך 48 שעות נוספות. הם נשטפו עם PBS והוסרו עם 1 אחוז Triton X-100 מעורבב ב-100 mM PBS (pH 6.8); התערובת שהתקבלה הוקפאה במהלך הדגירה ב-80 מעלות למשך 15 דקות והופשרת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הדגימות עברו צנטריפוגה. מצע שהוכן טרי (15 מ"מ L-DOPA במאגר נתרן פוספט 48 מ"מ pH 7.1) הוסף לסופרנטנט והודגרה. הספיגה נמדדה לאחר מכן ב-405 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחיות (Tecan, Grodig, אוסטריה).

קצב פעילות טירוזינאז חושב באמצעות המשוואה הבאה:

ניתוח כתם מערבי

נעשה שימוש באנליזה של Western blot כדי להדגים את ההשפעות של K36E על הביטוי של חלבונים הקשורים למלנוגנזה בתאי B16F0 כפי שתואר קודם לכן [7, 8, 22, 28, 29]. תאי B16F{{10}} נזרעו בצלחת של 10-ס"מ למשך 24 שעות וטופלו ב-MSH בלבד (קבוצת ביקורת) או ב-MSH בתוספת ריכוזים שונים של K36E למשך 48 שעות. הליסאטים עברו צנטריפוגה ותכולת החלבון נקבעה באמצעות ריאגנט של ברדפורד (Bio-Rad, Hercules, CA, ארה"ב). 20 מיקרוגרם של חלבון הופרדו על גבי ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) של סודיום דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ונסוגו באמצעות ממברנת פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) (Hybond ECL, Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, ארה"ב). הכתם נחסמו עם 5 אחוז (w/v) חלב דל שומן בתמיסת מלח טריס המכיל 0.05 אחוז Tween 20 ועם נוגדנים ספציפיים: אקטין (1:1000), AKT (1:5000), p-AKT (1:5000) ), CREB (1:1000), p-CREB (1:1000), GSK3 (1:500), p-GSK3 (1:500), MITF (1:1000), TRP-1 (1: 500), וטירוזינאז (1:200). ממברנות PVDF הודגרו עם פרוקסידאז חזרת מצומד האנטי-אימונוגלובולין G (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). חלבונים אימונראקטיביים זוהו באמצעות ערכת Enhanced Chemiluminescence Plus (Fujifilm, LAS4000), וחוזק האות נכמת באמצעות תוכנית דנסימטרית (MultiGauge V2.2). התוצאות של מבחני הכתם המערבי ייצגו לפחות שלושה ניסויים בודדים.

ניתוח סטטיסטי

הערכים הובאו כממוצע ± סטיית התקן מהתוצאות של לפחות שלושה ניסויים בודדים. הבדלים בהשפעות של טיפולים שונים הושוו באמצעות מבחן t של הסטודנט או ANOVA וכן במבחן של Scheffe באמצעות תוכנת SPSS (גרסה 12.0). ערכי P<0.05 indicated significance. 

תוצאות

עיכוב פעילות טירוזינאז פטריות על ידי K36E

K36E ב-1000 מיקרומטר הפחית משמעותית את פעילות טירוזינאז הפטריות. ההשפעה המעכבת של טירוזינאז פטריות ב-500, 750 ו-1000 מיקרומטר הייתה 6.8 אחוז ± 1.6 אחוז, 14.0 אחוז ± 7.1 אחוז ו-36.8 אחוז ± 1.1 אחוז, בהתאמה. בנוסף, שיעור העיכוב של 2 mM arbutin על פעילות טירוזינאז פטריות היה 65.3 אחוז ± 2.5 אחוז.

השפעת K36E על הכדאיות של תאי B16F0

כדאיות התא לאחר טיפול ב-1, 1.5, 2, 2.5, 4, 5, 10, 25 ו-50 מיקרומטר K36E הייתה 92.7 אחוז ± 2.0 אחוז, 91.7 אחוז ± 2.1 אחוז , 90.9 אחוז ± 2.2 אחוז , 87.8 אחוז ± 4.2 אחוז , 72.8 אחוז ± 1.0 אחוז , 68.5 אחוז ± 2.4 אחוז , 54.6 אחוז ± 1.6 אחוז , 38 אחוז 0.8 אחוזים ו-28.4 אחוזים ± 2.3 אחוזים, בהתאמה. מי חמצן היה בקרה חיובית, וכדאיות התא של 0.1 מיקרומטר H2O2 הייתה 48.9 אחוז ± 7.5 אחוז לאחר 48 שעות טיפול. כדאיות התא הייתה מקובלת לפיתוח חומר לקוסמטיקה. על פי ארגון התקינה הבינלאומי (ISO) 10993– 5:2009 (הערכה ביולוגית של מכשירים רפואיים), כדאיות תאים הגבוהה מ-80 אחוז נחשבת לא-רעילות של ציטוט. התוצאות הצביעו על כך שלטיפול ב-0.5 עד 2.5 מיקרומטר K36E במשך 48 שעות לא הייתה השפעה ציטוטוקסית על תאי B16F0.

עיכוב ביוסינתזה של מלנין על ידי K36E בתאי B16F0

איור 2a מציג את ההשפעות של K36E על ביוסינתזה של מלנין לאחר גירוי על ידי 0.5 מיקרומטר -MSH בתאי B16F0. תכולת המלנין התוך תאית גדלה ל-124.6 אחוז ± 13.{{10}} אחוזים לאחר טיפול ב-MSH. K36E במינונים גבוהים מ-1.0 מיקרומטר הפחיתו באופן משמעותי את תכולת המלנין, אשר ירדה ל-97.5 אחוזים ± 1.9 אחוזים, 96.6 אחוזים ± 3.3 אחוזים, 94.4 אחוזים ± 2.8 אחוזים ו-90.8 אחוזים ± 1.4 אחוזים (איור 2א). ההשפעה של K36E על ביוסינתזה של מלנין הייתה דומה לזו של 1 mM של ארבוטין.

עיכוב פעילות טירוזינאז על ידי K36E בתאי B16F0

K36E עיכב באופן משמעותי את פעילות טירוזינאז בתאי B16F0 לאחר טיפול במשך 48 שעות (איור 2ב). רמות פעילות טירוזינאז היו 83.2 אחוז ± 2.1 אחוז, 76.3 אחוז ± 2.9 אחוז, 72.0 אחוז ± 5.0 אחוז, ו-67.2 אחוז ± 4.4 אחוזים לאחר טיפול עם 1, 1.5, 2 , ו-2.5 מיקרומטר K36E, בהתאמה, למשך 48 שעות. התוצאות הצביעו על כך ש-K36E עיכב את תכולת המלנין של תאי B16F0 באמצעות עיכוב פעילות טירוזינאז.

השפעות של K36E על חלבונים הקשורים למלנוגנזה

K36E הוריד את הטירוסינאז ואת ביטוי ה-TRP-1

כדי לבחון האם עיכוב המלנוגנזה על ידי K36E היה קשור לרמות הביטוי של חלבונים הקשורים למלנוגנזה, כולל טירוזינאז ו-TRP-1, הודגרו תאי B16F0 עם -MSH (0. 5 מיקרומטר) וריכוזים שונים של K36E (1-2.5 מיקרומטר) למשך 48 שעות. למרות שביטוי טירוזינאז הראה עלייה של פי 2.7- בהשוואה לזו בביקורת לאחר טיפול ב-MSH, K36E דיכא באופן משמעותי את ביטוי טירוזינאז באופן תלוי מינון (איור 3). בנוסף, K36E הפחית באופן משמעותי את ביטוי TRP-1 מגורה -MSH במינונים גבוהים מ-1.5 מיקרומטר (איור 3).

K36E הוריד את ביטוי MITF

ביטוי MITF בתאי B16F0 הציג עלייה של פי 1.5- בהשוואה לזה שבביקורת לאחר טיפול ב-MSH (איור 4). K36E שטופל במשך 4 שעות עיכב ביטוי MITF תלוי במינון והוריד משמעותית את ביטוי MITF בתאי B16F0 בריכוז של 1 מיקרומטר (איור 4).

K36E הוריד את ביטוי p-CREB

ביטוי p-CREB בתאי B16F0 הראה עלייה של פי 1.4- בהשוואה לזה שבביקורת לאחר טיפול -MSH (איור 5). K36E עיכב באופן משמעותי את ביטוי p-CREB בריכוזים גבוהים מ-1.5 מיקרומטר ולאחר מכן הוריד את ביטוי MITF בתאי B16F0.

השפעות של K36E על מסלול איתות המלנוגנזה

מלנוגנזה מעוכבת K36E הייתה קשורה לוויסות PKA

כדי לקבוע אם מלנוגנזה מעוכבת K36E קשורה ל-PKA, תאי B16F0 הודגרו עם 10 מיקרומטר H-89, מעכב PKA [30] ו-2.5 מיקרומטר K36E למשך 48 שעות . טיפול עם K36E ו-H-89 בנפרד גרם לירידה של פי 1.2- ו-1.5- בביטוי טירוזינאז המושרה על ידי-MSH, בהתאמה, בהשוואה לזה שבביקורת (איור 6) ). בנוסף, טיפול משותף עם K36E ו-H-89 גורם לירידה של פי 0.9- בביטוי טירוזינאז בהשוואה לזה שבביקורת. בנוסף, הביטוי של טירוזינאז לאחר טיפול משותף היה נמוך משמעותית מזה של טיפול K36E או H-89 בנפרד. התוצאות הצביעו על כך שמסלול PKA עשוי להיות מעורב בהשפעה האנטי-מלנוגנית של K36E.

K36E עיכב מלנוגנזה על ידי הגברת ביטוי p-AKT ו-p-GSK3

כפי שמוצג באיור 7, טיפול ב-2.5 מיקרומטר K36E למשך שעה אחת הגדיל באופן ניכר את ביטוי ה-p-AKT ו-p-GSK3. רמת ה-p-AKT הגיעה למקסימום (עלייה של פי 1.{{10}} בהשוואה לזו בביקורת) לאחר שעה אחת ועלייה של פי 1.5- לאחר שעתיים; רמת ה-p-GSK3 הציגה גם עלייה של פי 1.2- לאחר שעה אחת בהשוואה לזו בביקורת, מה שמרמז ש-K36E דיכא את המלנוגנזה בתאי B16F0 על ידי הפעלת מסלולי האיתות AKT ו-GSK3, וכתוצאה מכך לעיכוב של פעילות ביטוי ותעתוק MITF, ובכך, עיכוב הביטוי של הגן טירוזינאז.

דִיוּן

טירוזינאז ופעילותו ממלאים תפקיד מרכזי בשליטה במלנוגנזה [31-33]. נעשה שימוש בחומרים או מוצרים המעכבים את פעילות טירוזינאז בקוסמטיקה וקוסמטיקה להלבנת עור [1, 2, 34]. קוורצטין וחומצה ונילית מעוכבת -MSH גרמו לביטוי של MITF, טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2, וגרמו לעיכוב מלנוגנזה [35, 36]. נגזרות של רזברטרול עיכבו את סינתזת המלנין באמצעות עיכוב של ביטויי אנזימים מלנוגניים כגון טירוזינאז ו-TRP-1 [37]. התוצאות שלנו הצביעו על כך ש-K36E עיכב את פעילות טירוזינאז וביטוי חלבון המושרה על ידי-MSH, ובכך דיכא את הביוסינתזה של מלנין. בנוסף, K36E עיכב חלבונים הקשורים למלנוגנזה כגון TRP-1. TRP-1 נחשב למלא תפקיד חיוני הן כחלבון מבני והן כאנזים קטליטי במסלול האומלני של המלנוזומים [38, 39]. התוצאות שהוזכרו לעיל הצביעו על כך שניתן להשיג את הירידה במלנוגנזה של K36E באמצעות עיכוב של מסלול האיתות המווסת את הביטוי והפעילות של טירוזינאז.

MITF הוא גורם השעתוק הקריטי ביותר המווסת את המלנוגנזה על ידי השראת הביטוי של גנים מלנוגניים [5, 40]. הפעלת MITF מגבירה את הביטוי של טירוזינאז ו-TRP-1, וכתוצאה מכך היא מגבירה את סינתזת המלנין. במחקר זה, K36E דיכא את המלנוגנזה על ידי עיכוב ביטוי MITF המושרה על ידי -MSH. מסלול cAMP ממלא תפקיד מרכזי במלנוגנזה הנגרמת על ידי MSH.

במחקר קודם, תרופות להעלאת cAMP עיכבו את PI3K/AKT. GSK3 עשוי לעורר את הקישור של MITF לרצף היעד שלו כדי לעורר את הביטוי של אנזימים מלנוגניים ולהקל על ייצור המלנין [41]. cAMP מעכב זרחון ופעילות PI3K ו-AKT, ומפחית זרחון GSK3 כדי לעורר את פעילותו. ההפעלה של העברת אותות cAMP גורמת לקשירה של MITF למקדם טירוזינאז, ובכך מובילה לגירוי מלנוגנזה [41, 42]. הפעלת מסלול AKT דיכאה את סינתזת המלנין על ידי הפחתת אנזימים מלנוגניים [41]. דווח כי קורדיצפין מעכב -MSH ו-IBMX ביוסינתזה של מלנין על ידי עיכוב אנזימים הקשורים לסינתזת מלנין, כגון טירוזינאז, TRP-1 ו-TRP-2, דיכוי פעילות CREB ו-MITF והפעלת ה-PI3K מסלול /AKT בתאי מלנומה B16F10 [43]. בתוצאות שלנו, K36E עיכב זרחון CREB. K36E העלה את הביטוי של p-AKT ו-p-GSK3, ואולי הפחית את שעתוק MITF כדי לדכא את ביטוי הגנים של טירוזינאז. מחקרים קודמים דיווחו כי ההפעלה של AKT עיכבה מלנוגנזה במלנוציטים [33, 44]. לפיכך, K36E עיכב היפר-פיגמנטציה הנגרמת על ידי -MSH הנגרמת על ידי הפעלת AKT ו-GSK3, ובהמשך הוריד את ייצור MITF, CREB, טירוזינאז ו-TRP-1 (איור 8).

חשיפה ל-UV מעוררת הפרשת -MSH בקרטינוציטים. -MSH נקשר ל-MC1R במלנוציטים, וכתוצאה מכך ייצור cAMP והפעלת PKA [10]. העברת האותות הקשורה למסלול cAMP, כולל הפעלה של גורמי שעתוק PKA ו-CREB, מובילה לוויסות העל של MITF [45]. PKA לאחר מכן מזרחן את CREB כדי להפעיל ביטוי גנים MITF [46, 47]. חומצה ניקוטינית הידרוקסמט עיכבה את סינתזת המלנין באמצעות הפעלת מסלולי האיתות MEK/ERK ו-AKT/GSK3 בתאי מלנומה B16F10 [48]. אבקת ריכוז רימונים מיובשים מפעילה השפעות הלבנה על ידי הפחתת פעילות טירוזינאז וייצור מלנין בתאי B16F10 באמצעות השבתת מסלולי האיתות p38 ו- PKA/CREB בתאי B16F10 [49]. עיכוב PI3K המושרה על ידי cAMP מפחית את זרחון AKT ואת הפעלתו. במחקר הנוכחי, ביטוי MITF המושרה על ידי -MSH עוכב על ידי K36E ו-H-89, שהוא מעכב PKA. בנוסף, טיפול משותף עם K36E ו-H-89 החליש משמעותית את ההפחתה הנגרמת על ידי K36E של סינתזת המלנין. התוצאות שלנו הצביעו על כך שהפעילות האנטי-מלנוגנית של K36E קשורה למסלול PKA ובכך מובילה להורדת ויסות ה-MITF (איור 8).

סיכום

K36E הפחית את ביטוי MITF על ידי עיכוב זרחון CREB. בנוסף, K36E עיכב ביטוי MITF על ידי הסדרת הזרחון של AKT ו-GSK3, אשר עיכבו לאחר מכן את הביטוי של טירוזינאז ו-TRP-1 ובכך הפחית את הביוסינתזה של מלנין. ניתן ליישם מלנוציטים נורמליים ומחקרים in vivo לחקירה נוספת על ההשפעה של K36E על המלנוגנזה. לסיכום, K36E עשוי להיות מועמד לוויסות המלנוגנזה וסביר שיהיו לו יישומים שונים במוצרי הלבנת עור בעתיד.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ממשרד המדע והטכנולוגיה (NSC100-2320-B-039-002-MY3; MOST104-2320-B-039-006), CMU תחת תוכנית המטרה לאוניברסיטה מובילה של משרד החינוך, טייוואן וטייוואן משרד הבריאות והרווחה לניסויים קליניים ומרכז מחקר למצוינות (MOHW105-TDU-B-212-133019), והאוניברסיטה הרפואית של סין (CMU102- אסיה-18).

זמינות נתונים וחומרים

מערכי הנתונים התומכים במסקנות של מאמר זה כלולים במאמר.

תרומות מחברים

YHK, CYL ו-HMC היו אחראים לתכנון המחקר ולמתן מימון המחקר. PYW, CSW ו-PJS תכננו את הניסויים וסיפקו הדרכה טכנית. CCC ו-HMC ביצעו את הפעולה הניסיונית. YHK, YHK, CYL ו-HMC כתבו את המאמר. כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד הסופי.

אינטרסים מתחרים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

הסכמה לפרסום

לא ישים.

אישור אתיקה והסכמה להשתתפות

מחקר זה השתמש בשורות תאים זמינות מסחרית; לפיכך, לא נדרש אישור אתי.

פרטי מחבר

1המחלקה למדעי התרופות הסיניות ומשאבי רפואה סינית, האוניברסיטה לרפואה של סין, טאיצ'ונג 404, טייוואן. 2 המחלקה לביוטכנולוגיה, אוניברסיטת אסיה, טאיצ'ונג 413, טייוואן. 3 המחלקה לקוסמטיקה, האוניברסיטה הרפואית של סין, טאיצ'ונג 404, טייוואן. 4 המחלקה לדרמטולוגיה, בית החולים האוניברסיטאי הרפואי בסין, טאיצ'ונג 404, טייוואן. 5 בית הספר לרפואה, אוניברסיטת סין לרפואה, טאיצ'ונג 404, טייוואן. 6 המוזיאון הלאומי לביולוגיה ימית ואקווריום, Pingtung 944, טייוואן.

הפניות

1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G. Hypopigmenting agents: סקירה מעודכנת על היבטים ביולוגיים, כימיים וקליניים. פיגמנט Cell Res. 2006;19(6):550–71.

2. Chiang HM, Chen HW, Huang YH, Chan SY, Chen CC, Wu WC, Wen KC. מלנוגנזה וחומרי היפופיגמנטציה טבעיים. 2012.

3. Costin GE, Hearing VJ. פיגמנטציה של העור האנושי: מלנוציטים מווסתים את צבע העור בתגובה ללחץ. FASEB J. 2007;21(4):976–94.

4. Kondo T, שמיעה VJ. עדכון על ויסות תפקוד המלנוציטים של יונקים ופיגמנטציה של העור. מומחה Rev Dermatol. 2011;6(1):97–108.

5. Yamaguchi Y, שמיעה VJ. גורמים פיזיולוגיים המווסתים פיגמנטציה של העור. גורמים ביולוגיים. 2009;35(2):193–9.

6. שמיעה VJ. אבני דרך במלנוציטים/מלנוגנזה. J Invest Dermatol. 2011;131(E1):E1.

7. Chiang HM, Chien YC, Wu CH, Kuo YH, Wu WC, Pan YY, Su YH, Wen KC. תמצית הידרו-אלכוהולית של Rhodiola rosea L. (Crassulaceae) וההידרוליזט שלו מעכבים מלנוגנזה בתאי B16F0 על ידי ויסות מסלול ה-CREB/MITF/tyrosinase. Food Chem Toxicol. 2014;65:129–39.

8. Wen KC, Chang CS, Chien YC, Wang HW, Wu WC, Wu CS, Chiang HM. טירוסול והאנלוגים שלו מעכבים מלנוגנזה הנגרמת על ידי הורמונים מגרה אלפא-מלנוציטים. Int J Mol Sci. 2013;14(12):23420–40.

9. Cui R, Widlund HR, Feige E, Lin JY, Wilensky DL, Igras VE, D'Orazio J, Fung CY, Schanbacher CF, Granter SR, et al. תפקיד מרכזי של p53 בתגובת השיזוף והיפרפיגמנטציה פתולוגית. תָא. 2007;128(5):853–64.

10. Hocker TL, Singh MK, Tsao H. גנטיקה של מלנומה וגישות טיפוליות במאה ה-21: מעבר מחוף הים למיטה. J Invest Dermatol. 2008;128(11):2575–95.

11. Drira R, Sakamoto K. Isosakuranetin, פלבנואיד 4'-O-methylated, ממריץ מלנוגנזה בתאי מלנומה עכברים B16BL6. Life Sci. 2015;143:43–9.

12. Chou TH, Ding HY, Lin RJ, Liang JY, Liang CH. עיכוב מלנוגנזה וחמצון על ידי חומצה פרוטוקטכואית מ-Origanum vulgare (אורגנו). J Nat Prod. 2010;73(11):1767–74.

13. Yeom GG, Min S, Kim SY. 2,3,5,6-Tetramethylpyrazine של Ephedra sinica מווסת את המלנוגנזה והדלקת במערכת תרבית משותפת של מלנומה/קרטינוציטים הנגרמת על ידי UVA. Int Immunopharmacol. 2014;18(2):262–9.

14. Chiang HM, Chen CW, Lin TY, Kuo YH. N-phenethyl קפאין ופוטו-דאג': הגנה על העור על ידי עיכוב פירוק פרוקולגן מסוג I וגירוי סינתזת קולגן. Food Chem Toxicol. 2014;72C:154–61.

15. Kuo YH, Chen CW, Chu Y, Lin P, Chiang HM. מחקרים במבחנה וב-In Vivo על פעולת הגנה של N-Phenethyl Caffeamide נגד פוטו-דאג' של העור. PLoS ONE. 2015;10(9):e0136777.

16. Shimoda H, Shan SJ, Tanaka J, Maoka T. beta-Cryptoxanthin מדכא מלנוגנזה המושרה על ידי UVB בעכבר: מעורבות של עיכוב פרוסטגלנדין E2 ומסלולי הורמון מגרה מלנוציטים. ג'יי פארם פרמקול. 2012;64(8):1165–76.

17. Okombi S, Rival D, Bonnet S, Mariotte AM, Perrier E, Boumendjel A. אנלוגים של N-hydroxycinnamoylphenalkylamides כמעכבים של מלנוציט-tyrosinase אנושי. Bioorg Med Chem Lett. 2006;16(8):2252–5.

18. Bellei B, Pitisci A, Izzo E, Picardo M. עיכוב מלנוגנזה על ידי מחלקה של תרכובות pyridinyl imidazole: מעורבות אפשרית של מסלול איתות Wnt/beta-catenin. PLoS ONE. 2012;7(3):e33021.

19. Wang L, Lu AP, Yu ZL, Wong RN, Bian ZX, Kwok HH, Yue PY, Zhou LM, Chen H, Xu M, et al. ההשפעה המעכבת את המלנוגנזה והניסוח הליעורי של ג'ינסנוסיד Rb1. AAPS PharmSciTech. 2014;15(5):1252–62.

20. Suwannalert P, Kariya R, Suzu I, Okada S. ההשפעות של Salacia reticulata על חומרי חמצון אנטי-תאיים ועיכוב מלנוגנזה בתאי מלנומה מסוג B16 מעוררי אלפא-MSH ותאי UV. Nat Prod Commun. 2014;9(4):551–4.

21. Chou YC, Sheu JR, Chung CL, Chen CY, Lin FL, Hsu MJ, Kuo YH, Hsiao G. עיכוב מכוון גרעיני של NF-kappaB על ייצור MMP-9 על ידי N-2- ( 4-ברומופניל) קפאין אתיל בתאים מונוציטיים אנושיים. Chem Biol Interact. 2010;184(3):403–12.

22. Chiang HM, Lin JW, Hsiao PL, Tsai SY, Wen KC. הידרוליזטים של צמחי הדרים מעוררים מלנוגנזה בהגנה מפני נזק עורי הנגרם כתוצאה מ-UV. Phytother Res. 2011;25(4):569–76.

23. Chiang HM, Ko Y, Shih I, Wen K. פיתוח עוגת יין כחומר להלבנת עור וכחומר לחות. J Food Drug Anal. 2011;19(2):223–9.

24. Chiang HM, Chen HC, Lin TJ, Shih IC, Wen KC. תמצית Michelia alba מחלישה את הביטוי המושרה על ידי UVB של מטלופרוטאנאזות מטריקס דרך מסלול MAP kinase בפיברובלסטים עוריים אנושיים. Food Chem Toxicol. 2012;50(12):4260–9.

25. Salucci S, Burattini S, Battistelli M, Buontempo F, Canonico B, Martelli AM, Papa S, Falcieri E. Tyrosol מונע אפופטוזיס בקרטינוציטים מוקרנים. J Dermatol Sci. 2015;80(1):61–8.

26. Zhang Y, Helke KL, Coelho SG, Valencia JC, Hearing VJ, Sun S, Liu B, Li Z. תפקיד חיוני של המלווה המולקולרית gp96 בוויסות המלנוגנזה. Pigment Cell Melanoma Res. 2014;27(1):82–9.

27. Park H, Song KH, Jung PM, Kim JE, Ro H, Kim MY, Ma JY. השפעה מעכבת של אפגנין מתמצית Fructus Arctii על סינתזת המלנין באמצעות הדחקה של ביטוי טירוזינאז. משלים אלטרנטיבי על בסיס Evid: eCAM. 2013; 2013:965312.

28. Chiang HM, Lin TJ, Chiu CY, Chang CW, Hsu KC, Fan PC, Wen KC. תמצית Coffea arabica ומרכיביה מונעים הזדקנות צילום על ידי דיכוי ביטוי MMPs ומסלול MAP kinase. Food Chem Toxicol. 2011;49(1):309–18.

29. Chiang HM, Chiu HH, Liao ST, Chen YT, Chang HC, Wen KC. תמצית פלמינגיה מאקרופילה עשירה באיזופלבונואיד מחלישה נזקי עור המושרה על ידי UVB על ידי ניקוי מיני חמצן תגובתיים ועיכוב ביטוי MAP Kinase ו-MMP. Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:12.

30. Bertolotto C, Bille K, Ortonne JP, Ballotti R. ויסות של ביטוי גן טירוזינאז על ידי cAMP בתאי מלנומה B16 כולל שני מוטיבים CATGTG המקיפים את תיבת ה-TATA: השלכה של תוצר גן המיקרופתלמיה. J Cell Biol. 1996;134(3):747–55.

31. Korner A, Pawelek J. Mammalian tyrosinase מזרז שלוש תגובות בביוסינתזה של מלנין. מדע (ניו יורק, ניו יורק). 1982;217(4565):1163–5.

32. Tripathi RK, Hearing VJ, Urabe K, Aroca P, Spritz RA. מיפוי מוטציוני של הפעילויות הקטליטיות של טירוזינאז אנושי. J Biol Chem. 1992;267(33):23707–12.

33. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. פיגמנטציה של מלנין בעור היונקים והוויסות ההורמונלי שלו. Physiol Rev. 2004;84(4):1155–228.

34. Fu YT, Lee CW, Ko HH, Yen FL. תמציות של Artocarpus communis מפחיתות מלנוגנזה הנגרמת על ידי הורמונים מעורר אלפא-מלנוציטים באמצעות הפעלה של מסלולי איתות ERK ו-JNK. ScientificWorldJournal. 2014; 2014:724314.

35. Chou TH, Ding HY, Hung WJ, Liang CH. מאפיינים נוגדי חמצון ועיכוב מלנוגנזה מגורה הורמון מגרה אלפא-מלנוציטים של ונילין וחומצה וניל מ-Origanum vulgare. Exp Dermatol. 2010;19(8):742–50.

36. Kumar KJ, Yang JC, Chu FH, Chang ST, Wang SY. Lucidone, מעכב מלנין חדש מהפרי של Lindera erythroderma Makino. Phytother Res. 2010; 24(8):1158–65.

37. Liu Q, Kim C, Jo YH, Kim SB, Hwang BY, Lee MK. סינתזה והערכה ביולוגית של נגזרות רזברטרול כמעכבי מלנוגנזה. מולקולות (באזל, שוויץ). 2015;20(9):16933–45.

38. Jimenez-Cervantes C, Solano F, Kobayashi T, Urabe K, Hearing VJ, Lozano JA, Garcia-Borron JC. פונקציה אנזימטית חדשה במסלול המלנוגני. פעילות 5,6-די-הידרוקסי אינדול-2-אוקסידאז של חומצה קרבוקסילית של חלבון הקשור לטירוזינאז-1 (TRP1). J Biol Chem. 1994;269(27):17993–8000.

39. Kobayashi T, Urabe K, Winder A, Jimenez-Cervantes C, Imokawa G, Brewington T, Solano F, Garcia-Borron JC, Hearing VJ. חלבון 1 הקשור לטירוזינאז (TRP1) מתפקד כ-DHICA אוקסידאז בביוסינתזה של מלנין. EMBO J. 1994;13(24):5818–25.

40. Gaggioli C, Busca R, Abbe P, Ortonne JP, Ballotti R. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) נדרש אך אינו מספיק כדי לגרום לביטוי של גנים מלנוגניים. פיגמנט Cell Res. 2003;16(4):374–82.

41. Khaled M, Larribere L, Bille K, Aberdam E, Ortonne JP, Ballotti R, Bertolotto C. Glycogen synthase kinase 3beta מופעל על ידי cAMP וממלא תפקיד פעיל בוויסות המלנוגנזה. J Biol Chem. 2002;277(37):33690–7.

42. Khaled M, Larribere L, Bille K, Ortonne JP, Ballotti R, Bertolotto C. Microphthalmia-associated transcription factor הוא יעד של מסלול ה-phosphatidylinositol-3-kinase. J Invest Dermatol. 2003;121(4):831–6.

43. Shao YY, Chen CC, Wang HY, Chiu HL, Hseu TH, Kuo YH. מרכיבים כימיים של Antrodia camphorate שקועים במרק שלם. Nat Prod Res. 2008;22(13):1151–7.

44. Oka M, Nagai H, Ando H, Fukunaga M, Matsumura M, Araki K, Ogawa W, Miki T, Sakaue M, Tsukamoto K, et al. ויסות של מלנוגנזה באמצעות phosphatidylinositol 3-מסלול kinase-Akt בתאי מלנומה G361 אנושיים. J Invest Dermatol. 2000;115(4):699–703.

45. Busca R, Ballotti R. Cyclic AMP שליח מרכזי בוויסות פיגמנטציה של העור. פיגמנט Cell Res. 2000;13(2):60–9.

46. ​​Shibahara S, Takeda K, Yasumoto K, Udono T, Watanabe K, Saito H, Takahashi K. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF): ריבוי במבנה, בתפקוד ובוויסות. J Invest Dermatol Symp Proc/Soc Invest Dermatol, Inc [ו] Eur Soc Dermatol Res. 2001;6(1):99–104.

47. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. חומצת קפאית פנאתיל אסטר מעכבת אלפא-מלנוציטים מעוררת סינתזת מלנין המושרה על ידי הורמונים באמצעות דיכוי פעילות טרנסאקטיבציה של גורם שעתוק הקשור למיקרופתלמיה. J Nat Prod. 2013;76(8):1399–405.

48. Huang GJ, Huang SS, Lin SS, Shao YY, Chen CC, Hou WC, Kuo YH. השפעות משככות כאבים והמנגנונים של אנטי-דלקת של ארגוסטטריאן-3בטא-אול מ-Antrodia camphorate מרק שלם שקוע בעכברים. J Agric Food Chem. 2010;58(12):7445–52.

49. Tsai TC, Tung YT, Kuo YH, Liao JW, Tsai HC, Chong KY, Chen HL, Chen CM. השפעות אנטי דלקתיות של Antrodia camphorate, רפואת צמחים, במודל של איסכמיה בעור עכבר. J Etnopharmacol. 2015;159:113–21.

For more information:1950477648nn@gmail.com