MiR-214 משפר פגיעה חריפה בכליות הנגרמת אלח דם באמצעות אוטופגיה מווסתת PTEN/AKT/mTOR
Feb 28, 2022
תַקצִיר. מחקרים קודמים העלו כי עקה חמצונית ואוטופגיה גורמות לחריפותפגיעה בכליות (AKI) במהלך אלח דם ומיקרו-RNA (miR)-214 ממלא תפקיד חיוני בהגנה עלכליותנתון ללחץ חמצוני. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לבדוק האם ההגנה מחדש של miR-214 קשורה לאוטופגיה באלח דם. תפקידה של אוטופגיה נחקר במודל עכבר של קשירה וניקור cecal (CLP). תגובת שרשרת פולימראז (RT-qPCR) בשעתוק הפוך שימשה לניתוח הביטוי של miR-214. המבנה והתפקוד שלכליותשנקטפו מהעכברים הוערכו.כִּליָהרמות אוטופגיה זוהו עם אימונוהיסטוכימיים, אימונופלורסנטים ו-Western blotting. נמצא כי miR-214 יכול להקל על AKI בעכברים ספטי על ידי עיכוב רמתכִּליָהאוטופגיה. יתר על כן, miR-214 עיכב אוטופגיה על ידי השתקת ביטוי PTEN ב-כִּליָהרקמות של עכברי ספיגה. ממצאים אלה הצביעו על כך ש-miR-214 שיפר את AKI המושרה על ידי CLP על ידי הפחתת מתח חמצוני ועיכוב אוטופגיה באמצעות ויסות מסלול PTEN/AKT/mTOR.
מילות מפתח:microRNA-214, אלח דם, פגיעה חריפה בכליות, אוטופגיה, כליות
מבוא חַדפגיעה בכליות(AKI) הוא אחד הסיבוכים השכיחים ביותר של אלח דם ומתרחש ב-40-50 אחוזים מחולי ספיגה, עם שיעור תמותה של עד 60 אחוז (1). עם זאת, הפתוגנזה של AKI המושרה באלח דם נותרה לא ברורה. אוטופגיה דווחה כממלאת תפקיד מפתח ב-AKI המושרה באלח דם ועיכוב האוטופגיה מביא להתפתחות של AKI במהלך אלח דם (2,3). מחקרים קודמים (4,5) אישרו כי אלח דם מעורר אוטופגיה במספר איברים, כוללכִּליָה(6) ותהליכים אוטופגיים מעורבים בהסרה של מיטוכונדריה פגומות ולחץ חמצוני (7). עם זאת, אוטופגיה מוגזמת עלולה לגרום למוות לא רצוי ומזיק של תאים (8). לכן, רמה מתונה של אוטופגיה היא המפתח להפחתת AKI המושרה באלח דם. מחקרים קודמים דיווחו כי miR-214 משפר AKI המושרה על ידי איסכמיה על ידי עיכוב אפופטוזיס (9) ו-miR-214 מדכא עקה חמצונית בנפרופתיה סוכרתית באמצעות מסלול האיתות של מיני חמצן תגובתי (ROS)/AKT/mTOR (10). המחקר הנוכחי מצא כי miR-214 יכול להחליש תפקוד לקוי של שריר הלב בעכברים על ידי עיכוב אוטופגיה (11). עם זאת, נותר להבהיר האם miR-214 יכול לשפר את AKI שנגרם אלח דם. במחקר הנוכחי, ההשערה הייתה כי miR-214 מחליש AKI המושרה על ידי CLP על ידי הפחתת מתח חמצוני ועיכוב אוטופגיה באמצעות ויסות מסלול PTEN/AKT/mTOR.
CISTANCHE ישפר מחלת כליות/כליות
חומרים ושיטות
חיות.סה"כ 100 עכברים זכרים של קונמינג (משקל, 20.40±2.92 גרם; גיל, 6-8 שבועות) שסופקו על ידי המרכז הרפואי לבעלי חיים במעבדה של האוניברסיטה הרפואית Hebei (Shijiazhuang, סין) שימשו במחקר הנוכחי. כל העכברים הותאקלמו למחזור אור/חושך של 12 שעות ב-24 מעלות צלזיוס עם 50 אחוזי לחות וקיבלו גישה חופשית למזון ומים בשעה של יותר או שווה לשבוע לפני הניסויים. כל ההליכים הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המכון הלאומי לבריאות (פרסום NIH מס' 85-23, מתוקן 1996) ובאישור הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים המרכזי בקאנגג'ואו (אישור מס' 2017-020- 01). כל הניתוחים בוצעו בהרדמה ונעשה כל מאמץ למזער את הסבל.
קשירה וניקור צקל (CLP).CLP בוצע על עכברים כדי ליצור מודל אלח דם עכברים, כפי שתואר קודם לכן (12). לאחר הרדמה על ידי שאיפת איזופלורן (המושרה ב-3 אחוזים ונשמרה ב-0.5 אחוזים), נחתך חתך בקו האמצע של 1 ס"מ. המעי הגס החשוף (מרחק 1 ס"מ מהקצה) נקשר בשני פנצ'רים באמצעות מחט בגודל 23. המעי הגס הוציא בעדינות כמות קטנה של צואה והוחזר למקומו האנטומי. דופן הבטן נתפרה בשכבות עם צמת משי 3-0. לאחר ההליך, 1 מ"ל של 0.9 אחוז תמיסת מלח הוזרק תת עורית. לעכברים ניתנה גישה חופשית למים בלבד. עכברים מדגם דמה הופעלו באותו אופן כמו מודל CLP ללא CLP.
עיצוב נסיוני. עכברים (n=6 לניתוח דמה ו-CLP) חולקו באופן אקראי לשבע קבוצות: קבוצת דמה, קבוצת CLP, חלבון פלואורסצנטי אדנווירוס (Ad)-ירוק (GFP) בתוספת קבוצת CLP, קבוצת Ad-miR-214 פלוס CLP , קבוצת anti-miR-214 פלוס CLP, מעכבי PTEN פלוס קבוצת CLP וקבוצת מעכבי PTEN פלוס Ad-miR-214 פלוס CLP. העכברים מקבוצת הדמה נחשפו לאותו הליך אך ללא קשירה וניקור של המעי הגס. עכברים בקבוצות האחרות קיבלו קשירה וניקוב cecal. כל העכברים הורדמו במהירות על ידי שאיפת איזופלורן כדי לאסוף דם, שתן וכִּליָהדגימות 24 שעות לאחר הטיפול האחרון.
Ad-miR-214, anti-miR-214 או Ad-GFP בתיווך אדנו-וירוסהעברת גנים in vivo והזרקת מעכבי PTEN. Ad-miR-214, anti-miR-214 או Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) נמסרו לחלל הבטן של עכברים 4 ימים לפני CLP. בקצרה, עכברים הורדמו על ידי שאיפת איזופלורן. צנתר המכיל 200 μl של אדנוווירוס (2x1011 pfu, המבטא miR-214, anti-miR-214 או Ad-GFP) ניתן לעכברים רגילים באמצעות הזרקה תוך צפקית. מעכב ה-PTEN (VO-OHpic, intraperitoneal, Sigma-Aldrich; Merck KGaA) ניתן לעכברי CLP שקיבלו אנטי-miR-214 באמצעות הזרקה תוך צפקית במינון בודד של 10 מיקרוגרם/ק"ג 30 דקות לפני מתן adenovirus .
הערכה של תפקוד הכליות. דגימות דם נקצרו מלב עכברים, ולאחר מכן צנטריפוגה (בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ב-3, 000 xg) לאיסוף סרום. רמות הסרום של חנקן אוריאה בדם (BUN) וקריאטינין בסרום (Cr) נקבעו באמצעות מנתח אוטומטי של Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.). ELISA שימש לניתוח רמות שלפגיעה בכליותמולקולה-1 (KIM-1; מס' קטגוריה RKM100; R&D Systems, Inc.) וליפוקלין הקשור לנויטרופילים ג'לטינאז (NGAL; מס' קטגוריה DY3508; R&D Systems, Inc.) בדגימות שתן.
בדיקת ציטוקינים של דלקת בסרום.סרום TNF‑ (מספר קטגוריה H052) ו-IL‑6 (מספר קטגוריה H007) נבדקו באמצעות ערכות ELISA מסחריות (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) לפי הוראות היצרן.מדידת סמני מתח חמצוני. ערכת הבדיקה המקבילה (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, סין) שימשה למדידת רמות המלונדיאלדהיד (MDA) ולבדיקת פעילות הסופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) בהתאם להוראות היצרן.
ציון היסטולוגיה ופציעה צינורית. כל העכברים היו נתוניםכִּליָהזלוף בהרדמה 24 שעות לאחר CLP. הכִּליָהדגימות נקבעו ב-4 אחוז פרפורמלדהיד למשך 72 שעות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן התייבשו דגימות הרקמה בסדרה מדורגת של תמיסות אתנול, שהוטבעו בפרפין וחתכו למקטעים של 4 מיקרון. חתכים (4 מיקרומטר) נחתכו באמצעות מיקרוטום וחתכי הרקמה נצבעו בהמטוקסילין (5 דקות) ואאוזין (דקה) בטמפרטורת החדר לבדיקה היסטולוגית. השקופיות הוערכו ודורגו באמצעות מיקרוסקופ (BX51, Olympus Corporation).שֶׁל הַכְּלָיוֹתtissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 אחוז (13).
מיקרוסקופ אלקטרונים העברה (TEM).טָרִיכליותנשטפו בתמיסת מלח מבוקרת פוספט, וחתכו לקוביות בגודל 1 מ"מ וקבועות ברצף ב-2.5 אחוז גלוטראלדהיד למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס. המקטעים נטבלו ב-1% אוסמיום טטרוקסיד למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס, התייבשו באתנול מדורג והוטמעו באפוקסישרין. לבסוף, החתכים האולטרה-דקים (60 ננומטר) הוכתמו כפול באורניל אצטט ועופרת ציטראט ב-20 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. התצפית בוצעה במיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת (Tecnai; Hitachi, Ltd.) בעוצמה של 80 קילוואט באמצעות Electron Microscopy Film 4489 (בסיס עבה ESTAR; Kodak).
אימונוהיסטוכימיה (IHC).טָרִיכִּליָהרקמות היו מקובעות ב-4 אחוז פרפורמלדהיד (למשך 72 שעות ב-4 מעלות צלזיוס) והוטמעו בפרפין. דגימות נחתכו למקטעים בעובי של 4 מיקרומטר והוסרו מהפראפין בקסילן. לאחר שטיפת חלקי רקמה ב-PBS, הם בושלו במאגר ציטראט של 10 mM (pH 6.0) למשך 4 דקות לאחזור אנטיגן ולאחר מכן נחסמו עם 10 אחוז סרום עיזים ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך 1 שעה. הנוגדן העיקרי (anti-LC3B; 1:400; מס' קטגוריה 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) הוסף בהתאם להוראות והודגר ב-4°C למשך 12 שעות. הנוגדן המשני (HRP נגד ארנבת עיזים; 1:2,000; מס' קטגוריה BS13278; Bioworld Technology, Inc.) הוסיפו והודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. DAB (100 μl) נוספה ונצבע נגדי למשך 5 דקות עם הצביעה שנצפה תחת מיקרוסקופ אור (דגם CX31-P; Olympus Corporation). עוצמת הצביעה החיובית, שנראתה חומה, נקבעה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.). הצפיפות האופטית האינטגרלית (IOD) חושבה כדי לייצג את העוצמה. ערכי IOD עלו עם עלייה בביטוי החלבון.
תמלול הפוך - כמותי(RT‑q) PCR. RNA כולל הוצארקמת כליהבעקבות אינדוקציה של המודל באמצעות ריאגנט TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). על פי ההוראות של ערכת השעתוק ההפוכה של TaqMan (מספר קטלוגי N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), RNA הועתק לאחור ל-cDNA. נעשה שימוש בתנאים התרמו-מחזוריים הבאים (miR‑214): דנטורציה ראשונית ב-95°C למשך 5 דקות; ואחריו 40 מחזורים של דנטורציה ב-95°C למשך 30 שניות, חישול ב-60°C למשך 30 שניות והתארכות ב-72°C למשך 30 שניות. RT-qPCR בוצע באמצעות ABI Prism 7500 Sequence Detection System (PerkinElmer, Inc.) וערכת SYBR Green PCR סטנדרטית (Toyobo Life Science). U6 שימש כבקרה פנימית עבור miR-214. רצפי הפריימר היו כדלקמן: miR-214, קדימה, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' והיפוך, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3'; U6, קדימה, 5'‑ATTGGAACGATACAGAGAAGATT‑3' ואחורה, 5'‑GGAACGCTTCACGAATTTG‑3'. ניסויים אלה שוכפלו שש פעמים. התוצאות נותחו בשיטת 2‑ΔΔCq (14). רמות ביטוי ה-mRNA של LC3, p62, PTEN, AKT ו-mTOR הוערכו באמצעות RT-qPCR. עם -אקטין כהתייחסות פנימית של גנים אלה, נעשה שימוש ב-2-ΔΔCq למדידת הביטוי היחסי של גני מטרה. רצפי ה-primer המוצגים בטבלה I יוצרו על ידי Sangon Biotech Co., Ltd.
סופג מערבי. כִּליָההרקמה עורבבה עם RIPA lysate (Beyotime Institute of Biotechnology) כדי להפוך את ההומוגנית והליזה הופסקה כאשר לא נצפתה רקמה נראית לעין. הדגימות עברו צנטריפוגה ב-13,000 xg למשך 10 דקות ב-4˚C והסופרנטנט הוחזר לניתוח ה-Western blot. בקצרה, ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות ערכת בדיקת חלבון מיקרו BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.). דגימות חלבון (80 מיקרוגרם לדגימה) הועברו להפרדה על ידי הפחתת אלקטרופורזה של 12% נתרן דודציל סולפט-פוליקרילאמידג'ל ולאחר מכן הועברו על גבי ממברנות פוליווינילידן דיפלואוריד ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. חלבונים מופרדים הועברו לממברנות PVDF. לאחר חסימה של 5 אחוז חלב דל שומן בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ממברנות הודגרו למשך הלילה (ב-4 מעלות צלזיוס) עם נוגדנים ראשוניים. נעשה שימוש בנוגדנים העיקריים הבאים (כולם Cell Signaling Technology, Inc.): שרשרת קלה 3B (1:1,000; מס' קטגוריה 4412), p62 (1:1,000; cat . no. 4412), Anti-PTEN (1:1,000; cat. no. 9188), anti-phosphorylated (p)-AKT (Ser473) (1:1,000; cat . no. 4060), anti-AKT (1:1,000; cat. no. 9272), anti-p-mTOR (Ser 2448) (1:1,000; cat. no. .5536), anti-mTOR (1:1,000; מס' קטגוריה 2972) ו-actin (1:2,000; מס' קטגוריה 4970). לאחר הכביסה, הממברנות הודגרו (בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות) עם הנוגדנים המשניים האנטי-ארנבים המצומדים ב-HRP (1:3,000; מס' קטגוריה A0208; מכון ביו-טיים לביוטכנולוגיה). רצועות חלבון זוהו עם Immobilon Western (MilliporeSigma) ונותחו באמצעות תוכנת Total-Lab TL120 (Nonlinear Dynamics, 2.01). הביטוי של חלבון היה מנורמל ל-אקטין.
ניתוח סטטיסטי. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). כל הנתונים הוצגו כממוצעים ± סטיית תקן או חציונים (טווחים בין-רבעוניים) עבור משתנים מתמשכים, בהתאם להתפלגויות שלהם. מאפיינים ותוצאות הבסיס הושוו באמצעות ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן הפוסט-הוק של Tukey, או מבחן Kruskal-Wallis ואחריו מבחן Dunn לפי המתאים. פ<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
תוצאות
נקודת זמן 24 שעות לאחר CLP. מחקרים קודמים דיווחו (6,15,16) שניתוח ביוכימי (כלומר, LC3 ו-p62) מגלה ששטף האוטופגיה מדוכא עם התקדמות אלח דם לאחר 6-8 שעות של CLP. במחקר הנוכחי, מספר האוטוליזוזומים ב-כִּליָהשל עכברים שטופלו ב-CLP עלו תוך 24 שעות לאחר הניתוח. בנוסף, ניתוח סמנים שלפגיעה בכליותהראה זאתתפקוד כליותנפגע בצורה הקשה ביותר 24 שעות לאחר CLP. לכן, נקודת הזמן 24 שעות לאחר CLP נבחרה עבור הניסויים הבאים.
השפעה רגולטורית על miR-214 ברקמות הכליות. ניתוח RT-qPCR שימש לזיהוי ביטוי miR-214 בעכברים שטופלו ב-CLP. נמצא שביטוי miR-214 היה מווסת מעט ב-כִּליָהרקמות לאחר ניתוח CLP 24 שעות, בהשוואה לקבוצת הדמה (פי 1.47, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">כִּליָהרקמה, בהשוואה לקבוצת הדמה (שתיהן P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE ישפר אי ספיקת כליות/כליות
השפעת miR-214 על תפקוד לקוי של הכליות בעכברים ספטי.כל העכברים הוקרבו כדי לאסוף דם, שתן וכִּליָהדגימות 24 שעות לאחר ניתוח CLP. BUN ו-Cr הם אינדיקטורים חשובים לחומרתשֶׁל הַכְּלָיוֹתירידת ערך (17). יתר על כן, NGAL ו-KIM-1 זוהו כסמנים ביולוגיים ספציפיים שלפגיעה בכליותוהביטוי המוגבר שלהם קשור מוקדםשֶׁל הַכְּלָיוֹתפגיעה בצינורית ב-AKI (17). כפי שמוצג באיור 2A-D, הרמות של BUN, Cr, KIM-1 ו-NGAL עלו באופן משמעותי בעקבות ניתוח CLP בהשוואה לקבוצת הדמה. עם זאת, Ad-miR-214 הפחית משמעותית את רמות BUN, Cr, KIM-1 ו-NGAL בהשוואה לקבוצת CLP (כל P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">תפקוד כליותפרמטרים. עם זאת, בעקבות טיפול מקדים עם מעכב PTEN, השפעות ההגנה של Ad-miR-214 הוגברו. התוצאות מראות כי miR-214 מחליש תפקוד לקוי של הכליות בעכברים ספטי.
השפעת miR-214 על דלקת כליות ולחץ חמצוני.כפי שמוצג באיור 3A ו-B, CLP העלה באופן משמעותי את רמות ה-TNF-ו-IL-6, בעוד Ad-miR-214 הפחית משמעותית את רמות הסמנים הללו. בהשוואה ל
השפעת miR-214 על אוטופגיה כלייתית בעכברים ספטי.המחקר הנוכחי בחן את השינויים ב-LC3 inכִּליָהרקמות באמצעות צביעת IHC. כפי שמוצג באיור 6, עוצמת ה-LC3 של צביעה חיובית עלתה באופן משמעותי בקבוצת CLP בהשוואה לקבוצת הדמה (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 מפעיל את מסלול ה-AKT/mTOR לעיכובאוטופגיה על ידי השתקת PTEN ברקמות הכליות.ההשפעה של CLP על אוטופגיה בכִּליָהרקמות נחקרו על ידי הערכת הרמות של LC3-II/I ו-p62. מסלול האיתות PTEN/AKT/mTOR ממלא תפקיד חשוב באוטופגיה (18). כדי לחקור את ההשפעה של miR-214 על מסלול PTEN-AKT/mTOR, נותחו רמות החלבון של LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR ו-PTEN באמצעות Western blotting ו-RT-RT ניתוח qPCR. כפי שמוצג באיור 7A-C, שינוי בחלבונים אלה מתרחש במהירות, עם עלייה בשיעור של LC3-II/LC3-I, והפחתה ברמות של p62 (שניהם P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">כִּליָה tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). תוצאות אלו הראו שאוטופגיה נגרמת על ידי CLP, וביטוי היתר של miR-214 יכול לעכב אותה באופן חלקי.
כפי שמוצג באיור 7A ו-D‑F, רמת הביטוי של PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">כִּליָה tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). ממצאים אלו מצביעים על כך ש-CLP גורםכִּליָהאוטופגיה של רקמות על ידי עיכוב מסלול AKT/mTOR. Ad‑miR‑214 הפעילה את מסלול ה-AKT/mTOR על ידי השתקת PTEN בכִּליָהרקמות. עם זאת, בהשוואה לקבוצת CLP, anti-miR-214 לא עיכב באופן משמעותי את הביטוי של mTOR. לכן, נעשה שימוש נוסף ב-RT-qPCR כדי לקבוע את הביטוי של mRNA של גנים הקשורים למסלול האיתות PTEN/AKT/mTOR. על פי תוצאות RT-qPCR (איור 8), בהשוואה לקבוצת Sham, רמות ביטוי ה-mRNA של p62, LC3 ו-PTEN עלו באופן ניכר, בעוד שביטוי ה-mRNA של AKT ו-mTOR ירד בקבוצת CLP. בהשוואה לקבוצת CLP, ה-Ad‑miR‑214, PTEN
קבוצות מעכבי ומעכבי Ad-miR-214 פלוס PTEN הציגו ירידה בביטוי mRNA של LC3 ו-PTEN, אך ביטוי מוגבר של mRNA של p62, AKT ו-mTOR (כולם P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). לפיכך, ההשפעה של p62 על אוטופגיה עשויה להתרחש ברמת התעתיק ולא ברמה שלאחר התמלול. התוצאות הנוכחיות הראו כי miR-214 הפחית את הביטוי של PTEN והפעיל את מסלול האיתות AKT/mTOR.
דִיוּן
המחקר הנוכחי מצא שאוטופגיה מוגזמת מזיקהתפקוד כליותבעכברי ספיגה. מחקרים קודמים הראו כי miR-214 קשור לשגשוג מוגבר, גרורות, פלישה ומתפקד כאונקוגן לתאים ורקמות (19-22). מחקרים מדווחים כי miR-214 משרת הגנה מפני AKI באמצעות אפופטוזיס מחליש, עקה חמצונית והורדת ויסות של גורמים דלקתיים (21,23). המחקר הנוכחי בחן עוד את המנגנונים העומדים בבסיס ההשפעה המגנה של miR-214 על AKI המושרה באלח דם על ידי התמקדות במעורבות הפוטנציאלית של miR-214 באפנון של אוטופגיה. התוצאות הראו שלחץ חמצוני התרחש ב-כִּליָהלאחר מתן ניתוח CLP. בינתיים, ההפעלה של אוטופגיה מתרחשת ב-כִּליָה.LC3 II/I מוגבר והפחתת p62 ב-כִּליָהנצפה בעקבות טיפול בניתוח CLP. כצפוי, ביטוי היתר של miR-214 נחלש באופן משמעותיכִּליָהפציעות פתולוגיות וכִּליָהתפקוד לקוי שנגרם על ידי אלח דם. עם זאת, העיכוב של miR-214 הראה נטייה הפוכה להגנת רינו. בנוסף, אפקט ההגנה של Ad‑miR‑214 הוגבר על ידי מעכב PTEN.
בספיגהכִּליָה, דלקת יתר מלווה בעליות מסיביות בייצור ROS ומספר רב של ROS מעורר שינויים במבנה המיטוכונדריאלי ופוגע בתפקוד המיטוכונדריאלי, מה שגורם לגוף להיכנס למעגל קסמים המחמירכִּליָהנזק (24,25). לכן, עקה חמצונית עשויה להיות אחד המנגנונים הפתולוגיים העיקריים של AKI המושרה באלח דם. המחקר הנוכחי סיפק ראיות נוספות המדגימות עקה חמצונית מוגזמת, אשר הצביעו על ייצור מוגבר של MDA והפחתת פעילות SOD בכִּליָהרקמות לאחר ניתוח CLP. יתר על כן, נמצא כי ביטוי היתר של miR-214 יכול להגן עלכִּליָהנגד פגיעה חמצונית הנגרמת על ידי CLP, המעורבת בעיכוב אוטופגי. זה תואם את המחקרים הקודמים לפיהם miR-214 מגן על תאים ורקמות שונות מפני עקה חמצונית (26,27).
אוטופגיה משמשת כ'חרב פיפיות' בהתפתחות אלח דם: אוטופגיה בסיסית יכולה להפעיל השפעות הגנה על ידי הסרת חלבונים חמצוניים רעילים, אך אוטופגיה מוגזמת עלולה להוביל למוות תאי אוטופגי תחת לחץ חמור, כגון התפרצות ROS (28,29) . הוכח כי אוטופגיה מופעלת בתחילה באלח דם, ולאחר מכן שלב עוקב של חוסר תפקוד עקב מוות אוטופגי של תאים (30), אשר מחמיר פגיעה חמצונית הנגרמת על ידי אלח דם. במחקר הנוכחי, מעכב PTEN או ביטוי יתר של miR-214 הציג הגנה נוגדת חמצון מחדש בעכברים שטופלו ב-CLP. עם זאת, העיכוב של miR-214 הראה נטייה הפוכה להגנת רינו נוגדת חמצון. אז אוטופגיה מוגזמת או לא מספקת יכולה לגרוםנזק לכליות; שניהם אינם מסתגלים ובסופו של דבר מעוררים מוות של תאים. לפיכך, שמירה על רמות מתונות של אוטופגיה היא המפתח להחלשת פגיעה חמצונית במצב ספיגה.
CISTANCHE ישפר כאבי כליות/כליות
עדויות מצטברות הצביעו על כך ש-miR-214 מעכב אוטופגיה בתאים ורקמות שונות (31-33). במחקר הנוכחי, נמצא כי ביטוי היתר של miR-214 מעכב אוטופגיה הנגרמת על ידי CLP ברקמות כליות,כפי שמצוין על ידי השינויים בסמני חלבון, כגון LC3-II/I ו-p62. יתר על כן, התוצאות הראו שביטוי יתר של miR-214 החליש את הפגיעה החמצונית הנגרמת על ידי CLP על ידי עיכוב אוטופגיה מוגזמת. המחקר הנוכחי חקר גם את המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם מווסת miR-214כִּליָהאוטופגיה ב-AKI המושרה על ידי אלח דם. PTEN/AKT/mTOR הוא מסלול איתות חשוב המווסתכִּליָהautophagy (34,35) ואשר משמשת תפקיד מפתח ב-AKI המושרה באלח דם, ו-PTEN הוא מעכב שלילי של מסלול האיתות PI3K/AKT/mTOR. מחקרים קודמים דיווחו כי miR-214 יכול לווסת אוטופגיה דרך מסלול האיתות PI3K/AKT/mTOR בדגמים שונים (36-38). Ma וחב' (39) מצאו כי miR-214 יכול לווסת את האוטופגיה בכליות סוכרתיות. לכן, ההשערה הייתה שההשפעות של miR-214 על AKI המושרה על ידי CLP עשויות להיות מעורבות בוויסות של מסלול PTEN/AKT/mTOR. יש לציין, תוצאות המחקר הנוכחי הראו שניתוח CLP העלה באופן משמעותי את רמות ה-PTEN אך הפחית את רמות ה-p-AKT ו-p-mTOR, מה שמצביע על כך שניתוח CLP השבית את מסלול ה-AKT/mTOR. בנוסף, ביטוי היתר של miR-214 הפעיל את מסלול ה-AKT/mTOR על ידי השתקת PTEN באוטופגיה המושרה על ידי CLP בכִּליָהרקמות. עם זאת, anti-miR-214 לא עיכב באופן משמעותי את הביטוי של mTOR בניתוחי כתם מערבי. לפיכך, נעשה שימוש נוסף ב-RT-qPCR כדי לקבוע את הביטוי של mRNA של גנים הקשורים למסלול האיתות PTEN/AKT/mTOR. המחקר הנוכחי זיהה כי miR-214 הוריד את הביטוי של PTEN והפעיל את מסלול האיתות AKT/mTOR לעיכוב אוטופגיה. עם זאת, יש לבצע מחקרים ממצים נוספים כדי לקבל פרטים נוספים הקשורים למנגנון שלכִּליָהאוטופגיה במצב ספטי.
לסיכום, תוצאות המחקר הנוכחי העלו כי miR-214 שימש תפקיד מגן מפני אלח דם.פגיעה בכליותעל ידי הפחתת מתח חמצוני ועיכוב אוטופגיה באמצעות ויסות של מסלול PTEN/AKT/mTOR. הממצאים הנוכחיים העלו כי miR-214 עשוי להיות יעד טיפולי פוטנציאלי עבור AKI המושרה באלח דם. עם זאת, המחקר הנוכחי השתמש בעכברים בני 6-8 שבועות, ולכן יש צורך במחקר נוסף על המנגנון של miR-214 בעכברים בוגרים.