זיהוי גנים של שעון הקשורים ליתר לחץ דם בכליות מחולדות בעלות יתר לחץ דם ספונטנית
Feb 20, 2022
רקע כלליקיימת וריאציה יומית בתנודת לחץ הדם של יתר לחץ דם, ואי נורמליות בתנודת לחץ הדם נחשבת לגורם סיכון עצמאי לנזק לאיברים כולל סיבוכים קרדיווסקולריים. במחקר הנוכחי, ניסינו לזהות מולקולות האחראיות להיווצרות קצב יממה בלחץ הדם תחת שליטה שלכִּליָהשעון ביולוגי ביתר לחץ דם.
שיטות ניתוח מיקרו מערכי DNA בוצע בכליותמחולדות 5-בת שבוע עם יתר לחץ דם ספונטני (SHRs)/Izm, חולדות SHR המועדות לשבץ (SHRSP)/Izm, וחולדות Wistar Kyoto (WKY)/Izm. כדי לזהות וריאציה, תאי אפיתל צינורי עכברים (TCMK-1) עוררו באמצעות דקס-מתזון. ביצענו צביעה חיסונית וניתוח כתם מערבי ב-שֶׁל הַכְּלָיוֹתמדולה שלכִּליָהמחולדות WKY ו-SHR בנות 5-שבועות.
תוצאותחילצנו 1,032 גנים עם E-box, רצף מחייב עבור BMAL1 ו-CLOCK באמצעות ניתוח העשרה של סט גנים. בניתוח מיקרו-מערכים, זיהינו 12 גנים שעלו פי יותר מ-2- בכליותשל SHRs ו-SHRSP בהשוואה לחולדות WKY. בניתוח רגרסיה תקופתי, phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase (Ppat) ופיגור שכלי שביר X, הומולוגי אוטוזומלי 1 (Fxr1) הראו קצב יממה. אימונוציטוכימיה חשפה חיוביות PPAT בגרעינים ובציטופלזמה בצינוריות, וחיוביות FXR1- בציטופלזמה של TCMK-1. בעכברוש WKY ו-SHR בן 5-שבועכליות, PPAT היה מקומי בגרעין ובציטופלזמה של הצינוריות הפרוקסימלית והדיסטלית, ו-FXR1 היה מקומי לציטופלזמה של הצינוריות הפרוקסימלית והדיסטלית.
מסקנותPPAT ו-FXR1 הן מולקולות מרכזיות בשליטה על קצב לחץ הדם הצירקדי על ידיכִּליָהביתר לחץ דם.
מילות מפתח:לחץ דם;; לַחַץ יֶתֶר; כִּליָה; נפרוטובולוס; חולדה בעלת יתר לחץ דם ספונטנית
לתופעות ביולוגיות שונות, כולל מחזור השינה, קצב הלב ולחץ הדם, יש קצב צירקדי. עבור המקצב הצירקדי, התגלתה נוכחות של שעון ביולוגי, ואז הוכח שמקצב צירקדי קיים בכל האורגניזמים החיים מארכיבקטריה ועד לבני אדם. 1
הגרעין העל-כיאסמטי (SCN), הנחשב לתפקד כשעון מרכזי, הוא מרכז המפעיל תנודה אוטונומית של קצב יממה. בנוסף, שעונים פנימיים הקיימים באיברים ההיקפיים נשלטים על ידי שעונים מרכזיים, ומסמנים את הקצב המתאים לכל איבר. 2 השעון המרכזי שולט בשעונים ההיקפיים באמצעות גורמים עצביים והומורליים. ה-SCN מורכב ממספר רב של נוירונים שמתנדנדים באופן אוטונומי, כאשר תאים אלו בודדו והתפזרו בחולדות ובעכברים, הם הראו מקצבים יממה עם הבדלים קלים בתדירות הירי שלהם ובביטוי הגנים שלהם. לפיכך, נוירונים בודדים ב-SCN הם תאי שעון עם מתנדים circadian משלהם. 3
לאחרונה הובהרו המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הקצב של השעונים הביולוגיים. השעון הביולוגי מורכב מלולאה ראשית שבה 1 (BMAL1) דמויי מוח ושרירים, מחזורי הפלט של תנועה Circadian Kaput (CLOCK), תקופה (PER) ו-CRYPטוכרום (CRY) פועלים כחלבוני ליבה. CLOCK ו-BMAL1 יוצרים דימר כדי לפעול כגורם שעתוק ולהיקשר לרצף E-box (CACGTG). 4 גני המטרה כוללים גני שעון אחרים, כגון Per ו-Cry. חלבוני ה-PER וה-CRY שנוצרים עוברים לגרעין ומדכאים את הגנים BMAL1 ו-CLOCK. לאחר מכן, PER ו-CRY נפתרים לאורך זמן באמצעות זרחון רב-שלבי על ידי קזאין קינאז (CKIε), גליקוגן סינתאז (GSK-3) וחלבון קינאז מופעל על ידי AMP (AMPK). לפיכך, הדיכוי של BMAL1 ו-CLOCK מתבטל על ידי PER ו-CRY, וקידום ביטוי הגנים על ידי CLOCK ו-BMAL1 מתחיל שוב, והשעון מסתובב. בנוסף ללולאה הראשית הזו, קיימת גם תת-לולאה הכוללת תת-משפחה של קולטן גרעיני 1 קבוצה D חבר 1 (NR1D1), קולטן יתומים הקשורים לחומצה רטינואית (ROR), אתר D של חלבון קושר מקדם אלבומין (DBP) ו-E4 פרומטור קושר חלבון 4 (E4BP4). NR1D1 נקשר לרצף RRE (AGGTCA) ומדכא את הלולאה הראשית באמצעות משוב שלילי, בעוד ש-DBP מקדם את הלולאה הראשית באמצעות משוב חיובי על ידי קשירה לרצף D-box (TTATGTAA). כמו כן, מדווחים שחלבונים המתקתקים את הקצב הצירקדי תחת שליטה של השעון הביולוגי מגיעים לכ-15 אחוזים בכל רקמה. 6 השעון הביולוגי מעורב ביצירת מקצבים צירקדיים של תופעות פיזיולוגיות שונות.
ידוע כי קיימת וריאציה יומית בתנודת לחץ הדם של יתר לחץ דם, ואי נורמליות בתנודת לחץ הדם נחשבת לגורם סיכון עצמאי לנזק לאיברים כולל סיבוכים קרדיווסקולריים. 7 הפרעת לחץ דם בקצב הצירקדי גורם לנזק לאיברים. ישנם דיווחים רבים על הקשר בין לחץ דם לשעונים ביולוגיים, כגון Per, Cry, Bmal1 ו-Clock. ירידה בלחץ הדם, אובדן תנודות בלחץ הדם היומי, ופגיעה בתאי אנדותל כלי דם דווחו בעכברי נוקאאוט Bmal1. 8 עכברי נוק-אאוט של שעון דיווחו על הפרשת נתרן מוגברת בשתן, ירידה בלחץ הדם, ואפילו קצב לב מופחת וירידה במשרעת הצירקדית של קצב הלב. 9 דשתי ואח'. דיווח כי גני השעון גורמים לחלק גדול של שונות פנוטיפית בלחץ הדם הסיסטולי. 10
לגבי התרומה של הכליותלמקצבים הצירקדיים, נורמליכליותיש הפרשת אלקטרוליטים וייצור שתן גדולים יותר במהלך היום מאשר בלילה, וקיים קצב יממה בהפרשת נתרן, אשלגן וכלור. 11 ביתר לחץ דם, כישלון בקצב הצירקדי של תפקודים אלו מדווח כקשור לסיבוכים קרדיווסקולריים. 12 עכברי נוקאאוט Per1 מראים הפרשת נתרן מוגברת וירידה בלחץ הדם ביחס לתת-היחידה שלשֶׁל הַכְּלָיוֹתתעלת נתרן אפיתל (ENaC) בצינור האיסוף שלכִּליָה, המצביע על נוכחות של שעון ביולוגי בכִּליָה.13 בנוסף, נצפתה וריאציה יומית בלחץ הדם (מצב ללא דיפר) בחולים עם כרונימחלת כליות. 14 לפיכך, השעון המרכזי הממוקם ב-SCN מסדיר אתשֶׁל הַכְּלָיוֹתשעון היקפי, מסמן את התזמון האופטימלי עבורכִּליָה.
דווח כי החולדה עם יתר לחץ דם ספונטנית (SHR), מודל גנטי של יתר לחץ דם חיוני, מראה סטייה בקצב הלב ותנודות יומיות בלחץ הדם, אשר מוגברת על ידי ההזדקנות. 15 בעבר, חקרנו את השעון הצירקדיאני של בלוטת יותרת הכליה בחולדות SHR ו-Wistar Kyoto (WKY) שנשמרו במחזור אור-חושך של 12-שעות, ומצאנו של-SHR יש שעון צירקדי לא תקין של יותרת הכליה
ולהראות את הקצב הצירקדי המשתנה של אנזים מגביל קצב מגביל קצב גנים מבוקר שעון בהתחדשות סטרואידים וכן שינוי ברמת הגלוקוקורטיקואידים בסרום. 16 בנוסף לאות משעון SCN המרכזי, ידוע כי גלוקוקורטיקואיד המשתחרר מבלוטת יותרת הכליה מסנכרן את השעון הצירקדי ההיקפי באיברים אחרים. 17 גירוי דקסמתזון יכול לשחזר את התנודות הצירקדיאניות של גן השעון ולהתאים למחקר חוץ-גופני. 18 בנסיבות אלו, יתכן של-SHR יש גם שעונים צירקדיים היקפיים חריגים באיברים שונים, כוללכִּליָהאשר ממלא תפקיד מרכזי בוויסות לחץ הדם. עם זאת, שעון יממהכִּליָהמ-SHR לא הובנה במלואה.
במחקר הנוכחי, ניסינו לזהות את גני השעון האחראים שלכִּליָהביתר לחץ דם באמצעות SHR וחולדות SHR מועדות לשבץ (SHRSP), והעריך את התפקידים של גני השעון המעורבים בוויסות של מקצב לחץ הדם הצירקדי הלא תקין.
שיטות
אתיקה ובעלי חייםהחקירה שלנו תאמה את המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (פרסום מס' NIH 85-23, 1996). פרוטוקולי מחקר הכוללים שימוש בבעלי חיים חיים הוערכו על ידי ועדת האתיקה של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ניהון (מס' 11–034). חולדות WKY/Izm ו-SHR/Izm שנשמרו ב-Disease Model Cooperative Research Association נרכשו מיפן SLC (Hamamatsu, Shizuoka, יפן). לחץ דם סיסטולי נמדד בשיטת שרוול הזנב. במחקר זה, על מנת להימנע משינויים משניים בביטוי הגנים על ידי עליית לחץ הדם וכדי לזהות גנים אחראיים המשפיעים על מקצבי היממה ובסופו של דבר מקשרים יתר לחץ דם, בחרנו בחולדות בנות שבוע טרום לחץ דם.
חפש גנים עם E-box בגנום שלם
השתמשנו במאגר החתימות המולקולריות בניתוח העשרה של מערכי גנים (GSEA; Broad Institute, Boston, MA) כדי לחפש במקבץ הגנים מטרות של גורמי שעתוק אנושיים והשתמשנו במסד הנתונים עם המספר הגבוה ביותר של גנים במעלה הזרם מהגן A של נקודת ההתחלה של התעתוק, שבו E-box (CACGTG) היה קיים ב-2,000 bp במעלה הזרם.
ניתוח מיקרו מערכי DNA
כליותהוסרו מחולדות SHR/Izm, SHRSP/Izm ו-WKY/Izm בנות 5-שבוע ב-12:00. הכרותיםכִּליָההומוגזה עם תקן TaKaRa BioMasher (Takara, Otsu, Shiga, יפן), ו-RNA כולל הוצא. לאחר הכלאה וסריקה, בוצע כימות עם Agilent Feature Extraction 10.7.3.1 (Agilent Technologies). ביטוי הגנים הושווה ונבדק. גנים שהביטוי שלהם משתנה בין זנים חולצו עם סף של יותר מפי 2- או פחות מפי 0.5-.
זיהוי וריאציה של גנים מועמדים בתאי TCMK-1
תאי אפיתל צינורי של עכברים (TCMK{{0}}) מאוסף American Type Culture (ATCC, Manassas, VA) עוררו עם 0.5 מיקרומול/ליטר דקסמתזון כמתואר
קוֹדֶם. 18 המדיום הוחלף ל-Dulbecco's Modified Eagle Medium ללא סרום. RNA כולל הוצא כל 4 שעות לאחר גירוי דקסמתזון, והשפע של mRNAs Npm1, Nptx1, Trim46, Plbd1, Plagl1, Bcl6, Fxr1, Tbl1, Hnrnpa3, Ppat ו-Tef כמת באמצעות תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת. באותו שלב, בוצעה תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת על RNA של גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) והשתמשה בו כתקן פנימי. הפריימרים שבהם נעשה שימוש מופיעים בטבלה משלימה S1 באינטרנט. המחזוריות של תנודת ה-mRNA לאחר גירוי דקסמתזון של תאי TCMK-1 נותחה על ידי ניתוח רגרסיה רב-משתני שקבע את עקומת הרשת (MESS), משרעת (AMP), פאזה (TZ1) על ידי אופטימיזציה של עקומת הקוסינוס באמצעות שיטת הריבועים הפחות אומדנים של MESS, AMP ו-TZ1; רווחי הסמך של 95 אחוזים שלהם חושבו באמצעות שיטת צירוף המקרים היחיד.
צביעה אימונופלואורסצנטית של תאי TCMK-1תאי TCMK-1 תוקנו עם 4 אחוז פרפורמלדהיד. לאחר שטיפה עם תמיסת מלח מאוחסת פוספט, התאים הודגרו עם נוגדן אנטי-PPAT חד שבטי ארנבת
(Sigma-Aldrich) מדולל 250 פעמים ונוגדן חד שבטי אנטי-FXR1 של ארנב (Abcam, Cambridge, UK) מדולל 300 פעמים בטמפרטורת החדר למשך שעה. דילול פי 1,000- של Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgG (Invitrogen), כנוגדן משני, נוצר להגיב בחושך למשך שעה.
צביעה חיסונית בכליה מחולדות WKY ו-SHRהשֶׁל הַכְּלָיוֹתמדולה שלכִּליָהמחולדות WKY/Izm בנות 5-שבועות ו-SHR/Izm בודדו והוטמעו בפרפין, והודגרו עם נוגדן אנטי-PPAT חד שבטי ארנב מדולל 250 פעמים, ונוגדן חד שבטי אנטי-FXR1 ארנב מדולל 200 פעמים. Histofine Simple Stain Rat MAX-PO (MULTI) (Nichirei Biosciences, טוקיו, יפן) הוחל כנוגדן משני. הפרוסות התייבשו, נוקו, נאטמו במרינול ונצפו במיקרוסקופ אופטי.
סופג מערבי לחלבוני FXR1 ו-PPAT בכליות מחולדות WKY ו-SHRהשֶׁל הַכְּלָיוֹתהמדולה הייתה נתונה למיצוי חלבון באמצעות חיץ בדיקת רדיו-אימוניות (Nacalai Tesque, קיוטו, יפן). הפרוסות הועברו לממברנת פוליווינילידן דיפלואוריד עם iblot (Invitrogen) ונחסמו בתמיסת חלב רזה של 5 אחוז למשך שעה. נוגדנים ראשוניים, שהם נוגדנים חד שבטיים לארנבים נגד FXR1, ונוגדנים חד שבטיים נגד PPAT של ארנב, יושמו. IgG נגד ארנבת עיזים מצומדת חזרת פרוקסידאז (Jackson ImmuneReseach, West Grove, PA) שימש כנוגדן משני. GAPDH שימש כסטנדרטים פנימיים.
ניתוח סטטיסטיהערכים דווחו כממוצע ± SE. מבחן t של התלמיד שימש לניתוח נתונים לא מזווגים. נעשה שימוש גם בניתוח השונות של 2-דרך Bonferroni/Dunn כאחר-בדיקה. ערכי P של<0.05 were="" considered="" to="" indicate="" statistical="">
תוצאות
לחץ דםלחץ הדם הסיסטולי של חולדות WKY/Izm בנות שבוע {{0}}, חולדות SHR/Izm וחולדות SHRSP/Izm היה 116 ± 3.0 (n=6), 121 ± 3.3 (n=6), ו-125 ± 3.4 (n=5) מ"מ כספית, בהתאמה. לחץ הדם הסיסטולי לא היה שונה בין 3 הזנים במידה משמעותית סטטיסטית.
חפש גנים עם E-box במקדם על ידי ניתוח GSEAחיפשנו גנים הנושאים את רצף הקישור E-box (CACGTG) של CLOCK והטרודימר BMAL1 בגנום כולו. כתוצאה מכך, זוהו 1,032 גנים הנושאים תיבת E בין 2,000 bp במעלה הזרם או במורד הזרם מנקודת ההתחלה של התעתוק (טבלה משלימה S2 מקוונת).
השוואה של ביטוי הגנים בכליה מחולדות WKY, SHR ו-SHRSP על ידי ניתוח מיקרו מערכי DNAהשווינו את ביטוי הגנים בכליותמחולדות WKY/Izm בנות 5-שבועות וחולדות SHR/Izm באמצעות מיקרו-מערכי DNA. שלוש מאות שישים ושלושה גנים באו לידי ביטוי גבוה (יותר מפי 2-) ב-שֶׁל הַכְּלָיוֹתקורטקס של חולדות SHR/Izm בהשוואה לחולדות WKY/Izm. רמות הביטוי של 281 גנים ב-כִּליָההיו יותר מ-0.5-פיפול בהשוואה לחולדות WKY/Izm. בתוך השֶׁל הַכְּלָיוֹתמדולה של חולדות SHR/Izm, 284 גנים הראו רמות ביטוי גבוהות יותר ו-203 גנים
הראו רמות ביטוי נמוכות יותר בהשוואה לחולדות WKY/Izm. בתוך השֶׁל הַכְּלָיוֹתקליפת המוח של חולדות SHRSP/Izm, רמות הביטוי של 267 גנים היו יותר מפי 2- בהשוואה לאלו בחולדות WKY/Izm. רמות הביטוי של 580 גנים היו פחות מפי 0.5- בהשוואה לחולדות WKY/Izm. בתוך השֶׁל הַכְּלָיוֹתמדולה של SHRSP/Izm, 639 גנים הראו רמות ביטוי גבוהות יותר ו-251 גנים הראו רמות ביטוי נמוכות יותר בהשוואה לחולדות WKY/Izm. בין 1,032 גנים עם E-box, רמת הביטוי של 17 גנים mRNAs הייתה יותר מפי 2- ב-שֶׁל הַכְּלָיוֹתקורטקס של חולדות SHR/Izm בהשוואה ל
איור 2. וריאציה של הביטוי של mRNA גנים מועמדים בתאי TCMK-1 לאחר גירוי דקסמתזון. תאי TCMK-1 עוררו עם 0.5 µmol/l dexamethasone למשך שעתיים. RNA כולל הוצא כל 4 שעות לאחר גירוי דקסמתזון, והשפע של mRNAs Npm1, Nptx1, Trim46, Plbd1, Plagl1, Bcl6, Fxr1, Tbl1, Hnrnpa3, Ppat ו-Tef הוערך על ידי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת. ביטוי הגנים היחסי נותח על ידי השוואה ל-GAPDH mRNA. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM (n=6).
חולדות WKY/Izm. בין 17 הגנים הללו, הביטוי של 4 גנים (Bcl6, Nr1d1, Ppat ו-Tef) גדל פי יותר מ-2- ב-שֶׁל הַכְּלָיוֹתקורטקס של חולדות SHRSP/Izm בהשוואה לחולדות WKY/Izm (טבלה 1). בתוך השֶׁל הַכְּלָיוֹתקליפת המוח של חולדות SHR/Izm, זוהה ביטוי של 10 גנים mRNA, שהצטמצמו לפי פחות מפי 0.5- בהשוואה לחולדות WKY/Izm; 8 מהגנים הללו (Fxr1, Hnrnpa3, Npm1, Nptx1, Plagl1,
Plbd1, Tbl1x ו-Trim46) ירדו גם הם כפחות מ-0.5-קיפולשֶׁל הַכְּלָיוֹתקורטקס של חולדות SHRSP/Izm (טבלה 1). ביטוי ה-mRNA של 10 גנים ב-שֶׁל הַכְּלָיוֹתהמדוללה מחולדות SHR/Izm גדלה יותר מפי 2- בהשוואה לחולדות WKY/Izm. בין 10 הגנים הללו, הביטוי Nr1d1 ו-Tef mRNA ב-שֶׁל הַכְּלָיוֹתהמדוללה מחולדות SHRSP/Izm גדלה יותר מפי 2- בהשוואה לחולדות WKY/Izm (טבלה 1). ביטוי ה-mRNA של קולטן טרנספרין (Tfrc) ב-שֶׁל הַכְּלָיוֹתהמדולה של חולדות SHR/Izm הראתה פחות מ-0.5-פיפול בהשוואה לחולדות WKY/Izm. עם זאת, ביטוי ה-Tfrc mRNA גדל ב-שֶׁל הַכְּלָיוֹתמדולה של חולדות SHRSP/Izm (טבלה 1).
אינדוקציה של mRNA של גן שעון בתאים נפרוטובולרייםאיור 1 מציג את השונות בביטוי של Per1, Bmal1, Nr1d1 ו-Cry1 mRNA לאחר הוספת דקס-אמטזון בתאי TCMK-1. האמפליטודות של ביטוי ה-mRNA Per1, Bmal1 ו-Nr1d1 הראו שיאים ב-28 ו-44 שעות לאחר 4 שעות של גירוי דקסמתזון. המשרעת של ביטוי ה-mRNA של Cry1 הראתה שיאים ב-4, 28 ו-44 שעות לאחר 4 שעות של גירוי דקסמתזון. לפיכך, גירוי דקסמתזון גרר את התנודות של ביטוי ה-mRNA של גן השעון ב-TCMK-1 (איורים 1 ו-2).
גירוי דקסמתזון. ביטוי ה-mRNA של Ppat הגיע לשיא לאחר 28 שעות לאחר גירוי עם דקסמתזון, ולאחר מכן עלה שוב לאחר 44 שעות. Hnrnpa3 הראה שיאים ב-16, 28 ו-44 שעות והראה אמפליטודות דומות יחסית ל-Per1. Npm1 הראה שיא לאחר 28 שעות, בדומה ל- Per1. Fxr1 הראה שיא ב-24 ו-44 שעות (איור 2). ביצענו ניתוח רגרסיה תקופתי כדי להעריך את המובהקות הסטטיסטית של וריאציות אלו. הניתוח הצביע על כך שהוריאציה של ביטוי ה-mRNA Cry1 ו-Bmal1 הראתה מחזוריות משמעותית (P < 0.05)="" לאחר="" טעינת="" דקסמתזון="" בתאי="" tcmk-1="" (איור="" משלים="" s1="" וטבלה="" s3="" באינטרנט).="" התוצאות="" של="" ניתוח="" רגרסיה="" תקופתי="" של="" 7="" גנים="" מוצגות="" באיור="" משלים="" s2="" ובטבלה="" s3="" באינטרנט.="" הניתוח="" הצביע="" על="" כך="" ש-fxr1="" ו-ppat="" הראו="" רגרסיה="" מובהקת="" (p=""><0.05). ברגרסיה="" של="" fxr1,="" גם="" התקופה="" וגם="" המשרעת="" הראו="" גלים="" גדולים,="" בעוד="" שב-ppat,="" גם="" התקופה="" וגם="" המשרעת="" היו="" קטנות="" והראו="" קצב="">
צביעה חיסונית של PPAT ו-FXR1 בתאים נפרוטובולריים ובכליות מחולדות WKY ו-SHRPPAT היה מקומי הן בציטופלזמה והן בגרעין. FXR1 היה מקומי רק בציטופלזמה של תאי TCMK-1 (איור 3). PPAT נצבע הן בגרעינים והן בציטופלזמה בצינוריות הפרוקסימלית והדיסטלית (איור 4). FXR1 נצבע בעיקר בציטופלזמה של הצינוריות הפרוקסימלית והדיסטלית (איור 4). לא היו הבדלים ברורים בצביעה או לוקליזציה בכליות של חולדות WKY ו-SHR.
ביטוי החלבון FXR1 ו-PPAT בכליות מחולדות WKY ו-SHRאיור 5 מציג את הספיגה המערבית של חלבוני FXR1 ו-PPAT ב-שֶׁל הַכְּלָיוֹתמדולה מחולדות WKY ו-SHR בנות 5-שבועות. השפע של חלבון FXR1 היה בשֶׁל הַכְּלָיוֹתהמדולה של חולדות SHR הייתה נמוכה משמעותית בהשוואה לחולדות WKY (P < 0.05).="" ביטוי="" החלבון="" ppat="">שֶׁל הַכְּלָיוֹתמדולה של חולדות WKY ו-SHR לא נבדלו במידה משמעותית סטטיסטית.
דִיוּןיתר לחץ דם גורם ללב וכלי דםשֶׁל הַכְּלָיוֹתסיבוכים, כגון כרונייםמחלת כליות(CKD). ידוע כי חולים עם CKD מפתחים חריגות בתנודות בלחץ הדם, דבר המצביע על כךכִּליָהעשוי להיות מעורב במקצבי לחץ דם לא תקינים ביתר לחץ דם. 19 במחקר הנוכחי, כוונתנו אפוא לזהות מולקולות האחראיות להיווצרות קצב circa-dian לחץ דם תחת שליטה של השעון הביולוגי שלכִּליָהביתר לחץ דם. השגנו 1,032 גנים מועמדים הנושאים את רצף ה-E-box ממסד הנתונים של GSEA. מכיוון שהטרודימר BMAL1/CLOCK קושר את E-box כדי לווסת את שעתוק הגנים במורד הזרם, גנים אלה נחשבים לנשלטים על ידי שעון ביולוגי ביולוגי. על מנת לזהות מולקולות המעורבות בקצב הצירקדי של לחץ הדם בכליה, חקרנו באופן מקיף את ביטוי הגנים בכליות מחולדות SHR, SHRSP ו-WKY באמצעות מיקרו-מערך DNA. בין 1,032 הגנים, בחרנו תעתיקים שעלו פי יותר מ-2-או פחתו פחות מפי 0.5-
ב-SHRכִּליָהיחסית לאלו של חולדות WKY. לאחר מכן התמקדנו בגנים שהראו מגמות דומות בתחוםכליותשל SHRSP, במיוחד, Bcl6, Nr1d1, Ppat, Tef, Fxr1, Hnrnpa3, Npm1, Nptx1, Plagl1, Plbd1, Tbl1x ו-Trim46. 12 הגנים הללו הנושאים את רצף ה-E-box, שהראו רמות ביטוי גבוהות או נמוכות יותר אצל חולדות מודל יתר לחץ דם (SHR ו-SHRSP) בהשוואה לחולדות WKY נורמוטיות, קשורים אולי לקצב הצירקדי של לחץ הדם. בין הגנים הללו, דווח כי Nr1d1 הנקרא גם Reverse erythroblastosis virus- (Rev-erb ), יוצר תת-לולאה של השעון הביולוגי. 20
אושר כי הכפפת תאים מתורבתים להעמסת דקסמתזון או הלם בסרום סוס בריכוז גבוה, שיחזרה את המשרעת של ביטוי גן השעון במבחנה. 21,22 תוספת של סרום וגלוקוקורטיקואיד בריכוז גבוה נחשבים שימושיים להתרבות של הקצב הצירקדי של ביטוי גן השעון ברקמות היקפיות. 18,23 במחקר זה, הצלחנו לגרום לאמפליטודה של גני השעון Per1, Cry1 ו-Nr1d1 mRNA in vivo עם טעינת דקסמתזון בתאי אפיתל צינורי עכברים. עם טעינת דקסמתזון, Per1 גדל ב-4, 20-24 ו-44 שעות לאחר הגירוי, Cry1 גדל ב-0-8 ו-24-32 שעות, ו-Nr1 d1 גדל ב-0- 4, 16-24 ו-40-44 שעות. שינויים אלו דומים לאלה שתוארו בדוחות קודמים. 21 באמצעות מערכת דקסמתזון זו, זיהינו אינדוקציה של אמפליטודות של 2 גנים: Fxr1 ו-Ppat. יתרה מכך, צביעה חיסונית הוכיחה ש-PPAT בא לידי ביטוי בגרעין ובציטופלזמה של הצינוריות, ו-FXR1 בא לידי ביטוי בציטופלזמה של הצינוריות. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-2 המולקולות הללו נשלטות על ידי השֶׁל הַכְּלָיוֹתשעון היקפי והם מועמדים פוטנציאליים להיווצרות קצב צירקדי של לחץ דם.
סופג מערבי גילה שביטוי החלבון של FXR1 היה נמוך יותר ב-שֶׁל הַכְּלָיוֹתמדולה של חולדות SHR מאשר בזו של חולדות WKY. הביטוי של PPAT במדולה הכלייתית של חולדות WKY ו-SHR לא היה שונה במידה משמעותית סטטיסטית. Fxr1 שייך לאותה משפחת גנים כמו גן פיגור שכלי שביר X שביר (Fmr1), הנחשב לגן הסיבתי של תסמונת ה-X השביר. FXR1 הוא חלבון קושר ל-RNA שמקיים אינטראקציה עם FMR1 ו-FXR2. ההשערה היא שניתן להחזיר את הציטופלזמה והגרעין מכיוון שיש להם אותות לוקליזציה גרעינית ואותות ייצוא גרעיניים. 24 בבני אדם, הוכח שהביטוי החריג של Fxr1 בשרירי השלד גורם לניוון שרירים פנים. 25 במחקר זה, ביטוי Fxr1 הופחת ב-כליותשל חולדות SHR ו-SHRSP ובאה לידי ביטוי בציטופלזמה צינורית ממקור מזודרמלי, שזהה לזה של שרירי השלד, ועשויה להיות מעורבת בשגשוג ובצמיחה של תאים צינוריים. PPAT יוצר הומוטטרמר בצורת סופגנייה והופך להומוטטרמר מומת על ידי קשירת נוקלאוטידים פורין כדי להשפיע על חילוף החומרים של חומצת השתן. במחקר זה, הביטוי של PPAT גדל ב-כליותשל חולדות SHR ו-SHRSP, ו-PPAT היה מקומי בציטופלזמה ובגרעין של תאים צינוריים. מכיוון שלחומצה שתן יש רעילות חזקה של כלי הדם והיא גורם סיכון עצמאי לטרשת עורקים. לפיכך, תפקוד חריג של PPAT עשוי להיות קשור למאפיינים הפתופיזיולוגיים של SHR.
מחקר זה יישם ניתוחי רצף וביטוי וניסויים בתאים מתורבתים בניסיון חדש לצמצם את המולקולות הקשורות לוויסות לחץ הדם והנשלטות על ידי השעון הביולוגי. יתר על כן, Fxr1 ו-Ppat נשלטים על ידי השעון הביולוגי וקשורים לוויסות לחץ הדם. יש צורך במחקרים נוספים כדי למדוד ולאשר את השונות הזמנית של ביטוי הגנים Fxr1 ו-Ppat בחולדהכִּליָה.צפוי כי יתבררו מנגנוני הפעולה של מולקולות אלו. השליטה במולקולות אלו נחשבת מטרה לטיפול ביולוגי בהפרעות בתנודות בלחץ הדם.
בהתבסס על ממצאי המחקר הנוכחי, לולאת משוב צירקדית אפשרית ב-כִּליָהמ-SHR מוצג באיור 6. ל-PPAT ול-FXR1 יש EBOX שבו BMAL1 ו-CLOCK נקשרים למקדם, מה שמצביע על כך שהם מעורבים ביצירת קצב יממה באבובות תחת שליטה של גני שעון. נחשב כי הם מעורבים בספיגה מחדש והפרשה של מים ואלקטרוליטים באבוביות, וכי הם עלולים להשפיע על יתר לחץ דם ועל קצב לחץ הדם הצירקדי.
לפיכך, PPAT ו-FXR1 נחשבו למולקולות המעורבות ביצירת קצב צירקדי של לחץ הדם ב-כִּליָה. בכל הנוגע למנגנוני ויסות לחץ הדם, מולקולות אלו מהוות מועמדות מובילות למחקרים המבקשים להבהיר את המנגנונים העומדים בבסיס היווצרות קצב לחץ הדם הצירקדי.
