MicroRNAs מעצבים חסינות חברתית: יעד פוטנציאלי לבקרה ביולוגית של טרמיט Reticulitermes Chinensis

תַקצִיר

חרקים יוסוציאליים יכולים להשתמש בהגנות שונות של מחלות התנהגותיות ופיזיולוגיות כדי להימנע, להתנגד ולסבול זיהומים פתוגנים במושבות הקרובות והדחוסות שלהם, המכונה חסינות חברתית. מחקרים עדכניים הראו שמספר מולקולות משרתות חסינות חברתית של חרקים, כולל ריחות כימיים, ארס חרקים, חלבונים הקשורים למערכת החיסון וכו'. עם זאת, האם וכיצד מיקרו-RNA (miRNAs), שמבשריהם מעובדים על ידי Dicer-1, מניעים את החברתיים חסינות במושבות חרקים עדיין לא ידועה. כאן, השתמשנו במערכת 'מארח-פתוגן' (מארח: Reticulitermes chinensis; פתוגן: Metarhizium anisopliae) כדי לחקור את ההשפעה של מירנאים על חסינות חברתית במושבות טרמיטים. מצאנו שהשתקה בתיווך RNAi של Dicer-1 הובילה לירידה בריכוז ה-miRNA עיכבה משמעותית את חילוף החומרים של פחמימות ואנרגיה, והשפיעה על תהליכי חיים אחרים, כגון התגובה החיסונית ותגובות חמצון-הפחתה, בכל הגוף של הטרמיט. . בהגנה התנהגותית, השתקת Dicer-1 הפחיתה באופן משמעותי התנהגויות חברתיות מתגוננות כמו תנועה, טיפוח, קניבליזם וקבורה בקבוצות טרמיטים כאשר נתקלו בזיהום פטרייתי. בהגנה פיזיולוגית, השתקת Dicer-1 וגירוי miR- 71-5 הביאו לירידה משמעותית בפעילות האנטי-פטרייתית של טרמיטים. יתרה מזאת, קבוצות טרמיטים שטופלו בחומרים ממריצים של Dicer-1- והן ב-miR-71-5 הראו רמה גבוהה של תמותה במהלך זיהום פטרייתי. הממצאים שלנו הדגימו את התפקיד החשוב של מירנאים בעיצוב חסינות חברתית במושבות טרמיטים, תוך מתן תובנות הדרושות להבנת המנגנונים הפוטנציאליים העומדים בבסיס ההגנה על מחלות התנהגותיות ופיזיולוגיות בחרקים, ומכאן הנחת היסוד להדברת מזיקים מבוססת miRNA.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

מילות מפתח חרק יוסוציאלי · פטריות אנטומפתוגניות · הגנת מחלות · Dicer-1 · miR-71-5

מסר מפתח

• miRNAs תיווכו ביטויי גנים הקשורים למערכות חיסון חברתיות.

• miRNAs השפיעו על הגנת המחלה ההתנהגותית בקבוצות טרמיטים.

• miRNAs השפיעו על ההגנה על המחלה הפיזיולוגית אצל יחידי טרמיטים.

• קוטלי טרמיטים מבוססי miRNA יכולים להיחשב כגישה חדשה להדברה ביולוגית.

מבוא

טרמיטים הם מזיקים חשובים מבחינה כלכלית, בעלות של 30 מיליארד דולר ברחבי העולם, וגורמים נזק עולמי לגידולים, עצים, מבני עץ וחומרי תאית. חומרי הדברה כימיים מספקים שדרת הדברה יעילה למזיקי טרמיטים, אך הם גם יוצרים בעיות חמורות, המאיימות על בריאות האדם והסביבה. בקרה ביולוגית היא חלופה חשובה שיכולה לטפל בבעיות אלו. מספר אנטומפתוגנים, כגון Metarhizium ו-Beauveria, יושמו בהצלחה להדברה ביולוגית, שהיא סבירה ויעילה (Verma et al. 2009; Kumar and Upadhyay 2021). עם זאת, ההדברה הביולוגית של טרמיטים אינה מספקת, בעיקר בשל הגנות המחלה הייחודיות במושבות טרמיטים. טרמיטים, בהיותם חרקים איוסוציאליים, פיתחו הגנות התנהגותיות ופיזיולוגיות אינדיבידואליות קולקטיביות כדי לנטרל את הסיכון הגבוה להתפשטות של פתוגנים מדבקים בקרב בני קן צפופים וקרובים (המכונה 'חסינות חברתית') (Van Meyel et al. 2018; Liu et al. . 2019א). מתועד היטב כי טרמיטים פורסים רפרטואר רחב של הגנות התנהגותיות: הימנעות היא קו ההגנה הראשון ועוזרת למנוע כניסת טרמיטים לאזורים מזוהמים (Yanagawa et al. 2015); התנהגות אזעקה מוצגת בתנועה נדנדת אורכית מהירה כדי להזהיר בני קן על נוכחות פתוגנים (Rosengaus et al. 1999); טיפוח כלפי בני קן מזוהמים עם פתוגנים יכול להסיר ביעילות פתוגנים מציפורני הציפורן של הקן (Liu et al. 2019b); קבורה והתנהגויות קניבליסטיות מגבילות העברת פתוגנים מגופות לבני קן רגישים (Sun et al. 2016). תגובות פיזיולוגיות כגון תגובות חיסוניות ותגובות חמצון-הפחתה משרתות גם הגנה על מחלת טרמיטים. התגובות החיסוניות כוללות פפטידים אנטי-מיקרוביאליים בתיווך חסינות הומורלית (AMPs) ופגוציטוזיס ואנקפסולציה בתיווך חסינות תאית, המסוגלים לעכב את השכפול וההפצה של פתוגנים בחלל הגוף של החרקים (Hussain et al. 2013; Liu et al. 2015; Lopez-Uribe et al. 2016; Hong et al. 2018). תגובות חמצון-הפחתות מפחיתות את הנזק שנגרם על ידי רעלים ומיני חמצן תגובתיים (ROS) במהלך זיהומים פתוגנים, תורמות לסבילות לחרקים (Liu et al. 2015; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). בנוסף, מחקרים קודמים על הגנת מחלות טרמיטים הראו שחלק מסימביונטות המעיים היו מרכיב חשוב בהגנה הפיזיולוגית של המארח (Rosengaus et al. 2014). ניתן להשתמש בכמה AMPs כחומרי חיטוי חיצוניים על פני הציפורן ובחומרי הקן, כאשר הם בשילוב עם התנהגויות כגון טיפוח וקינון (Bulmer et al. 2009; Hamilton and Bulmer 2012). לכן, החלשת ההגנה ההתנהגותית והפיזיולוגית של טרמיטים עשויה להיות הצעד המרכזי לשיפור השפעת השליטה הביולוגית של טרמיטים.

יתרונות cistanche לגברים - מחזקים את המערכת החיסונית

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

הבסיס המולקולרי של חסינות חברתית דווח במספר הולך וגדל של מחקרים. מספר מולקולות, כולל ריחות כימיים, הפרשות חיצוניות, אנטיביוטיקה, חלבונים חיסוניים וכימורצפטורים המשרתים הגנות התנהגותיות ופיזיולוגיות של חרקים, זוהו על ידי מספר טכניקות אומיקה וכרומטוגרפיה של גז/נוזל-ספקטרומטריית מסה (Seipke et al. 2011; Hussain et al. 2013; Terrapon et al. 2014; Liu et al. 2015; Sun et al. 2016; He et al. 2018). בקבוצות טרמיטים, ריח מעופש מפתוגנים גורם להתנהגות טיפוח משופרת (Yanagawa et al. 2011). רמזים למוות מגופות טרמיטים מעוררים קניבליזם או התנהגויות קבורה (Sun et al. 2016). הפרשות חיצוניות מבלוטות הרוק והפרונטאליות ופעילות אנטי-מיקרוביאלית בתיווך מיקרואורגניזמים מועילים עוזרות לטרמיטים להגן על עצמם, בני קן ואפילו מושבות (Bulmer et al. 2009; Rosengaus et al. 2000, 2014; Chouvenc et al. 2013). עבור המנגנונים הגנטיים והביוכימיים המניעים חסינות חברתית של חרקים, ניתן להשתמש בטכנולוגיות RNAi ועריכת גנים. בטרמיטים, השתקה מתווכת RNAi של הגנים טרמיצין, חלבון מקשר גרם שלילי 2 (GNBP2), חלבון קושר סלניום וטרנסגלוטמינאז (TG) הוכחה כמפחיתה משמעותית את הפעילות האנטי-פטרייתית של טרמיטים ומכאן מגבירה את תמותת הזיהומים (המילטון). ו-Bulmer 2012; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). Isocitrate dehydrogenase (IDH) יכול להשפיע על חילוף החומרים של טרמיטים, וחוסר הוויסות שלו גורם לנגעים אפופטוטיים מוגברים, מה שמוביל לרמות גבוהות של זיהומים ותמותה (Liu et al. 2020). בנוסף, GNBP2 ו-TG משרתים גם את ההגנה ההתנהגותית של טרמיטים, המשפיעים על התנהגויות קניבליסטיות וטיפוח, בהתאמה (Zhao et al. 2020; Esparza-Mora et al. 2020). עם זאת, הבסיס המולקולרי של חסינות חברתית טרם הובן בבירור, במיוחד המנגנון המולקולרי המניע את ההתנהגויות החברתיות המסובכות בתגובה לפתוגנים מדבקים. יתר על כן, המנגנון הגנטי והביוכימי של חסינות חברתית מתמקד ב-RNA המקודד המניע את החסינות החברתית של חרקים, אך עדיין לא ברור האם RNAs לא מקודדים כגון miRNAs לוקחים חלק בוויסות החסינות החברתית של חרקים.

Dicer-1, אנדונוקלאז של RNase III, חיוני לשלב הסופי של הביוסינתזה של מירנה. miRNAs הם אנדוגניים, 18-25 nt, RNAs שאינם מקודדים המווסתים לרעה את ביטוי הגנים ברמה שלאחר התמלול על ידי זיווג בסיסים בין אזור הזרע ב-miRNAs לאזור התואם ב-mRNAs מטרה (Gomez-Orte and Belles 2009; Wang et al. 2013; Yang et al. 2014; Lucas et al. 2015). מכיוון שייצור ה-miRNA תלוי ב-Dicer-1, ניתן לחקור את הפונקציות של ה-miRNAs בוויסות התהליכים הביולוגיים של חרקים על-ידי הפסדים תפקודיים של Dicer-1. על ידי שימוש במוטציות Dicer-1 של זבובי פירות, הוכח כי miRNAs מתפקדים בעובר ובמורפוגנזה של נוירוני ריח (Lee et al. 2004; Berdnik et al. 2008). על ידי השתקה בתיווך RNAi של Dicer-1, חוקרים אימתו ש-miRNAs ממלאים תפקיד מפתח בוויסות תהליכי התפתחות במטמורפוזה של חרקים, כמו אלה בג'וקים וארבה (Gomez-Orte et al. 2009; Wang et al. 2013). יתר על כן, miRNAs מעורבים גם בוויסות התנהגויות של חרקים. miR-8 ו-miR-429 מסדירים את התנהגות הטיפוס הנגרמת על ידי וירוסים בתולעי כותנה על ידי שליטה ישירה בביטוי BrZ2 (Zhang et al. 2018). miR-133 מווסת את סינתזת הדופמין ומכאן מעכב צבירה התנהגותית בארבה (Yang et al. 2014). בהתבסס על עדויות כאלה לתפקוד של מירנאים בפיזיולוגיה והתנהגות של חרקים, מטרתנו לקבוע את ההשפעה של מירנאים על הפיזיולוגיה וההתנהגות של טרמיטים המעורבים בחסינות חברתית על ידי שימוש במערכת 'מארח-פתוגן' (מארח: Reticulitermes chinensis; פתוגן: Metarhizium anisopliae). המחקר שלנו כלל בעיקר שלושה היבטים של המחקר על חסינות חברתית: ההשפעה של miRNAs על (1) מולקולות in vivo המניעות חסינות חברתית; (2) התגובה ההגנתית ההתנהגותית, כגון תנועה באזורים מזוהמים בפטריות, טיפוח כלפי בני קן מזוהמים בפטריות וקניבליזם/קבורה כלפי גופות מזוהמות בפטריות; ו (3) תגובת ההגנה הפיזיולוגית, כגון פעילות אנטי פטרייתית. יתר על כן, בדקנו את ההשפעה של חוסר ויסות מירנא על התמותה של טרמיטים מזוהמים בפטריות כדי להעריך את ההשפעה של מירנאים על הבקרה הביולוגית של הטרמיטים. המחקר שלנו חשף את המנגנון הפוטנציאלי העומד בבסיס ההגנה על מחלות התנהגותיות ופיזיולוגיות ומטרות חדשות להדברת מזיקים.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

חומר ושיטות

טרמיטים

כל הטרמיטים הניסויים במחקר שלנו היו עובדים של הטרמיט R. chinensis. הם נאספו מגבעת שיזי בעיר ווהאן, מחוז הוביי, סין. טרמיטים גודלו במיכלי פלסטיק (40×20×20 ס"מ) המכילים גושי אורן קטנים במעבדה בטמפרטורה של 25±1 מעלות, 80% לחות יחסית ו-24 שעות חושך.

אנטומפטוגנים, טרמיטים מזוהמים וגופות

הפטרייה האנטומפתוגנית M. anisopliae (זן IBCCM321.93) תורבת על אגר תפוחי אדמה דקסטרוז (PDA) במשך שבועיים ב-25±1 מעלות, 80% לחות יחסית ו-24 שעות של חושך. הקונידיות הפטרייתיות הושעו באמצעות 1% Tween 80 ואוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות למשך 3-4 שבועות לכל היותר. לפני כל ניסוי נבדקה תרחיף הקונידיאלי לנביטה. מצאנו שלתרחיף הקונידיאלי המשמש לזיהום טרמיטים היה שיעור נביטה של ​​יותר מ-90%. כדי להכין טרמיטים מזוהמים בפטריות, הבטן של טרמיטים זוהמה על ידי טיפת 0.3 μL של תרחיף קונידיאלי (108 conidia/mL) באמצעות פיפטה (0.1-2.5 μL, Transferpette). לאחר מכן, טרמיטים המזוהמים בפטרייה הוחזרו מיד בקירור של 4 מעלות למשך שעה אחת כדי לעכב את תנועתם לזרז קונידיות פטרייתיות על הציפורניים שלהם (Liu et al. 2015). כדי להכין גופות מזוהמות בפטריות, טרמיטים נאספו בשפופרת צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ולאחר מכן הוקפאו בחנקן נוזלי למשך 20 שניות כדי להרוג את הטרמיטים. הגופות הוטבלו בתרחיף הקונידיאלי (108 conidia/mL) ולאחר מכן הונחו בצלחת פטרי סטרילית עם נייר סינון לח למשך 0 ו-2 ד' של טיפוח (Sun et al. 2016).

סינתזה של dsRNA וסימולנט ה-miRNA

קטע Dicer-1 (1697 bp; חומר משלים 1-Text S1) הוגבר על ידי פריימרים ספציפיים (קדימה: 5'-CTG CGA CAG ATC ATT GCA CG-3′; הפוך: 5' -CAC TGG CTG TTT TGG CAC TC-3′), ומוצרי ה-PCR שלהם טוהרו באמצעות AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit (Axygen Scientific, ארה"ב), משובט לתוך וקטור pMD 18-T (TaKaRa, יפן) ולאחר מכן עבר טרנספורמציה באמצעות תא DH5 מוכשר מבחינה כימית (Tsingke Biotechnology, סין). מושבה בודדת ממדיום מרק ליזוגניה (LB) עם אמפיצילין נשלחה ל- Tsingke Biotechnology Co. Ltd לביצוע רצף. יישור הרצף הראה שהקטע שלנו היה Dicer-1. רצף מקדם T7 (5'-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3') נוסף לקצה 5' של פריימרי ההגברה של Dicer-1 (519 bp; קדימה: 5' -GTG ATG CTG GAG TTG GGT TT-3′; הפוך: 5′-AGA ATG AGT CGC CCA ATG TC-3′) ו-GFP (467 bp; קדימה: 5'-CTT GAA GAC CTT GAT GCC-3′; הפוך: 5′-TGG TCC CAA TTC TCG TGG AAC- 3′) תבניות dsRNA (חומר משלים 1-Text S1). תוצרי ה-PCR של תבניות ה-dsRNA חולצו עם הידרוקסיבנזן/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (25:24:1) (Solarbio, סין). dsRNA נוצר באמצעות ערכת תמלול T7 RNAi (Vazyme Biotech, סין) ולאחר מכן טוהר על ידי הידרוקסיבנזן/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (50:49:1) (Solarbio). לבסוף, ה-dsRNA הוערך באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל agarose ו-NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, ארה"ב) ואוחסן ב-80 מעלות.

סימולנט miR-71-5 היה RNA דו-גדילי קטן שתוכנן לפי רצף miR-71-5 (21 nt, חומר משלים 1-טקסט S1). התבנית של הסימולנט miR-71-5 כללה שני DNA דו-גדיליים המכילים את מקדם T7: אחד נוצר על ידי אוליגונוקלאוטיד A1 (5'-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAA A -3′) ואוליגונוקלאוטיד A2 (5'-TTT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) באמצעות PCR של מגע; השני נוצר על ידי אוליגונוקלאוטיד B1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAA A-3′) ואוליגונוקלאוטיד B2 (5'-TTT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) באמצעות PCR לנגיעה. סימולנט בקרה תוכנן לפי רצף ה-GFP (19 nt, חומר משלים 1-טקסט S1). התבנית של סימולנט הבקרה נרכשה גם על ידי שני DNA דו-גדילים המכילים את פרומוטור T7: אחד נוצר על ידי אוליגונוקלאוטיד C1 (5'-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG CAA GCT GAC CCT GAA GTT AA{{33} }′) ואוליגונוקלאוטיד C2 (5′-TTA ACT TCA GGG TCA GCT TGC CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′) באמצעות PCR מגע; השני נוצר על ידי אוליגונוקלאוטיד D1 (5'-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACT TCA GGG TCA GCT TGC AA-3') ואוליגונוקלאוטיד D2 (5'-TTG CAA GCT GAC CCT GAA GTT CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′) באמצעות PCR לנגיעה. הסימולנטים של ה-miR-71-5 והבקרה נוצרו באמצעות ערכת תעתוק RNAi T7 ולאחר מכן חולצו על ידי הידרוקסיבנזן/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול (50:49:1). התמצית הוערכה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל agarose ו-NanoDrop 2000 ואוחסנה ב-80 מעלות.

יתרונות cistanche לגברים - מחזקים את המערכת החיסונית

האכלת dsRNA

טרמיטים הורעבו במשך 12 שעות לפני האכלה (Zhou et al. 2008; Hamilton and Bulmer 2012). סך של 18 טרמיטים הונחו בצלחת פטרי תא (D =35 מ"מ) עם פיסת נייר סינון (D =18 מ"מ) שהורטבה על ידי 60 μL של מים ללא RNase המכילים 80 ug. dsDicer-1, 80 ug dsGFP, 60 ug miRNA סימולנט או סימולנט שליטה של ​​60 ug. עבור בדיקות ביולוגיות להאכלה של Dicer-1 dsRNA, הטרמיטים הורשו לבלוע את הנייר הלח במשך 24 שעות לפני הניסויים. טרמיטים שטופלו ב-GFP נחשבו כבקרות. עבור בדיקות ביולוגיות של הזנה סימולנטיות של מירנה, הטרמיטים הורשו לבלוע את הנייר הלח במשך 48 שעות לפני הניסויים. טרמיטים שטופלו בסימולנטים נחשבו כבקרות.

RT-qPCR

חמישה או שישה שכפולים משלוש מושבות שימשו לביטוי גנים באמצעות RT-qPCR. שלושה טרמיטים לכל שכפול לכל טיפול אספו למיצוי RNA כולל באמצעות ערכת Direct-zol™ RNA Miniprep (Zymo Research, ארה"ב). הטוהר והריכוז של ה-RNA המופק נקבעו באמצעות NanoDrop 2000. ה-RNA הומר ל-cDNA באמצעות PrimeScript™ RT Reagent Kit עם gDNA Eraser (זמן אמת מושלם) (Takara, יפן). RT-qPCR בוצע עם QuantStudio™3 Real-Time PCR System (Thermo Scientific) באמצעות ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech). הפריימרים הספציפיים מפורטים בחומר משלים 2-טבלה S1.

ריכוז מירנה

שש שכפולים משלוש מושבות שימשו לקביעת ריכוז ה-miRNAs באמצעות ערכת MiPure Cell/Tissue miRNA (Vazyme Biotech, סין). שלושה טרמיטים לכל שכפול לכל טיפול נאספו עבור miRNAs. הטוהר והריכוז של ה-miRNA שחולצו נקבעו באמצעות NanoDrop 2000.

רצף דה נובו וניתוח תעתיק עבור

Fifteen termites from three colonies per treatment were pooled for total RNA extraction using TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, USA). The concentration, quality, and integrity of the total RNA were determined using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific). Sequencing libraries were generated using the TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina, USA) and sequenced on a HiSeq platform (Illumina) by Shanghai Personal Biotechnology Cp. Ltd. (China). Sequencing data were filtered by Cutadapt (v1.15) software. For the transcriptome sequencing project without a reference genome, Trinity (v2.5.1) software was used to montage clean reads for the transcripts for later analysis. NR (NCBI non-redundant protein sequences), GO (Gene Ontology), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome), Egg NOG (Evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups), and Swiss-Prot databases were used for gene functional annotation. Furthermore, DESeq (1.30.0) was used to analyze the differentially expressed genes under the condition of |log2FoldChange(FC)|>1 ועמ'<0.05. The genes were then mapped to GO terms, and the terms with significant enrichment were calculated by hypergeometric distribution under the condition of p<0.05 to reveal the possible functions of the candidate genes. Additionally, the genes were mapped to KEGG pathways to determine their possible functions. 

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

תְנוּעָה

נותחו תשעה עותקים משלוש מושבות כדי להשוות את מרחק התנועה של טרמיטים מושתקים של Dicer-1- לעומת טרמיטים שטופלו ב-GFP. לאחר יום אחד של האכלה דרך הפה של dsDicer-1 או dsGFP, טרמיט אחד לכל שכפול לכל טיפול הונח בצלחת פטרי תא חדשה (D =90 מ"מ) עם פיסת נייר סינון שהורטבה על ידי התרחיף הקונידיאלי. (108 קונידיות/ מ"ל). לאחר מכן, השתמשנו בטוש שחור כדי לעקוב אחר תנועת הטרמיט על מכסה שקוף למשך 10 שניות. מרחק התנועה נמדד באמצעות נייר רשת (1×1 מ"מ).

טיפוח

נותחו תשעה עותקים משלוש מושבות כדי להשוות את מספר התנהגויות הטיפוח בין הטרמיטים המושתקים של Dicer- 1-לטרמיטים שטופלו ב-GFP. לאחר יום אחד של האכלה דרך הפה של dsDicer-1 או dsGFP, שלושה טרמיטים לכל שכפול לכל טיפול הונחו בצלחת פטרי תא חדשה (D =35 מ"מ) עם פיסת נייר סינון לח (D{{ 4}} מ"מ) ולאחר מכן מזוהם בקונידיות פטרייתיות (108 קונידיות/מ"ל). התנהגויות תועדו בווידאו במשך 15 דקות באמצעות מצלמת HD דיגיטלית (SONY, יפן). הסרטונים נסרקו כל 10 שניות כדי לראות אם התנהגויות טיפוח (פיות טרמיטים כלפי גופות קן) התרחשו בין טרמיטים מזוהמים בפטריות.

קָנִיבָּלִיוּת

תשעה שכפולים משלוש מושבות נותחו עבור ההשפעה של Dicer{{0}} לעומת GFP על ההתנהגות הקניבליסטית כלפי גופות מזוהמות בפטריות. שישה טרמיטים לכל שכפול לכל טיפול הונחו בצלחת פטרי תא (D=35 מ"מ) עם פיסת נייר סינון לח (D=18 מ"מ) המכילה dsDicer-1 או dsGFP. הם הורשו יום אחד של האכלה פומית של dsRNA, ולאחר מכן, גופה אחת מזוהמת בפטרייה שהודגרה במשך 0 ד' הונחה לתוך צלחת הפטרי התא, שם גודלו ששת הטרמיטים שטופלו. לאחר יום אחד של גידול משותף, הגופה המזוהמת בפטריות נאכלה לחלוטין (ציון מבחן גבוה=2), נאכלה חלקית (ציון מבחן נמוך=1), או שלא נאכלה (ללא ציון מבחן{{10 }}) (חומר משלים 1-איור S1) על ידי ששת הטרמיטים.

קְבוּרָה

תשעה עותקים משתי מושבות נותחו לגבי ההשפעה של Dicer-1 לעומת GFP על התנהגות הקבורה של גופות מזוהמות בפטריות. שישה טרמיטים לכל שכפול לכל טיפול הונחו בצלחת פטרי תא (D=35 מ"מ) עם פיסת נייר סינון לח (D=18 מ"מ) המכילה dsDicer-1 או dsGFP. הם הורשו יום אחד של האכלה פומית של dsRNA. לאחר מכן, גופה אחת מזוהמת בפטרייה הודגרה למשך 2 ימים, ונוספה אדמה לצלחת הפטרי שבה גידלו ששת הטרמיטים המטופלים. לאחר יום אחד של גידול משותף, הגופה המזוהמת בפטרייה נקברה לחלוטין (ציון מבחן גבוה=2), נקברה חלקית (ציון מבחן נמוך=1), או לא נקברה (ללא ציון מבחן{{10 }}) (חומר משלים 1-איור S2) על ידי ששת הטרמיטים.

פעילות אנטי פטרייתית

שישה שכפולים משלוש מושבות נותחו לגבי ההשפעה של Dicer{{0}} ו-miR-71-5 על יכולתם של טרמיטים לעכב צמיחה פטרייתית. חמישה טרמיטים לכל שכפול לכל טיפול אספו ונגרסו באמצעות חנקן נוזלי ולאחר מכן הומסו ב-100 μL של 0.9% תמיסת מלח. ההומוגנית עברה צנטריפוגה ב-6000×g למשך חמש דקות ב-4 מעלות כדי להניב 80 μL של סופרנטנט. לאחר מכן, הסופרנטנט היה צנטריפוגה שוב כדי להניב 50 μL של supernatant. לפעילות אנטי-פטרייתית, נעשה שימוש במיקרו-לוחית 96-בבאר למדידת הספיגה של דגימות, בקרות גדילה וחסרים סטנדרטיים כדי לחשב את הפחתת הגידול הפטרייתי: (1) 50 μL של דקסטרוז תפוחי אדמה (PD), 2 μL של conidia פטרייתי (108 conidia/mL), ו-5 μL של supernatant לבאר היו מעורבבים עבור הדגימה; (2) 50 μL של תפוחי אדמה דקסטרוז (PD), 2 μL של conidia פטרייתי (108conidia/mL), ו-5 μL של 0.9% תמיסת מלח לבאר היו מעורבים עבור בקרת הצמיחה הפטרייתית; (3) 50 μL של דקסטרוז תפוחי אדמה (PD) ו-7 μL של תמיסת מלח 0.9% לבאר היו מעורבים עבור הריק הסטנדרטי. לאחר 24 שעות של טיפוח במנערת טמפרטורה קבועה (150 סל"ד ב-25 ± 1 מעלות), בוצעה המדידה בספקטרופוטומטר של מיקרו-פלט (600 ננומטר; Thermo Scientific).

הישרדות

כדי לקבוע את ההשפעה של האכלה פומית של dsDicer-1 על הישרדות טרמיטים, טרמיטים משלוש מושבות נפרסו כדי לקבוע את ההישרדות של Dicer-1-מושתק (42 טרמיטים בסך הכל, 14 טרמיטים לכל מושבה) ו-GFP- מטופלים (42 טרמיטים בסך הכל, 14 טרמיטים לכל מושבה) טרמיטים במהלך זיהום פטרייתי. עבור ביקורת, 56 טרמיטים משתי מושבות נפרסו כדי לקבוע את הישרדותם של Dicer-1-מושתק (28 טרמיטים בסך הכל, 14 טרמיטים לכל מושבה) וטרמיטים שטופלו ב-GFP (28 טרמיטים בסך הכל, 14 טרמיטים לכל מושבה). בעת ביצוע הניסויים, שבעה טרמיטים גידלו בצלחת פטרי תא (D =35 מ"מ) עם פיסת נייר סינון (D =18 מ"מ) שהורטבה במים נטולי RNase המכילים dsDicer{{17} } או dsGFP, בעוד שהטרמיטים היו מזוהמים בפטריות ואז גודלו במשך עשרה ימים לצורך תצפית יומית על הישרדותם. כדי לקבוע את ההשפעה של האכלה פומית של סימולנט miR-71-5 על הישרדות טרמיטים, טרמיטים משלוש מושבות נפרסו כדי לקבוע את הישרדות ה-miR-71-5 (42 טרמיטים בסך הכל, 14 טרמיטים לכל מושבה) ובקרה ( 42 טרמיטים בסך הכל, 14 טרמיטים לכל מושבה) טרמיטים שטופלו בסימולנט במהלך זיהום פטרייתי. בנוסף, 56 טרמיטים משתי מושבות נפרסו כדי לקבוע את ההישרדות של miR- 71-5 (28 טרמיטים בסך הכל, 14 טרמיטים לכל מושבה) ובקרה (28 טרמיטים בסך הכל, 14 טרמיטים לכל מושבה) טרמיטים שטופלו בסימולנט. בעת ביצוע הניסויים, שבעה טרמיטים גידלו בצלחת פטרי תא (D=35 מ"מ) עם פיסת נייר סינון (D=18 מ"מ) שהורטבה במים נטולי RNase המכילים miR{{35} } סימולנט או סימולנט בקרה. לאחר יומיים של האכלה דרך הפה, טרמיטים זוהמו בפטרייה ולאחר מכן גודלו במשך עשרה ימים לצורך תצפית יומית על הישרדותם. טרמיטים מתים הוסרו בזמן.

ניתוח סטטיסטי

כל ניתוחי הנתונים נערכו ב-IBM SPSS, גרסה 19. מבחן Shapiro–Wilk שימש כדי לזהות אם מערכי הנתונים הופצו נורמלי. בהתחשב בכך שביטוי הגנים, קניבליזם ונתוני הקבורה הופצו בצורה לא תקינה, נעשה שימוש בבדיקת Wilcoxon. לחלופין, נתונים מריכוז ה-miRNA, התנועה, הטיפוח והפעילות האנטי-פטרייתית הופצו באופן נורמלי, והשתמשו במבחן t מצמד. ההישרדות נותחה בשיטת קפלן-מאייר עבור תוחלת החיים בתנאי הטיפול השונים. רמת המובהקות הייתה p<0.05 in this study.

תוצאות

פרופיל ביטוי mRNA של טרמיטים מושתקים של Dicer-1

כדי לקבוע את ההשפעה של Dicer{{0}} על פרופיל ביטוי הגנים של טרמיטים, בוצע רצף mRNA של טרמיטים מושתקים של Dicer-1-. לאחר יום אחד של האכלה דרך הפה של dsDicer-1, ביטוי Dicer-1 (איור 1A; n=6, p <0.05; מבחן Wilcoxon) ומכאן ריכוז ה-miRNA (איור 1B; df =5, עמ'<0.05; paired t-test) were significantly decreased in termites. A total of 1262 mRNAs were significantly altered in the whole bodies of Dicer-1-silenced termites (upregulated: 562 mRNAs; downregulated: 700 mRNAs; Fig. 1C and Supplementary material 2-Table S2). The differentially expressed genes (DEGs) were mapped to the salivary secretion, glycolysis, citrate cycle, and 29 other KEGG pathways (Fig. 1D–F and Supplementary material 2-Table S3). In addition, the DEGs were clustered into the ATP generation from ADP, structural constituent of the cuticle, defense response, glutathione transferase activity, oxidation–reduction process, and 171 other GO terms (Fig. 2 and Supplementary material 2-Table S4).

איור 1 פרופיל ביטוי גנים בכל גופם של טרמיטים-1-מורשי Dicer. ביטוי של Dicer-1. הנתונים מוצגים כממוצע±SEM. *עמ'<0.05. B The concentration of miRNAs. The data are shown as the mean±SEM. *p<0.05. C The number of diferentially expressed genes (DEGs). D The DEGs mapped to salivary secretion. ATP1B, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta; ATP2B, Plasma membrane calcium-transporting ATPase 1; PKC, Protein kinase C alpha type; CALM, Calmodulin-like protein; LYZ, Lysozyme C. E The DEGs mapped to glycolysis. GPI, Glucose-6-phosphate isomerase; PFKC, ATP-dependent 6-phosphor fructokinase; TIM, Triosephosphate isomerase; GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; PGK, Phosphoglycerate kinase; MINPP1, Multiple inositol polyphosphate phosphatase 1; GPMA, 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase; ENO, Enolase. F DEGs mapped to citrate cycle. PCK, phosphoenolpyru vate carboxykinase [GTP]; PYC, pyruvate carboxylase; MDH1, malate dehydrogenase; SUCD, succinate–CoA ligase [ADP-forming]. Red letters indicate upregulation; blue letters indicate downregulation

איור 2 מפות חום של DEG מקובצות במונחי GO הקשורים להגנה. דור ATP מ-ADP. B מרכיב מבני של הציפורן. ג תגובת ההגנה. D פעילות גלוטתיון טרנספראז. E תהליך חימצון-הפחתת

אימות RT–qPCR של DEGs מ-mRNA-seq

הגליקוליזה, מחזור הציטראט ויצירת ATP מ-ADP היו קשורים לחילוף החומרים של פחמימות ואנרגיה, שבהם שמונה DEGs (גליצראלדהיד{{0}}פוספט דהידרוגנאז, 2,3-תלוי פוספוגליצראט תלוי פוספוגליצראט, אנולאז, טריוזפוספט איזומראז, 6-תלוי ATP, פוספופרוקטוקינאז, phosphoenolpyru vate carboxykinase [GTP], succinate-CoA ligase [ADP יוצר] תת-יחידה אלפא-2, ו-malate dehydrogenase) אומתו ככאלה שהורדו בצורה משמעותית השתקה -1 (איור 3A–H; n=6, p < 0.05; מבחן Wilcoxon), המצביע על הפרעות של גליקוליזה, מחזור הציטראט, יצירת ATP, ומכאן חילוף החומרים של פחמימות ואנרגיה בכל הגוף של Dicer-1-השתיקו טרמיטים. DEGs (דפנסין וטרמיניצין) בתגובת ההגנה מקודדים AMPs. ביטוי של גנים אלה גדל באופן משמעותי בטרמיטים מושתקים של Dicer-1- בהשוואה לזה בטרמיטים שטופלו ב-GFP (איור 3I, J; n=5 או 6, p<0.05; Wilcoxon test). In the oxidation–reduction process, cytochrome P450 9e2 and peroxiredoxin-4 were significantly altered after Dicer-1 silencing in termites (Fig. 3K, L; n = 6, p<0.05; Wilcoxon test). These results implied an important effect of Dicer-1 on the immune response and oxidation–reduction reaction in whole-body of the termites. The effect of Dicer‑1 on behavioural disease defences in termite groups 

כדי לקבוע את ההשפעה של Dicer-1 על התגובה ההתנהגותית לזיהום פטרייתי, בדקנו ארבע הגנות התנהגותיות חשובות, תנועה, טיפוח, קניבליזם וקבורה, בטרמיטים מושתקים של Dicer-1-. התוצאות שלנו הראו שתנועה (איור 4A, t=7.013, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S3 and Video S1), grooming (Fig. 4B, t=5.949, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S4 and Video S2), cannibalistic (Fig. 4C, n =9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S1 and Video S3) and burial (Fig. 4D; n=9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S2 and Video S4) behaviors were significantly reduced in Dicer-1-silenced termites compared to GFP-treated termites, suggesting an important role of Dicer-1 in driving behavioral disease defenses in termite colonies.

איור 3 אימות RT-qPCR של DEG מ-mRNA-seq. A-H גנים הקשורים לחילוף חומרים של פחמימות ואנרגיה. גנים I-J הקשורים לתגובה חיסונית. K-L גנים הקשורים לתגובות חמצון-צמצום. הנתונים מוצגים כממוצע±SEM. *עמ'<0.05

ההשפעה של Dicer-1 ו-miR-71-5 על יכולות אנטי-פטרייתיות בטרמיטים

כדי לקבוע את ההשפעה של miRNAs על התגובה הפיזיולוגית לזיהום פטרייתי, בדקנו את כלל הפעילויות האנטי-פטרייתיות של הטרמיטים המושתקים של Dicer-1-. התוצאות שלנו הראו שהפעילות האנטי-פטרייתית ירדה באופן משמעותי (איור 5A; t=-3.046, df=5, p<0.05; paired t-test) in Dicer-1-silenced termites. Furthermore, miR-71-5 was selected for further testing to determine its role in physiological defense, which was chosen according to the comparative profiling of miRNAs and mRNAs in fungus-contaminated versus naive termites and miRNA-mRNA analysis (data unpublished). We found that the antifungal activity (Fig. 5B; t=−4.000, df=5, p<0.05; paired t-test) was significantly reduced in termites treated with miR-71-5 simulants compared to those treated with simulant controls. These results suggested that miRNAs played an important role in driving physiological disease defenses in termites.

איור 4 השפעת חוסר ויסות מירנא על התנהגויות חברתיות הגנתיות בקבוצות טרמיטים. התנהגויות A Locomotion, B Grooming, C קניבליסטיות ו-D קבורה של Dicer-1-מושתק לעומת קבוצות טרמיטים שטופלו ב-GFP. הנתונים מוצגים כממוצע±SEM. *עמ'<0.05, **p<0.01

איור 5 השפעת חוסר ויסות של מירנה על הגנה פיזיולוגית אצל אנשים טרמיטים. פעילות אנטי-פטרייתית של טרמיטים מושתקים-1-של Dicer לעומת טרמיטים שטופלו ב-GFP. B פעילות אנטי-פטרייתית של miR-71-5 לעומת טרמיטים שטופלו בסימולנטים. הנתונים מוצגים כממוצע±SEM. *עמ'<0.05

Dicer-1 ו-miR-71-5 השפיעו על ההישרדות של טרמיטים מזוהמים בפטריות

מכיוון שגם הסימולנטים dsDicer-1 וגם miR-71-5 הובילו להפחתת הפעילות האנטי-פטרייתית של טרמיטים, בדקנו את הפוטנציאל שלהם להדברה ביולוגית של טרמיטים. מצאנו שטרמיטים-1-משתקים של Dicer המזוהמים בפטרייה הפגינו ירידה משמעותית בהישרדות בהשוואה לזו של טרמיטים אחרים שטופלו (dsDicer-1+fungus לעומת dsGFP+fungus: χ2=81.839, p.<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsDicer-1+Tween 80: χ2=63.070, p<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsGFP+Tween 80: χ2=65.474, p<0.001). GFP-treated termites contaminated with fungus showed significantly decreased survival compared to the termites without fungal contamination (dsGFP+fungus versus dsDicer-1+Tween 80: χ2=58.636, p<0.001; dsGFP+fungus versus dsGFP+Tween 80: χ2=68.849, p<0.001). There was no significant difference between dsDicer-1- and dsGFP-treated termites without fungal contamination (χ2=2.037, p=0.154) (Fig. 6A). Additionally, the survival of fungus-contaminated termites treated with the miR- 71-5 simulant was signifcantly decreased compared to that of other treated termites (miR-71-5+fungus vs. control+fungus: χ2=63.593, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. miR- 71–5+Tween 80: χ2=60.585, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. control+Tween 80: χ2=67.129, p<0.001). The survival of fungus-contaminated termites treated with the simulant control was significantly decreased compared to that of the termites without fungal contamination (control+fungus vs. miR-71-5+Tween 80: χ2=61.065, p<0.001; control+fungus vs. control+Tween 80: χ2=68.064, p<0.001). There was no significant difference in survival between termites treated with the miR-71-5 simulant and simulant control without fungal contamination (miR-71-5+Tween 80 vs. control+Tween 80: χ2=1.000, p=0.317) (Fig. 6B). These results suggested a good effect of miRNAs coupled with entomopathogens in biologically controlling termites.

דִיוּן

מירנאים מבצעים פונקציות מרובות, כגון ויסות חילוף החומרים של פחמימות ואנרגיה, התגובה החיסונית, תגובות חמצון-הפחתה ותהליכי חיים אחרים בגופים שלמים של הטרמיטים. כצפוי, נטילת dsDicer-1 בטרמיטים הובילה להשתקת Dicer-1 ולאחר מכן הפחיתה את ריכוז ה-miRNA, מה שמרמז על ההשראה המוצלחת של חוסר ויסות מיRNA. ניתוח תמלול הראה שהשתקת Dicer-1 הייתה קשורה ל-32 מסלולי KEGG ו-175 מונחי GO. במושבות חרקים חברתיות, הפרשת הרוק יכולה לתפקד כחומר חיטוי חיצוני ולפעול בשילוב עם התנהגות חברתית כגון trophallaxis, טיפוח וקינון לטיפול בצאצאים, בני קן ומושבות (Bulmer et al. 2009; Hamilton et al. 2011 המילטון ובולמר 2012). הגליקוליזה, מחזור הציטראט ויצירת ATP מ-ADP מעורבים במטבוליזם של פחמימות ואנרגיה. מכיוון שהתגובות החיסוניות התגברות וביצוע התנהגויות חברתיות הן יקרות מבחינה אנרגטית, להפרעות בחילוף החומרים של פחמימות ואנרגיה יש השפעות שליליות על תהליכים אלה (Liu וחב' 2020; Hassan et al. 2021a, b; Xu et al. 2021a, b). המרכיב המבני של הציפורן מתחבר לציפורני החתול של חרקים, ויוצר את המחסום הראשון למניעת פלישת פתוגנים ל-hemocoel (Syazwan et al. 2021). מספר DEGs המעורבים בתגובת ההגנה, פעילות גלוטתיון טרנספראז ותהליך הפחתת חמצון מסוגלים לקודד פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs), חלבוני ניקוי רעלים ואנזימים נוגדי חמצון כדי להגביר את העמידות והסבילות של חרקים בפני פתוגנים (Liu et al. 2015, 2019א). פונקציות הקשורות להגנה עשויות לתרום לחסינות חברתית במושבות טרמיטים. שאר מסלולי KEGG ומונחי GO היו מעורבים במערכת העצבים, מערכת העיכול, אריכות ימים, התפתחות וכו' (חומר משלים 2-טבלה S3 ו-S4). בנוסף, חלק מה-DEGs (למשל גנים של פחמימות וחילוף החומרים באנרגיה) בטרמיטים המושתקים של Dicer-1 היו ממיקרובים (חומר משלים 2-טבלה S2), שהיו אולי הסימביונטים של המעיים ועשויים להיות מרכיבים חשובים השתתפות בתהליכי החיים של המארחים. לכן, ל-miRNAs יש השפעה גלובלית על כל הגוף של הטרמיט.

איור 6 השפעת ויסות מיRNA dys על ההישרדות של קבוצות טרמיטים מזוהמות בפטריות. A Survival of Dicer- 1-מושתק לעומת טרמיטים שטופלו ב-GFP עם או בלי זיהום פטרייתי; B הישרדות של miR-71-5 לעומת טרמיטים שטופלו בסימולנטים עם או בלי זיהום פטרייתי. אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים, עמ'<0.05

חילוף חומרים של פחמימות ואנרגיה, תגובה חיסונית ותגובות חימצון-הפחתת חימצון חשובים ל-miRNA בהנעת חסינות חברתית. התנהגות של בעלי חיים היא תהליך תלוי אנרגיה, ולפיכך, כמה מעכבי אנרגיה גורמים לבעלי חיים לנוע לאט ואף למות (Davidson 1930; Schuler and Casida 2001). במושבות טרמיטים, הפרעות של גליקוליזה או מחזור ציטראט גורמות לירידה ברמות ATP ומעכבות את התנהגות התנועה (Hassan וחב' 2021a, b; Xu et al. 2021a, b). הפרעות במחזור הציטראט מפחיתות גם את הפעילות האנטי-פטרייתית של טרמיטים, מה שמוביל להגברת זיהום ותמותה (Liu et al. 2020). בנוסף, מכיוון שדווחו שסימביונטים במעי טרמיטים משתתפים בהגנת מחלות המארח על ידי אספקת אנזימים (Rosengaus et al. 2014) ומטבוליטים (Inagaki and Matsuura 2018), הפרעות מטבוליות בסימביונטות המעיים עלולות להפחית את היכולת החיסונית שמקורה בסימביונט. ומכאן מופחתת ההגנות ממחלות טרמיטים. במחקר שלנו, שמונה גנים מטבוליים אומתו כבעלי ירידה משמעותית בוויסות, דבר המצביע על הפרעות של גליקוליזה ומחזור ציטראט בכל גופם של הטרמיטים המושתקים של Dicer-1-. הצענו שחילוף החומרים של פחמימות ואנרגיה בתיווך miRNA היה מנגנון ביוכימי חשוב בהנעת חסינות חברתית וששיבוש תהליך זה עשוי להפחית את הגנת המחלה ההתנהגותית והפיזיולוגית במושבות טרמיטים. מערכת החיסון של החרקים גורמת למספר רב של מולקולות אפקטור להילחם בפתוגנים in vivo. דפנסינים הם AMPs קומפקטיים, עשירים בציסטאין ועמידים לפרוטאזות עם פעילות רחבה נגד חיידקים, פטריות וטפילים אחרים (Weber 2021). טרמיצין הוא דפנסין אנטי-פטרייתי ספציפי לטרמיטים שהשתקתו מביאה לירידה בפעילות האנטי-פטרייתית ומכאן מוגברת לתמותה של טרמיטים מזוהמים בפטריות (Hamilton and Bulmer 2012). ניקוי רעלים של חרקים ומערכות נוגדי חמצון פועלות לעתים קרובות בשילוב עם המערכת החיסונית, מה שמפחית ביעילות את הסיכון של רעלים ו-ROS במהלך אינטראקציות מארח-פתוגן (Syazwan et al. 2021). Cytochrome P450 monooxygenases אחראים לזרז חמצון ומטבוליזם של רעלנים פתוגנים ויצירת רדיקלים חופשיים או ROS (Shankar and Mehendale 2014). משפחת הפרוקסירדוקסין כוללת אנזימים נוגדי חמצון המזרזים את הפחתת ה-ROS (Xu et al. 2021a; ב). התוצאות שלנו אימתו שהשתקת Dicer-1 שינתה באופן משמעותי את ביטוי הגנים של דפנסין, טריצין, ציטוכרום P450 9e2 ופרוקסירדוקסין-4, מה שמצביע על כך ש-miRNAs מילאו תפקידים חשובים בוויסות התגובה החיסונית תגובות חמצון-הפחתה בכל הגוף של הטרמיט. לכן, אנו מציעים כי חילוף החומרים של פחמימות ואנרגיה, התגובה החיסונית ותגובות חימצון-הפחתת עשויים להשתתף במנגנון ההנעה של חסינות חברתית בצורת מירנה, והשיבוש שלהם עלול להשפיע לרעה על חסינות חברתית במושבות טרמיטים.

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

אכן, לחוסר ויסות של miRNA יש השפעות שליליות על התנועה ומכאן על ההגנה ההתנהגותית במושבות טרמיטים. בניגוד לחרקים בודדים, חרקים חברתיים פיתחו רפרטואר עשיר של הגנות התנהגותיות, זיהוי קולקטיבי של נוכחות פתוגנים, הגבלת התפשטות פתוגנים והפחתת סיכון ההידבקות של יחידים (Van Meyel et al. 2018; Liu et al. 2019a). עובדים מבוגרים מבצעים משימות מסוכנות מחוץ לקן ומזוהמים בקלות. כאשר הם מזוהמים, בני קן נוטים להתלכד לקראת עובדים מזוהמים ולטפח אותם (Liu et al. 2019b). גם העובדים המזוהמים וגם המטפלים שלהם מגדילים את המרחק משאר בני הקינים התמימים. עובדי אחיות לוקחים דגירה עמוק יותר לתוך עומק המושבה כדי להגדיל את המרחק מהעובדים המזוהמים (Stroeymeyt et al. 2018). תוצאות אלו מראות כי הגדלת המרחק הפיזי בין חברי המושבה היא אסטרטגיה יעילה להגבלת העברת פתוגנים [המכונה 'חסינות ארגונית' (Liu et al. 2019a)], ותנועה צריכה להיות התנהגות חברתית חשובה, שכן היא מתאימה את מרחק בין פרטים מזוהמים לבין בני קן נאיביים. חסן ועמיתיו מצאו כי טרמיטים הגבירו משמעותית את תנועתם במהלך זיהום פטרייתי, והדגימו עוד יותר את התנועה בתגובה לפתוגנים (Hassan et al. 2021a, b). בנוסף, התנהגויות טיפוח, קניבליזם וקבורה ידועות בניהול של פרטים וגופות מזוהמות במושבות חרקים חברתיות. בטרמיטים המזוהמים בפטריות, התנהגות הטיפוח מתרחשת מיד, לפני הנביטה (Liu et al. 2019b). לעומת זאת, התנהגות קניבליסטית מתרחשת רק לאחר שאנשים מזוהמים חולים בעליל (Davis et al. 2018). לניהול גופות, גופות טריות נחשבות לעתים קרובות כתגמולים תזונתיים ומעוררות קניבליזם על ידי הפקת אות מוות מוקדם. לעומת זאת, גופות רקובות נחשבות לסיכוני זיהום וגורמות לקבורה על ידי הפקת סימני מוות מאוחרים (Sun et al. 2016). כאן, מצאנו שהשתקת Dicer-1 עיכבה באופן משמעותי תנועה ותנועות אחרות, כגון התנהגויות טיפוח, קניבליזם וקבורה, מה שמצביע על כך שחוסר ויסות של miRNA הפגין השפעה כללית על תנועת טרמיטים וכתוצאה מכך השפיע על ההגנה ההתנהגותית מפני פתוגנים, פתוגנים- בני קן מזוהמים וגופות מזוהמות עם פתוגנים במושבות טרמיטים. עבור מנגנון הנהיגה, חילוף חומרים של פחמימות ואנרגיה בתיווך מירנה יכול להיחשב לאחד הגורמים הביוכימיים החשובים ביותר (ראה הדיון לעיל). לכן, מירנאים יכולים לעצב את ההגנות ההתנהגותיות של טרמיטים.

לחוסר ויסות של miRNA היו גם השפעות שליליות על ההגנה הפיזיולוגית של טרמיטים. טרמיטים בדרך כלל מגבירים את יכולתם האנטי-פטרייתית על ידי וויסות מוגברת של גנים חיסוניים כדי לשפר את ההגנה הפיזיולוגית שלהם (Liu et al. 2015). החומרים האנטי-פטרייתיים שמקורם בסימביונט במעיים מספקים לטרמיטים את היכולת לעכב צמיחה פטרייתית כדי לשפר את ההגנה הפיזיולוגית שלהם (Rosengaus et al. 2014). לכן, הפעילות האנטי-פטרייתית הכוללת הייתה אינדיקטור יעיל להגנת המחלה הפיזיולוגית של הטרמיטים. מחקרים אחרונים הראו שלא רק גנים חיסוניים אלא גם חילוף חומרים של פחמימות וגנים נוגדי חמצון דווחו כמרכיבים חשובים המשפיעים על הפעילות האנטי-פטרייתית של טרמיטים (Liu et al. 2020; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). טרמיטים מנוולים היו פגיעים יותר לזיהום פטרייתי (Rosengaus et al. 2014). למרות שהגברת ביטויי הגנים החיסוניים כגון דפנסין וטריצין, חוסר ויסות מיRNA בתיווך Dicer הפחית את הביטוי של מטבוליזם של פחמימות וגנים נוגדי חמצון בתוך טרמיטים או סימביונים של המעיים, ומכאן הפחית משמעותית את הפעילות האנטי-פטרייתית הכוללת של טרמיטים. בנוסף, טרמיטים שטופלו בסימולנטים ב-miR-71-5 הראו גם ירידה בפעילות האנטי-פטרייתית הכוללת, דבר המצביע עוד יותר על ההשפעה השלילית של חוסר ויסות של מירנה על ההגנה הפיזיולוגית בטרמיטים. יתרה מזאת, קבוצות הטרמיטים שניזונו בסימולנט dsDicer-1 או miR-71-5 היו פגיעות יותר לזיהום פטרייתי, והראו עלייה בתמותה מזיהומים. לכן, מירנאים יכולים לעצב חסינות חברתית על ידי הפעלת הגנת מחלות התנהגותיות ופיזיולוגיות במושבות טרמיטים.

איור 7 מנגנונים פוטנציאליים העומדים בבסיס חסינות חברתית במושבות טרמיטים ומטרות חדשות להדברה ביולוגית. miRNAs משפיעים באופן נרחב על כל הגוף של טרמיטים, כולל חילוף החומרים של פחמימות ואנרגיה A, תגובה חיסונית B, תגובות חמצון-הפחתת C וכו'. D דווחו כי פחמימות וחילוף חומרים אנרגטיים ממלאים תפקידים חשובים בוויסות ההתנהגות והפעילות האנטי-פטרייתית בטרמיטים. לכן, מטבוליזם של פחמימות ואנרגיה בתיווך מירנא היו ככל הנראה אחד הגורמים הגנטיים והביוכימיים המניעים התנהגות התנהגותית (כגון תנועה, טיפוח, קניבליזם וקבורה) ופיזיולוגית (פעילות אנטי-פטרייתית) הגנת מחלות במושבות טרמיטים. E התגובה החיסונית עזרה לטרמיטים לעכב את השכפול וההפצה של פתוגנים בחלל הגוף. תגובת החמצון-הפחתת ההגנה על הטרמיטים מפני הנזק שנגרם על ידי רעלים ו-ROS מאינטראקציות "מארח-פתוגן". לכן, התגובה החיסונית בתיווך מירנה ותגובת החמצון-הפחתת ממלאת תפקיד חשוב בהנעת ההגנה על מחלות פיזיולוגיות בטרמיטים. F miRNAs עיצבו חסינות חברתית על ידי הנעת הגנת מחלות התנהגותיות ופיזיולוגיות במושבות טרמיטים. על ידי מיקוד ל-miRNAs, נוכל להגביר באופן מלאכותי את הרגישות של מושבות טרמיטים לאנטומופתוגנים וכתוצאה מכך לשפר את השליטה הביולוגית של טרמיטים.

למיטב ידיעתנו, זהו הדיווח הראשון על המנגנון הפוטנציאלי של מירנאים העומדים בבסיס החסינות החברתית במושבות טרמיטים. מירנאים יכולים להשפיע על הפרשת הרוק, חילוף החומרים של פחמימות ואנרגיה, יצירת ציפורניים, תגובות חיסוניות, תגובות חמצון-הפחתה וכו'. ביניהם, חילוף חומרים של פחמימות ואנרגיה הוא כנראה גורם ביוכימי חשוב בהנעת הגנות התנהגותיות כמו תנועה, טיפוח, קניבליזם, וקבורה במושבות טרמיטים. בנוסף, חילוף חומרים של פחמימות ואנרגיה, התגובה החיסונית ותגובות חימצון-הפחתת צפויים להשתתף בהנעת הגנות פיזיולוגיות של טרמיטים, כגון פעילות אנטי-פטרייתית.

לכן, חסינות חברתית בצורת מירנה יכולה להשפיע על הרגישות של מושבות טרמיטים לפטריות אנטומפתוגניות; לפיכך, מירנאים עשויים להיות מטרות יעילות לבקרה ביולוגית של טרמיטים (איור 7). מחקרים רבים הוכיחו שהשתקה בתיווך RNAi של גנים מטרה עלולה להוביל למוות של חרקים, עם פוטנציאל ניכר להדברת חרקים. בהדברת טרמיטים, Zhou et al. (2008) התמקדה לראשונה בגנים אנדוגלוקנאז והקסאמרים באמצעות הזנת dsRNA, והדגימה את היתכנותם של קוטלי טרמיטים מבוססי RNAi. כדי להגביר את ההשפעה הקטלנית במושבות טרמיטים, הופעלו קוטלי טרמיטים מבוססי RNAi יחד עם פטריות אנטומפתוגניות זיהומיות. השתקה בתיווך RNAi של טריצין, GNBP2, TG, IDH וגנים מקודדים אחרים יחד עם Metarhizium עשויה להגביר באופן משמעותי את הרגישות של בני קן לקונידיות פטרייתיות המועברות חברתית, ומכאן להוביל לעלייה בשיעור תמותה מזיהומים (Hamilton and Bulmer 2012; Liu et al. 2020; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). במחקר שלנו, הדגמנו את ההיתכנות של מיקוד ל-RNAs קטנים שאינם מקודדים באמצעות האכלה כדי לייעל את הבקרה הביולוגית של טרמיטים באמצעות Metarhizium. בהשוואה ל-dsRNAs המכוונים ספציפית לגן, ה-miRNAs היו מסוגלים למקד למספר גנים בעלי תפקוד זהה או שונה, ומכאן שיש להם השפעה רחבה על תהליכי החיים של טרמיטים. לכן, על ידי התמקדות ב-miRNAs, קבוצות טרמיטים הציגו הגנת מחלות התנהגותיות ופיזיולוגיות מופחתות הן ברמת הקבוצה והן ברמת הפרט, דבר המצביע על עיכוב רחב של חסינות חברתית של טרמיטים. על ידי מיקוד ל-miRNAs, קבוצות טרמיטים הציגו כתוצאה מכך רמה גבוהה של תמותה במהלך זיהום פטרייתי, מה שמרמז שניתן להשתמש ב-miRNAs כקוטלי טרמיטים כדי לשפר את השליטה הביולוגית של טרמיטים על ידי הפחתת החסינות החברתית שלהם. לכן, miRNAs יכולים להיחשב מטרות חדשות פוטנציאליות להדברת חרקים.

הפניות

Berdnik D, Fan AP, Potter CJ, Luo L (2008) מסלול עיבוד MicroRNA מווסת מורפוגנזה של נוירוני הריח. Curr Biol 18:1754–1759. https://doi.org/10.1016/j.cub.2008.09.045

Bulmer MS, Bachelet I, Raman R, Rosengaus RB, Sasisekharan R (2009) מיקוד לתפקוד אפקטור אנטי-מיקרוביאלי בחסינות חרקים כאסטרטגיית הדברה. Proc Natl Acad Sci USA 106:12652–12657. https://doi.org/10.1073/pnas.0904063106

Chouvenc T, Efstathion CA, Elliott ML, Su NY (2013) עמידות מורחבת למחלות המגיעה מקן הצואה של טרמיט תת קרקעי. Proc R Soc B 280:20131885. https://doi.org/10.1098/ rspb.2013.1885

Davidson WM (1930) רוטנון כקוטל חרקים מגע. J Econ Entomol 23:868–874. https://doi.org/10.1093/JEE/23.5.868

Davis HE, Meconcelli S, Radek R, McMahon DP (2018) טרמיטים מעצבים את התגובה ההתנהגותית הקולקטיבית שלהם על סמך שלב ההדבקה. Sci Rep 8:14433. https://doi.org/10.1038/ s41598-018-32721-7

Esparza-Mora MA, Davis HE, Meconcelli S, Plarre R, McMahon DP (2020) עיכוב של מולקולה חיסונית מופרשת מפריע לחסינות חברתית של טרמיטים. Front Ecol Evol 8:75. https://doi.org/10. 3389/fevo.2020.00075

Gomez-Orte E, Belles X (2009) מטמורפוזה תלוית מיקרו-RNA בחרקים hemimetabolan. Proc Natl Acad Sci USA 106:21678– 21682. https://doi.org/10.1073/pnas.0907391106

Hamilton C, Bulmer MS (2012) הגנות מולקולריות נגד פטריות בטרמיטים תת קרקעיים: הפרעות RNA חושפת תפקידים in vivo של טרמינוס ו-GNBPs נגד פתוגן שנתקל באופן טבעי. Dev Comp Immunol 36:372–377. https://doi.org/10.1016/j.dci. 2011.07.008

Hamilton C, Lejeune BT, Rosengaus RB (2011) Trophallaxis and prophylaxis: חסינות חברתית בנמלה הנגרתCamponotus pennsylvanicus. ביול לט 7:89–92. https://doi.org/10.1098/rsbl. 2010.0466

Hassan A, Huang Q, Mehmood N, Xu H, Zhou W, Gao Y (2021a) שינוי של תנועת טרמיטים ואלוגרום בתגובה לזיהום על ידי פטריות פתוגניות. J Econ Entomol 114:1256– 1263. https://doi.org/10.1093/jee/toab071

Hassan A, Huang Q, Xu H, Wu J, Mehmood N (2021b) Silencing of theפוספופרוקטוקינאזהגן פוגע בגליקוליזה וגורם לתנועה לא תקינה בטרמיט התת קרקעיReticulitermes chinensisסניידר. חרק מול ביול 30:57–70. https://doi.org/10. 1111/imb.12672

He S et al (2018) חיילי טרמיטים תורמים לחסינות חברתית על ידי סינתזה של הפרשות אוראליות חזקות. חרק מול ביול 27:564–576. https://doi.org/10.1111/imb.12499

Hong M, Hwang D, Cho S (2018) מורפולוגיה של המוציטים ותגובה חיסונית תאית בטרמיט (רטיקוליטרמס ספראטוס). J Insect Sci 18:46. https://doi.org/10.1093/jisesa/iey039

Hussain A, Li YF, Cheng Y, Liu Y, Chen CC, Wen SY (2013) Immune-related transcriptome ofקופטוטרמס פורמוסנוסעובדי שיראקי: מנגנון ההגנה. PLoS ONE 8:e69543. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069543

Inagaki T, Matsuura K (2018) הדדיות מורחבת בין טרמיטים וחיידקי מעיים: סימביונים תזונתיים תורמים להיגיינת הקן. Sci Nat 105:52. https://doi.org/10.1007/ s00114-018-1580-y

Kumar S, Upadhyay RK (2021) פוטנציאל אנטי-טרמיטים של מרכיבים ביו-אורגניים שונים עם התייחסות מיוחדת למשפחת אסטרציים. WJPR 10:1109–1149. https://doi.org/10.20959/wjpr2 0213-19977

Lee YS et al (2004) תפקידים ברורים עבורתסיסניתDicer-1 ו-Dicer-2 במסלולי השתקת siRNA/miRNA. תא 117:69– 81. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(04)00261-2

Liu L, Li GH, Sun PD, Lei CL, Huang QY (2015) אימות ניסוי ובסיס מולקולרי של חיסון פעיל נגד פתוגנים פטרייתיים בטרמיטים. Sci Rep 5:15106. https://doi.org/ 10.1038/srep15106

Liu L, Wang W, Liu YL, Sun PD, Lei CL, Huang QY (2019a) השפעת התנהגות ה-allogrooming על חסינות מולדת אינדיבידואלית בטרמיט התת-קרקעיReticulitermes chinensis(Isoptera: Rhinotermitidae). J Insect Sci 19:6. https://doi.org/10.1093/jisesa/ iey119

Liu L, Zhao XY, Tang QB, Lei CL, Huang QY (2019b) המנגנונים של חסינות חברתית נגד זיהומים פטרייתיים בחרקים איוסוציאליים. רעלים 11:244. https://doi.org/10.3390/toxins11050244

Liu L, Wang CC, Zhao XY, Guan JX, Lei CL, Huang QY (2020) הפרעות מטבוליות בתיווך Isocitrate dehydrogenase משבשות חיסון פעיל נגד פתוגנים פטרייתיים בטרמיטים איוסוציאליים. J Pest Sci 93:291–301. https://doi.org/10.1007/ s10340-019-01164-y

Lopez-Uribe MM, Sconiers WB, Frank SD, Dunn RR, Tarpy DR (2016) תגובה חיסונית תאית מופחתת בשושלות חרקים חברתיות. ביול לט 12:20150984. https://doi.org/10.1098/rsbl.2015. 0984

Lucas KJ, Zhao B, Liu S, Raikhel AS (2015) ויסות תהליכים פיזיולוגיים על ידי microRNAs בחרקים. Curr Opin Insect Sci 11:1–7. https://doi.org/10.1016/j.cois.2015.06.004

Rosengaus RB, Jordan C, Lefebvre ML, Traniello JFA (1999) התנהגות אזעקת פתוגן בטרמיט: צורה חדשה של תקשורת בחרקים חברתיים. Naturwissenschaften 86:544–548. https://doi.org/ 10.1007/s001140050672

Rosengaus RB, Lefebvre ML, Traniello JFA (2000) עיכוב של נביטת נבגי פטריות על ידי nasutitermes: עדות לתפקיד אנטיספטי אפשרי של הפרשות הגנתיות של חייל. J Chem Ecol 26:21–39. https://doi.org/10.1023/A:1005481209579

Rosengaus RB, Schultheis KF, Yalonetskaya A, Bulmer MS, DuComb WS, Benson RW, Thottam JP, Godoy-Carter V (2014) סימביונט נגזר -1,3-גלוקאנאזות בחרק חברתי: הדדיות מעבר לתזונה . פרונט מיקרוביול 5:607. https://doi.org/10.3389/fmicb. 2014.00607

Schuler F, Casida JE (2001) יעד קוטל החרקים ביחידת המשנה PSST של קומפלקס I. Pest Manag Sci 57:932–940. https://doi.org/10. 1002/ps.364

Seipke RF et al (2011) A singleStreptomycessymbiont מייצרת מספר תרופות אנטי פטרייתיות כדי לתמוך בנמלה החקלאית הפטרייתיתAcromyrmex octospinosus. PLoS ONE 6:e22028. https://doi.org/10.1371/journ al.pone.0022028

Shankar K, Mehendale HM (2014) Cytochrome P450. בתוך: Wexler P (ed) Encyclopedia of toxicology. Academic Press, pp 1125–1127 Stroeymeyt N, Grasse AV, Crespi A, Mersch DP, Cremer S, Keller L (2018) פלסטיות ברשת החברתית מפחיתה את העברת המחלה בחרק איוסוציאלי. מדע 362:941–945. https://doi.org/10.1126/ science.aat4793

Sun Q, Haynes KF, Zhou XG (2016) שינויים דינמיים ברמזים למוות מווסתים סיכונים ותגמולים של ניהול גופות בחרק חברתי. Funct Ecol 31:697–706. https://doi.org/10.1111/1365- 2435.12754

Syazwan SA, Lee SY, Sajap AS, Lau WH, Omar D, Mohamed R (2021) אינטראקציה ביןMetarhizium anisopliaeוהמארח שלו, הטרמיט התת-קרקעיCoptotermes curvignathusבמהלך תהליך ההדבקה. ביולוגיה 10:263. https://doi.org/10.3390/biolo gy10040263

Terrapon N et al (2014) עקבות מולקולריים של ארגון חברתי חלופי בגנום טרמיטים. Nat Commun 5:3636. https://doi.org/10. 1038/ncomms4636

Van Meyel S, Körner M, Meunier J (2018) חסינות חברתית: מדוע עלינו ללמוד את טבעה, האבולוציה והתפקודים שלה בכל המערכות החברתיות. Curr Opin Insect Sci 28:1–7. https://doi.org/10.1016/j. cois.2018.03.004

Verma M, Sharma S, Prasad R (2009) חלופות ביולוגיות להדברת טרמיטים: סקירה. Int Biodeter Biodegr 63:959–972. https:// doi.org/10.1016/j.ibiod.2009.05.009

Wang YL, Yang ML, Jiang F, Zhang JZ, Kang L (2013) התפתחות תלוית מיקרו-RNA נחשפה על ידי השתקת גנים בתיווך הפרעות RNA שלLmDicer1בארבה הנודד. Insect Sci 20:53–60. https://doi.org/10.1111/j.1744-7917.2012.01542.x

Weber F (2021) חסינות מולדת אנטי-ויראלית: מבוא. בתוך: Bamford DH, Zuckerman M (עורכים) Encyclopedia of virology. Elsevier, pp 577–583 Xu H, Huang QY, Gao YY, Wu J, Hassan A, Liu YT (2021a)IDHההפלה משנה את התנהגות חיפוש המזון אצל הטרמיטיםodontocetes formosanusבהקשרים חברתיים שונים. קור זוול 67:609. https:// doi.org/10.1093/cz/zoab032 Xu Z, Zeng X, Li M, Liao J, Chen Q (2021b) MicroRNA-383 מקדם אוטופגיה תגובתית הנגרמת על ידי מיני חמצן באמצעות הורדת פרוקסירדוקסין 3 בגליומה אנושית תאי U87. Exp Ther Med 21:439. https://doi.org/10.3892/etm.2021.9870

Yanagawa A, Fujiwara-Tsujii N, Akino T, Yoshimura T, Yanagawa T, Shimizu S (2011) ריח עבש של אנטומפטוגנים משפר התנהגויות מניעת מחלות בטרמיטיםקופטוטרמס פורמוסנוס. J Invertebr Pathol 108:1–6. https://doi.org/10.1016/j.jip.2011. 06.001

Yanagawa A, Imai T, Akino T, Toh Y, Yoshimura T (2015) סימני ריח מפטרייה פתוגנית משפיעים על כיוון התנועה של טרמיטים,קופטוטרמס פורמוסנוס. J Chem Ecol 41:1118– 1126. https://doi.org/10.1007/s10886-015-0649-8

Yang ML וחב' (2014) MicroRNA-133 מעכב צבירה התנהגותית על ידי שליטה בסינתזה של דופמין בארבה. PLoS Genet 10:e1004206. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004206