MicroRNAs בהתפתחות כליות ומחלות Ⅱ

התפתחות כליות

הכליה של יונקים(או metanephros) הוא איבר חיוני הממלא תפקיד קריטי בהפרשת פסולת מטבולית,ויסות נפח הנוזל החוץ תאי, ותחזוקה של אלקטרוליטוהומאוסטזיס על בסיס חומצה. יתרה מכך, הכליה מייצרת הורמונים חשובים, כגוןאריתרופויאטין, קלציטריול,רנין, ופרוסטגלנדינים(48). היכולת התפקודית של הכליה עומדת בקורלציה עם מספר הנפרונים המתפקדים שנוצרים במהלך התפתחות הכליות לפני הלידה, המכונה גם הקדשת נפרון. כל כליה אנושית מכילה בממוצע 1,000,000 נפרונים, אם כי מספר זה משתנה במידה ניכרת, עם הערכות שנעות בין 200,000 ל-2,000,{{8 }} נפרונים (49, 50). עםהְזדַקְנוּת,אובדן רזרבה תפקודית של נפרוןמתרחשת לאורך זמן (51, 52); לכן, הקניית נפרון נמוכה בלידה קשורה לסיכון מוגבר לפתח יתר לחץ דם ומחלת כליות כרונית (CKD) בשלב מאוחר יותר בחיים (53-55). יתרה מכך, CAKUT, אשר מוביל לירידה בהקצאת נפרון ותפקוד נפרון, הוא הגורם המוביל לאי ספיקת כליות בילדים, וכתוצאה מכך לתחלואה ותמותה משמעותיים הקשורים להשתלה ודיאליזה (56, 57). לפיכך, הבנה טובה יותר של המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס ביסוס מספר הנפרונים ויצירת נפרון תקינה מספקת תובנות לגבי דרכים חדשות לניבוי, מניעה ולטפל במחלת כליות בילדות.

כמה זמן לוקח ל-CISTANCHE לעבוד עבור חולי מחלת כליות?

התפתחות כליות מטנפריתמתחיל בסביבות יום 10.5 עוברי (E10.5) בעכברים ובסביבות השבוע החמישי להריון בבני אדם (58). בתגובה לאותות אינדוקטיביים מהמזנכימה המטנפרית, ניצן השופכן משתרע מהקצה הזנב של צינור הוולפיאן ופולש אל המזנכימה הסמוכה (איור 2). במקביל, מורפוגנים הנובעים מהניצן השופכן מעוררים התעבות של המזנכימה המטנפרית ליצירת מזנכים הכובע (המכונה גם אבות נפרון) סביב קצות ניצן השופכן. עם התקדמות הנפרוגנזה, ניצן השופכן עובר סבבים רצופים של הסתעפות, התארכות והתמיינות כדי ליצור את צינורות האיסוף של הכליה. תת-אוכלוסיה של אבות נפרון עוברת מעבר מזנכימלי-אפיתל ליצירת שלפוחיות כליות, אשר לאחר הקיטוב וההתארכות הופכות למבני גוף בצורת פסיק ו-S. לבסוף, החלק המרוחק של הגוף בצורת S מתמזג עם צינור האיסוף ויוצר נפרון פונקציונלי (59-61). הגוף בצורת S עובר התמיינות נוספת ליצירת סוגי התאים הבוגרים של הנפרון, מלבד צינור האיסוף. תאי אבות סטרומה של Foxd1+ סמוכים לאבות נפרון באזור הקורטיקלי או הנפרוגני החיצוני של הכליה המתפתחת (איור 2) (62). האותות מהסטרומה של קליפת המוח נחשבים לעכב את התרחבות תאי אבות נפרון וממריצים את ההתמיינות שלו, שכן אבלציה של סטרומה הכלייתית גורמת לפגיעה בהתמיינות של אבות נפרון (63). תאי האב של Foxd1+ יוצרים את כל תאי הסטרומה בכליה המטנפרית, כולל תאים אינטרסטיציאליים של קליפת המוח והמדולרי, פריציטים, פיברובלסטים perivascular, תאים mesangial ותאי שריר חלק של כלי הדם (64, 65). הפרעות בכל שלב בתהליך זה עלולות להוביל ל-CAKUT, הגורם העיקרי ל-CKD בילדות (66, 67).

הנפרון הבוגר מורכב מגלומרולוס הפועל כיחידת הסינון ותא ספיגה אחורי צינורי המחולק לצינורית מפותלת פרוקסימלית, לולאה של Henle, צינורית מפותלת דיסטלי וצינור איסוף (איור 2). מחסום הסינון של הגלומרולוס (המורכב מהאנדותל המחורר, קרום הבסיס הגלומרולרי, תהליכי כף הרגל וסרעפות חריצים של פודוקיטים) מאפשר סינון של פלזמה ומומסים קטנים, תוך שמירה סלקטיבית של חלבונים כמו אלבומין ואימונוגלובולינים בדם (68, 69). בינתיים, תא הספיגה החוזרת הצינורית אחראי לשמירה על הומאוסטזיס מים, ספיגה חוזרת של מומסים (כולל נתרן, אשלגן, סידן, זרחן, מגנזיום, גלוקוז ועוד רבים אחרים), והפרשת חומצה ופסולת אחרת.

MiRNAs בכליה המתפתחת

במחקרים בעכברים טרנסגניים מותנים, ה-miRNAs הופיעו כמווסתים קריטיים של יצירת מורפו של הכליות בשושלות תאים מרובות. המחקרים הראשוניים שהעריכו תפקיד תפקודי של miRNAs בהתפתחות הכליות השתמשו במחיקה מותנית של Dicer (70) בשושלות כליות שונות. עם זאת, דיסר ידוע גם כבעל תפקידים בלתי תלויים ב-miRNA (71), מה שסיבך את הפרשנות של מודלים אלה. מחיקה מותנית של Dicer באבות מזנכיים מטאנפריים או נפרון מוקדמת גורמת לאפופטוזיס מוגברת של אבות נפרון, רמות גבוהות של חלבון פרואפופטוטי Bim והפסקה מוקדמת של נפרוגנזה (72-75) (טבלה 1). באופן מעניין, אובדן ביטוי Bim ב-Dicer-deficiency nephron pro genitors מקטין את האפופטוזיס ומשקם חלקית את היווצרות הנפרון. שני miRNAs המובעים באבות נפרון, miR-17 ו-miR-106, זוהו כמדכאים של ביטוי BIM (76). יחד, ממצאים אלה מצביעים על כך ש-miRNAs שולט על האיזון בין הישרדות לאפופטוזיס באבות נפרונים כדי להבטיח היווצרות של מספר נכון של נפרונים לאורך הנפרוגנזה.

איור 2. המחשה סכמטית של שלבי התפתחות הכליה המטנפרית. אותות מהניצן השופכן מעוררים התעבות של המזנכימה המטנפרית ליצירת מכסה של אבות נפרון (כובע מזנכימה) סביב קצות ניצן השופכן. ה-cap mesenchyme עובר מעבר mesenchymal-apithelial ליצירת שלפוחיות כליות, המתפתחות ברצף לגופים בצורת פסיק ו-S. מבנים אלו מתחברים לגבעול ניצן השופכן, אשר מולידה את צינור האיסוף. תאים בתחום הפרוקסימלי של הגוף בצורת S מתמיינים לתאי אפיתל מיוחדים של גוף הכליה הבוגר (כלומר, פודוציטים ותאי הקפסולה של באומן), בעוד תאים בחלקים האמצעיים והדיסטליים מתמיינים למקטעים הצינוריים של הנפרון (צינוריות פרוקסימליות). , לולאות של הנלה וצינוריות דיסטליות). נוצר עם BioRender.com.

מחיקה מותנית של Dicer בשושלת ניצני השופכה גורמת לספקטרום של חריגות הדומות מאוד ל-CAKUT, כולל דיספלזיה כלייתית והתפתחות של ציסטות מתכנסות (73, 77, 78). סיום מוקדם של מורפוגנזה מסועפת (בתגובה לירידה בביטוי של Wnt11 ו-c-Ret מהניצן השופכן) הוא ככל הנראה הגורם התורם העיקרי לדיספלזיה כלייתית (73). תחילת היווצרות הציסטה מתרחשת בסביבות E15.5 וקשורה לפגמים באורך הריסים הראשוניים, מוות מוגבר של תאים אפופטוטיים ושגשוג תאים מוגזם (73). מכיוון שלדיסר תפקידים חשובים בלתי תלויים ב-miRNA בתא, נעשה שימוש במחיקה מותנית של Dgcr8 כדי לאשר שהפנוטיפים שנצפו במודלים מותנים של Dicer-knockout הם אכן תוצאה של אובדן של miRNAs. בעלי חיים עם מחיקת Dgcr8 בנפרון הדיסטלי ונגזרות של צינור האיסוף מפתחים הידרונפרוזיס וציסטות צינור איסוף (79), פנוטיפ דמוי CAKUT הדומה לאובדן פעילות Dicer בשושלת ניצני השופכה.

מחקרים משתי קבוצות עצמאיות הראו כי אבלציה של Dicer משושלת Foxd1+ הכליות סטרומה ונגזרותיה מביאה לספקטרום של אנומליות בכליות, עם ממצאים עקביים לגבי כליות היפופלסטיות, מספרים גלומרולריים מופחתים, התבגרות גלומרולרית לא תקינה וכלי דם פגומים. דפוס (80, 81). למרות ששתי הקבוצות תיארו פנוטיפים תואמים במידה רבה תוך שימוש במודלים דומים של עכברים, צוינו שני הבדלים ברורים. Nakagawa et al. נצפה בחוסר של המדולה הפנימית והפפילה, כמו גם ירידה באזור הנפרוגני (80). לעומת זאת, Phua et al. הראה התרחבות של אוכלוסיית אבות הנפרון ופפילה כלייתית משומרת (81). Nakagawa et al. הציע שהפגמים הללו קשורים לשיבוש של איתות מסלול Wnt, וכתוצאה מכך לשינויים בנדידת תאי סטרומה ובשגשוג, עקב הורדת ויסות של miRNAs תאי הסטרומה, miR-214, miR-199a{{7 }}p, ו-miR-199a-3p (80). המחקר של Phua et al. הציע ששינויים בתוכניות אפופטוטיות (כולל ביטוי מוגבר של גנים אפקטורים Bim ו-p53) תורמים לפגמים פנוטיפיים (81). ניתן להעלות על הדעת כי הבדלי רקע גנטי ו/או היעילות של רקומבינציה בתיווך Cre עשויים להיות אחראים להבדלים שהמחקרים הללו מתארים. עם זאת, הפנוטיפים המתוארים תואמים את התפקידים הרב-גוניים הידועים של סטרומה כלייתית בהתפתחות הכליות, והמנגנונים העומדים בבסיס הפנוטיפים הללו עשויים להיות מורכבים בהתחשב באופי של מחיקת Dicer. יש צורך במחקרים נוספים הבוחנים מירנאים ספציפיים בתת-אוכלוסיות סטרומליות שונות כדי להגדיר טוב יותר את מנגנוני הרגולציה הפועלים.

עבודה עדכנית יותר עסקה בשאלת התפקוד של מירנאים ספציפיים הן באבות הכליה המתפתחים והן באבות הנפרון. באמצעות מודל של תאי גזע עובריים אנושיים, Bantounas et al. הראה שעיכוב של מקבץ miR-199a~214 גורם לגלומרולי דיסמורפי, אבובות פרוקסימליות חריגות, ירידה בביטוי WT1 והגדלת נימים בין-סטיציאליים באורגנואידים דמויי כליות (82). מעניין, מחיקה גלובלית של miR-210 המגיב להיפוקסיה גורמת לחסר נפרון ספציפי לגבר (83). לדוגמה, מחיקה מותנית של צביר miR-17}~92 באבות נפרונים ונגזרותיהם בעכברים פוגעת בשגשוג תאי אבות ומקטינה את מספר הנפרונים המתפתחים. כתוצאה מכך, עכברים מוטנטים מפתחים פרוטאינוריה, פיברוזיס בכליות ופגיעה בתפקוד הכליות (84). רמות לא מווסתות של גן היעד miR-17~92, CFTR, מעורבות בשגשוג הפגום של תאי אבות ובהפחתת הקניית נפרון במודל עכבר זה (85).

רצף RNA קטן (smRNA-Seq) נעשה יותר ויותר בשימוש כדי ליצור פרופיל של דפוסי ביטוי של מירנה ולגילוי מיני miRNA חדשניים. smRNA-Seq של תאי mesenchymal nephrogenic E15.5 זיהו 162 miRNAs מוערים שמתבטאים בצורה דיפרנציאלית באוכלוסיית תאים זו בהשוואה לכליות שלמות ו-49 מיני miRNA חדשים (86). מעניין לציין שרמות של miRNA ממשפחת miR-200 הופחתו באופן משמעותי באבות נפרון. בהתחשב בכך שבני משפחת miR-200 הם מווסתים מרכזיים של מעבר מזנכימלי-אפיתל בצינור האיסוף (87), אנו משערים שהביטוי שלהם עשוי להיות מווסת היטב כדי להבטיח התמיינות אפיתל תקינה של אבות נפרון במהלך התפתחות הכליות.

תפקוד ה-MiRNA בנפרון הבוגר

בנוסף לדרישה שלהם במהלך התפתחות הכליות, מירנאים מווסתים תהליכים ביולוגיים רבים בשושלות התאים העיקריות היוצרות את הנפרון הבוגר (69, 88-91). בהתאם לכך, תואר ביטוי ספציפי למקטע של miRNAs לאורך הנפרון, כולל miR-143 ו-miR-195a בגלומרולוס, miR-107 ו-miR{{7} }a באבובית הפרוקסימלית, miR-193 ו-miR-378a באיבר העולה העולה, miR-874 ו-miR-155 באבובית המפותלת הדיסטלית, ו-miR{{ 12}}ג בתעלת האיסוף (87). יתר על כן, מחקרים פונקציונליים בתאים של הנפרון הבוגר תומכים בתפקידים ברורים עבור miRNAs.

עכברים חסרי Dicer או Drosha בפודוציטים מפגינים פרוטאינוריה ניכרת, גלומרולוסקלרוזיס והתקדמות מהירה לאי ספיקת כליות, משנית להפרעה במחסום הסינון הגלומרולרי (90-93). ניתוחי סיליקו גילו כי תמלילים שונים בעלי ויסות גבוה בגלומרולי מוטנטי מכילים רצפי מטרה עבור בני משפחת miR-30. כמו כל ארבעת בני המשפחה miR-30 (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d ו-miR-30c{ {9}}) בדרך כלל באים לידי ביטוי גבוה בפודוציטים, מיRNAs אלה עשויים להיות אחראים לבעיות הפודוציטים ולשיבוש מחסום הסינון הגלומרולרי בעכברים מוטנטים (91).

באופן קצת מפתיע, מחיקת Dicer מצינוריות הפרוקסימליות של יונקים לאחר לידה אינה משפיעה על התפתחות הכליות, היסטולוגיה או תפקוד, אך כן מגינה מפני פגיעת איסכמיה/פרפוזיה כלייתית. עכברים מוטנטים מציגים תפקוד כליות טוב יותר, פגיעה בכליות מופחתת, אפופטוזיס צינורי נמוך יותר והישרדות משופרת בהשוואה לחבריהם ל-WT (94). זה ככל הנראה משקף את ה"סכום" של ההשפעה של מחיקת מירנ"א מרובים באבובית הפרוקסימלית, מכיוון שעבודות אחרות הוכיחו מאז שהביטוי של מירנאים ספציפיים מגן באיסכמיה כלייתית/פגיעה חוזרת (למשל, miR-16 ו miR-21; בעוד שאחרים מזיקים (למשל, miR-182; ר' 97).

למרות שנראה ש-miRNAs ניתנים להפרדה לתפקוד אבובתי פרוקסימלי, הם חיוניים לנפרונים דיסטליים ולהומאוסטזיס של צינור איסוף (79, 88, 98). איסוף השבתה ספציפית לצינור של Dicer וגנים קריטיים אחרים הקשורים לביוגנזה ל-miRNA (כולל Dgcr8, Ago1, 2, 3 ו-4) גורם לאי ספיקת כליות בעכברים בוגרים בגלל פיברוזיס פרוגרסיבי של tubulointerstitial ודלקת בין תאי (88). קדם לזה מעבר אפיתל-מזנכימלי חלקי (EMT) של תאי איסוף צינור, וויסות מטה של ​​בני משפחת miR-200, המעכבים EMT (88). באופן דומה, אבלציה של Dicer או Dgcr8 מנגזרות של נפרון דיסטלי ושל ניצני השופכן, בהתאמה, גורמת להפרעות כליות ואי ספיקת כליות (78, 98), אשר בסופו של דבר קשורות להורדת ויסות של בני משפחת miR-200 (98). ביטוי מוגבר של גן היעד miR -200 Pkd1 בעכברים מוטנטים אלה משבש טובולוגנזה ומייצר מבנים דמויי ציסטה (98). ההבדלים הללו בדרישה ל-miRNAs פונקציונליים בצינוריות פרוקסימליות ובצינור נפרון/איסוף דיסטלי עשויים להיות מוסברים על ידי התפלגות מגזרית של mirRNAs לאורך הנפרון וצינור האיסוף בכליות WT (88).

מחיקת Dicer בתאים המפרישים רנין במנגנון ה-juxtaglomerular מביאה לחסר של תאים juxtaglomerular, רמות רנין מופחתות במחזור הדם וכתוצאה מכך הפחתה בלחץ הדם העורקי, ירידה בתפקוד הכליות, דפוס פסים של פיברוזיס בין-סטיציאלי, והפרעות בכלי הדם (89). הירידה בתאים juxtaglomerular מציעה דרישה עבור miRNAs בוגרים בשמירה על הפנוטיפ שלהם. מאוחר יותר, miR-330 ו-miR-125b-5p זוהו כמועמדים פוטנציאליים המעכבים או מקדמים, בהתאמה, את הפנוטיפ של השריר החלק של תאים יוקסגלומרולריים (99).

תחומי מחקר פעילים אחרים על miRNAs בפגיעות כליות חריפות (8-10), מחלת כליות פוליציסטית (11) והשתלת כליה (10), טופלו באופן מקיף בסקירות אחרונות אחרות.

MiRNAs במחלות כליה ילדים בחלק זה, אנו מספקים סקירה כללית של התפקיד של miRNAs במחלות כליה התפתחותיות, כולל גידולי CAKUT ו-Wilms. CAKUT הם בין הצורות השכיחות ביותר של מומים בלידה, המשפיעות על כ-3-7 מתוך 1000 לידות חי (100). הפרעה בהתפתחות הכליות ודרכי השתן התחתונות מובילה למגוון רחב של ביטויים קליניים שנצפו ב-CAKUT, כולל חריגות בכליות (כלומר, אגנזיס כליות, היפופלזיה ודיספלסיה כלייתית, וכליות דיספלסטיות מולטיציסטיות), חריגות השופכה (כלומר חסימת צומת השופכה), מערכת איסוף דופלקסית, ואנומליות של שלפוחית ​​השתן והשופכה (101-103). הטרוגניות פנוטיפית זו נובעת ככל הנראה מאינטראקציות מורכבות בין גורמים סביבתיים גנטיים, אפיגנטיים ו/או טרום לידתיים המשפיעים על התפתחות הכליות ודרכי השתן התחתונות, וכתוצאה מכך CAKUT (101). רוב הידע הנוכחי שלנו על פתוגנזה של CAKUT נבע ממודלים של עכברים וצורות תסמונות של CAKUT. מחקרים אלו הובילו לזיהוי של מספר גנים של CAKUT, שרבים מהם מעורבים בהתפתחות מוקדמת של הכליות, כולל PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2, ואחרים (101, 104, 105). עם זאת, מוטציות בודדות או וריאנטים של מספר עותק בגנים מקודדי חלבון אינם מסבירים את רוב מקרי CAKUT (~80%) (101, 106).

כפי שהוזכר לעיל, דלדול של מירנאים בוגרים משושלות תאים שונות של הכליה המתפתחת במודלים של עכברים גורמת להפרעות בכליות המחקות CAKUT אנושי (73, 74, 78, 79). בנוסף, מחיקות קו הנבט של MIR17HG, המקודד את אשכול miR-17~92, גורמות לתסמונת Feingold מסוג 2 בבני אדם (107). למרות שפנוטיפ כליות בחולי תסמונת Feingold סוג 2 עם מוטציות MIR17HG נותר בלתי מוגדר, שכיחות של 18% של CAKUT דווחה במקרים של תסמונת Feingold הקשורים למוטציות MYCN (108, 109). יחד, תצפיות אלו מצביעות על כך שמוטציות ב-miRNA המתבטאות במהלך התפתחות הכליות עשויות לגרום ל-CAKUT בבני אדם, במיוחד מכיוון ש-miRNA רבים נשמרים מאוד בין עכברים לבני אדם.

כדי לבחון השערה זו, מחקר אחד חקר 1248 מטופלים עם CAKUT לא תסמונתית מ-980 משפחות וחיפש מוטציות ב-96 אזורי לולאת גזע של 73 גנים התפתחותיים של מיRNA בכליות (106). בתוך קבוצה זו זוהו 31 אנשים עם 17 וריאנטים שונים של נוקלאוטידים בודדים המשפיעים על 16 גנים שונים של miRNA. בין אלה, נמצאו שתי גרסאות חדשות ב-miRNAs שעלולות להיות פתוגניות. MIR19B1 (חבר במקבץ miR-17~92) היה קשור לנוכחות של אגנזיס כליות ימני, ו-MIR99A היה קשור לרפלוקס vesicoureteral חמור ופטוזיס בכליות. המספר הנמוך באופן מפתיע של וריאנטים פתוגניים מועמדים נובע בחלקו מהמגבלות של מחקר זה, שכן הניתוח הביא רק למוטציות בגנים של miRNA שנכללו בגישת הגנים המועמדים ולא זיהה שינויים במספר העתקים וסידורי DNA גדולים (106) .

בגישה חלופית, מקטעי שופכן מחולים עם מגוון של CAKUT נותחו לביטוי תעתיק דיפרנציאלי באמצעות מיקרו-מערך, עבור נוכחות של יעדי miRNA חזויים ביו-אינפורמטיים, ו-miRNA בוגרים באמצעות qPCR (110). באמצעות גישה רב-שכלית זו, זוהו שבעה miRNA עם תפקידים פוטנציאליים ב-CAKUT, ובין אלה, has-miR-144 גדל באופן משמעותי בחולים עם CAKUT. ניתוח אונטולוגיה של גנים הצביע על כך שגנים חזויים של has-miR-144 תורמים לתהליכים ביולוגיים המעורבים בפיתוח CAKUT, כולל פיתוח צינור (22 גני מטרה), פיתוח מערכת אורוגניטלית (18 גני יעד), פיתוח כליות (14 גני מטרה) , ופיתוח איברים עובריים (18 גני מטרה) (110).

יש צורך במחקרים נוספים כדי להגדיר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפקידים הפתוגניים של miRNAs ב-CAKUT. ממצאים ממחקרים כאלה יהיו קריטיים בשיפור הטיפול בחולים עם CAKUT ובמניעת התקדמותם ל-CKD, במתן ייעוץ גנטי מתאים לחולים ובני משפחותיהם, ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.