מתיל ג'סמונט מעורר תגובות טאנין, פאבונואידים ופיטו-אוקסיליפין ניתנים להידרוליזה ייחודיים בעלי רימון (Punica Granatum L.) חלק 1

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

תַקצִיר:מתיל יסמונט (MeJA) המיוצר בצמחים יכול לתווך את תגובתם ללחצים סביבתיים. יישום אקסוגני של MeJA הוכח גם כמפעיל מסלולי איתות ומעורר הצטברות phytoalexin במיני צמחים רבים. כדי להבין כיצד צמחי רימונים מגיבים ביוכימית ללחצים סביבתיים, בוצע ניתוח מטבוליטים בעלי רימון הנתונים ליישום MeJA וחשף שינויים ייחודיים בטאנינים הניתנים להידרוליזה, פלבנואידים ופיטו-אוקסיליפינים. בנוסף, ניתוחי תעתיק ו-qPCR בזמן אמת של עלי רימון מדומה ו-MeJA זיהו גנים מטבוליים וגורמי שעתוק בעלי ביטוי דיפרנציאלי העשויים להיות מעורבים בשליטה שלניתן להידרוליזהמסלולי טאנין, פלבנואידים ופיטו-אוקסיליפין. אפיון מולקולרי, ביוכימי וביואינפורמטי של היחידליפוקסיגנאזעם ביטוי מתמשך, המושרה על ידי MeJA, הראה שהוא מסוגל לחמצן חומצות שומן רב בלתי רוויות, אם כי אינו ממוקם בתא התת-תאי בו הופקו פיטו-אוקסיליפינים שאינם יסמונאטים (שאינם JA). תוצאות אלו הציעו יחדיו כי בעוד שהדיכוי הרחב של פלבנואידים ואנתוציאנינים נשלט לפחות חלקית ברמת התעתיק, הביוסינתזה המושרה של non-JAפיטו-אוקסיליפיניםככל הנראה אינו מוסדר באופן תעתיק. בסך הכל, הבנה טובה יותר של האופן שבו עלי הרימון מגיבים ללחצים סביבתיים לא רק תקדם את בריאות הצמח ופריון אלא גם תשפיע על בריאות האדם שכן פירות המיוצרים על ידי צמחי הרימון הם מקור עשיר לתרכובות תזונתיות.

מילות מפתח:מתיל יסמונט.פלבנואיד·אנטוציאנין· חומצת שומן.פיטו-אוקסיליפין· Lipoxygenase

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

מבוא

כאשר נפצעים או מותקפים על ידי אוכלי עשב ופתוגנים, צמחים מייצרים ופולטים מתיל יסמונט (MeJA), אשר נתפס על ידי רקמות צמחים לא פצועים וצמחים שכנים כדי להפעיל תגובת הגנה (Cheong and Choi 2003). בנוסף, יישום אקסוגני של MeJA לצמח הוכח כמעורר מסלולי איתות כמו גם ייצור של חלבונים הקשורים לפתוגנזה וכימיקלים הגנה הידועים בשם phytoalexins. פיטואלקסינים פנוליים, למשל פלבנואידים ואנתוציאנינים, הפגינו הצטברות מוגברת בתגובה לטיפול ב-MeJA בצמחים שונים, כגון Arabidopsis thaliana, ענבים (Vitis vinifera), בננה (Musa acuminate), תפוח (Malus Domestica) ופטל אדום (Rubus idaeus). )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res and Ruiz del Castillo 2014). הביוסינתזה של פלבנואידים ואנתוציאנינים מתחילה עם היווצרות של נרינגנין צ'לקון מקומארויל CoA ושלוש מולקולות של מלוניל CoA המזוזות על ידי כלקון סינתאז (CHS) והאיזומריזציה שלאחר מכן של נרינגנין צ'לקון לנרינגין על ידי chalcone isomerase (CHI). לאחר מכן נעשה שימוש ב- Naringenin ליצירת שלדי הליבה של פלבנואידים ואנתוציאנין, אשר עוברים שינויים נוספים עם קבוצות פונקציונליות של גליקוזיל, מתיל, הידרוקסיל ופרניל כדי להוליד מבנים ותפקודים מגוונים (Tian et al. 2008).

Cistanche יכול לשפר חסינות

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>דמיון של 75 אחוז) ואינם מכילים פפטיד אות, ואילו ל-LOXs מסוג II יש דמיון כללי ברצף נמוך (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

רימון (Punica granatum L.) הוא יבול גננות מיוחד המוערך בשל התרכובות הפנוליות השופעות בפירותיו, כגון פלבנואידים, אנתוציאנינים וטאנינים ניתנים להידרוליזציה (HTs) המופקים מאמצעי ביניים של מסלול השיקימט (Ono et al.2016 ). מחקרים רבים התמקדו עד כה בתפקידם של פנולי רימונים בהקלה על מתחים ומחלות בבני אדם (Wu and Tian 2017). לעומת זאת, מעט ידוע על תפקודם של פנולים ופיטוכימיקלים אחרים בהגנה על הרימון מפני גורמים אביוטיים וביוטיים (למשל פצעים, פתוגנים, אינדוקציה של MeJA) בעלים ובפירות. שני דוחות עדכניים העריכו טיפול MeJA לפני הקציר באיכות שלאחר הקציר של פירות הרימון (קושש סבא וזראי 2019; Garcia-Pastor et al.2020). סך האנתוציאנינים, הפלבנואידים והפנולים של פירות שטופלו ב-MeJA, אך לא עלים, נותחו באופן קולקטיבי באמצעות ספקטרופוטומטר. אחד המחקרים גם ניתח אנתוציאנינים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה (Garcia-Pastor et al.2020). עם זאת, עדיין לא ברור כיצד רקמות צמחי הרימון, עלים או פירות, מגיבות ללחצים סביבתיים לפני עריכת הפרי.

כדי להתחיל לנתח אינטראקציות בין צמחי רימון וגורמים סביבתיים, חקרנו את התגובה המטבולית של עלי רימון ליישום MeJA אקסוגני באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) וכרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרוספרייז טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-MS/MS) . שינויים ייחודיים ב-HTs, פלבנואידים ואנתוציאנינים כמו גם שינויים בשומנים, חומצות שומן ופיטו-אוקסיליפינים נצפו בעלי רימון שטופלו ב-MeJA. ניתוח תנסקריפטום השוואתי, מאומת על ידי ניתוח qPCR בזמן אמת, גילה כי גנים מבניים ו/או רגולטוריים המעורבים במטבוליזם של HT, פלבנואיד, אנתוציאנין ופיטו-אוקסיליפין באו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בעלי רימון מדומה ו-MeJA. הגן היחיד של LOX שהציג ביטוי מווסת מתמשך בעלים שטופלו ב-MeJA היה נתון לאפיון מולקולרי, ביוכימי ופילוגנטי נוסף.

חומרים ושיטות

כימיקלים

תקני -glucogallin ו- pentagalloylglucose נרכשו משנגחאי Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (שנחאי, סין). כימיקלים המשמשים במבחן LOX הושגו מהספקים הבאים: 3-(dimethylamino)benzoic acid (DMAB)(Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, China), acid linoleic(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב),3-מתיל-2-בנזותיאזולינון (MBTH) והמוגלובין (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, סין).

חומרים צמחיים

פירות וזרעי רימונים (ק"ו נפלאים) סופקו בנדיבות על ידי האקדמיה למדעי החקלאות והיער של פנז'יהואה וזוהו על ידי ד"ר Binjie Ge בגן הבוטני של שנחאי צ'נשן. דגימת שובר (מס' CSHO173966) הופקדה בעשב של הגן הבוטני של שנחאי צ'נשאן, שנגחאי, סין. שתילי רימונים גודלו בחדר גידול מבוקר טמפרטורה במשך 6 שבועות ב-25 מעלות ו-16 שעות בהיר/8 שעות כהה. ריכוז MeJA ליישום ריסוס על רקמות צמחים נע לפי הדיווחים בין 100 ל-250 מיקרומטר (Ku et al.2014; Hickman et al.2017). ריכוזים שונים של MeJA יושמו בתחילה על עלי רימון, מתוכם 200μM MeJA הובילו לתגובה מטבולית ניתנת להבחין בניתוח המקדים ושימשו לניתוחי המטבוליטים וביטוי הגנים המתוארים במחקר זה. לפני טיפול MeJA, מחצית מצמחי הרימון הועברו לחדר גידול אחר עם תנאים דומים. בעוד שצמחים בחדר גידול אחד רוססו ב-200 מיקרומטר MeJA, אלו בחדר הגידול השני רוססו במים (כלומר בקרה מדומה). ב-2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h,and72-h לאחר הטיפול, יוצא מ-3 אוחדו עד 5 צמחים שטופלו בדומה או ב-MeJA, המהווים שכפול ביולוגי אחד. שלושה שכפולים ביולוגיים נאספו עבור ניסויי הטיפול המדומה וה-MeJA; כל שכפול ביולוגי חולק למנות עבור פרופיל מטבוליטים וניתוח ביטוי גנים.

ניתוח פרופיל מטבוליטים

עלי הרימון עברו ליאופיל, שקלו וטחנו לאבקה דקה באמצעות חרוזי זירקוניה במקצף חרוזים (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, גרמניה) עבור שנות ה-90 ב-30 הרץ. לצורך ניתוח HPLC, דגימת העלים חולצה ב-70 אחוז מתנול למשך 60 דקות תחת צלילי קול וצנטריפוגה ב-13,000 סל"ד למשך 10 דקות. הסופרנטנט הועבר לבקבוקון HPLC, שמתוכו הוזרק 30μL ל-HPLC פאזה הפוכה (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ארה"ב) ונותח כפי שתואר קודם לכן (Wil-son et al.2019). מטבוליטים זוהו על ידי ספיגת UV ב-254 ננומטר, 280 ננומטר, 320 ננומטר ו-360 ננומטר. עקומות כיול סטנדרטיות של -גלוקוגלין ופנטגלוילגלוקוז נבנו; הם שימשו להמרת אזורי הפסגות התואמים את זמני השמירה וספקטרום הספיגה של גלוקוגלין ופנטגלוילגלוקוז לריכוזים המתאימים.

לניתוח LC-ESI-MS/MS, דגימת העלים ההומוגנית (100 מ"ג) חולצה ב-1 מ"ל של 70 אחוז מתנול ב-4 מעלות Covernight. למחרת, התמצית המתנולית עברה צנטריפוגה ב-10 ,000×g למשך 10 דקות והסופרנטנט הועבר דרך מחסנית CNWBOND Carbon-GCB SPE (ANPEL, שנחאי, סין) ומסנן מזרק 0.22-מיקרומטר (ANPEL) לפני ניתוח מטבוליטים.

התמצית （2 μL） נותחה באמצעות LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, קיוטו, יפן; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, ארה"ב) ועמודת C1s הפוכה (ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 מ', 2.1 מ"מ×100 מ"מ, ווטרס, מילפורד, MA, ארה"ב). מטבוליטים נפלטו באמצעות מים ממסים(A) המכילים 0.04 אחוז חומצה אצטית ,ו(B)אצטוניטריל המכיל 0.04 אחוז חומצה אצטית בשיפוע של 0-11 דקות,95-5 אחוז A;11-12 דקות,5 אחוז A;12-12.1 דקות ,5-95 אחוז A;12.1-15דקה,95 אחוז A.קצב הזרימה נשמר על 0.4 מ"ל דקות-1. סריקות מלכודת יונים ליניארית (LIT) וסריקות משולשות quadrupole (QQQ)MS נרכשו במצבי יונים חיוביים ושליליים. מקור יוני ספריי טורבו הופעל ב-500 מעלות צלזיוס עם מתח יינון של 5500 V. גז מקור היונים I, גז I וגז הווילון נקבעו ל-55 psi, 60 psi ו-25 psi, בהתאמה. גז ההתנגשות (חנקן) נקבע על 5 psi. עבור ניתוח MRM, פוטנציאל שחרור (DP) ואנרגיית התנגשות (CE) אופטימיזו עבור כל מעבר יון מבשר-תוצר.

For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 נחשבו להשתנו באופן משמעותי.

ניתוח טרנסקריפטום

סך ה-RNA הופק מעלי רימון באמצעות ריאגנט TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, ארה"ב) וכומת באמצעות Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). שלמות דגימות ה-RNA אומתה באמצעות הפרדה על ג'ל אגרוז (ללא פירוק נראה לעין) וקביעת היחס OD20/28o (בין 1.8 ל-2.2) באמצעות Nanodrop2000. העשרת mRNA מ-RNA הכולל בוצעה באמצעות החרוזים המגנטיים אוליגו (dT) (Invitrogen). ספריות mRNA-Seq נבנו באמצעות ערכת ההכנה לספריית Truseq RNA (Illumina, San Diego, CA, ארה"ב). ניתוח טראנסקריפטום בוצע על Illumina HiSeq4000 והתקבלו 55-60 מיליון 150-bp קצה מזווג קריאה (PE150) עבור כל ספריית דוגמה.

נתוני הרצף הגולמיים עובדו על ידי הסרת רצפי המתאם וכן קצרים (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS:GitHub. com/Joshi/sickle).Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1, וערך P מותאם<>

ניתוח qPCR בזמן אמת

סך ה-RNA הופק מעלי רימון מדומה ו-MeJA באמצעות ערכת RNAprep Pure Plant (Tiangen Biotech Co., Ltd., בייג'ינג, סין). שעתוק הפוך (RT) בוצע באמצעות RNA כולל ו-PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Kusatsu, יפן). PCR כמותי (qPCR) בוצע באמצעות ערכת TB GreenTM Premix Ex Taq TM(Tli RNaseH Plus) ( Takara) ומערכת StepOnePlus בזמן אמת PCR (Ther-moFisher Scientific). בוצע ניתוח עקומת התכה והראה תוצר הגברה יחיד עבור כל זוג פריימר. עבור ניתוח RT-qPCR, נבדקו שלושה שכפולים ביולוגיים וכל אחד עם שלושה שכפולים טכניים עבור דגימות מדומה ו-MeJA שטופלו. ביטוי גנים נותח בשיטת C,(△AC) ההשוואתית (Livak and Schmittgen 2001), ורמות המובהקות נקבעו באמצעות מבחן t דו-זנב של Student. רצפי הפריימר לניתוח qPCR בזמן אמת ויעילות ההגברה של צמדי הפריימר מוצגים בטבלה S1.

ביטוי וטיהור של חלבונים רקומביננטיים ומבחני אנזימים

מסגרת הקריאה הפתוחה של Pgr025417 (המקודדת LOX משוער) סונתזה לשימוש אופטימלי בקודונים ב-E. coli (Genewiz, Suzhou, סין) ושובטה ב-pET28a. הפלסמיד הרקומביננטי עבר טרנספורמציה ל-E. coli BL21 (DE3) תאים. תרבית 5-מ"ל Luria Bertani (LB) עם 50 ug מ"ל-Ikanamycin התחילה ממושבה יחידה והודגרה למשך הלילה עם ניעור ב-37C. תרבית הלילה שימשה כדי לחסן מדיום 100-mL LB עם 50ug mL-'kanamycin והותרה לגדול ל-OD600 של 0.5. לאחר מכן הוסף איזופרופיל- -D-thiogalactoside(IPTG) לריכוז סופי של 0.1 mM להשראת ביטוי חלבון. לאחר דגירה עם ניעור ב-16 מעלות במשך 18 שעות, התאים נקצרו באמצעות צנטריפוגה. כדורי התאים הושעו מחדש במאגר התמוגה (50 mM NaH, PO, pH 7.4,300 mM NaCl, 10 mM imidazole) והומוגגו באמצעות משבש תאים (Constant Systems Ltd, Northants, בריטניה). החלבונים המתויגים שלו טוהרו באמצעות חרוזי Ni-NTA (ThermoFisher Scientific) עם חיץ הכביסה (50 מ"מ NaH,PO, pH 7.4,300 מ"מ NaCl, 25 מ"מ אימידאזול) ומאגר האלוציה (50 מ"מ NaH, PO, pH 7.4,300 מ"מ NaCl, 500 מ"מ imidazole). החלבונים המטוהרים הופרדו על גבי ג'ל SDS-PAGE של 10 אחוז להדמיה של טוהר החלבון. ריכוז החלבונים המטוהרים נקבע באמצעות מבחן Bradford (Bradford 1976).

עבור בדיקת LOX, חומצה לינולאית שימשה כמצע בשיטה קולורימטרית דו-שלבית עם שינויים קלים (Anthon ובארט 2008). תערובת התגובה 500-μL, כולל 50 mM Na-phosphate, pH 6, 10 mM DMAB, 0.5 mM לינולאית, וכמויות שונות של חלבונים רקומביננטיים מטוהרים (1.5 mg mL-), הודגרה ב-25 מעלות למשך 10 דקות. לתערובת התגובה נוספה תמיסה שנייה (500 μL) המכילה 0.2 מ"מ MBTH ו-0.1 מ"ג מ"ל-'המוגלובין, שהודגרה למשך 5 דקות נוספות. התגובה הופסקה על ידי הוספת 500μL 1 אחוז (w/v) נתרן לאוריל סולפט. נקבעה ספיגת אור ב-598 ננומטר.

לוקליזציה תת-תאית וניתוחים פילוגנטיים

חיפוש בגנום הרימון המצוין (Qin et al. 2 0 17) זיהה 1L LOXs באורך מלא (786 AA ל- 970 AA), כולל PGR025413, PGR020032, PGR025418, PGR025417, PGRO182828 (PGRO18, (PGRO18, PGRO18, PGO18, PGRO182, PGRO18282, PGRO18282, PGRO182828282828282, רצף באורך מלא ב-GenBank XP_031395793),Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 ו-PgrO13780. אתרי לוקליזציה תת-תאיים ואתרי ביקוע של פפטידי אות עבור ה-LOX של הרימון נחזו באמצעות TargetP 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/)(Almagro Armenteros et al.2019).

ניתוח אתר מחייב TF

כדי לחזות את אתרי הקישור של TFs, 1000 bp במעלה הזרם של קודון ההתחלה של ATG של גני המטרה הושגו מ-GenBank ונבדקו נגד Eucalyptus Grandis TFs ב-PlantRegMap (גרסה 5) (Tian et al.2020). ערך הסף לקישור זיהוי האתר הוגדר ל-P פחות או שווה ל-le-4.

ניתוח סטטיסטי

ניתוח סטטיסטי לכימות המטבוליטים, תעתיק ונתוני qPCR בזמן אמת מתואר בסעיפים המתאימים.

תוצאות

MeJA מווסת את איתות התא ואת מסלולי חילוף החומרים בעלי הרימון

כדי להבין את תגובת התעתיק הגנום של רימון לגיוס MeJA, תעתיקים של עלי רימון ב-2-h,6-h,24-h ו-72-h לאחר MeJA או טיפול מדומה (כל אחד עם שלושה שכפולים ביולוגיים) נותחו (איור S1). כ-55 מיליון קריאות רצף גולמיים (2×150 bp קצה זוגי) התקבלו עבור כל תעתיק עם תוכן GC בסביבות 52 אחוז וערכי Q30 שנעים בין 91.6 ל-95 אחוז (טבלה S2). עבור כל התעתיקים, יותר מ-96 אחוז מקריאות הרצף המנוקות מופו לגנום הרימון הייחוס (Qin et al.2017)(טבלה S3). רוב התמלילים שנאספו היו פחות מ-1000 bp (34.3 אחוז), 1000bp— 2000 bp (32.9 אחוזים), או 2000 bp-3000 bp (18.1 אחוזים) (טבלה S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, מותאם P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="">

גנים של מסלולי שיקימט ו-HT ומטבוליטים של HT הושררו ב-MeJA-טופלו עלים של רימון כפי שנחשף בניתוח העשרה של מסלולי התעתיק ו-KEGG, שלושה גנים למסלול ביו-סינתטי של שיקימט הראו ביטוי מווסת בעלים שטופלו ב-MeJA ביחס לבקרות מדומה ב-{{3 }}h, כולל 3-deoxy-D-arabinose-heptulosonate-7-phosphate synthase (DAHPS), 3-dehydrogenate synthase(DHS), וה-3-dehydrogenate dehydrase הדו-פונקציונלי/ shikimate dehydrogenase (DHQ/SDH; בקיצור SDH)(Figs.S1b ו-la). בפרט, זוהו שלוש איזופורמות של SDHs רימון והראו ביטוי דיפרנציאלי בניתוח התעתיק, Pgr020271, Pgr019030 ו-Pgr019029,

כדי לקבוע אם שינויים בכמות תעתיקי הגנים הביוסינתטיים של shikimate ו-HT עשויים להשפיע על רמת המטבוליטים שמקורם במסלולים אלה, חולצו מטבוליטים פנוליים מעלים שנקטפו ב-24-h, 30-h. 36-h,48-h ו-72-h לאחר יישום MeJA או מדומה ונותחו על ידי HPLC(איור 2). יש לציין שנקודות זמן אלו נבחרו כדי לתת את הדעת על הזמן הדרוש לסינתזת חלבון וייצור והצטברות מטבוליטים לאחר שינויי הביטוי שנצפו של גנים ביו-סינתטיים של shikimate ו-HT בשעה 6-. זמני השמירה וספקטרום הספיגה של שני מטבוליטים שנפלטו לאחר 4.57 דקות (שיא 1) ו-24.98 דקות (שיא 2) התאימו לאלו של תוצרי הביניים של מסלול ה-HT - גלוקוגלין וסגסוגות פנטה-גלוקוז, בהתאמה (איורים la ו-2a). שתי הפסגות הראו שינויים משמעותיים באזורי שיא משולבים במספר נקודות זמן (איור 2ב). באופן ספציפי, שיא 1 עלה בעלים שטופלו ב-MeJA ביחס לבקרות מדומה ב-30-h, 36-h ו-48-h(איור 2ב). מעניין, שיא 2 בעלים שטופלו ב-MeJA ירד בתחילה ב-24-h, אך לאחר מכן עלה ב-30-h ו-36-h לפני שחזר לרמה הדומה לפקדים מדומים ב-48- h ו-72-h (איור 2ב).

הפחתה של רוב הפלבנואידים והאנטוציאנינים, כמו גם עלייה בפלבונים ופלבנולים מתילטים, ניכרה בעלי רימון שטופלו ב-MeJA

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; טבלאות S5 ו-S6). עבור המטבוליטים שהצטברו באופן דיפרנציאלי, הייתה העשרה כוללת של מטבוליטים המעורבים במטבוליזם משני/מתמחה בצמח (67 מתוך 102), במיוחד תרכובות פנוליות (63 מתוך 102) (טבלה S6).

בקרב פנולים, הפחתה מתואמת במגוון רחב של פלבנואידים ואנתוציאנינים (42 מתוך 73 התרכובות המופחתות) ניכרה בעלים שטופלו ב-MeJA (איור 3; טבלה S6). באופן מסקרן, שלושה פלבונים ופלבנולים מונו-או-די-O-מתילטים, כולל די-O-מתיל קוורצטין, כריסובריל O-hexosyl-O-hexoside, ומוכר 5-O-hexoside, עלו בעלים שטופלו ב-MeJA (איור 3; טבלה S6). מספר תוצרי ביניים של מסלולי הפלבנואידים והאנטוציאנין, כולל לוטאולין, כריסובריל, דיהידרוקאמפרול, דיהידרוקוורצטין, דיהידרומיריצין, אפיקאטכין, דלפינידין ופלרגונידין, היו ניתנים לזיהוי אך לא הראו שינויים משמעותיים בעלים שטופלו ב-MeJA (איור 3; Table). נגזרות של הידרוקצין-נמויל, איזופלבונים וקומרינים היו בין שאר הפנולים שהראו הצטברות מופחתת בהשראת MeJA (טבלה S6). לעומת זאת, שתי חומצות פנוליות, חומצה 2,3-די-הידרוקסי-בנזואית וחומצה פרוטוקטכואית (3,4-חומצה די-הידרוקסי-בנזואית), וקומרין, 6-מתיל קומרין, עלו בעלים שטופלו ב-MeJA (טבלה S6).

תואם את הפלבנואידים והאנטוציאנינים המופחתים במידה רבה בעלי רימון שטופלו ב-MeJA, התמלילים של שני אנזימים מרכזיים לביו-סינתזה של פלבנואידים ואנתוציאנין. CHS(Pgr005566)ו-CHI (Pgr025966), ירדו באופן מובהק ב-6-h ו-24-h לאחר יישום MeJA לפי ניתוח התעתיק (איור 4). ניתוח qPCR בזמן אמת בוצע כדי לבחון ביטוי CHS ו-CHI עם נקודות זמן נוספות, כולל 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h, ו-72-h (איור 4). תמלילי CHS ירדו בעלים שטופלו ב-MeJA ב-3-h ונשארו נמוכים משמעותית מאלו המדומה שולט עד 72-h, עם הירידה הגדולה ביותר ב-12-h. לעומת זאת, הפחתה בביטוי CHI הייתה משמעותית רק ב-24-h, 48-h ו-72-h לאחר הטיפול ב-MeJA (איור 4).

מאמר זה מופק מ-Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9