תמצית עלי אברוס פרקטוריוס הופכת את מחלת הסוכרת הנגרמת על ידי אלוקסן/ניקוטינאמיד בחולדות באמצעות אפנון הורמונלי (אינסולין, GLP-1 וגלוקגון) ואנזימטי (-עמילאז/ - גלוקוזידאז) חלק 1

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

רקע כללי

Abrus precatorius משמש ברפואה עממית ברחבי אזורים אפרו-אסייתיים בעולם. מוקדם יותר, השפעות הפחתת הגלוקוז והלבלב של תמצית עלי אברוס (APLE) אושרו בניסוי בחולדות סוכרתיות הנגרמות על ידי STZ/ניקוטינאמיד; עם זאת, המנגנון הבסיסי של אפקט אנטי-סוכרתי והגנה על הלבלב נותר לא ידוע. מַטָרָה. מחקר זה הבהיר מנגנונים אנטי-סוכרתיים והשפעות הגנה על הלבלב של APLE בחולדות סוכרתיות. חומרים ושיטות. APLE הוכן בשיטת מיצוי אתנול/סוקסלה. סך כל הפנולים והפלבנואידים כמתו קלומטרית לאחר ההקרנה הפיטוכימית הראשונית. סוכרת (DM) הוקמה בחולדות Sprague-Dawley בוגרות (במשקל 120-180 גרם) משני המינים על ידי הזרקה יומית רציפה של ניקוטינמיד (48 מ"ג/ק"ג; ip) ואלוקסן(120 מ"ג/ק"ג; ip) על פני תקופה של 7 ימים. פרט לחולדות בקרה שלהן היה גלוקוז בצום בדם (FBG) של 4.60 mmol/L, חולדות עם FBG יציב (16-21 mmol/L) 7 ימיםפוסט ניקוטינמיד/אלוקסןזריקה נחשבה סוכרתית והוקצו מחדש באופן אקראי לאחת מהקבוצות הבאות (מודל, APLE (100, 200 ו-400 מ"ג/ק"ג, בהתאמה; PO) ומטפורמין (300 מ"ג/ק"ג; PO)) וטופלו מדי יום במשך 18 ימים . משקל גוף ו-FBG נמדדו כל 72 שעות במשך 18 ימים. ביום 18, חולדות הקריבו קורבן מתחת לעומקהַרדָמָה; איברים (כליות, כבד, לבלב וטחול) בודדו ונשקלו. דם נאסף להערכת אינסולין בסרום, גלוקגון ו-(LP-1 באמצעות ערכת ELSA מיוחדת לחולדות. הלבלב עבר עיבוד. נחתך, ו-H&E נצבע לבדיקה היסטולוגית. השפעת APLE עלאנזימטיהפעילות של אלפא (a)-עמילאז ו-glucosidase הוערכה. תכונות נוגדות חמצון ורידיקלים חופשיים של APLE הוערכו בשיטות סטנדרטיות. תוצאות. APLE הפחית, תלוי במינון, את ה-FBG הראשוני ב-68.67 אחוז, 31.07 אחוז ו-4.39 אחוז בהשוואה למודל (4.34 אחוז) ומטפורמין (43.63 אחוז). טיפול APLE (100 מ"ג/ק"ג) החזיר את הירידה במשקל ביחס למודל. APLE העלה את האינסולין וה-GLP בסרום-1 אך הפחית את הגלוקגון בסרום ביחס למודל. APLE הגדיל הן את המספר והן את שטח החתך החציוני (×10 מעלות אום') של איי הלבלב בהשוואה לזה של המודל. APLE יצר עיכוב תלוי ריכוז של -עמילאז ו-glucosidase ביחס לאקרבוז. APLE סילק DPPH ותחמוצת חנקן (NO) רדיקלים, תלוי בריכוז, והדגים יכולת נוגדת חמצון מפחיתה ברזל מוגברת (FRAC) ביחס לתקנים. סיכום. ההשפעה האנטי-סוכרתית של APLE מתווכת באמצעות אפנון של אינסולין ו-GLP-1 הפוך לגלוקגון, עיכוב לא-תחרותי של c-עמילאז ו-glucosidase, ניקוי רדיקלים חופשיים והחלמה של תאי לבלב פגומים/נקרו-אפופטוזיס.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

1. הקדמה

סוכרת (DM) היא אחת מהתסמונות המטבוליות המאופיינת בהיפרגליקמיה כרונית, ששיאה מחוסר ויסות של חילוף החומרים של גלוקוז, משני לליקויים בתפקוד תאי הלבן-קריאטי [1]. מבחינה פתולוגית, DM הוא תוצר של שגיאות בחילוף החומרים של גלוקוז עקב ליקויים בתפקוד תאי הלבלב אשר גורמים לחוסר אינסולין (סוג 1 DM) או עמידות לאינסולין (DM 2). תסמינים שכיחים של DM כוללים פוליפגיה, פולידיפסיה, ראייה מטושטשת, אובדן כרוני במשקל גוף, גסטרופרזיס ופוליאוריה [2]. עם הזמן, היפרגליקמיה שלא נפתרה מעלה את הסיכון לסיבוכים מיקרו-וסקולריים של DM כגון נפרופתיה סוכרתית, רטינופתיה סוכרתית ונוירופתיה סוכרתית [2]. סיבוכים אלה מתרחשים עקב עקה חמצונית נרחבת ושומניםחמצוןשהם תוצרי לוואי של תגובות בין גלוקוז למולקולות ביולוגיות [3]. גליקוזילציה נרחבת של מולקולות ביולוגיות כגון DNA, חלבונים ושומנים מובילה ליצירת תוצרי ביניים ביוכימיים לא יציבים המשמשים כמקורות למיני חמצן תגובתיים (ROS) ולמיני חנקן (RNS). בתאים ורקמות שונות [3].

מבחינה אפידמיולוגית, דווח כי DM משפיע על למעלה מ-387 מיליון אנשים ברחבי העולם [4]. הערכה זמנית זו צפויה לגדול ל-592 מיליון עד שנת 2035 [5]. בתחילה, DM נחשב למבוגרים, אך כעת, הוכח כי DM אינו תלוי בגיל, מה שמראה בבירור את גודל האיום הנשקף על ידי DM לבריאות עולמית.

Cistanche יכול לשפר חסינות

באופן קונבנציונלי, הטיפול ב-DM (סוגים 1 ו-2) כרוך בשימוש בתרופות אנטי-סוכרתיות, המקובצות כאינו-אינסולין (כולל הביגואנידים (למשל, מטפורמין), סולפונילאוריאה (למשל, glyburide), SGLT-2 מעכבי (למשל, דפאגליפלוזין), חומרי ספיגה של חומצות מרה (למשל, colesevelam), עמילין חיקוי (למשל, פרמלינטיד), אגוניסט דופמין-2 (למשל, ברומוקריפטין), מעכבי DPP-4 (למשל, sitagliptin), GLP{{5 }}RAs (למשל, exenatide), תיאזולידינדיון (למשל, רוזיגליטזון), ומעכבי גלוקוזידאז (למשל, Acarbose ו-voglibose)) ואינסולין (למשל, אינסולין אנושי ואנלוגים) [6]. הטיפולים האנטי-סוכרתיים הקונבנציונליים הוכחו כיעילים למרות העובדה שהשימוש בחלקם יקר ועשוי להיות קשור לתופעות לוואי חמורות[7]. עלות, תופעות לוואי והאמונה הכללית שתרופות קונבנציונליות הן סינתטיות ולצורך העניין אינן בטוחות בהשוואה לתרופות צמחיות, הנחשבות "טבעיות" ובטוחות יחסית תרמו לעניין המחודש בשימוש בצמחי מרפא וצמחי מרפא. מוצרים לטיפול וניהול של מחלות אנושיות כולל DM[8,9]. פרדיגמה זו נפוצה למדי במדינות טרופיות עניות יותר בעולם, שבהן רוב האנשים מסתמכים על רפואת צמחים כדי לענות על צורכי הבריאות העיקריים שלהם [8]. כמו כן, זה כנראה מאשר את הקביעה הרגילה שהשימוש בצמחי מרפא קדם לרפואה המודרנית ושמוצרים טבעיים ממשיכים לשמש כתבניות לסינתזה פרמצבטית של תרופות חדשות[10]כולל תרופות אנטי-סוכרתיות. חשוב לציין, צמחי מרפא אלה וטיפולים שמקורם בצמחי מרפא משמשים כטיפול משלים באופן המשקף את מערכות האמונות והמורשת האתנובוטנית של רוב הקהילות המקומיות ברחבי אזורי אפרו-אסיה בעולם. לדוגמה, צמחי מרפא רבים עם טענות אתנו-בוטניות לטיפול בסוכרת כגון Chrysobalanus orbicularis[11], Spondias mombin ו-Mangifera indica[12], Sesamum indicum [13], ו-Bryophyllum pinnatum [14] כולם הדגימו -עמילאז ו- -השפעות מעכבות גלוקוזידאז הנחשבות חיוניות לבקרה גליקמית. בתגובה לעניין המחודש הזה בשימוש בצמחי מרפא ומוצרים שמקורם בצמחי מרפא כטיפול משלים או אלטרנטיבי, המליץ ​​ארגון הבריאות העולמי (WHO) יחד עם קבוצות עניין אחרות לשלב מערכות ריפוי מקומיות, במיוחד רפואת צמחים מערכות הבריאות של מדינות עניות יותר [15]. המלצה זו חייבה את הצורך לאמת טענות בריאותיות על עשבי מרפא הנפוצים בשימוש על ידי אנשים מקומיים לטיפול במחלות אנושיות[16,17]. מעניין, אברוס פרה-קטוריוס המכונה בדרך כלל "אפונת ירידות" הוא עשב מרפא בשימוש נרחב ברפואה העממית של תרבויות רבות באזורים אפרו-אסייתיים בעולם לטיפול במחלות אנושיות[18-20]. מספר דיווחים הדגישו את השימושים המסורתיים של עלי אברוס פרקטוריוס בטיפול וניהול של סוכרת [21-23]. יש לציין, תמציות מעלים של אברוס פרקטוריוס הוכיחו יעילות נגד סוכרת [1] וסרטן השד [24], שתי מחלות אנושיות שתרמו באופן משמעותי לעומס המחלות העולמי [25]. מחקרים רבים הצדיקו את השימושים האתנו-פרמקולוגיים ותביעות רפואיות אחרות של אברוס פרקטוריוס על ידי הדגמה ניסיוני של תכונותיו הביולוגיות, כולל ניקוי רדיקלים חופשיים [26], הגנה מפני רינו [27], הגנה עצבית [28], אימונומודולטורית [19], אנטי דלקתית. [29], אנטי-ליפוטוקסיות [30], והצטברות נוגדת טסיות [31] רק כדי להזכיר רק דוגמה.

בעבר, השפעות הורדת גלוקוז והשפעות הגנה על הלבלב של APLE הוכחו בניסוי בחולדות סוכרתיות הנגרמות על ידי STZ/nicotinamide כדי לאשר את השימוש בו כרפואה עממית נוגדת סוכרת על ידי אנשים מקומיים באזור המערבי של גאנה [1]. עם זאת, המנגנון העומד בבסיס ההשפעות להורדת הגלוקוז וההשפעות המגנות על הלבלב של APLE נותר גרוע. כיום, מנגנונים העומדים בבסיס ההשפעות להורדת הגלוקוז וההשפעות המגנות על הלבלב של APLE כגון אפנון של אינסולין, גלוקגון ו-GLP-1, עיכוב הפעילות האנזימטית של -עמילאז ו-גלוקוזידאז, ניקוי רדיקלים חופשיים והתאוששות של נזק לתאים בלבלב ונקרו-אפופטוזיס הוכחו in vivo ו-in vitro.

2. חומרים ושיטות

2.1. תרופות וכימיקלים. אלוקסן מונוהידראט (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, ארה"ב), ניקוטינמיד (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, ארה"ב), אקרבוז (LGM Pharma, ארה"ב), מטפורמין (Bristol laboratories Ltd.) , חומצה גאלית (Merck KGaA, ארה"ב), רוטין (Acros organics, ארה"ב), חומצה אסקורבית (קרל רוט, גרמניה), קוורצטין (Alfa Aesar, בריטניה), p-nitrophenyl glucopyranoside (pNPG) (BBI Biotech, סין), עכברוש במחקר נעשה שימוש בערכת אינסולין ELISA, ערכת Glucagon-ELISA של עכברוש וערכת ELSA של עכברוש GLP-1 (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd, סין). כל הממסים והכימיקלים האחרים ששימשו במחקר היו בדרגה אנליטית.

2.2. איסוף, זיהוי ואימות של עלי אברוס פרקטוריוס. עלים טריים של A. precatorius נאספו מאדמות חקלאיות לא מעובדות ב-Sefwi Asawinso'A'(מחוז Bibiani-Ahwiaso-Bekwai, אזור המערבי, גאנה). העלים זוהו ואומתו על ידי בוטנאי מוסמך ביחידת העשבים, בית הספר למדעי הביולוגיה, אוניברסיטת קייפ קוסט, שם הופקדה דגימת שובר (CC3366) כפי שדווח בעבר [1].

2.3. הכנת תמצית עלי אברוס פרקטוריוס (APLE). APLE הוכן לפי שיטה קודמת [1]. בקצרה, עלים מיובשים בצל של A. precatorius נטחנו מכנית לאבקה דקה. אבקת העלים אוחסנו במיכלי פלסטיק אטומים לפני השימוש. כמות של 120 גרם מהעלים האבקת הוספגה ב-700 מ"ל אתנול למשך 48 שעות וכוסה בבד גבינה. התערובת עברה בחישה לפחות 3 פעמים ביום. ביום השני, התערובת עברה סינון דרך נייר סינון שהוכנס למשפך בוכנר. התסנין עבר הפרדה באמצעות מאייד סיבובי שהותקן על אמבט מים. לאחר איסוף אתנול באמצעות המאייד הסיבובי, הנוזל הסירופי הירוק-כהה שנוצר יובש במייבש למשך מספר שבועות והותיר תמצית מוצקה בצבע ירוק כהה. התמצית סומנה ואוחסנה במכונת ייבוש לפני השימוש. APLE הוכנה באופן רציף על מנת לקבל מספיק כמויות לכל הניסויים.

2.4.PhytochemicalScreening של APLE.APLE נבדק עבור נוכחות של phytocompounds כפי שדווח בעבר [1]. 2.5. קביעת תוכן פנולי כולל (TPC) ב-APLE. התוכן הפנולי הכולל ב-APLE נקבע על ידי שימוש בשיטת הריאגנט Folin Ciocalteu כפי שתואר בעבר [32] עם שינויים קלים. ריכוז דליל של APLE (250μL של 1mg/mL) היה מעורבב עם ריאגנט Folin Ciocalteu 750μL (1 מתוך 10 דילולים עם מים) ו-750μL של 7 אחוז Na, CO. התערובות הוכנסו לאחר מכן ל-5 מ"ל וזוקוקו עם מים טמפרטורת החדר למשך שעתיים לפיתוח צבע. לאחר מכן נמדדה הספיגה ב-765 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (UV-vis, T70 PG Instruments). לאחר הכנת עקומת חומצה גאלית סטנדרטית (0-300ug/mL), ה-TPC ב-APLE הוחלף מעקומת כיול החומצה הגאלית ובא לידי ביטוי בשווי חומצה גאלית (GAE). כל הניסויים נערכו בשלושה עותקים.

2.6. קביעת תכולת הפלבנואידים הכוללת (TFC) ב- APLE. תכולת הפלבנואידים הכוללת ב-APLE נמדדה לפי שיטה שתוארה בעבר [33] עם כמה שינויים. בקצרה, 500 μL של תמצית צמח Abrus precatorius (1 מ"ג/מ"ל) שהוכנה ב-50 אחוז אתנול עורבבו עם 500 μL של 10 אחוזי אלומיניום כלוריד (AlCl,.6H,O) ו-1500μL של 10 אחוז נתרן אצטט (NA C, O) ,.3H,O). תערובת התגובה הודגרה בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות, והספיגה נמדדה ב-415 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (UV-vis, T70 PG Instruments). לאחר הכנת עקומת הכיול הרגילה של רוטין (0-250ug/mL), TFC ב-APLE הוחלף מעקומת כיול הרוטין והובע בשווה לרוטין (RE). כל הניסויים בוצעו בשלושה עותקים.

2.7. אישור אתי. כל הפרוטוקולים הכוללים בעלי חיים נבדקו ואושרו בתחילה על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת Kwame Nkrumah למדע וטכנולוגיה (KNUST) בנושא ניסויים בבעלי חיים (FPPS/PCOL/006/2019). כמו כן, ניסויים הכוללים חולדות בוצעו בהתאם להנחיות האיחוד האירופי (2010/63/EU) על שימוש וטיפול בבעלי חיים בניסויים מדעיים. סבל בעלי חיים ומספר בעלי החיים צומצמו ככל האפשר כדי לעמוד בדרישות בהמלצות 3R (חידוד, החלפה והפחתה) [34].

2.8. רכישה וטיפול בחיות ניסוי. חולדות ספראג-דאולי בוגרות 7-8-בריאות בנות שבוע משני המינים (במשקל בין 120 ל-180 גרם) נרכשו מהמכון למחקר רפואי נוגוצ'י (NMRI), אוניברסיטת גאנה. חולדות הועברו מאוחר יותר לבית החיות של המחלקה למדעי ביו-רפואה, אוניברסיטת קייפ קוסט, קייפ קוסט, גאנה. חולדות אוחסנו בכלובי נירוסטה (34 ס"מ × 47 ס"מ × 18 ס"מ) עם שברי עץ יבשים כמצעים, הוזנו עם מאכל מכרסם רגיל (GAFCO, TEMA), והייתה להם גישה בלתי מוגבלת למים. חולדות נשמרו בתנאי סביבה של טמפרטורה, לחות ומחזור חושך/אור רגיל. עם זאת, תנאים אלה היו מגוונים כדי להתאים לדרישות הספציפיות של כמה ניסויים. חולדות הורשו להתרגל בתנאי הסביבה והמעבדה הללו במשך יותר משבועיים לפני השימוש בניסויים.

2.9. ביסוס סוכרת הנגרמת על רקע אלוקסן/ניקוטינאמיד בחולדות. סוכרת ניסויית הוקמה בחולדות בוגרות נורמוגליקמיות בצום לילה של ספראג-דאולי לפי שיטה שתוארה קודם לכן [1, 35] עם שינוי מסוים. בקצרה, לחולדות הוזרק ברצף ניקוטינמיד (48 מ"ג/ק"ג; IP) מומס בתמיסת מלח רגילה ונשמר על קרח; לאחר מכן, 15 דקות לאחר מכן, Alloxan (120mg/kg; ip) שוחזר בתמיסת 100 mM citrate buffer (pH4.5) ניתנה לחולדות מדי יום במשך 7 ימים. לאחר מכן, חולדות קיבלו תמיסה של 5% גלוקוז (5 מ"ל/ק"ג; PO) מדי יום במשך 7 ימים. כדי לאשר את היווצרות היפרגליקמיה בחולדות, נאסף דם מחולדות בצום לילה 3-7 ימים לאחר מתן Alloxan/Nicotinamide ו-5 אחוז טיפולי גלוקוז בשיטת כריתת קצה הזנב. זנבות של חולדות ניגבו תחילה עם כותנה סטרילית טבולה ב-10 אחוז אתנול. גלוקוז בדם בצום (FBG) נמדד באמצעות URIT G26 גלוקומטר (URIT Medical Electronic Co., Ltd.).

2.10.Experimental Design. A curative rather than prophylactic treatment approach was adopted in this study, where after the establishment of experimental diabetes mellitus in rats, diabetic rats were subjected to various treatments. Figure 1 shows an outline of experiments carried out in this study. Rats having consistent FBG(11.1 mmol/L or >250 מ"ג/ד"ל) על פי מדידות מרובות נחשבו כבעלי סוכרת (היפרגליקמיה)[1,35]. חולדות סוכרתיות מאושרות חולקו אקראית לחמש קבוצות. חולדות בקרה לא נחשפו לאלוקסן; במקום זאת, הם קיבלו תמיסת מלח רגילה. כל הקבוצות טופלו לתקופה של 18 ימים כפי שמוצג להלן:

בקרה: תמיסת מלח רגילה (5 מ"ל/עכברוש/יום; פו) בתוספת אוכל מכרסמים בתוספת מים

דגם: ניקוטינמיד (48 מ"ג/ק"ג ip) בתוספת Alloxan (120 מ"ג/ק"ג; ip) בתוספת אוכל מכרסמים בתוספת מים

מטפורמין: ניקוטינמיד (48 מ"ג/ק"ג; ip) בתוספת Alloxan (120 מ"ג/ק"ג; ip) בתוספת מטפורמין (300 מ"ג/ק"ג; po) בתוספת מזון למכרסמים בתוספת מים

APLE(100 מ"ג/ק"ג): ניקוטינמיד (48 מ"ג/ק"ג; ip) בתוספת Alloxan (120 מ"ג/ק"ג; ip) בתוספת APLE (100 מ"ג/ק"ג; po) בתוספת מאכל מכרסמים בתוספת מים

APLE(200 מ"ג/ק"ג): ניקוטינמיד (48 מ"ג/ק"ג; ip) בתוספת Alloxan (120 מ"ג/ק"ג; ip) בתוספת APLE (200 מ"ג/ק"ג; po) בתוספת מאכל מכרסמים בתוספת מים

APLE (400 מ"ג/ק"ג): ניקוטינמיד (48 מ"ג/ק"ג; ip) בתוספת אלוקסן (120 מ"ג/ק"ג; ip) בתוספת APLE (400 מ"ג/ק"ג po) בתוספת מכרסמים בתוספת מים

2.11. מדידת משקל גוף.משקל הגוף של חולדות נמדד לפני תחילת כל הניסויים בבעלי חיים. לאחר מכן, משקל הגוף של חולדות בכל הקבוצות נמדד כל 3 ימים במשך 18 ימים. המינונים הותאמו כדי לשקף שינויים במשקל הגוף כל 3 ימים. לבסוף, משקל הגוף של החולדות בכל הקבוצות נמדד לפני הקרבתם.

2.12. איסוף דם, הכנת סרה ובידוד איברים.לאחר שקילת חולדות ביום 18, חולדות הוקרבו בהרדמה עמוקה של כלורופורם. דגימות דם נאספו באמצעות ניקור לב ולאחר מכן חולקו לתוך צינורות שואב ריקים מסומנים. דגימות דם מייצגות עבור כל קבוצה בוצעו בצנטריפוגה ב-3000 סל"ד (צנטריפוגה של אפנדורף 5702,4 מעלות) למשך 5 דקות. כדי להשיג סרה, הסופרנטנט נאסף לתוך צינורות דגימה שסומנו בהתאמה. הכבד, הטחול הכליות והלבלב נקצרו, נשקלו טרי ותוקנו ב-10 אחוז פורמלין.

2.13. מדידת אינסולין בסרום, גלוקגון ו-GLP-1.רמות האינסולין, הגלוקגון וה-GLP-1 בסרום נמדדו, בהתאמה, באמצעות אינסולין עכברוש ELISA (Wuxi Donglin Sci &Tech Development Co. Ltd, סין), גלוקגון ELISA של חולדות (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd. , סין), וחולדות GLP-1 ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd., סין) אך ורק לפי הוראות היצרן.

2.14. קביעת השטח החציוני של איי הלבלב של לנגרהנס.לאחר עיבוד היסטולוגי של לבלב מייצג, צילומי מיקרוסקופ שהתקבלו עבור קבוצות בהתאמה נסרקו באמצעות מצלמת עינית Amscope MD35 כפי שתואר קודם[1]. כל צילום מיקרוגרף הועלה ל-Adobe photoshop CS6 ולאחר מכן הונחה על גבי רשת סטריאולוגית. מספר הצמתים המונחים מעל לסטרומה של איי הלבלב נספר. שטח החתך של איי הלבלב של לנגרהנס של הלבלב המייצג נקבע על ידי שימוש בשיטת Cavalieri וספירת נקודות [36]. שטח החתך נקבע על ידי הנוסחה:

איפה

A מייצג שטח חתך של איי הלבלב של לנגרהנס

XP מייצג את המספר הכולל של הצמתים המונחים מעל הסטרומה של איי הלבלב

a/p מייצג את השטח לכל נקודה של הרשת הסטריאולוגית M מייצג את ההגדלה הליניארית.

2.15. מיצוי של -עמילאז מהלבלב של חזירי ים.לאחר 20 שעות של רעב, שפן ניסיונות הוקרב בהרדמה עמוקה, והלבלב הוסר בניתוח. הלבלב נחתך ללא שומן ומכל רקמה אחרת ונשטף מיד במאגר נתרן פוספט (pH7.4). לאחר שקילת הלבלב, הוא נשמר במקפיא ב-4 מעלות. הלבלב הקפוא עבר הומוגגן (1 גרם מהלבלב: 5 מ"ל חיץ) עם חיץ נתרן פוספט קר כקרח (pH של 7.4) (pH של 7.4) על ידי שימוש בהומוגנית (הומוגנית WiseTis HG-15D) ולאחר מכן צנטריפוגה. ב-4400 סל"ד למשך 30 דקות ב-4 מעלות. הסופרנטנט הועבר לפיפטה לצינורות מיקרופיוג' נפרדים ואוחסן במקפיא ב--20 מעלות. כדי לאשר את האנזים המופק (-עמילאז), עמילאז זמין מסחרית סומן עם האנזים המופק (-עמילאז) באמצעות עמילן ויוד. התעלפות או היעלמות של הצבע הכחול-שחור שנחשב כאינדיקציה לפעילות-עמילאז הושוו למערך ביקורת (ללא אנזים פלוס עמילן פלוס יוד) שבו היה צבע כחול-שחור עמוק.

2.16.השפעה של APLE על פעילות אנזימטית -עמילאז.עיכוב של פעילות אנזימטית אלפא ()-עמילאז נבדק בשיטה קודמת [37] עם כמה שינויים. בקצרה, APLE(125uL) או acarbose בריכוזים גדלים (100-1500 ug/mL) נוספו לסט של מבחנות מסומנות המכילות 125 ul של תמיסת -עמילאז במאגר נתרן פוספט בנפח 20mM (pH6.9). תערובת ה-APLE או acarbose/-עמילאז הודגרה מראש ב-25 מעלות למשך 10 דקות. לאחר מכן, נוספו 125 uL של עמילן 1 אחוז (הוכן במאגר פוספט 20mM, pH =6.9) במרווחי זמן נבחרים. תערובת התגובה בכל מקרה הודגרה ב-25 מעלות למשך 10 דקות. הפסקת כל תגובה בוצעה במרווחי זמן על ידי הוספת 250uL של 3,5-מגיב דיניטרוסליצילית (DNSA) וחימום נוסף באמבט מים ב-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז נתן להתקרר לטמפרטורת החדר. כל תגובה הועלתה ל-2.5 מ"ל עם מים מזוקקים והספיגה נמדדה ב-540 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר (UV-vis, T70 PG Instruments). ערכת בקרה הוכנה באמצעות אותו הליך פרט לכך שעמילאז הודגרה מראש עם מים מזוקקים במקום APLE. פעילות מעכבת אלפא()-עמילאז חושבה באופן הבא:

2.17. אופן עיכוב הפעילות האנזימטית של -עמילאז על ידי APLE.אופן העיכוב של פעילות אנזימטית -עמילאז על ידי APLE נעשה בשיטה קודמת [38] עם שינוי מסוים. בקצרה, 125 μL של APLE (5mg/mL) הודגרו לראשונה עם 125 ul של תמיסת -עמילאז ב-2 0mM פוספט ב-25 מעלות למשך 10 דקות בסט מבחנות מסומנות. לאחר מכן, 125uL של תמיסת עמילן בריכוזים משתנים (0.3-5 מ"ג/מ"ל) נוספו לתערובות התגובה כדי

להתחיל את התגובה. לאחר מכן הודגרה תערובת התגובה ב-25 מעלות למשך 10 דקות לפני הוספת 250uL של ריאגנט 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA) כדי לעצור את התגובה. כמות המוצר שנוצר נבדקה על ידי מדידת הספיגה באורך גל של 540nm באמצעות ספקטרופוטומטר (UV-vis, T70 PG Instruments). ההליך חזר על עצמו לבקרה שהוגדרה על ידי דגירה מוקדמת של -עמילאז עם חיץ במקום APLE. העלילה של Lineweaver-Burk מהעלילה של Michaeles-Menten בוצעה באמצעות גרסת Graph-Pad פריזמה 8 (Graph Pad Software, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב) להערכת Km ו-Vmax. אופן העיכוב של הפעילות האנזימטית -עמילאז על ידי APLE נגזר מ-Km ו-Vmax המשוערים.

2.18. מיצוי של -Glucosidase מהמעי הדק של חזירי ים.מיצוי של -glucosidase ממעיים של שפני ניסיונות בוצע על פי שיטה קודמת [39] עם כמה שינויים. בקצרה, חזירי ניסיונות הורעבו תחילה במשך 20 שעות ולאחר מכן הוקרבו בהרדמה עמוקה. המעי הדק הממוקם מיד מעל המעי הגס ומיד מתחת לתריסריון הוסר בניתוח ונשטף ביסודיות במאגר נתרן פוספט 0.02 M קר כקרח (pH6.9) לפני טבילה בתמיסת חיץ טרייה. בשיעור של 1 גרם ממעי-ne:5 מ"ל של חיץ, המעי המבודד עבר הומוגניזציה (WiseTis HG-15D homogenizer, גרמניה) ב-4400 סל"ד למשך 10 דקות בעצירות לסירוגין של 2 דקות על קרח. ההומוגנט עבר צנטריפוגה (צנטריפוגה Eppendorf 5430R) למשך 30 דקות ב-4 מעלות והסופרנטנט נקצר בעדינות. מנות הוכנסו ל-2 מ"ל צינוריות קריוטות ונשמרו בדרגה-20 לשימוש מיידי בניסויים. כדי לאשר את האנזים המופק (-glucosidase), - גלוקוזידאז זמין מסחרית סומן עם האנזים המופק (a-glucosidase) על ידי דגירה של 50μL של 3mM p-nitrophenyl glucopyranoside (pNPG) עם 25 μL של 25 μL של 25 μL של 50 μL זמין מסחרית. μL של האנזים המופק (a-glucosidase) ב-25 מעלות. התבוננות במוצר p-nitrophenol צהוב לאחר 5 דקות בכל מקרה נחשבה כאישור לפעילות של -glucosidase.

2.19.השפעה של APLE על פעילות אנזימטית של גלוקוזידאז.ההשפעות המעכבות של APLE ושל acarbose (מעכב גלוקוזידאז סטנדרטי) הוערכו לפי שיטה קודמת [40]עם כמה שינויים. בקצרה, נעשה שימוש במאגר פוספט (20mM;pH=6.9) להכנת p-nitrophenyl glucopyranose (pNPG) (מצע ל-glucosidase). בניסויים נפרדים, a-glucosidase (50 μL) הודגרה מראש עם ריכוזים הולכים וגדלים של APLE (25μL בכל מקרה), acarbose או חיץ למשך 10 דקות בכל מקרה. לאחר מכן, 25uL של 3mM p-nitrophenyl glucopyranoside נוספו לתערובת המוקדמת של APLE/a-glucosidase או acarbose/a-glucosidase כדי להתחיל תגובה. תערובת התגובה בכל מקרה הודגרה ב-25 מעלות למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות של דגירה, התגובה הופסקה על ידי הוספת 0.1 M Na,CO, (1 מ"ל). בקרה הוכנה באמצעות אותו הליך, פרט לכך ש-glucosidase הודגרה מראש עם חיץ במקום APLE או acarbose. תוצר התגובה (p-nitrophenol בצבע צהוב) לאחר סיום התגובה נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר (UV-vis, T70 PG Instruments) ב-405 ננומטר לקביעת פעילות a-glucosidase. התוצאות הובעו כאחוז מהביקורת. בכל אחד מהמקרים חזרו על הניסויים שלוש פעמים. אחוז ( אחוז ) עיכוב של פעילות גלוקוזידאז נאמד באמצעות הנוסחה:

2.20. אופן עיכוב גלוקוזידאז על ידי APLE.אופן העיכוב של הפעילות האנזימטית של -glucosidase על ידי APLE נערך על פי נוהל קודם [41] עם כמה שינויים. בקצרה, בסט אחד של מבחנות, בדיוק 25 μL של 5 מ"ג/מ"ל של APLE הודגרו מראש עם תמיסת -glucosidase（50 μL) ב-25 מעלות למשך 10 דקות. בסט השני של הצינורות, - גלוקוזידאז הודגרה מראש עם 50 μL של חיץ פוספט 20mM (pH=6.9). לאחר מכן, נוספו 25uL של p-nitrophenyl glucopyranoside (PNP) בריכוזים משתנים (0.3-3.0 mg/mL) לשתי קבוצות המבחנות כדי להתחיל את התגובה. לאחר מכן הודגרו תערובות התגובה ב-25 מעלות למשך 20 דקות ולאחר מכן נוספו Na, CO, （1000μL） כדי לסיים את התגובה. כמות המוצר ששוחרר נמדדה בספקטרופוטומטריה באמצעות עקומת תקן p-nitrophenol והומרה למהירויות תגובה, (v). עלילה הדדית כפולה (1/v נגד 1/S) שבה S הוא ריכוז המצע התוותה. אופן העיכוב של פעילות -glucosidase על ידי APLE נקבע על ידי ניתוח של העלילה Line weaver-Burk.

2.21. הערכה של פעילות 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazy(DPPH)Radical Scavenging.פעילות סילוק רדיקלי DPPH בוצעה על פי שיטה קודמת [42] עם שינוי מסוים. בקצרה, תערובת תגובה של 2 מ"ל הוכנה על ידי ערבוב DPPH(1.0 מ"ל של 0.135 מ"ל) שהוכן במתנול ו-1.0 מ"ל של ריכוזים משתנים של APLE (40,80,120,160 ו-200 ug/mL) או חומצה אסקורבית. תערובת התגובה נערה בחוזקה והושארה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הספיגה נמדדה (UV-vis, T70 PG Instruments) ב-517nm מול ריק. כל הבדיקות בוצעו בשלושה עותקים. כמות שווה של מתנול ותמיסת DPPH שימשה כשליטה. פעילות סילוק רדיקלים של DPPH הוערכה על ידי שימוש בנוסחה:

2.22. בדיקת תחמוצת החנקן (NO) רדיקלית.לא הוערכה פעילות סילוק רדיקלית של APLE ותקנים באמצעות תגובת Griess Illosvory כפי שתואר קודם [43] עם כמה שינויים. בקצרה, ריאגנט Griess Ilosvory השתמש ב-0.1 אחוז (w/v) naphthyl ethylene diamine dihydrochloride במקום 5% 1-naphthylamine. ריכוזים משתנים

({{{{10}}}}ug/mL) של APLE וגם של סטנדרטים (חומצה גאלית וחומצה אסקורבית) שהוכנו והכילו עד 167uL הונחו במבחנות מסומנות, ולאחר מכן, 667 uL של נוספו 10 מ"מ נתרן ניטרופרוסיד. לאחר מכן הוסף חיץ נתרן פוספט (167uL, pH7.4), והתערובת הודגרה ב-25 מעלות למשך 150 דקות. לאחר מכן, הוסף ריאגנט של 2000 μL חומצה סולפנילית (0.33 אחוז ב-20 אחוז חומצה אצטית קרחונית) ואפשר לעמוד במשך 5 דקות להשלמת התגובה של דיאזוטיזציה. לבסוף, נוספו עוד 2000μL של 0.1 אחוז נפטיל אתילן דיאמין דיהידרוכלוריד, ערבבו, ולאחר מכן הורשו לעמוד במשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות. ריכוז הניטריט נמדד (UV-vis, T70 PG Instruments) ב-546 ננומטר וחושב עם תמיסת הניטראט הבקרה שלא הייתה לה APPLE/או תקנים אבל היו בה כל שאר מרכיבי תערובת התגובה. חיץ נתרן פוספט שימש כתמיסה ריקה. אחוז ( אחוז ) יכולת ניקוי של APLE וסטנדרטים לא חושב באמצעות הנוסחה:

כאשר Ac הוא ספיגה של הבקרה ו-At הוא ספיגה של הבדיקה (APLE/תקן).

2.23. בדיקת קיבולת נוגדת חמצון מפחיתה ברזל (FRAC).FRAC נבדק לפי השיטה הקודמת [44] עם מעט שינויים. בקצרה, התגובה כללה 25 0uL APLE/תמיסה סטנדרטית בריכוז שונה (12.5-200ug/mL), 625 uL של חיץ נתרן פוספט (0.2M ב-pH6.6 ), ו-625 ul של 1 אחוז ציאניד ברזל אשלגן, [K,Fe(CN)] לתוך מבחנות שונות. אלה הודגרו במשך 20 דקות ב-50 מעלות כדי להשלים את התגובה. לאחר מכן, 625uL של תמיסת חומצה טריכלורו אצטית (TCA) 10 אחוז נוספה למבחנות. התערובת הכוללת עברה צנטריפוגה ב-3000 סל"ד למשך 10 דקות, ולאחר מכן נלקחה 1800 ul supernatant וערבבה עם 1800 μL של מים מזוקקים. לאחר מכן, נוספה 360 μL של 0.1 אחוז כלוריד ברזל (FeCl), תמיסה וערבבה היטב. הספיגה של התמיסה נמדדה ב-700nm באמצעות ספקטרופוטומטר (UV-vis, T70 PG Instruments) כנגד ריק התגובה. תמיסה ריקה טיפוסית המכילה את אותה תערובת תמיסה ללא APLE/או קוורצטין הודגרה בתנאים דומים. ספיגה מוגברת של תערובת התגובה מצביעה על יכולת הפחתת מוגברת. הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים בכל ריכוז. FRAC נמדד כשווה ערך לקוורצטין (QE).

2.24. אומדן של ICs ו-ECs0 כדי לקבוע את IC ו-ECsoof APLE בהתאמה לנוגד החמצון, ניקוי הרדיקלים החופשיים והשפעתו המעכבת על הפעילות האנזימטית של עמילאז וגלוקוזידאז, נבדקה סדרה של ריכוזים הולכים וגדלים של APLE מול הגורמים המתאימים. פעילויות. לאחר המרת הריכוזים ליציאה נרשמה על הציר האופקי כנגד אחוז הפעילות המקסימלית (נוגד חמצון, ניקוי רדיקלים חופשיים והשפעה מעכבת על פעילות אנזימטית של עמילאז ו-a-glucosidase) על הציר האנכי. הריכוז של APLE שיצר 50 אחוז מהפעילות המקסימלית (נוגד חמצון,

סילוק רדיקלים חופשיים, והשפעה מעכבת על פעילות אנזימטית של-עמילאז ו-a-glucosidase) שנבדקו נקבעו באופן גרפי באמצעות תוכנה סטטיסטית של GraphPad פריזמה גרסה 8.

2.25. ניתוח סטטיסטי.הנתונים שהתקבלו הוצגו כממוצע ± SD. ניתוח סטטיסטי נעשה באמצעות Graph Pad Prism גרסה 8 עבור Windows (Graph Pad Software, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). השוואה ממוצעת בין קבוצות נעשתה על ידי שימוש בניתוח שונות (ANOVA) בכיוון אחד ואחריו מבחני ההשוואה המרובים של Tukey. P פחות או שווה ל-0.05 נחשב מובהק סטטיסטית בכל הניתוחים.

מאמר זה מופק מ-Hindawi BioMed Research International Volume 2021, מזהה מאמר 9920826, 17 עמודים https://doi.org/10.1155/2021/9920826