שיטות ליצור ולהעריך מודלים של דג זברה של מחלות כליה אנושיות חלק 1

תַקצִיר

הפרעות הקשורות בכליות משפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם. סקר שנערך בקרב חולי מחלת כליות כרונית (CKD) הראה כי עומס מחלות הכליה גדל מדי שנה. מחקר נטל המחלה העולמי (GBD) 2017 דירג את CKD כגורם המוות ה-12 המוביל בעולם. לפיכך, זיהוי הגורמים למחלות כליה, פיתוח שיטות אבחון מדויקות וטיפולים חדשניים רלוונטיים ביותר. מודלים של אורגניזמים המשחזרים נאמנה מחלות אנושיות ממלאים תפקידים חשובים בהבנת תהליך המחלה ומספקים קרקע חשובה למציאת ריפוים. דג הזברה הוא מודל מצוין לחקר ההתפתחות, הפתופיזיולוגיה וההיבטים המולקולריים של מחלות כליה אנושיות. בסקירה זו, אנו מסכמים מניפולציות גנטיות וניסיוניות שונות שניתן לבצע בדג הזברה כדי להבין טוב יותר את הפתופיזיולוגיה של מחלות כליה אנושיות. אנו מציעים ששיטות אלו יועילו בפיתוח טיפולים פוטנציאליים לטיפול במחלות כליה.

על פי מחקרים רלוונטיים,cistancheהוא עשב סיני מסורתי ששימש במשך מאות שנים לטיפול במחלות שונות. הוכח מדעית שהוא בעל תכונות אנטי דלקתיות, אנטי אייג'ינג ונוגדי חמצון. מחקרים הראו כי cistanche מועיל לחולים הסובלים ממחלת כליות. החומרים הפעילים של cistanche ידועים כמפחיתים דלקת, משפרים את תפקוד הכליות ומשחזרים תאי כליה לקויים. לפיכך, שילוב cistanche בתוך תוכנית טיפול במחלת כליות יכולה להציע יתרונות גדולים לחולים בניהול מצבם. Cistanche עוזר להפחית פרוטאינוריה, מוריד את רמות ה-BUN והקריאטינין, ומפחית את הסיכון לנזק נוסף לכליות. בנוסף, cistanche גם מסייע בהפחתת רמות הכולסטרול והטריגליצרידים אשר עלולים להיות מסוכנים לחולים הסובלים.מחלת כליות.

לחץ על Cistanche Norge

למידע נוסף:

דוד.דנג

@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

מילות מפתח:CKD, AKI, מודל של דג זברה של מחלות כליה אנושיות, פרונפרוס, פתולוגיה כלייתית

מבוא

הכליה היא אחד האיברים החיוניים בבעלי חוליות שמסלק חומרי פסולת ושומר על ריכוזי pH, יונים ומטבוליטים בדם בטווח הפיזיולוגי. הכליה מפרישה אריתרופויאטין המווסת את ייצור תאי הדם האדומים ומפעיל ויטמין D המסייע לעצמות לספוג סידן. ישנם כמיליון נפרונים בכל כליה אנושית, שהם היחידות המבניות והתפקודיות של איבר זה. כתוצאה מכך, פגמים בנפרונים משפיעים על מבנה ותפקוד הכליות. תפקוד לקוי של הכליה יכול להתרחש בגלל מוטציות גנטיות, זיהומים, פציעה, תרופות או חשיפה לתרכובות רעילות בסביבה. מחלות כרוניות כמו סוכרת, מחלות לב וכלי דם ויתר לחץ דם הן תורמים עיקריים לנטל מחלות הכליה (Levey et al., 2010). תפקוד כליות לקוי מגביר את הסיכון לסיבוכים גם במערכות איברים אחרות (Thomas et al., 2008). הסוגים הנפוצים של מחלות כליות והגורמים להן מפורטים בטבלה 1.

מחלות כליות

מחלות כליות תורמות לחלק משמעותי מנטל המחלות בעולם. כ-750 מיליון אנשים ברחבי העולם מושפעים מהפרעות הקשורות בכליות (Crews et al., 2019). CKD הוא הנפוץ ביותר בקרבם עם שכיחות עולמית של 13.4 אחוזים (Hill et al.,2016). מחקר GBD 2010 דירג את CKD כגורם המוות ה-18 המוביל בעולם, אשר זינק למקום ה-12 עד 2017 בשל גרימת המספר המרבי של מקרי מוות ברחבי העולם (Jha et al., 2013; Carney, 2020). על פי מחקר ה-GBD בשנת 2017, כ-697.5 מיליון מקרים של CKD דווחו ברחבי העולם, ביניהם 1.2 מיליון אנשים מתו. מספר מקרי המוות כתוצאה מ-CKD מוערך לעלות ל-4 מיליון עד 2040 בתרחיש הגרוע ביותר (Foreman et al., 2018). שליש מחולי CKD חיים בשתי מדינות, סין והודו (Bikbov et al., 2020). מצבו של CKD בקרב האוכלוסייה ההודית אינו ברור בשל היעדר מערכות איסוף נתונים מדויקות. כ-115 מיליון מקרים של CKD דווחו בהודו בשנת 2017 (Bikbov et al., 2020). המחלות השכיחות ביותר באוכלוסייה ההודית הן סוכרת ויתר לחץ דם (Geldsetzer et al., 2018). לפי דוח המועצה ההודית למחקר רפואי (ICMR), השכיחות של סוכרת ויתר לחץ דם בקרב אוכלוסיית המבוגרים העירונית היא 28 אחוז ו-21.4 אחוזים בהתאמה (Varma, 2015). בין 40% ל-60% מה-CKD, מקרים מתרחשים בגלל סיבוכים אלה ומספרם גדל במהירות (Rajapurkar et al., 2012). מרכז הנתונים של האגודה הבינלאומית לנפרולוגיה של מחלות כליות דיווח על שכיחות של 16.8 אחוזים של CDK בקרב האוכלוסייה ההודית (Ene-Iordache et al., 2016). הסיבות ל-CKD משתנות ברחבי הודו. אנדרה פראדש, אודישה וגואה דיווחו על רמות גבוהות של CKD של אטיולוגיה לא ידועה הידועה בשם נפרופתיה בין-סטיציאלית כרונית (Varughese ואברהם, 2018). מכיוון שמספר חולי CKD גדל ברחבי העולם בקצב מדאיג, יש צורך דחוף לבצע ניתוח יסודי של גורמי השורש למחלות כליה נפוצות כדי למצוא דרכים טובות יותר למניעה ולריפוי שלהן. מודלים של אורגניזמים שיכולים לחקות פיזיולוגיה אנושית ומצבים חולים יכולים לספק דרכים נהדרות לטיפול בבעיות הנ"ל. דג הזברה הפך למודל שימושי לחקר התפתחות ומחלות ומספק דרכים מבטיחות לזהות מטרות ותרופות טיפוליות חדשות. בסקירה זו, דנו בשיטות שונות לשחזר מחלות כליה אנושיות בדגי זברה וכיצד ניתן להשתמש במודלים אלה כדי להבין את הפתוגניות של המחלה והמנגנונים המולקולריים הבסיסיים שלה. זה עשוי לגרום ליצירת גישות טיפוליות חדשות לניהול וריפוי של מחלות כליה.

קווי דמיון בין כליה אנושית לדג הזברה

התפתחות הכליות אצל יונקים היא ייחודית שכן היא מתרחשת באמצעות שלושה מבנים שונים במהלך העובר: פרונפרוס, מזונפרוס ומטנפרוס. שני המבנים הראשונים חולפים אצל יונקים ורק המטנפרוס נמשך לאורך כל החיים (Smyth et al., 2017; Jain, 2014). Pronephros היא הכליה התפקודית במהלך התפתחות עוברית בחולייתנים נמוכים יותר כמו דו-חיים ודגים, המוחלפת במזונפרוס בתור הכליה התפקודית בשלבים מאוחרים יותר (Tahara et al., 1993; Diep et al., 2015). טבלה 2 מתארת ​​את משך הזמן של צורות שונות של כליות בבני אדם, עכברים, קסנופוס ודגי זברה.

למרות שהמורכבות הכללית של הכליה גדלה ככל שאנו מתקדמים לעבר הצורות הגבוהות יותר, הנפרונים הם היחידות המבניות והתפקודיות של כל סוגי הכליות. לכל נפרון שלושה חלקים: גוף כליות לסינון דם, צינורית לספיגה והפרשת מומסים וצינור איסוף לאיסוף פסולת לא רצויה להפרשה. האפיתל הצינורי מעוצב במקטעים שונים כדי לבצע פונקציות ספציפיות. לנפרונים מכל צורות הכליות יש דפוס פילוח דומה (Desgrange and Cereghini, 2015). הארגון הסגמנטלי של הנפרון של דג הזברה פרונפרוס ומזונפרוס דומה ל-metanephros של יונקים, כפי שמוצג באיור. 1. הצינורית הפרונפרית של דג הזברה מחולקת לאבובית מפותלת פרוקסימלית (PCT), צינורית ישרה פרוקסימלית (PST) ומוקדמת דיסטלי (DE) ) ואבוביות מאוחרות דיסטליות (DL), אשר מקבילות לדפוס הפילוח של נפרונים מטאנפריים של יונקים. לדג הזברה בלוטה אנדוקרינית בשם גופיות סטאניוס (CS), השומרת על הומאוסטזיס של סידן (Krishnamurthy, 1976). ה-CS נוצר על ידי התמיינות של תאי אפיתל כליות בין מקטעי DE ו-DL, הנפרדים בהדרגה מהאבוביה ויוצרים את בלוטת ה-CS המזווגת הממוקמת retroperitoneally על פני הכליה בדגים בוגרים (Roberts and Ellis, 2012; Naylor et al., 2018). אחד ההבדלים העיקריים בין דג הזברה לנפרונים של יונקים הוא היעדר לולאה של הנלה בדג הזברה, שפועל כמכפיל זרם נגדי ליצירת גרדיאנט אוסמוטי מדולרי לשימור מים. למקטע זה אין כל תועלת בדג הזברה מכיוון שהוא דג מים מתוקים (Elmonem et al., 2018). לכל מקטע יש סוגי תאים שונים וביטויי גנים ספציפיים למקטעים, אשר נשמרים בקרב בעלי חוליות (Verlander, 1998; Desgrange and Cereghini, 2015). כל סוגי הכליות עוקבים אחר מסלולי התפתחות דומים. ארבעת השלבים הבאים מעורבים ברציפות בפיתוח נפרון; A: אינדוקציה של מזודרם ביניים ליצירת פרימורדיום כלייתי, B: אפיתליזציה וצמיחה של צינור כליה, C: דפוס של נפרון למקטעים מיוחדים, ו-D: וסקולריזציה של נפרון לצורך סינון דם (Drummond, 2003).

שיטות ליצירת מודלים של דג זברה של מחלות כליה אנושיות

לדגי זברה יש זוג אחד של פרונפרוס שמתחיל להיווצר לאחר 12 שעות לאחר ההפריה (hpf) והופך לתפקוד מלא ב-48 hpf. זמינות של רצף גנום שלם, 71 אחוז גנים אנושיים בעלי אורתולוג של דג זברה אחד לפחות, קלות טיפול, עוברים שקופים, זמן דור קצר, טכניקות מניפולציה גנטיות יעילות, שיטות ליצירת דגים מהונדסים והסריקה המהירה שלו הופכים את דג הזברה לאורגניזם המודל המתאים ביותר לחקור חריגות בכליות (Howe et al., 2013; Poureetezadi and Wingert, 2016). אחד המאפיינים המכריעים של דג זברה בוגר הוא יכולתו לחדש נפרונים חדשים על ידי תהליך של ניאו-נפרוגנזה בתגובה לפגיעה כלייתית (Chambers and Wingert, 2016). טבלה 3 מתארת ​​את ההשוואות בין דג הזברה לבין מודלים נפוצים אחרים של אורגניזמים כמו עכברים וזנופוס. מניפולציות גנטיות בדגי זברה הראו שניתן לזהות את המרכיבים הגנטיים החדשים של התפתחות ותפקוד הכליות באמצעות אורגניזם מודל זה (Poureetezadi and Wingert, 2016). ישנן מספר שיטות ליצור מודלים של דג זברה של מחלות כליה אנושיות.

גנטיקה קדימה

מסך הגנטיקה קדימה משמש לזיהוי גנים הקשורים לפנוטיפים בעלי עניין (Lawson and Wolfe, 2011). הן מוטגנזה כימית והן הוספה משמשות במסכי גנטיקה קדימה (Patton and Zon, 2001). מוטגנזה כימית היא בדיקה המבוססת על שלושה דורות שבה גברים בוגרים מטופלים במוטגנים כימיים כגון אתיל מתאן סולפונט (EMS), אתיל ניטרוזוריאה (ENU), או מוטגנים פיזיקליים כמו קרינת גמא ליצירת מספר מוטציות בתאי נבט (Varshney ו-. בורגס, 2014). לאחר מכן מצליבים את הדגים הנושאים מוטציות עם נקבות מסוג פרא ליצירת דגי F1 המכילים אללים ייחודיים למוטציה שנוצרה. דגי F1 מוצלבים כדי ליצור נשאי F2 אשר לאחר מכן מוצלבים כדי להשיג את המוטנטים ההומוזיגוטים שלהם בדור F3. לאחר מכן מבודדים הצאצאים בעלי הפנוטיפים הרצויים ומשמשים למיפוי גנטי ורצף לזיהוי הגן שעבר מוטציה (Patton and Zon, 2001). וריאציות אחרות של מסך זה, כמו שימוש בדיפלואיד הפלואידי והומוזיגוטי, יכולות לסייע בהפחתת הזמן והמאמץ הדרושים לזיהוי הפנוטיפ והמוטציה הגנטית הסיבתית (שנדונה בפירוט על ידי Patton and Zon, 2001). קווי כתב טרנסגניים המבטאים חלבונים ניאון באיבר המעניין יכולים להיות משולבים עם הקרנה גנטית קונבנציונלית קדימה כדי לסנן בקלות מוטנטים מעניינים. מסך מוטגנזה מבוסס ENU הוביל לזיהוי של דג הזברה המוטנטי (lib) אשר מציג פגמים מורפולוגיים ופילוח נפרון הדומים לעוברי דג זברה חסרי חומצה רטינואית (RA). נמצא כי למוטנטים lib יש מעבר C ל-A בנוקלאוטיד 174 של aldh1a2, אשר צפוי לסנתז חלבון קטוע באורך 58 חומצות אמינו, ובכך לבטל את תפקוד aldh1a2 ולהשפיע על הסינתזה של RA מ-retinaldehyde. ניתוח של עוברים שטופלו lib, חסר צוואר (nls) בעל מוטציה נקודתית בתחום הקטליטי של aldh1a2 ו-DEAB (מעכב סינתזה של חומצה רטינואית) גילה שרמות RA מווסתות פילוח נפרון על ידי שינוי הביטוי המרחבי של גורמי שעתוק ספציפיים למקטעים (Wingert) Davidson, 2011; Begemann et al., 2001; Mullins et al., 1994). מוטנט נוסף בשם זפלין עזר לזהות brac2 כמווסת של התפתחות פודוציטים (Kroeger et al., 2017).

מוטגנזה הוספה היא שיטה מבוססת טרנספוזון או אנטי וירוס המשמשת להחדרת DNA באופן אקראי בלוקוסים גנומיים שונים, וה-DNA הזר הזה עוזר לזהות את הגן שעבר מוטציה (Amsterdam et al., 1999). מעבדת הופקינס ב-MIT ביצעה בדיקת מוטגנזה של החדרה בעוברי דג זברה באמצעות וקטור רטרו-ויראלי. הם זיהו 12 גנים שהיו קשורים לפנוטיפים של כליות פגומים המציגים ציסטות באזור הצינורי הגלומרולרי, ביניהם ארבעה היו קשורים להיווצרות ריסים (Sun et al., 2004). החסרונות של גישת הגנטיקה קדימה הם שתהליך ההקרנה מסורבל וגוזל זמן. עם זאת, ההתקדמות בטכנולוגיית הרצף החדשה הפכה את גישת הגנטיקה קדימה ליעילה הרבה יותר.

נוק-אאוט של גנים באמצעות נוקלאזות הניתנות לתכנות

אחד היתרונות העיקריים של שימוש בדג הזברה כדגם אורגניזם הוא הזמינות של טכניקות עריכת גנום יעילות כגון CRISPR/Cas, TALEN ו-ZFN (Sertori et al., 2016). CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/ Cas9 היא טכנולוגיית עריכת הגנום המגוונת והנפוץ ביותר בדג הזברה. כימרה של CRISPR RNA (crRNA) ו-transactivating crRNA (tracrRNA) מתוכננת כ-RNA מנחה יחיד (sgRNA), אשר יחד עם חלבון Cas9/mRNA מוזרקים לעוברי דג הזברה בשלב חד-תא (Varshney et al. , 2016). ה-sgRNA נקשר לרצף ה-DNA המטרה של 20bp הסמוך לרצף NGG של protospacer adjain motif (PAM) בגנום, לאחר מכן Cas9 יוצר חתך כפול גדיל ברצף ה-DNA היעד. לאחר מכן, רצוי לתקן זאת על ידי צירוף קצה לא הומולוגי, שהוא מנגנון תיקון נוטה לשגיאות שגורם ליצירת הכנסה/מחיקה אקראית (indel) המובילה לשינויים במסגרת הקריאה של רצף הקידוד, וכתוצאה מכך, מבטל את פונקציות של הגן המעניין. מתודולוגיות מתקדמות פותחו בשנים האחרונות כדי להגביר את היעילות של טכניקת עריכת הגנום מבוססת CRISPR (Liu et al., 2019). אפשר למחוק קטע גדול של DNA באמצעות שניים או יותר sgRNA בו-זמנית (קים וג'אנג, 2020). ניתן גם למקד בו-זמנית למספר גנים ביעילות בעובר דג זברה בודד (Shah et al., 2016). מחקרים רבים נערכו ליצירת מוטנטים של דג זברה כדי לשחזר מחלות כליה אנושיות באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9. נוק-אאוט בתיווך CRISPR של חלבון הממברנה הצילרית Arl13b הביא ליצירת מוטנטים המחקים את "תסמונת ז'וברט" (Cantagrel et al., 2008). דווח כי מוטציות בגן האנושי ELMO1 תורמות לנפרופתיה סוכרתית. דג הזברה מוטנטי elmo1 מציג פנוטיפים הנראים בעוברים היפרגליקמיים שנוצרו על ידי פגיעה בגן pdx1 כגון גלומרולוס גדול יותר, פודוציט פגום, צוואר קצר יותר והיפרפילטרציה, ובכך מדגישים את התפקוד השמור של גן זה (Sharma et al., 2016). דג הזברה magi2a מוטנטי מציג תסמונת נפרוטית עמידה לסטרואידים, אשר נצפית גם אצל אנשים עם מוטציות ב-MAGI2 (Jobst-Schwan et al., 2019). תצפיות אלו מדגישות את התאמתו של דג הזברה כאורגניזם למודל של מחלות כליה אנושיות.

שיטה נוספת ליצור מוטציות של דג זברה היא Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN) המבוססת על עריכת גנום. בטכניקה זו, תחום מקשר ה-DNA TALE מורכב ממונומרים, כל מונומר מורכב מחזרות טנדם של 34 שאריות חומצות אמינו הנקשרות לנוקלאוטיד מסוים ברצף ה-DNA. רצפי TALE אלו נגזרים מהחיידקים הפתוגנים Xanthomonas אשר משנה את שעתוק הגנים בתאי המארח (Boch and Bonas, 2010). מבנה המיקוד של TALEN מורכב מאותת לוקליזציה גרעינית, תחום מקשר ה-DNA ותחום הנוקלאז של FokI בקצה הקרבוקסיל שלהם. TALEN עובדים בזוגות כאשר אתרי הקישור שלהם ממוקמים על גדילים מנוגדים של DNA מופרדים על ידי רצף מרווח של 12 עד 25 bp. המבנים נקשרים לאתר היעד בגרעין ויוצרים שבירה כפולה גדילית, אשר לאחר מכן מתוקנת על ידי חיבור קצה לא הומולוגי (Liu et al., 2014). דג הזברה המוטנטי שנוצר על ידי CRISPR או TALEN יכול להפעיל גנים המפצים על אובדן הגנים המעניינים, ובכך מקשה על חשיפת תפקוד הגן (Rossi et al., 2015). עם זאת, ניתן לזהות את הגנים המפצים הללו על ידי ניתוח תעתיק באמצעות שיטות רצף הדור הבא (NGS), שיכולות לסייע בזיהוי תפקוד הגן המעניין. זיהוי של גנים ומסלולים מולקולריים המפצים על אובדן תפקוד של גן יכול לעזור למצוא שיטות טיפול חדשות למוטציות גנים הגורמות למחלות קשות (El-Brolosy and Stainier, 2017).

דפיקת גנים באמצעות אוליגו מורפולינו אנטי-סנס

Morpholinos הם אוליגונוקלאוטידים לא-אניוניים שהם יציבים יחסית בהשוואה לאוליגומרים של DNA או RNA שלהם (Summerton, 1999). אוליגונוקלאוטידים מורפולינו אנטי-סנס נקשרים ל-mRNA של חלבון מטרה באתר התחלת התרגום שלו וחוסמים את התרגום שלו. סוג אחר של אוליגו מורפולינו אנטי-סנס יכול לכוון לצמתי שחבור ולחסום שחבור טרום-mRNA (Summerton, 1999). אפקט אוליגו מורפולינו-אנטיסנס חולף וניתן להשתמש בו כדי לחקור את התפקיד ההתפתחותי המוקדם של הגנים המעניינים. הזרקת אוליגו מורפולינו-אנטיסנס נעשית בשלב התא 1-4 של עוברי דג הזברה וניתן לראות את השפעתה עד 3-5 ימים לאחר ההפריה (pdf) (Bill et al., 2009). אוליגונוקלאוטידים של Morpholino antisense מציגים לעתים קרובות השפעות מחוץ למטרה (Robu et al., 2007). יש לבצע ניסויי בקרה כגון ניסוי הצלה על ידי הזרקת מורפולינו יחד עם mRNA שלא ניתן לכוון אליו אוליגו אנטי-סנס זה כדי לאמת את הספציפיות שלו (Eisen and Smith, 2008). פותח מורפולינו מופעל באמצעות פוטו, שניתן לשלוט בפעילותו באופן מרחבי וזמני על ידי חשיפה ל-UV (Tallafuss et al., 2012). מחקרים רבים בוצעו תוך שימוש ב-Morpholino antisense oligo-nock-down להבנת מחלות כליה אנושיות. לדוגמה, הרס של הגן nephrocystin-3 הוביל להיווצרות של ציסטות והידרוצפליה בעוברי דג הזברה באופן דומה למחלת נפרונופטיזיס מסוג -3 (Zhou et al., 2010).

אנטיביוטיקה אמינוגליקוזיד המשמשת בדרך כלל לטיפול בזיהומים מסכני חיים רבים ידועות בהשפעה הנפרוטוקסית והאוטוטוקסית שלהן (Mingeot-Leclercq and Tulkens, 1999). גנטמיצין היא אנטיביוטיקה נפוצה שיכולה לגרום לפגיעה בכליות חריפה (AKI) אצל דג הזברה. גנטמיצין גורם להשטחה של אפיתל גבול המברשת, אובדן אפיתל צינורי, דפורמציה של מבנה הגלומרולוס, פוספוליפידוזיס ליזוזומלית והצטברות של לויקוציטים או פסולת תאים בלומן הצינורי, המחקה מנת יתר של גנטמיצין בבני אדם (Cianciolo Cosentino et al., 2010). דג הזברה יכול להתחדש ולהחליף נפרונים פגומים. עלבון גנטמיצין יכול לשמש כדי לחקור את התחדשות הכליה בדג הזברה (Kamei et al., 2015). פציעת גנטמיצין גורמת לתגובת התחדשות אשר מעוררת תאי גזע בכליות לעבור את שלבי המפרט, התפשטות והתמיינות ליצירת נפרונים חדשים. זה לוקח בערך 14 עד 21 ימים בדגים בוגרים כדי לחדש נפרונים (Diep et al., 2011; McCampbell et al., 2015). ל-Cisplatin, המשמש כתרופה כימותרפית לטיפול בגידולים, יש גם השפעות נפרוטוקסיות, כפי שנצפתה אצל דג הזברה (Hentschel et al., 2005). Etimicin הוא אמינוגליקוזיד נוסף שניתן להשתמש בו תוך חיקוי רעילות נפרוטוקסית נמוכה ורעילות אוטו בעוברי דג זברה (Shao et al., 2020). לפיכך, ניתן ללמוד AKI והתחדשות כליות בדג הזברה בעזרת אנטיביוטיקה אלו.

פגיעה מכנית בכליה

הפרונפרוס של דג הזברה יכול להיפצע פיזית באמצעות כריתה, דקירה או פציעת קריו. ניתן לבצע פציעה כירורגית על ידי שימוש בפינצטה עדינה כדי לדקור את האזור הרצוי של הפרונפרוס ליצירת מודל AKI. טכניקה זו שימשה לפגיעה בצינור הפרונפרי הקרוב לקלואקה, דבר שפגע בזרימת הנוזלים והוביל להיווצרות ציסטה תוך 30 דקות (Kramer-Zucker, 2005). נמצא שההפחתה בקצב זרימת הנוזל בפרונפרוס מייצרת לחץ חוזר באתר כניסת הנוזל, הגורם להתרחבות הלומינלית של הצינורית ולהיווצרות ציסטה. קבוצה נוספת של חוקרים ביצעה חסימה באבובית הפרונפרית במהירות של 50 hpf או באבוביות מזונפריות של 12-דגי זברה בני חודש על ידי שימוש בפינצטה כדי לצבוט את האזור הסמוך לצינוריות האיסוף הדיסטלית (Hellman et al., 2010). הם גילו שהצטלקות צינורית מובילה לעלייה בקצב פעימות הריסים ולהגברת ויסות של גורם השעתוק foxj1a המווסת את ביטוי הגנים הליפוגני. זה מצביע על כך שפגיעה באבובות הפרונפריות יוצרת אות מכנו-סנסורי מבוסס ריסים לשמירה על הומאוסטזיס נפרוני.

פגיעה בכליות הנגרמת על ידי לייזר

אבלציה של תאים בתיווך לייזר משמשת ככלי לחקר פגיעה כלייתית וחיקוי AKI בדג הזברה. Johnson et al., (2011) תיארו שיטה לאבלציה בתיווך לייזר ואחריה מעקב אחר נפרונים מתחדשים. הם הזריקו 40 kDa dextran-FITC לסומיטים של עוברי דג הזברה ב-48-55 hpf כדי לתייג את תאי האפיתל הפרוקסימליים של הצינורית, אשר נועדו לאחר מכן לאבלציה בתיווך לייזר ב-72 hpf. לאחר מכן, העוברים שנמחקו הוזרקו מחדש עם רודמין דקסטרן כדי להתחקות אחר תאי האפיתל הפרוקסימלי של הצינורית. הם מצאו שצינורית פרוקסימלית מפותחת לחלוטין נוצרה ביום השביעי לאחר אבלציה בתיווך לייזר (Johnson et al., 2011). חלופה נוספת היא להשתמש בקו מהונדס ספציפי לכליה כדי לזהות תאים לאבלציה בתיווך לייזר ולנטר את התנהגויות של תאים שכנים. אור לייזר סגול באורך גל של 405 ננומטר שימש כדי למקד את הצינורית הפרונפרית של דג הזברה Tg(atp1a1a.4:GFP) (Palmyre et al., 2014). מכיוון שספקטרום עירור GFP נמצאים בטווח של אור כחול עד סגול, הוא ספג אור לייזר של 405 ננומטר, שפועל כשקע אנרגיה כדי לגרום לפציעה בתאי האפיתל. ניסוי זה הוביל לגילוי שנדידת תאים היא התגובה העיקרית של אפיתליה פצועה. נדידת תאים קולקטיבית גרמה למתיחה מכנית שסיפקה גירויים להתפשטות התאים לתיקון הצינורית הפגועה. כדי לקבוע את הזמן שבו הצינורית הפרונפרית של דג הזברה רוכשת את יכולת ההתחדשות, Yakulov et al., (2018) השתמשו בלייזר פוטון 2-כדי להסיר חלק קטן מהצינוריות הפרונפריות ב-Tg(cldn2b:lyn-GFP) עוברים בנקודות זמן שונות ועקבו אחר תהליך ההתחדשות. הם מצאו כי אבלציה של צינוריות פרונפפריות של עוברים 2-בני יום תוקנה במהירות על ידי תגובות נדידה, בעוד שלעוברים בני יום לא הייתה יכולת זו. הם ביצעו פרופיל ביטוי גנים של עוברי דג זברה פצועים ומצאו כי cxcr4b ונציץ מעורבים בתהליך התיקון הזה (Yakulov et al., 2018).

גנטיקה כימית

ניתן להשתמש במולקולות ביו-אקטיביות קטנות כדי להפריע לתפקוד החלבון ולהבין את תפקידן הביולוגי. מספר רב של ספריות כימיות זמינות מסחרית או ניתנות להתאמה אישית לבדיקת פונקציות חלבון. ספריות מולקולות קטנות אלו כוללות מעכבי קינאז, מעכבי פרוטאז, קולטנים גרעיניים וליגנדים שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את תפקידם של מסלולי איתות המעורבים בהתפתחות האיברים ובתפקודם (Kawasumi and Nghiem, 2007). בעשורים האחרונים, דג הזברה הופיעו כאורגניזם רב עוצמה של חולייתנים לבדיקות כימיות בתפוקה גבוהה וציון פנוטיפי (Kaufman et al., 2009). Cao et al., (2009) השתמשו בגישת המסך הכימי כדי לזהות תרכובות שיכולות להפוך פנוטיפים הנגרמים על ידי מוטציות ב-pkd2 (גן סיבתי של PKD) וב-ift172 (גן שאחראי להיווצרות ריסים). הם חשפו כי מעכב פאן-היסטון דאצטילאז (פאן-HDAC) trichostatin A (TSA) וחומצה מסוג Valproic מעכבת HDAC ספציפית (VPA) יכולים לדכא היווצרות ציסטות בכליות במודל נוק-אאוט pkd2 (Cao et al., 2009 ). לפיכך, גנטיקה כימית יכולה להיות כלי שימושי לזיהוי מועמדים לתרופות חדשות שיכולות להפוך או לדכא מצבי מחלה.

מודלים של פגיעה בכליות הניתנות להשראה גנטית

ניתן להשתמש במודל אבלציה רקמה הניתנת להשראה גנטית בדג הזברה בו מתבטא ניטרודוקטאז חיידקי (NTR) תחת שליטה של ​​מקדם בחירה המניע את הביטוי של NTR בקטע מסוים של הפרונפרוס. NTR הופך מטרונידזול למטבוליט ציטוטוקסי שעלול לגרום למוות לתאים המבטאים NTR (Curado et al., 2008). Zhou and Hildebrandt (2012) השתמשו בטכניקה זו כדי לגרום לפציעה של פודוציטים על ידי ביטוי NTR בשליטה של ​​מקדם פודוקין בקו דג הזברה Tg(pod: NTR-mCherry). הם גם פיתחו קו טרנסגני כפול של VDBP-GFP (חלבון קושר ויטמין D מתויג ב-GFP) כמתאם של פרוטאינוריה יחד עם קו ה-Tg (תרמיל: NTR-mCherry). טיפול במטרונידזול גרם לפציעה של הפודוציט וכתוצאה מכך לבצקת בכל הגוף ולהצטברות של VDBP-GFP בצינוריות פרוקסימליות, המחקה את הפנוטיפ של התסמונת הנפרוטית האנושית (Zhou and Hildebrandt, 2012).

שיטות להערכת התפתחות ותפקוד פרונפרוס בדג הזברה

תיארנו את השיטות ליצור מודלים של מחלת כליות אנושית באמצעות דג זברה. יצירת מודל מחלה באמצעות אורגניזם אחר הוא השלב הראשוני, שצריך להעריך את יכולתו לשחזר נאמנה היבטים שונים של מחלה שנראתה בבני אדם. דג הזברה מציע יתרונות רבים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך במהירות את יכולתו לשמש כפונדקאית להבנת מחלות כליה אנושיות כפי שנדון להלן.

סקר מבוסס מורפולוגיה

לרוב עוברי דג זברה מוטנטיים מראים הבדלים מורפולוגיים, בהשוואה לסוג הבר שניתן לשפוט בקלות על ידי תצפיות מתחת למיקרוסקופ. השקיפות של עוברי דג הזברה ויכולתם לשרוד עד 5 ימים גם עם פגמים התפתחותיים חמורים היא יתרון מרכזי במסכים מבוססי מורפולוגיה. שינויים מורפולוגיים נפוצים שנצפו בעוברים של דג זברה עם פרונפרוס פגום כוללים בצקת קרום הלב, ציסטות פרונפריות, ציר גוף עקום והידרוצפלוס (Poureetezadi ו-Wingert, 2016; Outtandy et al., 2019). בצקת היא אחד הסימנים השכיחים של כליה פגומה הנראית גם במחסור באיברים אחרים כגון התפתחות לב (Hanke et al., 2013). מוטנטים עם מומים בכליות עלולים לפתח ציסטות בגלל שגשוג ורדי אחר של תאי אפיתל, כפי שניתן לראות בקלות תחת מיקרוסקופ (Zhao and Malicki, 2007; Yamaguchi et al., 2006). ציר גוף מעוקל נראה לעתים קרובות במוטנטים שיש להם פגמים של ריסים פרונפפריים. דג זברה מוטנטי כגון לוק (לוק), shen yantf214a(shy), garbustm304 (grb), ו-zatortg238a (zar) הן כמה דוגמאות נוספות המציגות ציר גוף מעוקל (Zhao and Malicki, 2007). מוטנטים של דג זברה עם פגמים בכליות מראים פגמים מורפולוגיים מרובים באותו עובר. הפלה של שני גנים פוליציסטין pkd1a ו-pkd1b הובילה לציר הגוף המעוקל דרך הפה, הידרוצפליה, סחוס ופגמים קרניופציאליים עם תדירות נמוכה של ציסטות פרונפפריות (Mangos et al., 2010). למוטנטים של חלבוני הובלה תוך-פלאגלריים ift57, ift88 ו-ift172, שבהם ריסים היו פגומים, היה ציר גוף עקום גחון (Lunt et al., 2009). לפיכך, מוטנטים של דג הזברה עם כליות פגומות מציגות תכונות מורפולוגיות רבות שניתן לזהות בקלות.

למידע נוסף: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501