איש קשר:jerry.he@wecistanche.com

LP Arantes1, ML Machado1, DC Zamberlan1, TL da Silveira1, TC da Silva1, IBM da Cruz1 , EE Ribeiro2, M. Aschner3 ו-FAA Soares1

1Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil 2Universidade Aberta da Terceira Idade, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM, Brasil

3המחלקה לפרמקולוגיה מולקולרית, מכללת אלברט איינשטיין לרפואה, ברונקס, ניו יורק, ארה"ב

ל- Cistanche יש אפקט אנטי אייג'ינג

תַקצִיר

גוארנה (Paullinia cupana) נבלעת בדרך כלל על ידי אנשים באזור האמזונס והיא מרכיב מפתח במשקאות אנרגיה שונים הנצרכים ברחבי העולם. הארכת אורך החיים ושכיחות נמוכה של מחלות כרוניות הקשורות לגיל נקשרו לצריכה רגילה של גוארנה.האנטי אייג'ינגהפוטנציאל של גוארנה הודגם גם ב- Caenorhabditis elegans; עם זאת, המנגנונים המעורבים בהשפעותיו אינם ברורים. כאן, חקרנו את המסלולים המשוערים המווסתים את ההשפעות של תמצית אתנולית גוארנה (GEE) על תוחלת החיים באמצעות C. elegans. מסלולי אורך החיים העיקריים הידועים נותחו באמצעות תולעים מוטציות ומבחן RT-qPCR (DAF-2, DAF-16, SKN-1, SIR-2.1, HSF{{6 }}). גם המעורבות האפשרית של איתות פורינרגי נחקרה. מחקר זה הוכיח ש-GEE פועל דרךנוגד חמצוןפעילות, מסלולי DAF-16, HSF-1 ו-SKN-1 ואורתולוג של קולטן אדנוזין אנושי (ADOR-1) כדי להאריך את תוחלת החיים. GEE גם הורידה את ה-skn-1, daf-16, sir-2.1 ו-hsp-16.2 ב-9-C. elegans בן היום, מה שעשוי לשקף פחות צורך להפעיל את הגנים המגינים הללו עקב ישירנוגד חמצוןאפקטים. התוצאות שלנו תורמות להבנת השפעות הגוארנה in vivo, שעשויות להועיל למניעה או טיפול בהפרעות הקשורות להזדקנות, וגם מציעות איתות פורינרגי כיעד טיפולי סביר למחקרי אריכות ימים.

מילות מפתח: הזדקנות; נוגד חמצון; גוארנה; אורך חיים, משך חיים; מוצרים טבעיים; Xanthines

מבוא

Paullinia cupana, המכונה גם גוארנה, הוא צמח יליד אגן האמזונס ונפוץ במיוחד בברזיל. אבקת הזרעים שלו נבלעת בדרך כלל על ידי אנשים מכל הגילאים באזור האמזונס, בעיקר בגלל תכונות הטוניק והממריצים שלה (1). יתרה מכך, גוארנה היא מרכיב מפתח במשקאות אנרגיה שונים הנצרכים במדינות רבות (2). השפעות תרופתיות נוספות של גוארנה כוללות ירידה במשקל, הפחתת סינתזת תרומבוקס-אן של טסיות דם, הגנה מפני נגעים בקיבה, פעילות נוגדת חמצון והשפעות אנטי דלקתיות [לסקירה ראה: (1)]. עם זאת, בצריכה מוגזמת, גוארנה עשויה להשפיע לרעה על בריאות האדם, ולגרום לחרדה, הפרעות שינה וטכיקרדיה, למשל, בגלל תכולת הקפאין הגבוהה שלה (2,3).

הארכת אורך החיים של אנשים החיים במאוז, אזור אמזונס בברזיל, נקשרה לתזונה האמזונית, כולל צריכה רגילה של גוארנה (4). יתר על כן, מחקר אפידמיולוגי קשר בליעת גוארנה עם שכיחות נמוכה של מחלות כרוניות הקשורות לגיל באוכלוסיית האמזונס (5). לאחרונה, מחקר גם הוכיח אתנוגד הזדקנותהפוטנציאל של תמצית זרעי גוארנה ב- Caenorhabditis elegans (6). עם זאת, המנגנונים העומדים בבסיס השפעות הגוארנה על ההזדקנות לא זוהו.

C. elegans היווה מודל מתאים להבנת התגובות האורגניזמיות לתרכובות סינתטיות וטבעיות שונות והשפעתן על ההזדקנות ותוחלת החיים. מסלולים ביולוגיים חיוניים והיבטים רבים של הזדקנות מקבילים בנמטודות ויונקים, כולל בני אדם (7).

מכיוון שאחוז האנשים המבוגרים גדל ברחבי העולם מלווה בשכיחות מוגברת של מחלות הקשורות לגיל, חיוני לזהות טיפולים יעילים ומטרות טיפוליות שעשויות לשפר את איכות החיים (8). כאן, חקרנו את המסלולים המשוערים המווסתים את ההשפעות של גוארנה על תוחלת החיים באמצעות C. elegans.

חומר ושיטות

כימיקלים

אגר, אתנול (96 אחוז), כלורופורם, כולסטרול, FUDR (5-פלואורו-20-דאוקסיורידין), מעכבי פרוטאז, קוקטיילים מעכבי פוספטאז, פריימרים של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ואלבומין בסרום בקר (BSA) נרכשו מסיגמא (ארה"ב). פריימרים של TaqMans המשמשים לניתוח qRT-PCR ו-Trizol נרכשו מ-Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific Corporation (ארה"ב). כל שאר הריאגנטים נרכשו מסינת' (ברזיל).

מתחים ותחזוקה

זנים ששימשו במחקר זה היו בריסטול N2 (סוג פראי); CB1370, daf-2 (e1370) III; CF1038, daf-16 (מו86) I; EU1, skn-1(zu67); PS3551, hsf-1(sy441) I; TK22, mev-1(kn1); ו-VC199, sir-2.1(ok434), שהושג ממרכז הגנטיקה של Caenor-habditis (CGC), אוניברסיטת מינסוטה, ארה"ב, כמו גם Escherichia coli OP50. זן EG6890, ador-1 (ox489), סופק בחביבות ממעבדת ד"ר אריק יורגנסן (אוניברסיטת יוטה, ארה"ב). לזן זה יש מחיקה מ-1 kb במעלה הזרם ומשלושת האקסונים הראשונים של הגן ador-1, והוא הוצלב 6 פעמים; הגן ador-1 מקודד לאורתולוג של קולטן אדנוזין אנושי (9).

נמטודות נשמרו ונבדקו ב-20 מעלות על לוחות אגר של נמטודות גידול (NGM) הנושאות מדשאה של E. coli OP50 (10). סנכרון של תרביות נמטודות הושג על ידי טיפול הלבנה של הרמפרודיטים בהריון וביצים הורשו לבקוע בן לילה במאגר M9 (42 מ"מ Na2HPO4, 22 מ"מ KH2PO4, 8.5 מ"מ NaCl ו-1 מ"מ MgSO4) (10).

הכנת חומר צמחי ותמצית

אבקת הזרעים הקלויים של Paullinia cupana Kunth var. sorbilis (Mart.), הגוארנה, בודד וסופק על ידי EMBRAPA Oriental (Agropecuary Research Brazilian Enterprise) הממוקם במערב אמזונס במאוז, אמזונאס, ברזיל. התמצית ההידרו-אלכוהולית התקבלה כמתואר במקום אחר (11). בקצרה, התמצית הופקה באמצעות 70 אחוז אתנול. לאחר 24 שעות, התמיסה שהתקבלה עברה סינון, האתנול הוסר והתמצית עברה ליופיליזציה. הקסנטינים והקטכינים השולטים המוצגים בתמצית הגוארנה נותחו באמצעות HPLC, והראו את הריכוזים הבאים: קפאין=12.240 מ"ג/ג, תיאוברומין=6.733 מ"ג/ג וסה"כ קטכינים{{ 9}}.336 מ"ג/גרם (11).

טיפול בתולעים

צלחות NGM הנושאות מדשאה של E. coli OP50 (כמקור מזון) הודגרו בעבר ב-37 מעלות למשך הלילה. תמצית אתנולית גוארנה ליאופילית (GEE) הומסה במים מזוקקים אוטוקלאבים קרים (121 מעלות, 30 דקות) ופזרה על הצלחות בריכוזים סופיים של 100, 500 ו-1,{8}} מ"ג/מ"ל של אגר. זחלי L1 מסונכרנים (10) הועברו באמצעות פיפטה אל פני השטח של צלחות הטיפול ותופחו לבגרות ב-20 מעלות.

אורך חיים, משך חיים

ניתוחי תוחלת חיים החלו בזחלים L4 בצלחות NGM שנזרעו עם E. coli OP50 בהיעדר או נוכחות של GEE (יום 0). בעלי חיים הועברו לצלחות טריות עם או בלי GEE כל יומיים כדי למנוע בלבול של דורות, וקיבלו ניקוד בו-זמנית עד למוות. היעדר תגובה לגירוי מכני צוין כמוות. תולעים צונזרו אם הן זחלו מהצלחת, הציגו איברים פנימיים שחולצו או מתו בגלל בקיעה של צאצאים בתוך הרחם. מבחני תוחלת חיים חזרו על עצמם שלוש פעמים עם 60-120 תולעים לכל בדיקה. באמצעות זנים מוטנטיים, נותחו מסלולי אריכות החיים העיקריים הידועים (12,13): i) daf-2 ו-daf-16, גורם הגדילה דמוי אינסולין/אינסולין (IGF){{11} } איתות (IIS), שקולטן DAF-2 מאותת באמצעות מסלול PI3-kinase/AKT משומר ומטה מווסת את DAF-16/FOXO, האחראי לקידום ביטוי של גנים להעניק אריכות ימים ועמידות מוגברת ללחץ; ii) skn-1, הקשור לחלבונים ממשפחת Nrf של בעלי חוליות ומקדם ביטוי של אנזימי ניקוי רעלים בתגובה ללחץ חמצוני, כמו גלוטתיון-S-טרנספראז; iii) אדוני-2.1, המקודד לחלבון דמוי היסטון דאצטילאז המשלב מצב מטבולי עם תוחלת החיים, וקשור להגבלה קלורית; ו-iv) hsf-1, המקודד גורם שעתוק הלם חום-1 (HSF-1) ומעורר הפעלה של גנים שונים של הלם חום או מלווים המעורבים בשמירה על ההומאוסטזיס הקונפורמטיבי של חלבונים בין פונקציות חשובות אחרות. קשר אפשרי בין אורך חיים לאיתות פורינרגי נחקר גם באמצעות זן מוטנטי ador-1.

מכיוון שחיידקים ממלאים תפקיד בתמותה של C. elegans, גידול E.coli OP50 הוערך בנוכחות או בהיעדר GEE כדי לחקור אם השפעות מועילות יכולות להיות תגובה לתכונה אנטי-מיקרוביאלית. ספיגת החיידקים נמדדה במהלך 12-שעות במדיום נוזלי (14).

תוחלת בריאות

פרמטרי התנהגות הקשורים לטווח הבריאות הוערכו (15). שאיבת הלוע הוערכה עם מיקרוסקופ Nikon E200 על ידי צפייה במספר התכווצויות הלוע במרווח של 60- שניות במבוגרים צעירים מסוג פרא.

תדירות הטראש נבחרה לניתוח של תנועה. מבוגרים צעירים מסוג פרא מטיפולי ביקורת או GEE נבחרו בנפרד והונחו בטיפה של M9. התולעים הורשו להסתגל למשך דקה אחת ולאחר מכן כמת את מספר הטראשים עם מיקרוסקופ Nikon E200 במרווח של 20- שניות. ת'ראש הוגדר כשינוי בכיוון הכיפוף באמצע הגוף.

הניתוחים בוצעו בשלושה מבחנים עצמאיים. 30 נמטודות נבדקו בכל קבוצה.

בידוד RNA ותגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-qPCR)

תולעים מסוג פרא בתולעים בוגרות 9-בנות יום נותחו עבור ביטוי גנים הקשור לאריכות ימים ותגובות מתח חמצוני. לאחר הבגרות, תולעים הועברו כל יומיים לצלחות המכילות 150 mM של FUDR (5-uoro-20-deoxyuridine) כדי לעכב רבייה, בנוכחות או בהיעדר GEE. RNA מ-20,000 תולעים לכל מצב בודד באמצעות Trizol ואחריו מיצוי כלורופורם, כפי שתואר קודם לכן (16) ו-1 מ"ג של RNA קלט הועתק לאחור ל-cDNA על ידי Applied Biosystems ערכת שעתוק לאחור של cDNA בקיבולת גבוהה (Applied Biosystems , ארה"ב). ניתוח ביטוי בוצע על ידי ניתוח מותאם אישית של מערך TaqMans תוך שימוש במבחני ביטוי גנים התואמים של TaqMans עבור מיטוכונדריאלי סופראוקסיד דיסמוטאז sod-3 (Ce02404515_g1), glutathione-S-transferase gst-4 (Ce{ {16}}g1), gamma glutamylcysteine ​​synthetase gcs-1 (Ce02436726_g1), daf-16 (Ce02422835_g1), אדוני-2.1 (Ce02 459018_g1), hsf-1 (Ce02423758_m1), חלבון הלם חום hsp-16.2 (Ce02506738_s1), ו-skn{ {35}} (Ce02407445_g1) (Applied Biosystems). ביטוי גן יעד עבר נורמליזציה לערכי הביטוי של actin afd-1 (Ce02414 573_m1). הביטוי היחסי של כל גן נקבע בשיטת 2 DDCt (17) והנתונים מדווחים כשינוי כפול ברמות ה-mRNA ביחס ל-afd-1. ניסוי זה בוצע בשלושה תכשירי תולעים עצמאיים, כל אחד בשלושה עותקים.

ניתוח סטטיסטי

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות GraphPad Prism גרסה 5 עבור Windows (תוכנת GraphPad, ארה"ב). התוצאות מדווחות כממוצע ± SD של לפחות שלושה ניסויים בודדים. מבחן t של הסטודנט שימש להשוואה בין זוגות של קבוצות, בעוד ANOVA חד או דו כיווני ואחריו מבחן הפוסט הוק של Bonferroni שימש להשוואה בין שלוש קבוצות או יותר. כל עקומות ההישרדות נותחו על ידי מבחן ה-log-rank (Mantel-Cox). מובהקות סטטיסטית נקבעה כ-Po0.05.

תוצאות

במחקר שלנו, לביקורת מסוג C. elegans תוחלת חיים ממוצעת של 11 ימים ותוחלת חיים מקסימלית של 14 ימים. במדיה המכילה GEE, תוחלת החיים הממוצעת של תולעים מסוג בר הוארך ל-13 ימים ב-100 מ"ג/מ"ל (18 אחוזים) ול-15 ימים ב-500 ו-1,000 מ"ג/מ"ל (36 אחוזים). אורך החיים המקסימלי הוארך בממוצע של 28 אחוזים בשלושת הריכוזים שנבדקו (טבלה 1). לא היה הבדל בצמיחת E. coli בנוכחות או היעדר של 1,000 מ"ג/מ"ל של GEE (לא מוצגים נתונים).

תוחלת הבריאות של התולעים התארכה גם לאחר טיפול GEE. התמצית עיכבה את הירידה הקשורה לגיל בשאיבה של הלוע (100, 500 ו-1,000 מ"ג/מ"ל) ובטראש (1,000 מ"ג/מ"ל) החל מהיום ה-9 לבגרות ( איור 1 א' ו-ב'). בהתאם, הריכוז של 1,000 מ"ג/מ"ל של GEE ודגימות של תולעים בוגרות 9-נבחרו לניתוח נוסף.

תמצית GEE (1,000 מ"ג/מ"ל) האריכה את תוחלת החיים הממוצעת של מוטנטים mev-1 ב-44 אחוזים ואת תוחלת החיים המקסימלית ב-77.8 אחוזים (טבלה 1), מה שמראה קשר ביןנוגד חמצון

מבחני תוחלת חיים בוצעו ב-20 מעלות. תוחלת החיים המרבית מיוצגת כתוחלת החיים הממוצעת של 10% מהחיים הארוכים ביותר מאוכלוסיית התולעים. כל ניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים החל עם לפחות 60 נמטודות לקבוצה. הנתונים מדווחים כממוצע ± SD. *Po0.05 בהשוואה לקבוצה הלא מטופלת (מבחן לוג-דרג מנטל-קוקס).

איור 1. תמצית אתנולית גוארנה (GEE) השפעות על פרמטרים התנהגותיים הקשורים לטווח הבריאות. קצב שאיבת הלוע (A) ו

תדירות דחיקה (B) במהלך ההזדקנות בתולעים מסוג בר. הנתונים מדווחים כממוצע ±SD (n=30 תולעים לקבוצה). *P o0.05 בהשוואה לבקרה (ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן השוואה מרובה של Bonferroni.

ונוגד הזדקנותפעילויות. התמצית גם האריכה את תוחלת החיים הממוצעת של Daf-2 ושל מוטציות Sir 2.1, וקבעה שהתמצית לא פעלה דרך המסלולים הללו כדי לקדם הארכת תוחלת חיים. לעומת זאת, הטיפול לא האריך את תוחלת החיים של מוטנטים daf-16, skn-1, hsf-1 ו-ador-1 (טבלה 1).

ניתוח PCR העריך אפנון גנים על ידי GEE (טבלה 2). GEE ב-1,000 מ"ג/מ"ל מווסתת skn-1, daf-16, sir-2.1, ו-hsp-16.2 ב-{{9 }}מבוגרים בני יום. לא נצפתה השפעה על ביטוי hsf-1, gst-4, gcs-1 ו-sod-3.

דִיוּן

כפי שהוכח בעבר (1), במחקר שלנו, תמצית גוארנה גם האריכה את תוחלת החיים ואת תוחלת הבריאות של מסוג C. elegans. לפיכך, מסלולים משוערים שעשויים להיות מעורבים בונוגד הזדקנותהשפעות נחקרו. כאן,נוגד הזדקנותהשפעות הוצגו בריכוז גבוה יותר של התמצית (1,000 לעומת 300 מ"ג/מ"ל כפי שהוכח קודם לכן). סתירה זו עשויה לנבוע מהבדלים בהכנת התמצית (תמצית הידרו-אלכוהולית לעומת מימית)

טבלה 2. ביטוי mRNA עם שינוי קיפול של גנים הקשורים לאריכות ימים ולחץ חמצוני בתולעים בוגרות 9-בר-יום שטופלו בתמצית אתנולית גוארנה (GEE)

ניסוי זה הוערך על ידי RT-qPCR ובוצע בשלושה תכשירי תולעים עצמאיים, כל אחד בשלושה עותקים. הנתונים מדווחים כאמצעים לשינוי קיפול ברמות mRNA ביחס ל-afd-1 (אקטין) ±SD. *Po0.05 בהשוואה ללא טיפול (ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של Bonferroni).

ושיטת המסירה (אגר לעומת מדיום נוזלי) ועשויה להיות תוצאה של סחף טבעי בשונות גנטית באוכלוסיית התולעים (18,19).

נראה שלחץ חמצוני הוא גורם מרכזי המגביל את תוחלת החיים הן אצל C. elegans והן בבני אדם וקשור למחלות רבות הקשורות לגיל (20,21), אשר מפנה את תשומת הלב לכיווןנוגד חמצוןתרכובות עם השפעות in vivo. כדי להמשיך ולחקור אם GEE יכול להאריך את תוחלת החייםנוגד חמצוןפעילות, הוערכה השפעתה על תולעי mev-1. זן זה מאופיין בייצור יתר של סופראוקסיד ובעל אורך חיים קצר יותר בהשוואה לזן פראי (22). תואם לתואר קודםנוגד חמצוןהשפעות של תמצית גוארנה (6), טיפול ב-GEE האריכו משמעותית את הממוצע ואת תוחלת החיים המקסימלית של תולעי mev-1.

חוץ מזה, נתיבים DAF-16, HSF-1 ו-SKN-1, המעורבים באיתות אינסולין/IGF (IIS), נראו חיוניים להארכת תוחלת חיים בתיווך GEE. IIS מופחת קשור לאריכות חיים והתאמה לתנאי סביבה שליליים ב-C. elegans, תסיסנית, יונקים ואולי בני אדם (13). HSF-1 מתפקד בשיתוף פעולה עם DAF-16 כדי להפעיל את הביטוי של גני מטרה נפוצים, כולל משפחת sHsp (גנים קטנים של חלבוני הלם חום) (23). SKN-1/Nrf משלב IIS ומווסת תגובה ללחץ חמצוני וביטוי של גנים לניקוי רעלים (24).

DAF-16, HSF-1 ו-SKN-1 עשויים גם לתווך הארכת טווח בריאות והומאוסטזיס של חלבון (25). DAF-16 מעורב ביצירת אגרגטים פחות רעילים של חלבון בעלי משקל מולקולרי גבוה (26), ולמרות ש-HSF-1 מווסת את פעילות פירוק החלבון תוך שחרור אגרגטים רעילים קטנים, עשויה להיות לו השפעה מועילה התורמת ל פינוי חלבון באמצעות מטבוליזם אנזימטי (27,28). SKN-1 ידועה בעיקר בתור רגולטור שלנוגד חמצוןוהגנה על קסנוביוטיקה, אך היא הייתה מעורבת גם בתפקודים נוספים הכוללים פרוטאוסטזיס וויסות מטבולי (24).

מתילקסנטינים, כקפאין, הם המרכיבים העיקריים של הגוארנה וידוע היטב שתרכובות אלו יכולות לפעול דרך קולטני אדנוזין ביונקים (29). קפאין נקשר להשפעות מועילות, כולל השפעות הקשורות להזדקנות (30,31) ושיפור של פנוטיפים של פגיעה קוגניטיבית על ידי אנטגוניזציה לקולטני האדנוזין A1 ו-A2A במכרסמים (32). לפיכך, בדקנו אם הארכת תוחלת החיים הנגרמת על ידי GEE עשויה להיות תלויה גם ב-ADOR-1, הומלוג קולטן לאדנוזין (33). התוצאות שלנו הצביעו על כך שתולעי ador-1(ox489) לא הצליחו להראות תוחלת חיים ממושכת, והדגימו, בפעם הראשונה, תפקיד אפשרי של המערכת הפורינרגית בהארכת תוחלת החיים. בהתאם לכך, איתות פורינרגי עשוי להיחקר באופן רווחי בעתיד כיעד פוטנציאלי לאיפונון אריכות ימים.

למרות של-GEE יש רמות גבוהות של קפאין, ומחקרים קודמים תיארו את השפעות הקפאין בתולעים (34-36),נוגד הזדקנותהשפעות של GEE עשויות להיות קשורות להשפעות סינרגיות של תרכובות שונות. ריכוז הקפאין בתמצית נמוך בהרבה מהריכוז היעיל שהודגם קודם לכן, והוכח כי לתמצית אלקלואידים מגוארנה לא היו אותן השפעות מועילות (6). חוץ מזה, נתונים מהספרות מראים שלתמציות יכולות להיות פעילויות פרמקולוגיות גדולות יותר מאשר תרכובות מבודדות (37,38).

ירידה בויסות של skn-1, daf-16, sir-2.1, ו-hsp-16.2 ב-9-C. elegans בן היום שטופלו ב-GEE עשויה משקף פחות צורך להפעיל גנים אלה כדי לתקן נזק לתאים במהלך ההזדקנות בהשוואה לתולעים לא מטופלות, אפשרי עקב ישירנוגד חמצוןהשפעות המופעלות על ידי התמצית (39,40).

לפיכך, מחקר זה הראה כינוגד הזדקנותההשפעות של גוארנה מתווכות על ידינוגד חמצוןפעילות ומסלולי DAF-16, HSF-1 ו-SKN-1. בנוסף, ADOR-1 היה הכרחי גם להשפעות GEE על תוחלת החיים, מה שמצביע על מעורבות אפשרית של המערכת הפורינרגית באורך חיים. התוצאות שלנו תורמות להבנת השפעות הגוארנה in vivo, שעשויות להיות מועילות למניעה או טיפול בהפרעות הקשורות להזדקנות, ומציעות איתות פורינרגי כיעד טיפולי סביר למחקרי אריכות ימים.

תודות

המחברים מודים ל-Caenorhabditis Genetics

מרכז (CGC) באוניברסיטת מינסוטה, ארה"ב לאספקת זני תולעים ולמעבדה של ד"ר אריק יורגנסן (אוניברסיטת יוטה, ארה"ב) על אספקת זן EG6890 באדיבות. מחקר זה נתמך על ידי Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, ברזיל (CNPq), Coordenac¸ão de Aperfeic¸oamento de Pessoal a Nível Superior, ברזיל (CAPES), PRONEM/FAPERGS/CNPq ו-MCTI/CNPq #427 3}} ו-#475896/ 2012-2. מייקל אשנר נתמך בחלקו על ידי מענק NIH R01 ES10563. מקורות המימון לא היו מעורבים

בעיצוב מחקר או פרשנות של נתונים.