ביו-assay לניטור השפעת אנטי-אייג'ינג של טיפול בדם טבורי

איש קשר:jerry.he@wecistanche.com

Sang-Hun Bae1*, Ala Jo1,2*, Jae Hyun Park1, Chul-Woo Lim1, Yuri Choi1, Juhyun Oh2, Ji-Min Park1, TaeHo Kong1, Ralph Weissleder2,3, Hakho Lee2, Jisook Moon1

1. המחלקה לביוטכנולוגיה, המכללה למדעי החיים, אוניברסיטת CHA, Gyeonggi-do 13488, הרפובליקה של קוריאה

2. המרכז לביולוגיה של מערכות, בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, MA 02114, ארה"ב

3. המחלקה לביולוגיה של מערכות, בית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, MA 02115, ארה"ב *מחברים אלה תרמו במידה שווה.

מחבר מקביל: Hakho Lee, PhD. המרכז לביולוגיה של מערכות, בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Boston, MA 02114, ארה"ב. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon, PhD. המחלקה לביוטכנולוגיה, המכללה למדעי החיים, אוניברסיטת CHA, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, הרפובליקה של קוריאה. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© Ivyspring International Publisher. זהו מאמר בגישה פתוחה המופץ תחת התנאים של רישיון Creative Commons Attribution (CC BY-NC) (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/). ראה http://ivyspring.com/terms לתנאים והגבלות מלאים.

התקבל: 2018.10.04; התקבל: 2018. 11. 18; פורסם: 2019.01.01

ל- Cistanche יש אפקט אנטי אייג'ינג

תַקצִיר

רקע כללי: טיפול בבעלי חיים מבוגרים עם פלזמה בשלב התפתחותי מוקדם (למשל, פלזמה של חבל הטבור) הראה פוטנציאל מרשים להאט את השפלה הקשורה לגיל של תפקודים עצביים וקוגניטיביים. אולם תרגום ממצאים כאלה למציאות קלינית דורש דרכים יעילות להערכת יעילות הטיפול; שיטות אידיאליות צריכות להיות פולשניות מינימליות, ניתנות לבדיקות סדרתיות, חסכוניות וכמותיות.

שיטות: פיתחנו גישת ביו-חיישן חדשה לניטורנוגד הזדקנותתֶרַפּיָה. קידמו שני מרכיבי חיישן מרכזיים: א) מטבוליט הנישא בדם זוהה כסמן הזדקנות פונדקאי; ו-ii) פותחה מערכת בדיקה קומפקטית וחסכונית עבור יישומים באתר. טיפלנו בעכברים מבוגרים עם פלזמה של חבל טבור אנושי או מי מלח; פרופיל מטבוליטים בלתי משוחד בפלזמה של עכבר גילה חומצה ארכידונית (AA) כאינדיקטור חזק הקשור ל-נוגד הזדקנותהשפעה. לאחר מכן יישמנו חיישן מגנטו-אלקטרוכימי תחרותי (cMES) המותאם לזיהוי AA ישירות מפלזמה. הפלטפורמה שפותחה יכלה לזהות AA ישירות מנפחים קטנים של פלזמה (0.5 µL) תוך 1.5 שעה.

תוצאות: מבחני cMES אישרו מתאם חזק בין רמות AA ואפקט אנטי אייג'ינג: רמות AA, בעוד שהן יורדות עם ההזדקנות, עלו בעכברים המבוגרים שטופלו בפלסמה, אשר הראו גם ביצועי למידה וזיכרון משופרים.

מסקנות: פלטפורמת cMES תעצים הן קדם והן קליניותנוגד הזדקנותמחקר על ידי הפעלת מעקב טיפול אורך זעיר פולשני; יכולות אלה יאיץ את הפיתוח שלנוגד הזדקנותטיפולים, שיפור איכות חיי הפרט.

מילות מפתח: אנטי אייג'ינג, חומצה ארכידונית, פרופיל מטבוליטים, חיישן מגנטו-אלקטרוכימי, ביוסנסור

מבוא

ההזדקנות מוכרת יותר ויותר כגורם סיכון קליני לניוון קוגניטיבי (למשל ניוון עצבי, דמנציה) ומחלות כרוניות אחרות (למשל סרטן, מחלות לב וכלי דם, ניוון שרירים) [1]. עם הרחבת תוחלת החיים של בני האדם ואוכלוסיית הקשישים הגדלה, נערכים מאמצים משמעותיים להבהיר את מנגנוני ההזדקנות [1-3] ולמצוא אסטרטגיות טיפוליות להאט או אפילו להפוך תהליכי הזדקנות [4]. אכן, דווחו תוצאות מבטיחות ממחקרים בבעלי חיים; עכברים בוגרים שקיבלו עירוי פלזמה מעכברים צעירים חזרו לתפקוד קוגניטיבי, פלסטיות סינפטית ופעילות עצבית [5]. פיתוח מהיר בנוגד הזדקנותצפויים טיפולים ותרגומם לניסויים בבני אדם [6]. עם זאת, למדדים נוכחיים לניטור השפעות הטיפול יש מעשיות מוגבלת, מכיוון שלעתים קרובות קשה ליישם שיטות בבני אדם (למשל, הדמיית מוח פולשנית, תצפית התנהגות מבוקרת) וסובייקטיביות (למשל, שאלונים על חוויות המטופל). תנאי מפתח אחד בהתקדמותנוגד הזדקנותהטיפולים טמונים אפוא בפיתוח מבחני כמות זעיר פולשניים לניטור טיפול.

חשבנו שמטבוליטים יהיו מקור חזק עבורנוגד הזדקנותסמנים ביולוגיים. מטבוליטים הם פנוטיפ חיוני באורגניזם ונחקרים כסמנים ביולוגיים אבחנתיים למחלות אחרות [7]. בפרט, הזדקנות קשורה בדרך כלל לשינויים מטבוליים או לחוסר תפקוד, המשפיעים על פרופילי המטבוליטים הכוללים באורגניזמים. ככזה, ניתן להעלות על הדעת כי מעקב אחר הרכב ו/או רמות המטבוליטים יודיע על היעילות שלנוגד הזדקנותיַחַס. יתר על כן, מבחני מטבוליטים, במיוחד בצורה של בדיקות דם, עלולים להיות כמותיים ופולשניים זעיר; יתרונות אלו יקלו על הסברה של משטרי טיפול או קבוצות חולים שונות, ומעקב אחר דינמיקה (אנטי-הזדקנות) באמצעות דגימה סדרתית.

אנו מתארים כאן אסטרטגיית ביו-חיישן חדשה לניטורנוגד הזדקנותיַחַס. שני אלמנטים מרכזיים קודמו: א) מטבוליט הנישא בדם זוהה כסמן הזדקנות פונדקאי; ו-ii) פותחה מערכת בדיקות מהירה וחסכונית עבור יישומים במסגרות קליניות שגרתיות. באופן ספציפי, טיפלנו בקבוצה של עכברים מבוגרים (בני שנתיים בערך) עם פלזמה מדם טבורי אנושי. ניתוחים מטבולומיים מקיפים בדם עכברים גילו כי חומצה ארכידונית (AA), שרמתה ירדה משמעותית עם ההזדקנות, עלתה באופן הפוך בקבוצה המטופלת. תצפית זו הובילה אותנו להמציא חיישן מגנטו-אלקטרוכימי עבור מטרות מולקולריות קטנות: ביצענו אופטימיזציה של תגובה אלקטרוכימית תחרותית שבה AA נלכד על חרוזים מגנטיים ורוכז עבור רגישות גבוהה יותר. הפלטפורמה שפותחה יכלה לזהות AA ישירות מנפחים קטנים של פלזמה (0.5 µL) תוך 1.5 שעות. באמצעות פלטפורמה זו, נוכל לבסס מתאם חיובי בין רמות AA בדם לבין ביצועים טובים יותר של בעלי חיים במשימה המוטורית.

תוצאות

טיפול בעכברים בוגרים בפלזמה של דם טבורי איור 1a מציג את ערכת הניסוי הכוללת.

כסוכן, השתמשנו בפלזמה שמקורה בדגימות דם טבורי אנושיות. מחקרים קודמים הראו כי עכברים מבוגרים שהוזרקו להם פלזמה צעירה של עכבר התאוששו תפקוד זיכרון מרחבי, ומתן מערכתי של פלזמה של דם טבורי אנושי שיפר את ההכרה התלויה בהיפוקמפוס בעכברים מבוגרים [5, 8]. הזרקת פלזמה, נטולת רכיבים תאיים, צמצמה למינימום את הסיכון לדחייה חיסונית הנובעת מאי התאמה בין מינים. עכברים מבוגרים (גיל התחלתי, בני 18 חודשים) חולקו באקראי וקיבלו פלזמה (קבוצת טיפול) או חיץ מלוחים (קבוצת דמה) באמצעות הזרקת זנב-שווא (130 μL; ראה איור S1 לפרטים). כביקורת חיובית, נעשה שימוש בעכברים צעירים (בני 3 חודשים). פלזמה שמקורה בדם טבורי לא נאספה ולכל עכבר הוזלפה שוב ושוב פלזמה מאותו תורם (איור S1). לאחר טיפול של 4-שבוע, עכברים עברו בדיקת התנהגות (כלומר, rotarod), ודם נלקח לניתוח.

איור 1. עיצוב ניסוי. פלזמה של דם טבורי אנושי ניתנה לקבוצות צעירות (3-בני חודש), מבוגרים (20- ו-23-בני חודש), וקבוצות מבוגרים שטופלו בפלזמה (20- ו23-בני חודש). שלוש הקבוצות עברו 2-מבחני Rotarod כדי למדוד קואורדינציה מוטורית ולמידה. פרופיל מטבוליטים לא ממוקד בוצע בדם משלוש הקבוצות, והרובנוגד הזדקנותהמסלול הרלוונטי נקבע באמצעות גישה ביואינפורמטית. החיישן הביולוגי פותח כדי לזהות את המטבוליט החשוב ביותר של המסלול.

איור 2. קביעת סמנים ביולוגיים של מטבוליטים הקשורים לטיפול בפלסמה של דם טבורי אנושי. (א) פרופיל גלובלי של הפרעות מטבוליטים. שורות מתאימות לתכונות (שילוב ייחודי של ערך m/z וזמן שמירה) מ-LC/MS ועמודות ועד לדוגמאות. שורות מקובצות בצורה היררכית. (ב) עלילת ציון של PCA להפחתת ממדים. דגימות שורטטו כנגד הרכיב הראשי (PC) 1 ו-2. ערכים בסוגריים של אגדות ציר הם פרופורציות של שונות המוסברות על ידי רכיבים אלה. ככל הנראה PC1 מסביר את ההשפעות האנטי-אייג'ינג, בהתחשב בכך שהקבוצה שטופלה בפלזמה הייתה הרבה יותר קרובה לקבוצה הצעירה מאשר לקבוצת הדמה. (ג) ניתוח העשרה של נתיב. מטבוליטים זוהו על ידי התאמת ערכי m/z הנמדדים למידע על המסה המולקולרית. כל מעגל מייצג מסלול מסוים שנמצא. עבור מסלול נתון, מיקום ה-x או גודל המעגל תואמים למרכזיות היחסית-בין-בין (מדד להשפעת המסלול) של מטבוליטים, ומיקום y או צבע (ערכי p נמוכים יותר עבור אדום וגבוהים יותר עבור כחול) במידה אילו מטבוליטים מיוצגים יתר על המידה. למסלולים דומיננטיים יש ערכי x ו-y גבוהים יותר. בהתאם לכך, חילוף החומרים של חומצה ארכידונית (AA) זוהה כמסלול הסביר ביותר להסברהשפעות אנטי אייג'ינגשל פלזמת הדם הטבורי.

ניתוחים מטבוליים על דגימות דם של עכברים

תחילה ביצענו פרופיל מטבוליטים של מולקולות קטנות ללא משוא פנים בפלזמה של עכבר. דגימות דם מכל שלוש קבוצות העכברים עברו ניתוחי כרומטוגרפיה נוזלים וספקטרומטריית מסה (LC/MS). עיבדנו את נתוני m/z על ידי MAIT (ערכת כלים לזיהוי אוטומטי של מטבוליטים) וזיהינו תכונות מובהקות סטטיסטית באמצעות ANOVA (8572 שילובים ייחודיים של m/z וזמן שמירה) (איור 2a). ניתוח מקבץ היררכי (HCA) של מטבוליטים גילה שני דפוסי מפתח: i) פרופילי מטבוליטים היו שונים באופן מובהק בין עכברים מבוגרים (לא מטופלים) לבין עכברים צעירים; ו-ii) הפרופיל של עכברים מבוגרים שטופלו בפלסמה היה קרוב יותר לזה של עכברים צעירים.

ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) חשף מבנים אינהרנטיים של נתונים מטבולומיים (איור 2b). כ-50 אחוז מסך כל הווריאציות היו ניתנות להסבר על ידי הרכיבים העיקריים הראשון (PC1) והשני (PC2). כל שלוש הקבוצות (כלומר, צעירים, מטופלים בפלסמה וקבוצות מדומה) התיישבו בעמדות נפרדות, מה שמצביע על כך שזוהו מאפיינים רלוונטיים ביולוגית להבדיל בין כיתות קבוצות. מעניין לציין שהקבוצה המבוגרת שטופלה בפלסמה התרחקה מהדמה לכיוון הקבוצה הצעירה. כדי לכמת את ההפרדה הקבוצתית, חישבנו אשכול היררכי על שני המרכיבים העיקריים. בדנדרוגרמה, הקבוצות הצעירות והקבוצות שטופלו בפלסמה התקבצו ברמת אי-דמיון נמוכה יותר (או רמת דמיון גבוהה יותר, 1120.9) בהשוואה לקבוצה שלא טופלה (3162.5) (איור S2). תוצאות אלו מצביעות על כך שניתן להשתמש בתכונות נבחרות (משתנים או שורות באיור 2א) כדי להסיק סמן ביולוגי של מטבוליטים רלוונטי להזדקנותנוגד הזדקנות. ביארנו את התכונות עם מטבוליטים ידועים באמצעות מסד נתונים ברשות הציבור [9].

הערכנו עוד את הפונקציות והקישוריות ההדדית של המטבוליטים שזוהו, תוך שימוש במיפוי KEGG (קיוטו אנציקלופדיה של גנים וגנומים) [10]. עבור מסלול נתון, מדדנו i) ייצוג יתר של מטבוליט מועמד ו-ii) חשיבותו (כלומר, מרכזיות ביניים) [11] כצומת ביניים מרכזי בין זוגות של מטבוליטים אחרים (ראה שיטות לפרטים). מצאנו שחילוף החומרים של חומצה ארכידונית (AA) היה המסלול עם ייצוג היתר הגבוה ביותר (ערך ה-y הגבוה ביותר באיור 2c), ומטבוליטים במסלול זה נטו להתמקם בנתיבי תקשורת (ערכי x גבוהים יותר באיור 2c) ו לשלוט בזרימת המידע. בין מטבוליטים רבים במטבוליזם של AA, בחרנו את AA עצמו כסמן ביולוגי; ככניסה התחלתית למסלול, AA לבדו יכול להיות נציג של מטבוליטים מופרעים אחרים.

חיישן מגנטו-אלקטרוכימי תחרותי (cMES) לזיהוי AA בפלזמה

בהמשך יצאנו לקדם מערכת בדיקה מהירה באתר לזיהוי AA. בחרנו להשתמש בטכנולוגיית החישה המגנטו-אלקטרוכימית [12-17]. הוא משלב העשרה וזיהוי מטרות לפלטפורמה אחת: חרוזים מגנטיים (MBs) משמשים ללכוד ולתיוג מטרות מולקולריות, ומטרות הקשורות לחרוזים מזוהות באמצעות חישה אלקטרוכימית. לגישה זו יתרונות מעשיים רבים: i) ניתן להשתמש בדגימות מקומיות (פלזמה או דם) ישירות ללא צורך בטיהור דגימה; ii) המבחן משיג רגישות זיהוי גבוהה באמצעות העשרה מגנטית והגברת אותות אנזימטי; iii) בהתבסס על ערכת הזיהוי החשמלי, ניתן למזער חיישנים בקלות כמכשיר נייד (איור 3א).

עם זאת, זיהוי AA באמצעות החישה המגנטו-אלקטרוכימית היווה אתגר טכני; מכיוון ש-AA היא מולקולה קטנה (~304.5 Da), היה קשה ליישם מבחני חיסון באמצעות זוג נוגדני AA. לכן חקרנו פורמט בדיקה תחרותית (cMES; חיישן מגנטו-אלקטרוכימי תחרותי) שדרש רק נוגדן AA בודד (איור 3b). עבור לכידת מטרה, ציפנו MBs עם נוגדני AA (MBAB). הכנו גם חומר מתחרה (AA-HRP) על ידי צימוד AA עם אנזים מחמצן (חזרת פרוקסידאז, HRP). באופן ספציפי, השתמשנו בצורת הפטן; AA מצומד על אלבומין בסרום בקר (BSA), ועוד מצומד HRP לנשא BSA (איור S3). עבור בדיקת cMES, דגימות דם עורבבו עם MBAB ו-AA-HRP. כמות ה-AA-HRP הספיקה כדי להרוות את אתרי הקישור ל-AA ב-MBAB (שיטות). זה יוביל לטעינת HRP דיפרנציאלית על MBs, בהתאם לכמויות ה-AA האנדוגניות בדגימות. הוספת ברציפות של מתווך אלקטרונים כרומוגני (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB) יצרה זרם חשמלי שנקרא על ידי אלקטרודה מישורית. זמן התגובה ללכידת AA ודגירת TMB עבר אופטימיזציה כדי למקסם את רמת האות (איור S4).

איור 3. חיישן מגנטו-אלקטרוכימי תחרותי (cMES) למבחן AA. (א) סכימה של מכשיר. למכשיר ה-cMES יש טביעת רגל קטנה ומאפשר

פעולות במקום. (ב) המצאנו בדיקה אלקטרוכימית תחרותית לזיהוי AA. חרוזים מגנטיים (MBAB) היו מצומדים עם נוגדנים נגד AA.

דגימות הבקרה הכילו AA-HRP בלבד ועורבבו עם חרוזים מגנטיים. דגימות הבדיקה עורבבו עם חרוזים מגנטיים ו-AA-HRP. (ג) זרמים חשמליים

נמדד על ידי קורא cMES הנייד. במבחן cMES, הגודל הנוכחי יורד עם הגדלת ריכוז AA [AA]. האות מהבקרה

מדגם קבע את קו הבסיס עבור [AA]=0 ננוגרם/מ"ל. ההבדל הנוכחי (∆I) בין הביקורת לדגימות הפלזמה הממוקדות שימש כמדד אנליטי. (ד)

כמויות ידועות של AA הודבקו בסרום ונמדדו על ידי cMES. גבול הגילוי היה ~ 126 ng/mL. (E) הושוו עבור cMES ו-ELISA

קונקורדנציה. התוצאות משני השיטות הראו התאמה טובה (R2=0.959). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM ממדידות משולשות.

איור 4. מדידות AA בדגימות פלזמה. (א) ניתוח מהלך זמן של רמת AA של עכבר לאחר הזרקת פלזמה. הזרמנו 13{{10}} מיקרוגל פלזמה (ריכוז AA=7.2 מיקרוגרם/מ"ל) לעכברים (n=6) ואספנו דם עכברים לאחר 3, 7 ו-14 ימים. לאחר מכן נוטרו רמות AA של דם עכברים. רמות AA עלו באופן משמעותי ביום 3 וחזרו לרמה הרגילה לאחר 7 ימים. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (ב)="" דגימות="" פלזמה="" של="" עכברים="" נבדקו.="" בקבוצת="" הביקורת="" (n="5)," לעכברים="" צעירים="" (גילאים,="" 5="" ו-8="" חודשים)="" היו="" רמות="" aa="" גבוהות="" יותר="" מאשר="" לעכברים="" ישנים="" שטופלו="" בדמה="" (גילאים,="" 20="" ו-23="" חודשים;="" n="8)." עבור="" הקבוצה="" שטופלה="" בפלזמה="" (n="5)," נצפתה="" עלייה="" מתמשכת="" ב-aa.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (ג)="" דגימות="" פלזמה="" מאותן="" קבוצות="" כמו="" ב(ב)="" נותחו="" באמצעות="" ספקטרומטריית="" מסה.="" רמות="" ה-aa="" הראו="" מגמה="" דומה="" כפי="" שנמדדה="" על="" ידי="" cmes.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" הנתונים="" מוצגים="" כממוצע="" ±="">

כתוצאה מבדיקה תחרותית, עוצמת הזרם החשמלי ירדה עם ריכוזי AA בפלזמה גבוהים יותר ([AA]). לכן הכנו דגימת בקרה על ידי דגירת MBAB עם AA-HRP בלבד. דגימת הביקורת שימשה לקביעת קו הבסיס העליון (כלומר, [AA]=0 ng/mL) לחישוב הבדלי האות; נמדדו זרמים חשמליים מבקרה ומדגימת פלזמה, וההפרש נטו |∆I |=|Icontrol - Iplasma|התקבל (איור 3ג). כגון

מדידות דיפרנציאליות פיצו גם על אות רקע משותף.

ניסוי הטיטרציה (איור 3ד) באמצעות דגימות עם תוספת של כמויות משתנות של AA חשף את גבול הגילוי (LOD) כ~125.9 ננוגרם/מ"ל. ה-LOD של הבדיקה היה פי 300- נמוך יותר מריכוז ה-AA הטיפוסי של (38 מיקרוגרם/מ"ל) בפלזמה של עכברים צעירים (5 חודשים, n=2). בהתבסס על תוצאות אלו, דיללנו דגימות פלזמה ראשוניות (100-פיפול) על ידי הוספת תמיסת חיץ (ראה שיטות). האות מקישור לא ספציפי היה קרוב לרמת רקע פנימית (~43 nA), ועשוי להפיק תועלת מגורם הדילול הגבוה. אישרנו גם שתוצאות הבדיקה תואמות לאלו מ-ELISA קונבנציונלי (R2=0.961, איור 3e). מבחן cMES, לעומת זאת, היה מהיר יותר (שעה) מאשר ELISA (4 שעות), בעיקר בשל קינטיקה של קישור מהיר; ב-cMES, MBs לוכדים AA בכל נפח הדגימה (3-דיפוזיה ממדית), ואילו לכידת AA מסתמכת על 1-דיפוזיה ממדית ב-ELISA המבוססת על לוחות.

ניטור AA בעכברים שטופלו בפלסמה

השתמשנו ב-cMES כדי לנתח רמות AA בעכברים לאחר טיפול פלזמה בודד. מכיוון ש-AA קיים באופן טבעי בדם טבורי אנושי, הזרקת פלזמה תגביר את רמות ה-AA של עכברים. ריכוז AA הממוצע משש פלזמות דם טבורי אנושיות שונות היה 7.2 ± 0.5 מיקרוגרם/מ"ל (ממוצע ± SEM). הזרקנו 13 0 µL של פלזמה של דם טבורי אנושי לעכברים (n=6) וניטרנו את רמות ה-AA שלהם (איור 4a). הזרקת פלזמה העלתה מיד את רמות AA בדם (יום 3; p < 0.01,="" בהשוואה="" לכל="" שאר="" נקודות="" הזמן),="" אך="" ההשפעה="" הייתה="" זמנית;="" רמות="" aa="" חזרו="" לנורמה="" 7="" ימים="" לאחר="" הטיפול="" (p="0.34," בהשוואה="" לנקודת="" הזמן="" שלפני="" הזרקת="">

בשלב הבא אנו עוקבים אחר רמות AA בפלזמה לאחר לוח הזמנים המלא לטיפול (איור S1). נעשה שימוש בשלוש קבוצות עכברים שונות: קבוצת גיל שטופלה בפלזמה (n=8) וקבוצת גיל דמה (n=8) (בני 20-23 חודשים), וקבוצת ביקורת צעירה (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

טיפול בפלזמה המוביל לשיפור קוגניטיבי והתנהגות בעכברים מבוגרים

הערכנו עוד פנוטיפים התנהגותיים של קבוצות בעלי חיים, במיוחד הערכנו את תפקודי הלמידה המוטורית והזיכרון שלהם. ביצענו {{0}} בדיקות rotarod 1 ו-4 חודשים לאחר טיפול פלזמה או דמה (איור 5a); השהיה (זמן הריצה) של עכבר לפני נפילה על מוט מסתובב שימש להערכת הביצועים המוטוריים של החיה. חודש אחד לאחר הטיפול (בני 20-חודש), ההשהיה של הקבוצות המדומה וגם של הקבוצות שטופלו בפלזמה הייתה נמוכה משמעותית (p < 0.0001)="" מזו="" של="" הצעירים="" (5-בני="" חודש="" )="" קבוצה="" (איור="" 5ב).="" עם="" זאת,="" הקבוצה="" שטופלה="" בפלסמה="" הראתה="" שיפור="" הדרגתי="" בלמידה="" המוטורית="" ובזיכרון,="" בעוד="" שאותה="" סגל="" ירד="" בקבוצת="" הדמה.="" שינויים="" ברמות="" aa="" המשיכו="" שינויים="" בהתנהגות,="" שיכולים="" לשמש="" אינדיקטור="" מוקדם="">נוגד הזדקנותאפקט הטיפול (איור 5c).

ניתוחי רקמת מוח (איורים 5d, 5e) הראו שלעכברים מבוגרים (קבוצת הדמה) יש שטח קטן יותר של תאים חיוביים ל-DCX באזור התת-חדרי מאשר לעכברים צעירים. לעומת זאת, השטח של תאים חיוביים ל-DCX גדל בחיה שטופלה בפלסמה ונשאר ללא שינוי (p=0.04) מה שמצביע על כך שפלזמה של דם טבורי שהוזרק עוררה נוירוגנזה של מוח ישן. התוצאות מצביעות על התועלת הפוטנציאלית של טיפול בפלזמה על נוירוגנזה מתמשכת שהביאה לשיפור התפקוד המוטורי בקבוצה המטופלת.

דִיוּן

ההתקדמות בטיפולי התחדשות מגבירה במקביל את הצורך במדד אובייקטיבי וכמותי לקריאת יעילות הטיפול. לפיכך תכננו את המחקר שלנו לזהות סמנים ביולוגיים מולקולריים שיכולים להסביר בצורה הטובה ביותר תכונות פנוטיפיות של הזדקנותנוגד הזדקנותיַחַס. הניסויים שלנו בבעלי חיים הובילו לתצפיות הבאות: i) פרופילי מטבוליטים של קבוצות עכברים צעירים ומבוגרים שונים בעליל; ו-ii) הזרקת פלזמה של חבל אנושי לעכברים מבוגרים משנה את דפוסי המטבוליטים שלהם קרובים יותר לאלו של עכברים צעירים. מעניין לציין שמצאנו חומצה ארכידונית (AA) בתור הסמן הביולוגי היעיל ביותר עבורנוגד הזדקנותיַחַס; חילוף החומרים של AA היה מאוד לא מווסת הן בעכברים צעירים והן בעכברים שטופלו בפלסמה, ונמצא כי הוא ממלא תפקידים מרכזיים באינטראקציה עם מסלולים מטבוליים אחרים כגון מטבוליזם של חומצה לינולאית [10, 18].

עוד פיתחנו מערכת חיישנים מהירה וניידת (cMES) כדי להקל על זיהוי AA במחקר שגרתי ובמסגרות קליניות. שילבנו במיוחד ערכת בדיקה תחרותית עם העשרה אימונומגנטית במטרה לזהות מטרות מולקולריות קטנות (כלומר, מטבוליטים) ישירות מדגימות פלזמה. שילוב זה מביא את היתרונות הבאים. (i) המבחן מפיק תועלת מקינטיקה של קישור מהיר, שכן חרוזים מגנטיים לוכדים AA בכל נפח הדגימה (3-דיפוזיה ממדית). (ii) תהליכי בדיקה (למשל, שלבי כביסה) מפושטים עם מגנטים חיצוניים המשמשים לאיסוף חרוזים. (iii) על ידי ריכוז מגנטי של חרוזים הקשורים ל-AA ליד אלקטרודת הזיהוי, ניתן לשפר את האות האנליטי הכולל (~72 אחוזים) [12]. ואכן, הראינו שמבחן cMES משתמש<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

איור 5. מבחני התנהגות ומולקולרים. (א) 2-ניסוי בדיקות Rotarod נערכו 1 ו-4 חודשים לאחר הזרקת הפלזמה. (ב) הקבוצה שטופלה בפלזמה

הראה שיפור מתקדם בקואורדינציה המוטורית; הביצועים היו קרובים לזו של הקבוצה הצעירה בסופו של דבר (הניסוי השני לאחר 3 חודשים). זמן הריצה של קבוצת הדמה ירד עם ההזדקנות. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01.="" (ג)="" עבור="" הקבוצה="" שטופלה="" בפלזמה,="" עלייה="" ברמות="" aa="" קדמה="" לשיפור="" התפקוד="" המוטורי.="" *p="">< 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (ד)="" תאי="" מוח="" באזור="" התת-חדרי="" הוצבעו="" באימונו="" עבור="" סמן="" נוירוגנזה,="" דו-קורטין="">

סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. שימו לב שלקבוצת הדמה היה שטח קטן יותר משמעותית של תאים חיוביים ל-DCX באזור התת-חדרי מאשר לעכברים צעירים, בעוד שהשטח גדל בחיה שטופלה בפלסמה ונשאר ללא שינוי. (ה) השטח של תאים חיוביים DCX בתמונה (D) נמדד. *p < 0.05;="" ***p=""><>

הוכח כי AA מקדם את צמיחת השרירים והתפתחות המוח [19, 20]. דוחות אחרים הדגישו גם את היתרונות הפוטנציאליים של AA בנוגד הזדקנות[21, 22]. המחקר הנוכחי תואם את הממצאים הללו, אך היקפו הוגבל לביסוס קשר מתאם בין רמות AA ו-נוגד הזדקנותפנוטיפים. עם זאת, ניטור AA סדרתי הצביע על כך שעליית AA בעכברים שטופלו בפלסמה הייתה ככל הנראה ממקורות אנדוגניים, לא מפלסמה שעבר עירוי. יתר על כן, מתמשךנוגד הזדקנותהשפעות נצפו בעכברים המקבלים אפילו 4 חודשים לאחר סיום הטיפול בפלזמה. הלמידה המוטורית ותפקודי הזיכרון השתפרו; ומספר תאי קודמים עצביים גדל במוח. תצפיות אלו מצביעות על שינויים פיזיולוגיים בעכברים שטופלו בפלסמה; המנגנון המדויק טרם הובהר.

יש להתייחס למספר מגבלות אחרות של מחקר זה במחקר עתידי. ראשית, יש לשכלל את בדיקת cMES לדיוק גבוה יותר. בפרט, עם היעדר דגימות שליליות אמיתיות (כלומר, דגימות דם ללא כל AA אנדוגני), היה קשה להסביר את האותות מקישור לא ספציפי. ניתן להעלות על הדעת, ההשפעה של מטריצות דם עשויה להיות זניחה מכיוון שדיללנו דגימות פי 100-. עם זאת, יש לאמת הנחה כזו באמצעות דגימות פלזמה שנמחקו מ-AA שניתן להכין ממודל עכבר חסר AA [23] או באמצעות דלדול חיסוני של AA. שנית, התמקדנו בזיהוי מטבוליט בודד במטבוליזם של AA לשם הפשטות, אך גישה זו עשויה להתעלם מהקשר ביולוגי כגון אינטראקציות בין מטבוליטים במסלול נתון. הכללת פאנל של מטבוליטים יתפוס טוב יותר הפרעות מטבוליות וגם תגביר את דיוק האבחון. ניתן להגדיל בקלות את cMES כדי לזהות סמנים מגוונים תוך צריכת כמויות דגימה קטנות. שלישית, אינטרפולציה של ממצאים נוכחיים לבני אדם תהיה מאתגרת. למרות לעכברים ובני אדם חולקים מסלולים מטבוליים דומים, לעכברים יש קצב חילוף חומרים גבוה פי 7- מבני אדם [24]. ניסויים בבני אדם נחוצים לקביעת מינוני פלזמה אופטימליים לעירוי וכדי לקבוע קווי בסיס לסמנים ביולוגיים; בהתבסס על מחקרים בבעלי חיים, אנחנו מתכננים מחקרים כאלה בבני אדם. מאמצים אלה יאיץ את הפיתוח שלנוגד הזדקנותטיפולים, שיפור איכות חיי הפרט וכן הפחתת עומסים חברתיים.

שיטות

עיצוב נסיוני

הפלזמה הופרדה מדם טבורי אנושי שנאסף בלידה. פלזמת הדם הטבורי ניתנה בעירוי תוך ורידי לעכברים מבוגרים (18-בני חודש), ושליטה מדמה (בני 18-חודש) ועכברים צעירים (3-בני חודש כחיוביים control) הוזרק עם מי מלח. 1 ו-4 חודשים לאחר ההשתלה, נערכו 2-בדיקות rotarod כדי להעריך קואורדינציה מוטורית וזיכרון לטווח ארוך (איור S1). פרופיל המטבוליטים הלא ממוקד בוצע בדם משלוש הקבוצות וניתוח ביואינפורמטיבי קבע אתנוגד הזדקנותמסלול רלוונטי (מטבוליזם של חומצה ארכידונית). החיישן הביולוגי פותח לאיתור חומצה ארכידונית במחזור הדם בקלות וביעילות.

הכנת דגימת דם טבורי

דם טבורי אנושי נאסף תחת המועצה לביקורת מוסדית של בית החולים הכללי של CHA (סיאול, קוריאה, מס' IRB CHAMC-2015- 08-130-009). דם טבורי אנושי נתרם מ-4 תורמים וטופל בציטראט-פאספאט-דקסטרוז עם נוגד קרישה של אדנין (CPDA-1). פלזמה של דם טבורי אנושי בודדה על ידי צנטריפוגה ב-2,000 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. דגימות פלזמה מבודדות אוחסנו ב--80 מעלות והשתמשו במחזור הקפאה-הפשרה בודד בטמפרטורת החדר.

ניסויים בבעלי חיים

פרוטוקולי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת CHA (IACUC). השתמשנו בעכברי נקבות C57BL/6 18-בני חודש כדי להעריך הפרעות מטבוליות ופנוטיפים התנהגותיים המתואמים עם הזדקנות ונוגד הזדקנות. הביקורות החיוביות היו 3-עכברי נקבות C57BL/6 בנות חודש. כל העכברים גודלו בטמפרטורת החדר במחזור אור-חושך סטנדרטי של 12 שעות. עבור העכברים הבוגרים, פלזמת דם טבורי או תמיסת מלח (130 μL) הוזרקה לווריד 12 פעמים למשך 4 שבועות. פלזמה מבודדת של דם טבורי אנושי לא אספה, וחיה נתונה קיבלה פלזמה של דם טבורי מאותו תורם. מספר החיות המשמשות בכל ניסוי מתואר בסעיפים המקבילים בשיטה. פלזמה נאספה באמצעות צנטריפוגה (3,000 גרם, 15 דקות בטמפרטורת החדר).

רכישת מטבוליטים וניתוח נתונים

לצורך יצירת פרופיל של מטבוליטים הנישאים בדם, דם נאסף מהעכברים על ידי ניקור לב בנקודות הזמן המיועדות: הקבוצה הצעירה (3-בני חודש, n=10), קבוצת הדמה ({{ 4}}בת חודש, n=10; 23-בת חודש, n=12), הקבוצה שטופלה בפלזמה (20-בת חודש, n {{13 }}; 23-בת חודש, n=5). דגימות הדם נותחו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS) מערכת (Agilent). המרנו קבצי LC/MS לפורמט mzXML סטנדרטי (ProteoWizard) [25] ולאחר מכן עיבדנו אותם באמצעות MAIT (ערכת כלי זיהוי אוטומטי של מטבוליטים) [26] לזיהוי תכונות, ניתוח סטטיסטי וזיהוי מטבוליטים. מאפיינים מובהקים סטטיסטית (כלומר, מטבוליטים מיוננים ו/או מקוטעים) זוהו באמצעות ניתוח שונות (ANOVA). תכונות אלו הותאמו לכל המטבוליטים המשוערים האפשריים במסד הנתונים של מטבולומים [9] בהתבסס על יחס המסה/טעינה של היון הספקטרלי המסתי (סובלנות m/z של 0.005). אפיינו שינויים גלובליים במטבוליטים באמצעות ניתוח אשכולות היררכי ואת המבנים הטבועים של נתוני מטבולומיקה באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA). שניים או שלושה שכפולים טכניים (המבטיחים שהווריאציה הטכנית קטנה בהרבה מהווריאציה הביולוגית) לכל עכבר נכללו בלמידה ללא פיקוח כגון PCA ו-Clustering היררכי. אשכול היררכי על רכיבים עיקריים (HCPC) בוצע על ידי FactoMineR, חבילת R [27]. לצורך ניתוח פונקציונלי, המסלולים המטבוליים הסבירים ביותר שיופרו על ידי הזדקנות וטיפול בפלזמה נקבעו באמצעות ניתוח נתיב KEGG (MetaboAnalyst 3.0) [28]. התפלגות היפרגיאומטרית שימשה למדידת ייצוג היתר של המטבוליטים התואמים במסלולי KEGG ספציפיים.

הכנת חרוזים אימונומגנטיים

חרוזים מגנטיים (5 מ"ג) מצופים בקבוצות אפוקסי (Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen) הושעו ב-100 μL של תמיסת נתרן פוספט של 0.1 M. נוספו מאה מיקרוגרם של נוגדן נגד חומצה ארכידונית (Biomatik) וערבבו היטב. נוספו מאה מיקרוליטר של תמיסת אמוניום גופרתי בנפח 3M, והתערובת הודגרה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים ולאחר מכן הודגרה עוד ב-4 מעלות למשך הלילה עם סיבוב הטיה איטי. תגובת הצימוד בוצעה ב-pH=7.4. תהליכים אלו מעוררים היווצרות של קשר קוולנטי בין קבוצות אפוקסי (חרוז) ואמינים (נוגדנים), אשר אישרנו בעבר על ידי הכפפת מצומדי נוגדנים-חרוזים לאתגרי pH [29]. בממוצע 2.4×104 נוגדנים היו מקובעים לכל חרוז. חרוזים מגנטיים מצומדים נוגדנים הופרדו עם מגנט קבוע, נשטפו פעמיים עם תמיסת PBS, והוקפו מחדש ב-200 μL של PBS עם 1 אחוז BSA. החרוזים אוחסנו ב-4 מעלות עד חודש.

צימוד HRP לחומצה ארכידונית

לאחר מכן הוצמד HRP ל-BSA באמצעות כימיה של אמינציה רדוקטיבית. באופן ספציפי, 100 מיקרוגרם של AA מצומד ב-BSA (RPU51089, Biomatik) הומס ב-0.5 מ"ל של חיץ קרבונט-ביוקרבונט 0.2M (pH 9.4), הוספה למיליגרם אחד של EZ-link lyofilized בתוספת פרוקסידאז מופעל (Thermo Scientific), ודגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, נוספו 10 μL של נתרן ציאנובורהידריד (Thermo Scientific) והתערובת הודגרה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, נוספו 20 μL של חיץ מרווה (Thermo Scientific), ולאחר מכן דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. אלקטרופורזה של ג'ל וניתוח פס חלבון אישרו צימוד HPR ל-BSA-AA (איור S3a). AA מצומד HRP נאספו ורוכזו עם מסנן צנטריפוגלי של Amicon Ultra 100K (Millipore). שאר הפרוקסידאז ו-BSA-AA נשטפו עם PBS במשך ארבע פעמים.

גילוי אלקטרוכימי של AA בדגימות פלזמה

לצורך זיהוי אלקטרוכימי של AA, נאסף דם מהקבוצות הצעירות (n {0}}), הדמה (n=8), והקבוצות שטופלו בפלזמה (n=5 למשך חודש אחד ו-n=5 למשך 3 חודשים). דגימות פלזמה של עכברים (0.5 μL) דוללו ב-50 μL של 1 אחוז BSA בדילול PBS (×100-פילול) וערבבו עם תמיסת חרוזים אימונומגנטיים (50 μL) ותמיסת AA מצומדת HRP (50 μL). כמות ה-AA-HRP הייתה גדולה מספיק כדי להרוות את אתרי הקישור בחרוזים מגנטיים. השתמשנו בערך ב-8.4×107 חרוזים לכל בדיקה, מה שהפך 2.0×1012 אתרי קישור AA זמינים. כמות ה-AA-HRP הייתה ~1.7×1013; היחס בין AA-HRP לאתרי קישור היה ~8:1. התערובת הודגרה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם סיבוב הטיה איטי. חרוז הבקרה הוכן על ידי ערבוב של 1 אחוז BSA ב-PBS (50 μL) עם תמיסת חרוזים אימונומגנטיים (50 μL) ותמיסת AA מצומדת HRP (50 μL). כל החרוזים שהגיבו הופרדו עם מגנט קבוע ונשטפו פעמיים עם 80 μL של PBS (1 אחוז BSA). לבסוף, החרוזים הושעו מחדש ב-7 μL של PBS. תמיסת החרוזים המוכנה ו-20 μL של תמיסת TMB (Biomatik) הועמסו על גבי האלקטרודה. לאחר 6 דקות, החלה מדידת כרונואמפרומטריה. השתמשנו בחיישן אלקטרוכימי ממוזער (מערכת אב טיפוס שפותחה על ידי AcurreHealth Inc.). הרמות הנוכחיות בטווח של 40-45 שניות היו ממוצעות. השתמשנו במקדם ההמרה (×100) כדי לדווח על ריכוזי ה-AA המקוריים המשוערים בפלזמה.

בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA)

ניסויי ELISA בוצעו באמצעות ערכת ELISA של חומצה ארכידונית עכבר (AA) (Biomatik) בהתאם להנחיות הייצור. AA מדולל סדרתי נוספו לכל באר, והודגרו עם AA מצומד HRP ב-37 מעלות למשך 40 דקות. לאחר כביסה עם חיץ כביסה במשך ארבע פעמים, נוספה תמיסת TMB והודגרה למשך 20 דקות. התפתחות הצבע הופסקה על ידי הוספת תמיסת עצור. הספיגה נקראה ב-450 ננומטר באמצעות קורא microplate (Tecan).

מבחן Rotarod

שינינו את מבחן Rotarod של Kong et al. [30] להערכת קואורדינציה תנועתית. הרוטארוד עם מוט בקוטר 3-ס"מ התחיל ב-4 סל"ד והאיץ ב-4 סל"ד ל-30 שניות למשך 5 דקות. העכברים הונחו על המוט, ונמדד הזמן שלקח לעכברים ליפול מהמוט. כל עכבר קיבל 3 ניסויים ביום, וזמני הריצה של כל יום חושבו כממוצע זמני האימון. בדיקת הרוטארו הראשונה נערכה ב1-חודש לאחר טיפול בפלזמה: הקבוצה הצעירה (n=29), הקבוצה הדמה (n=17), הקבוצה שטופלה בפלזמה (n {{ 11}}). פגישת אימון מחדש החלה 4-חודשים לאחר טיפול בפלזמה. כדי למנוע אימון יתר, נערך אימון מחדש במשך יומיים. הנוהל השני היה זהה לפגישה הראשונה.

הדמיה של רקמת מוח

בחודש אחד (n=4) ו-4 חודשים (n=3) לאחר הזרקת פלזמה של דם טבורי אנושי או הזרקת תמיסת מלח, החיות הורדמו ולאחר מכן הוזלו עם 4 אחוז פרפורמלדהיד (PFA) ו-PBS דרך חדר שמאל. הקבוצות הצעירות (n=5) והקבוצות הדמה (n=4) שימשו כבקרות. המוח שלהם היה

חולץ ומוגן בהקפאה. כל מוח נחתך על קריוטום בעובי של 30 מיקרומטר. ל

בצעו את האימונוהיסטוכימיה, קישור לא ספציפי נחסם עם 5 אחוז נסיוב עז תקין ב-0.3 אחוז Triton X-100 למשך 40 דקות. נוגדן ראשוני נגד Doublecortin (DCX; 1:400, Cell Signaling, #4604S) הושם למשך הלילה ב-4 מעלות, ולאחר מכן נעשה שימוש ב-PBS לכביסה [31]. נוגדן משני Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #A11008) שימש לזיהוי של DCX. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Nikon Eclipse 80i) ונותחו באמצעות תמונה J [32].

ניתוח סטטיסטי

ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות פונקציות R בסיסיות ו-lme4, חבילת R עבור כל אחת מהן

מודלים מעורבים או מודל ליניארי כללי

(GLM) ואחריו בדיקת LSD פוסט-הוק [33]. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאה סטנדרטית וערך ap של < 0.05="" נחשב="">

חומר משלים

דמויות משלימות.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

תודות

אנו מודים ל-AccureHealth Inc. על מתן החיישן האלקטרוכימי הממוזער. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק המכון לקידום טכנולוגיית מידע ותקשורת (IITP) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (2017M3A9B4025699).

אינטרסים מתחרים

המחברים הצהירו כי אין אינטרס מתחרה.