RNA ארוך שאינו מקודד KCNQ1OT1 מווסת חלבון קינאז CK2 באמצעות MiR-760 בהזדקנות והגבלת קלוריות

מילות מפתח:KCNQ1OT1; RNA ארוך שאינו מקודד; הְזדַקְנוּת;הגבלת קלוריות; חלבון קינאז CK2;מיר-760

לחץ כאן כדי לקבל מידע נוסף על השפעות אנטי אייג'ינג של Cistanche

1. הקדמה

RNAs ארוכים שאינם מקודדים (lncRNAs) הם תעתיקים בעלי גודל גדול מ-200 נוקלאוטידים שאינם מתורגמים לחלבונים. LncRNAs אחראים לתפקודים מגוונים, כולל ויסות תעתיק ב-cisאוֹעָבָר, ארגון של תחומים גרעיניים ואינטראקציה עם מיקרו-רנ"א (miRNAs) [1–3]. בפרט, הבנת רשת האינטראקציה של lncRNAs ו-miRNAs מספקת פרספקטיבה חדשה על מנגנוני הרגולציה של גנים. ה-lncRNAKCNQ1OT1, ששמו המלא הואKCNQ1תעתיק חופף 1, הוא תמלול של 91 קילובייט שמתעתק על ידי RNA פולימראז II בכיוון אנטי-סנס, ביחס לKCNQ1[4,5]. KCNQ1OT1קיים באינטרון 10 של הגן KCNQ1. הKCNQ1הלוקוס ממוקם על הזרוע הקצרה של כרומוזום 11 (11p15.5). באמצעות גיוס G9a ו-H3K27 ההיסטון מתילטרנספראז PRC2 (תסביך דיכוי פוליקומב 2),KCNQ1OT1מקיים אינטראקציה עם כרומטין ליצירת מבנה מתקפל מורכב ולאחר מכן משתיק גני מטרה מרובים [6]. בנוסף,KCNQ1OT1מעורב במספר הפרעות, כולל מחלות לב, שבץ איסכמי מוחי, טרשת עורקים, פירופטוזה וסוגי סרטן שונים (קיבה, שחלות ומעי הגס) על ידי קשירה ל-miRNAs שונים (לדוגמה, miR-760, miR{{1} }a, miR-452-3p, miR-320a, miR-701-3p ו-miR-2054), כולם מווסתים את הביטוי של גני המטרה שלהם [7–13]. עם זאת, התפקידים הביולוגיים שלKCNQ1OT1בהזדקנות והגבלת קלוריות (CR) נותרו לא ברורים.

הזדקנות תאית היא עצירה סופית של ריבוי, מגורה על ידי מספר מתחים תאיים כגון קיצור טלומרים, הפעלה אונקוגנית ולחץ חמצוני [14,15]. מחקרים קודמים זיהו את החלבון קינאז CK2 (CK2), המורכב משני קטליטיים ( ו/או 0 ) יחידות משנה ושתי רגולטוריות יחידות משנה, כמווסת הזדקנות. CK2עיכוב גורם לביטוי של מספר סמני הזדקנות, כולל הקשורים להזדקנות -גלקטוזידאז (SA- -gal) פעילות [16], p53–p21Cip1/WAF1הפעלת ציר [17], ייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS) [18], היווצרות מוקדי הטרוכרומטין הקשורים להזדקנות (SAHF) [19], וביטוי של פנוטיפ הפרשה הקשור להזדקנות (SASP) [20]. miR-186, miR-216b, miR-337-3p ו-miR-760 מקדמים הזדקנות תאית על ידי עיכוב CK2 [21,22]. הגבלת קלוריות (CR), המורכבת מהפחתה כרונית בצריכת הקלוריות הכוללת ללא תת תזונה, היא האסטרטגיה המוצלחת ביותר לדחות את ההזדקנות הסלולרית [23]. לאחרונה דווח כי CK2 מווסת על ידי CR ומעורר אוטופגיה [24]. עם זאת, המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הוויסות ההעלאה של CK2 בתיווך CR נותר לא ברור.

במחקר זה, התפקיד הפוטנציאלי שלKCNQ1OT1בהזדקנות ו-CR הוערך.KCNQ1OT1נוק-דאון קידם פנוטיפ של הזדקנות באמצעות הורדת ויסות CK2 בתאי MCF-7 ו-HCT116 סרטן אנושי ותאי פיברובלסטים IMR-90 של הריאות. מחקר זה מצביע על כךKCNQ1OT1מעלה ויסות של CK2 ביטוי באמצעות אינטראקציה עם miR-760 במהלך הזדקנות ו-CR, מה שמרמז על כךKCNQ1OT1עשוי להיות יעד טיפולי חדש למחלות הקשורות להזדקנות.

2. תוצאות

2.1. KCNQ1OT1 הפעלת נוק-דאון של SA- -gal Staining, ה-p53-p21Cip1/WAF1Pathway, ו-H3K9 Trimethylation Via CK2 השתקה בתאי סרטן אנושיים

תאי MCF-7 ו-HCT116 הועברו עםKCNQ1OT1siRNA לחקור את המעורבות שלKCNQ1OT1בהזדקנות.KCNQ1OT1נוק-דאון מווסת SA- פעילות גל (איור1א). בנוסף, תוצאות immunoblot הצביעו על כךנוק-דאון KCNQ1OT1הגביר את הרמות של p53 ו-p21Cip1/WAF1, וסימני ההיכר של SAHF (טרימתילציה מוגברת של H3K9 (H3K9me3) וירידה באצילציה של H3K9 (H3K9Ac)) (איור1ב). בעבר דווח כי הורדת ויסות CK2 משרה את סמני ההזדקנות הללו (הפעלה של SA- צביעת -gal, ה-p53-p21Cip1/WAF1מסלול, ו-SAHF) [16,17,19]. לכן, נבדק האםKCNQ1OT1מקיים אינטראקציה עם CK2. מעניין, CK2 מחוץ לרחם הביטוי ביטל את השראת SA- -גל ​​פעילות, p53, p21Cip1/WAF1, ו-H3K9me3, בתיווךKCNQ1OT1הורדת רגולציה (איור1א,ב). יתר על כן,נוק-דאון KCNQ1OT1הפחית את רמת החלבון של CK2 (דמות1ב). תוצאות אלה מצביעות על כך ביחדKCNQ1OT1נוק-דאון גורם להזדקנות תאית על ידי הורדת ויסות CK2.

2.2. KCNQ1OT1 Knockdown Induced SASP Factor Expression and ROS Generation Via CK2 השתקה בתאי סרטן אנושיים

נבדק האםKCNQ1OT1הורדת ויסות הגביר את הביטוי של גורמי SASP עקב דיווחים שתאים מזדקנים מפרישים גורמים מעודדי דלקת [14,15]. KCNQ1OT1נוק-דאון גרמה לביטוי של גורמי SASP, כולל אינטרלוקין (IL)-1 , IL-6 ומטריקס מטלופרוטאינז (MMP) 3 (איור2A). KCNQ1OT1הורדת ויסות הגדילה את כמות ה-ROS התוך תאי מכיוון שלחץ חמצוני הוא הגורם העיקרי להזדקנות [14,15]. למטרה זו, הועברו תאי HCT116 ו-MCF-7 עםKCNQ1OT1siRNA ומוכתם ב-CM-H2DCFDA.KCNQ1OT1נוק-דאון הגדיל את ייצור ROS, כפי שמצוין על ידי השינוי הימני בקרינת FL במהלך ציטומטריית flflow (איור2ב). בעבר דווח כי הורדת ויסות CK2 משרה ביטוי SASP [20] ודור ROS [18]. ביטוי חוץ רחמי של CK2 ביטלה את האינדוקציה של ביטוי גורם SASP ויצירת ROS, בתיווךKCNQ1OT1הורדת רגולציה (איור2א,ב). ביחד, תוצאות אלו מצביעות על כךKCNQ1OT1נוק-דאון גורם ליצירת ROS ודלקת באמצעות הורדת ויסות CK2.

איור 1. KCNQ10T1 נוק-דאון מושרה הפעלה של צביעת SA--gal, ה-p53-p21CipI/WAFpathway ו-H3K9 trimethylation באמצעות השתקת CK2x בתאי סרטן אנושיים. תאי HCT116 ו-MCF{{10}} הועברו ב-KCNO10T1 siRNA למשך יומיים בהיעדר או נוכחות של pcDNA3.1.HA-CK2x. (א) תאים נצבעו ב-5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside, ותמונות מייצגות התקבלו בהגדלה של פי 20 (עליון). סרגל קנה מידה=100 אממ. מוצגים נתונים מייצגים משלושה ניסויים עצמאיים. הגרפים מייצגים את אחוז התאים המוכתמים בכחול (למטה). (ב) נעשה שימוש באימונובלוטינג כדי לקבוע את רמת כל חלבון באמצעות נוגדנים ספציפיים (עליון). 3-אקטין שימש כבקר, הגרפים מייצגים את הכמות של כל חלבון ביחס ל-B-אקטין (למטה). הנתונים מדווחים כממוצע SEM.* p < 0.05; ** p < 0.01, ** p < 0.001.H3K9me3, היסטון H3 Lys9 טרימתילציה; אצטילציה של H3K9AC, H3 Lys9.

איור 2. KCNQ10התבטאות גורם הפרשה הקשורה בהזדקנות (SASP) ויצירת מיני חמצן תגובתיים (ROS) באמצעות השתקת CK2x בתאי סרטן אנושיים בתאי סרטן אנושיים HCT116 ו-MCF-7 הועברו טרנספקציה {20}}T1 siRNA למשך יומיים בהיעדר או נוכחות של pcDNA3.1-HA-CK2a. (א) הרמה של כל mRNA נקבעה על ידי תגובת שרשרת של שעתוק הפוכה-פולימראז (RT-PCR) באמצעות פריימרים ספציפיים (עליון). מוצגים נתונים מייצגים משלושה ניסויים עצמאיים. הגרפים מייצגים את הכמות של כל mRNA ביחס ל-6-אקטין (למטה). (ב) התאים הודגרו ב-10 UM CM-HDCEDA. מוצגים נתונים מייצגים משלושה ניסויים עצמאיים. הגרפים מציגים את רמת הקרינה היחסית (למטה) הנתונים מדווחים כממוצע 士 SEM. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.

2.3. KCNQ1OT1 היה מעורב בביטוי גורם SASP בתיווך ליפופוליסכריד (LPS) באמצעות השתקה CK2 בתאי סרטן אנושיים

מכיוון שטיפול ב-LPS גורם להזדקנות תאית על ידי הורדת ויסות CK2 [20], נבדק אם ה-LPS הורד ויסותKCNQ1OT1ביטוי. טיפול עם LPS (6µg/µל) הפחית את רמות התמלול שלCK2 וKCNQ1OT1בתאי סרטן אנושיים (איור3א). יתר על כן, ההשפעה שלKCNQ1OT1על ביטוי גורם SASP בתאים שטופלו ב-LPS נחקר. עם זאת, טיפול ב-LPS (6µg/µL) גורם SASP מוגבר (IL-1 ביטוי IL-6 ו-MMP3) בתאי סרטן אנושיים; טיפול נוסף עם pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36,181–37,140) ביטל את האינדוקציה בתיווך LPS של גורמי SASP (איור3ב). הוכח בעבר שהפעולה המתואמת של miR-760, miR- 186, miR-337-3p ו-miR-216b עוררה הזדקנות מוקדמת באמצעות השתקת ה-CK2 חלבון בתאי HCT116 [21], וכי miR-760 ו-miR-186 היו מווסתים למעלה בתאי IMR-90 רפליקטיביים [22]. נקבעו דפוסי הביטוי של miRNAs אלה המושפעים מטיפול ב-LPD. ניתוח כמותי בזמן אמת של תגובת שרשרת פולימראז (qPCR) גילה שכמות ה-miR-760 עלתה ביותר מ-200 אחוז בתאי HCT116 וגם ב-MCF-7 שטופלו ב-LPS (6)µg/µL), בהשוואה לתאי הבקרה. miR-186 לא היה מווסת על ידי טיפול ב-LPS, ו-miR-337-3p ו-miR-216b היו מווסתים בצורה שונה בתאים אלה (איור3ג). לפיכך, תוצאות אלו מצביעות ביחד על כך ש-LPS הגדיל את כמויות ה-miR-760 באמצעות וויסות מטהKCNQ1OT1, וכתוצאה מכך CK2 הזדקנות מתווכת בהורדת ויסות.

איור 3. KCNO10T1 היה מעורב בביטוי של גורם הפרשת פנוטיפ הפרשה (SASP) בתיווך ליפופוליסכריד (LPS) באמצעות השתקת CK2x בתאי סרטן אנושיים. (א) תאי HCT116 ו-MCF-7 טופלו ב-LPS (6 ug/uL) במשך יומיים. הרמה של כל mRNA נקבעה על ידי RI-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים (למעלה). מוצגים נתונים מייצגים משלושה ניסויים עצמאיים. B-Actin שימש כבקרה. הגרפים מייצגים את הכמות של כל mRNA ביחס ל-B-אקטין (למטה). (ב) תאים טופלו ב-LPS (6 ug/uL) בהיעדר או נוכחות של pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) ליומיים. הרמה של כל mRNA נקבעה על ידי RI-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים (משמאל). נתונים מייצגים משלושה ניסויים בלתי תלויים מוצגים ש3-אקטין שימש כבקרה. הגרפים מייצגים את הכמות של כל mRNA ביחס לאקטין (מימין). (ג) תאים טופלו עם LPS (6 ug/uL) במשך יומיים RNA הכולל בודד מתאי ונתון לניתוח PCR כדי לקבוע את הרמות היחסיות של miR-760, miR-186, miR{{ 26}}p, ו-miR-216b באמצעות RNU48 לנורמליזציה. הנתונים מוצגים כנושאים 士 SEM.*p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.

2.4. KCNQ1OT1 CK2 מווסת על ידי Sponging miR-760 בתאי סרטן אנושיים

לאחר מכן, נבדק האםKCNQ1OT1מסדיר את CK2 ביטוי באמצעות miR-760. תאי HCT116 ו-MCF-7 הועברו עם pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36,181–37,140) או KCNQ1OT1 siRNA, יחד עם חיקוי miR-760 או מעכב (רצפים המוצגים בטבלה משלימה S1). ביטוי חוץ רחמי שלKCNQ1OT1(36,181–37,140) העלה את רמת ה-mRNA שלCK2 , בעוד טיפול נוסף עם חיקוי miR-760 מדוכאKCNQ1OT1-תיווךCK2 upregulation (איור4א). בניגוד,KCNQ1OT1נוק-דאון הפחית את רמת ה-mRNA שלCK2 , בעוד טיפול נוסף עם מעכב miR-760 מדוכאKCNQ1OT1בתיווך נוק-דאוןCK2 הורדת רגולציה (איור4ב). גם החיקוי miR-760 וגם המעכב לא יכלו לשנות את הכמות שלKCNQ1OT1, המציין כי miR-760 לא היה רגולטור במעלה הזרם שלKCNQ1OT1. בסך הכל, התוצאות הללו מצביעות על כךKCNQ1OT1מגדיל את הכמות שלCK2 mRNA על ידי ספוג של miR-760. איור משלים S1 מציג את הרצפים ואתרי הקישור שלKCNQ1OT1, miR-760, וCK2 mRNA, נקבע באמצעות TargetScan ו- Miranda.

איור 4. KCNQ10T1 העלה ויסות CK2x על ידי ספוג של miR-760 בתאי סרטן אנושיים. (א) תאי HCT116 ו-MCF-7 הועברו ב-pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) במשך יומיים ב- היעדר או נוכחות של miR-760. (ב) תאי HCT116 ו-MCF-7 הועברו עם KCNO10T1 siRNA למשך יומיים בהיעדר או נוכחות של מעכב miR-760. הרמה של כל mRNA נקבעה על ידי RT-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים (למעלה). מוצגים נתונים מייצגים משלושה ניסויים עצמאיים. הגרפים מייצגים את הכמות של כל mRNA ביחס ל-B-אקטין (למטה). הנתונים מדווחים כממוצע 士 SEM.* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.

2.5. מצב CR מווסת CK2x על ידי miR-760 הורדת ויסות באמצעות KCNQ1OT1 Upregulationin בתאי סרטן אנושיים

ההנחה הייתה שביטוי KCNQ1OT1 היה מווסת למעלה במצב CR מכיוון שרמת ה- CK2x mRNA הייתה מווסתת במצב CR [24]. תאי HCT116 ו-MCF-7 הודגרו בתנאי CR כדי לבדוק השערה זו. כפי שמוצג באיור 5A, הביטוי של KCNO10T1 ו-CK2x הושרה על ידי CR בתאים אלה כאשר טיפול נוסף עם KCNQ10T1 siRNA דיכא CK2ainduction בתיווך CR, מה שמצביע על KCNQ10T1 כמווסת חיובי של CK2x בתנאי CR. בנוסף, ניתוח עם qPCR בזמן אמת הצביע על כך שרמת miR-760 ירדה ב-70 אחוז בתנאי CR, בעוד שהרמות של miR-186, miR-216b ו-miR{{22 }}p בתנאי CR לא השתנו או גדלו (איור 5B). לאחר מכן, נבדקה ההשפעה של miR-760 על CRmediated CK2x upregulation. טיפול ב-miR-760 מחקה דיכוי CK2x-upregulation בתיווך של suppresseoCR, מה שמצביע על miR-760 כמווסת שלילי עיקרי של מצבי CK2ain CR (איור 5C). לבסוף, ניתוח gPCR בזמן אמת גילה שטיפול ב-KCNO10T1 siRNA העלה את רמות ה-miR-760, בעוד ש-CR דיכא את השראת ה-miR-760 בתיווך KCNO10T1 (איור 5D). בסך הכל, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-CR הוריד את ה-miR-760 על-ידי הגברת הוויסות של KCNQ10T1, וכתוצאה מכך הגברה של CK2x בתאי סרטן אנושיים. מכיוון שדווח כי ה-lncRNA SNHG6 פועל גם בתור אספוג של miR-760 בתאי CRC [25], נבדק האם CR מעלה ויסותביטוי SNHG6. למרות זאת,SNHG6הביטוי לא השתנה במצב CR (נתונים לא מוצגים)

איור 5. מצב הגבלת קלוריות (CR) הגביר את ה-CK2x על ידי הורדת הוויסות miR-760 באמצעות הגברה של KCNO10T1 בתאי סרטן אנושיים. (A,C ו-D) תאי HCT116 ו-MCF-7 הועברו transfected עם KCNO1{{20}}T1 siRNA (A ו-D) או miR-760 (C) למשך 1.5 ימים ולאחר מכן דגירה בתנאי CR למשך שבע שעות. (ב) תאי HCT116 ו-MCF-7 הודגרו בתנאי CR למשך שבע שעות. (A,C) הרמה של כל mRNA נקבעה על ידי RT-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים (למעלה) מוצגים נתונים מייצגים משלושה ניסויים עצמאיים. 3-אקטין שימש כגרף בקרה כדי לייצג את הכמות של כל RNA ביחס ל-B-אקטין (למטה). (B,D) RNA הכולל בודד מתאי ונתון לאנליזה על ידי qPCR באמצעות RNU48 לנורמליזציה לקביעת הרמות היחסיות של ה-miRNA המצוינות הנתונים מוצגים כממוצע בתוספת SEM *y <0.05.*p <0.01;** * p < 0.001.

2.6. KCNQ1OT1 הוחלט במהלך הזדקנות רפליקטיבית בתאי פיברובלסט של ריאות אנושיים, אשר מצבי CR הצילו

מכיוון ש-CK2x מווסת מטה בתאים מזדקנים רפליקטיביים וברקמות מיושנות [16] נבדק האם KCNO1OT1 מווסת במהלך ההזדקנות בתאי פיברובלסט IMR-90 של ריאות אנושיים. נוק-דאון KCNO10T1 הפחית את רמת ה-mRNA של תאי CK2xin IMR-90 (איור 6A). לעומת זאת, KCNO1OT1 נוק-דאון הגביר את פעילות ה-SA-P-gal בתאי IMR-90, וביטוי חוץ רחמי של CK2a ביטל את השראת הפעילות של SA-3-גל בתיווך הורדת ויסות KCNO1OT1 (איור 6B). כדי לקבוע כיצד ירד ביטוי KCNQ10T1 על ידי הזדקנות רפליקטיבית, תאי IMR-90 הועברו שוב ושוב עד שנצפה מצב דמוי הזדקנות. רוב התאים ב-PDL 47 נצבעו באופן חיובי עבור SA-B-gal, בעוד שרק מעטים נצבעו באופן חיובי עבור SA-B-gal בין תאי מעבר מוקדם (PDL 34) (לא מוצגים נתונים). רמות התמלול של KCNO10T1 ירדו ב-60 אחוזים בתאי הזדקנות רפליקטיביים (PDL 47), בהשוואה לתאי מעבר מוקדם (PDL 34), מה שמצביע על כך ש-KCNO10T1 ירד בוויסות במהלך ההזדקנות המשכפלת. לבסוף, מצבי CR העלו את KCNO1OT1 ב-150 אחוז בתאי מעבר מוקדם (PDL 34) בהשוואה למצבי קלוריות רגילים. עם זאת, מצבי CR העלו את KCNO10T1 בצורה חזקה יותר (ב-250 אחוז) בתאים מזדקנים רפליקטיביים (PDL 47) בהשוואה למצבי קלוריות רגילים. המצביע על כך ש-CR יכול להציל את הביטוי המופחת של KCNO10T1 ו-CK2x, בתיווך על ידי הזדקנות רפליקטיבית (איור 6C). ביחד, נתונים אלה מצביעים על כך שהזדקנות רפליקטיבית מפחיתה את ביטוי CK2x באמצעות הורדת ויסות של KCNQ10T1, וש-CR יכול לדכא הזדקנות רפליקטיבית באמצעות ציר KCNO1OT1-CK2

איור 6. KCNQ1011 עבר ויסות מטה במהלך הזדקנות רפליקטיבית בתאי פיברובלסט ריאות אנושיים, אשר ניתן היה להציל אותם על ידי תנאי הגבלת קלוריות (CR). (א) תאי IMR-90 (PDI36) הועברו עם KCNO10T1 siRNA. הרמה של כל mRNA נקבעה על ידי RT-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים (למעלה). מוצגים נתונים מייצגים משלושה ניסויים בלתי תלויים3-אקטין שימש כבקרה. הגרפים מייצגים את הכמות של כל mRNA ביחס ל-6-אקטין (למטה). (ב) תאי IMR-90 (PDL 36) הועברו עם KCNO10T1 siRNA למשך יומיים בהיעדר או נוכחות של pcDNA3.1-HA-CK2a. תאים נצבעו ב-5-bromo-4-chloro3-indolyl--D-galactoside, ותמונות מייצגות התקבלו בהגדלה של פי 20 (משמאל) פס קנה מידה=100 um . מוצגים נתונים מייצגים משלושה ניסויים עצמאיים. הגרפים מייצגים את אחוז התאים המוכתמים בכחול (מימין). (ג) תאי IMR-90 של PDL 34 ו-PDL 47 הודגרו בתנאי CR למשך שבע שעות. רמת כל mRNA נקבעה על ידי RT-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים (משמאל). מוצגים נתונים מייצגים משלושה ניסויים בלתי תלויים3-האקטין שימש כבקרה. הגרפים מייצגים את הכמות של כל mRNA ביחס ל-6-אקטין (מימין). הנתונים מדווחים כממוצע 土 SEM.* p < 0.05, ** p < 0.01; *** p < 0.001. (ד) מודל אפשרי הממחיש את התפקידים של KCNO10T1 עבור הזדקנות ו-CR. PDL, רמת הכפלת אוכלוסייה