פקטור 6 דמוי קרופל אובדן של קטבוליזם BCAA תורם לפגיעה בכליות בעכברים ובבני אדם

edmund.chen@wecistanche.com

חילוף חומרים תאי השתנה בכִּליָהתאי אבובים פרוקסימליים (PT) ממלאים תפקיד קריטי במצב חריףפגיעה בכליות (AKI). גורם השעתוק Krüppel-like factor 6 (KLF6) מושרה במהירות ובאיתנות בשלב מוקדם של PT לאחר AKI. מצאנו ש-Klf6 נוק-דאון ספציפי ל-PT (Klf6PTKD) מגן מפני AKI וכִּליָהפיברוזיס בעכברים. אנליזה משולבת של רצף רצף חיסוני של RNA וכרומטין הוכיחה שביטוי של גנים המקודדים לאנזימים קטבוליים של חומצות אמינו מסועפות (BCAA) נשמר בעכברי Klf6PTKD, כאשר KLF6 תופס את אזור הפרומוטור של גנים אלה. לעומת זאת, ביטוי יתר KLF6 הניתן להשראה דיכא את הביטוי של גנים BCAA והחמירפגיעה בכליותופיברוזיס בעכברים. במבחנה, לתאים פצועים המבטאים יתר על המידה KLF6 היו ירידות דומות בביטוי הגנים הקטבוליים של BCAA והיו פחות מסוגלים להשתמש ב-BCAA. יתר על כן, נוק-דאון של BCKDHB, המקודד תת-יחידה אחת של האנזים מגביל הקצב בקטבוליזם של BCAA, הביא להפחתת ייצור ATP, בעוד שטיפול במשפר קטבוליזם BCAA BT2 הגביר את חילוף החומרים. ניתוח שלתפקוד כליותביטוי גנים KLF6 ו-BCAA באדם כרונימחלת כליותהחולים הראו מתאמים הפוכים מובהקים בין KLF6 לבין שניהםתפקוד כליות וביטוי BCAA. לפיכך, מיקוד לדיכוי6-מתווך של KLF של קטבוליזם BCAA עשוי לשמש יעד טיפולי מרכזי ב-AKI וכִּליָהלַיֶפֶת.

CISTANCHE ישפר אי ספיקת כליות/כליות

כְּרוֹנִימחלת כליות(CKD) גורם לתחלואה ותמותה משמעותיים ויש לו שכיחות באוכלוסיית המבוגרים בארה"ב של ~15 אחוזים. CKD יכול לנבוע מהתקפים חוזרים ונשנים של אקוטיפגיעה בכליות(AKI) מיוחסת לעלבונות סביבתיים או רעילים או להיות משנית למחלות אחרות או לטיפולים בהן. ברוב המקרים, הצינורית הפרוקסימלית (PT) היא אתר נזק ראשוני ב-AKI, שכן הפעילות המטבולית הגבוהה של תאי PT הופכת אותם לרגישים לפציעה איסכמית, ותפקידם בהפרשת תרופות ורעלים דורש שטף של פוטנציאל נזק. סוכנים דרך תאי PT (1). סוג אחד כזה של תרופות הוא כימותרפיות הפוגעות ב-DNA, המצטברות בתאי PT, וגורמות לאובדן AKI ונפרון. לאחר פציעה, תאי PT מתבדלים ומפרישים גורמים מסיסים כמו בני משפחת Wnt וקיפוד וציטוקינים (1-4). תאי PT נטולי התמיינות שורדים יכולים להיכנס מחדש למחזור התא ולהתרבות כדי לתקן את ה-PT הפגוע, ואחריו התמיינות מחדש לתאי PT מתפקדים במלואם (2). עם זאת, תאים שעוברים במקום עצירת מחזור תאים במחסום G2/M עשויים שלא להתאושש, מה שיוביל לאטרופיה ולוויסות עלייה של איתות פרופיברוטי (5), מפעילים פיברוזיס על ידי גירוי התמיינות של פיברובלסטים גרים למיופיברובלסטים המפרישים חלבוני מטריקס חוץ-תאיים, וכן גיוס תאי חיסון כגון מקרופאגים ותאי T (1).

מילות מפתח:כִּליָה; פגיעה חריפה בכליות; צינורית פרוקסימלית; גורם שעתוק; חומצות אמינו מסועפות

בנוסף להשראת מסלולי איתות פתוגניים, תאי PT פצועים מפגינים גם שינוי דרסטי בחילוף החומרים התאי. תאי PT שלא נפגעו מסתמכים במידה רבה על חמצון חומצות שומן מיטוכונדריות, מחזור חומצה טריקרבוקסילית (TCA), וזרחון חמצוני לייצור ATP. עם זאת, במצב של פציעה, חמצון חומצת שומן מדוכא, עם רק וויסות עלייה מפצה מתון של הגליקוליזה, כך שרמות ה-ATP הכוללות מופחתות ב-PT פצוע (6). יתר על כן, עיכוב של חמצון חומצת שומן במבחנה גרם לדה-דיפרנציאציה ואפופטוזיס של תאי אפיתל צינורי והחמרה in vivoפגיעה בכליותלאחר טיפול בחומצה פולית (6). באופן מעניין, וויסות-על של חמצון חומצת שומן מיטוכונדריה או חמצון חומצת שומן פרוקסיזומלית (FAO) יכול להגן מפניפגיעה בכליות(6, 7), מה שמצביע על כך ששימור חילוף החומרים הסלולרי עשוי להיות מטרה טיפולית ב-AKI. מחקרים טרנסקריפטומיים בביופסיות של כליה עם CKD אנושי וכן לאחר פציעת איסכמיה חוזרת (IRI) בעכברים מדגימים מטבוליזם לא מווסת של חומצות שומן כמו גם מטבוליזם של חומצות אמינו (6, 8). למרות שהתפקיד של חמצון חומצת שומן PT תואר בעבר ב-AKI, תפקידו של מטבוליזם של חומצות אמינו PT ב-AKI נותר לחקור. יתר על כן, המנגנונים של פציעת PT שתוארו עד כה נחקרו ברובם באמצעות מודלים של עכברים עם נוק-אאוט וביטוי יתר של מולקולות איתות בודדות, אך מנגנונים שבאמצעותם מסלולים גלובליים, הן פיברוטיים/דלקתיים והן מטבוליים, והמעבר בין החלמה נורמלית לניוון מוסדרים ב-AKI אינם מאופיינים היטב.

גורמי שעתוק פועלים כמווסת ראש של תהליכים ביולוגיים בסיסיים, בשל יכולתם לווסת את הביטוי של מטרות מרובות במורד הזרם וליצור לולאות משוב. ב-AKI, גורמי שעתוק שנחקרו היטב כמו בני משפחת FOS ו-JUN נמצאים בוויסות גבוה יותר. מחקרים עדכניים של תגובות מולקולריות ל-IRI בדגימות אנושיות ופרופיל תרגום PT לאחר חסימה חד-צדדית של השופכה (UUO) בעכברים זיהו גם את פקטור שעתוק אצבע האבץ Krüppel-like factor 6 (KLF6) כגן תגובה מוקדמת לפציעה דומה (9, 10 ). KLFs מהווים משפחה של גורמי שעתוק אצבע אבץ עם תחומים מקושרים ל-DNA המשומרים מאוד ו-N termini משתנים המתבטאים באופן נרחב, כולל ב-כִּליָה(11). ל-KLF6 יש תפקידים בתהליכים מרובים כגון התפשטות תאים והתמיינות, אפופטוזיס, תגובות נזק ל-DNA ותפקוד מיטוכונדריאלי (12) והוא זוהה כממלא תפקידים בכבד, לב וכִּליָהפיברוזיס, עם השפעות תלויות הקשר (13, 14). בתוך הכִּליָה, KLF6 מתבטא בפודוציטים גלומרולריים ומהווה מווסת חיוני של תפקוד המיטוכונדריאלי בסביבה של גלומרולוסקלרוזיס מוקדית (FSGS) (15). בנוסף לביטויו בפודוציטים גלומרולריים, KLF6 מתבטא באופן משתנה גם ב-PT, אך תפקידו בתאי PT, בתפקוד תקין או לאחר פציעה, אינו מובן. ביטוי יתר של KLF6 בתאי HK-2 הביא לפנוטיפ דה-דיפרנציאלי עם ירידה ב-E-cadherin והגברת ביטוי וימנטין וכן הוביל לביטוי מוגבר של חלבון דלקתי מקרופאג-3 (16). בנוסף, ביטוי KLF6 עלה בתגובה לגלוקוז גבוה, והשפעה זו נחסמה על ידי ביטול של TGFB1 או טיפול עם נוגדן מנטרל TGF- 1. טיפול ישיר עם TGF- 1 גרם גם לביטוי KLF6, מה שמצביע על לולאת משוב חיובית אפשרית בתאי HK-2 (16). כמו כן, הוכח כי KLF6 מושרה בתאי סרטן במבחנה על ידי מינונים תת-אפופטוטיים של התרופה הכימותרפית הפוגעת ב-DNA cisplatin (17). על מנת לקבוע את תפקידו של PT KLF6 בתגובה לנזק ל-DNA, השתמשנו ברעלן המתרחש באופן טבעי חומצה אריסטולוכית I (AAI). נפרופתיה הקשורה ל-AAI רלוונטית מבחינה קלינית (18), ורעילות AAI היא ספציפית מאוד ל-PT, ובכך מאפשרת לחקור את התפקיד של PT KLF6 באופן ספציפי בתגובה לפציעה PT. יתר על כן, AAI גורם באופן מהימן הן ל- AKI והן למעבר לפיברוזיס בעכברים, בניגוד לרוב משטרי cisplatin (19). AAI חודר לתאי PT דרך מעבירי אניונים אורגניים בזולטרליים (OATs) 1 עד 3 ויש לו גם השפעות גנוטוקסיות, דרך יצירת תוספות אריסטולקטאם (AL)-DNA, וגם השפעות ציטוטוקסיות, הגורמות לנזק מיטוכונדריאלי, שיוצר מיני חמצן תגובתיים, ובאופן ספציפי מעכב נורמלי. פונקציות PT כגון אנדוציטוזיס בתיווך קולטן (18-20). כאן, אנו מדגימים באמצעות אפנון של ביטוי KLF6 באופן ספציפי ב-PT באמצעות מחקרים של עלייה בתפקוד ואובדן תפקוד בעכברים ש-KLF 6-מתווך דיכוי של קטבוליזם של חומצת אמינו מסועפת (BCAA) תורם ל-AKI ובעקבותיוכִּליָהלַיֶפֶת.

תוצאות

AAI Treatment מגביר את ביטוי PT Klf6 כליות. מכיוון שכמה מבני משפחת KLF מתבטאים בתאי האפיתל ב-כִּליָה(21), בתחילה ביצענו qRT-PCR עבור Klfs אפיתל אלהכִּליָהקליפת המוח שנקטפה 24 שעות לאחר מנה בודדת של רעלן ספציפי ל-PT, AAI, לעומת כלי רכב (dimethyl sulfoxide [DMSO]) בעכברי C57BL/6. Klf4, Klf5 ו-Klf6 היו מווסתים באופן משמעותי, בעוד Klf15 היה מווסת משמעותית למטה (איור 1A), ושינויים אלה בביטוי הגנים התרחשו לפני עלייה משמעותית בקריאטינין בסרום (איור 1B). כדי לקבוע אם הרגולציה העליונה של Klf6 היא חולפת או ממושכת, ניתנו AAI בהזרקות מרובות 3 דאפארט עבור שתי זריקות או 3 שבועות (שלב פעיל) או למשך 3 שבועות ולאחר מכן 3 שבועות ללא AAI (שלב שיפוץ) (איור 1C) . PT נשאר שלם 24 שעות לאחר הזרקה אחת, אך לאחר שתי זריקות, תאי PT עברו מוות תאי, ועכברים שטופלו במספר מנות AAI הדגימו אובדן של PT, חדירות דלקתיות, חלבון

גבס, ופיברוזיס בסוף שלב השיפוץ (איור 1D). ביטוי Klf6 נשאר מוגבר באופן משמעותי בשלבים הפעילים והשיפוץ של הפציעה (איור 1E), מה שמצביע על תפקיד עבור KLF6 לאורך השלבים האקוטיים והפיברוטיים של הפציעה. KLF6 מתבטא בתאים גלומרולריים, צינוריים ודלקתיים, וכדי לקבוע את התרומה של ביטוי Klf6 הספציפי ל-PT לעלייה הנצפית בביטוי Klf6 של קליפת המוח הכלייתית, ביצענו רצף RNA (RNA-seq) במקטעי S2/S3 PT מנותחים במיקרו 24 שעה לאחר הזרקת AAI אחת, לפני אובדן תאי PT. Klf6 היה בעל ויסות גבוה ברמה דומה לגורמי שעתוק התגובה המוקדמת הידועים Fos ו-Jun, מה שמצביע על כך שההשראה המוקדמת של ביטוי Klf6 שליח RNA (mRNA) ב-כִּליָהמונע על ידי הביטוי שלו בתאי PT (איור 1F). ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם נתוני RNA-seq של תא בודד/גרעיני שפורסמו לאחרונה המראים ויסות-על של Klf6 בתאי PT בעכברים פצועים ובבני אדםכליות(22, 23). לבסוף, כריית נתונים של מערכי ביטוי ממחקרי קורס זמן IRI שדווחו בעבר (8) אישרה את האינדוקציה המוקדמת בביטוי KLF6, תוך 2 שעות מ-AKI, בדומה ל- Fos ו-Jun (איור 1G). נתונים אלו מצביעים על כך ש-Klf6 הוא גן מוקדם לתגובת פציעה לאחר טיפול ברעלן הספציפי ל-PT AAI ואחרי IRI ונשאר מוגבר למרות הפסקת ה-AAI.

אובדן PT-ספציפי של KLF6 מחליש את הפגיעה בכליות בשלבים הפעילים והשיפוץ שלאחר טיפול AAI.כדי לקבוע את התרומה של KLF6 הספציפי ל-PT לפציעה הנגרמת על ידי AAI, יצרנו עכברים עם נוק-דאון ספציפי ל-PT של Klf6 (Klf6PTKD) על ידי חציית עכברי Klf6fl/fl (24) עם עכברי Pepck-Cre (25). עכברי Klf6PTKD היו ברי קיימא ופוריים, עם ירידה משמעותית של ביטוי חלבון KLF6 ספציפי ל-PT אך ללא שינוי בביטוי Klf6 mRNA בכבד, בהשוואה לעכברי Klf6fl/fl (נספח SI, איור S1 A-C). לא היו הבדלים גלויים בכִּליָההיסטולוגיה או תפקוד בין עכברי Klf6fl/fl ו-Klf6PTKD בגיל 24 שבועות (נספח SI, איור S1 D ו-E), ורמות ביטוי של OATs 1 עד 3 (Slc22a6, Slc22a7 ו-Slc22a8), מסלול כניסת AAI PT, לא היו שונים באופן משמעותי (נספח SI, איור S1F).

עכברי בקרה (Klf6fl/fl) ו-Klf6PTKD טופלו עם כלי רכב (DMSO) או 3 מ"ג/ק"ג AAI תוך צפקית כל 3 ימים במשך 3 שבועות והורדו 3 ימים לאחר הזרקת AAI האחרונה כדי להעריך את השלב הפעיל של הפציעה או 3 שבועות לאחר הזרקת AAI האחרונה להערכת שלב השיפוץ של הפציעה (איור 1C). לעכברי Klf6fl/fl ו-Klf6PTKD היו כמויות דומות של תוספות AL-DNA הן לאחר הזרקה אחת והן בתום השלב הפעיל והשיפוץ (נספח SI, איור S1 G ו-H), מה שמצביע על קליטת PT דומה של AAI ותיקון של AL -תוספות DNA בעכברי Klf6fl/fl ו-Klf6PTKD. בזמן שעברו זריקות, עכברים שקיבלו AAI ירדו במשקל ביחס לאלה שקיבלו DMSO, עם ירידה דומה של ~18 אחוזים מהבסיס בעכברי Klf6fl/fl וגם Klf6PTKD בזריקה הסופית של AAI, ולאחר מכן החזרה של כמויות דומות של משקל גוף ( נספח SI, איור S2A).כִּליָהמשקלים ביחס למשקל הגוף ההתחלתי (יום 0) היו דומים בין עכברי Klf6fl/fl ו-Klf6PTKD שטופלו ב-DMSO וב-AAI בסוף השלב הפעיל (נספח SI, איור S2B). בשלב השיפוץ,כליותמעכברי Klf6fl/fl שטופלו ב-AAI שקלו פחות משמעותית מאלו של עכברים שטופלו ב-DMSO, אבל בעכברי Klf6PTKD שטופלו ב-AAI,כִּליָההמשקולות נשמרו (נספח SI, איור S2B).תפקוד כליותהוערך על ידי מדידת ריכוזי קריאטינין בסרום (איור 2A) וחנקן אוריאה (איור 2B). גם ריכוזי הקריאטינין והאוריאה בנסיוב עלו משמעותית בעכברים שקיבלו AAI לעומת DMSO; עם זאת, העליות היו פחותות משמעותית בעכברי Klf6PTKD בהשוואה לעכברי Klf6fl/fl (איור 2 A ו-B). ניתוח היסטורי לוגי באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין וחומצה מחזורית Schiff הראה שגם לעכברי Klf6fl/fl וגם Klf6PTKD שטופלו ב-AAI היו צינוריות נשפכות עם שאריות ממברנות בסיס, חדירות דלקתיות שהיו ממוקמות בעיקר ב

קליפת המוח החיצונית, ויציקות חלבון מרובות הן בקורטקס והן במדולה (איור 2 ג' ו-D). עם זאת, תכונות אלו היו פחות חמורות בעכברי Klf6PTKD בהשוואה לעכברי Klf6fl/fl, עם שימור של צינוריות ותחדירויות דלקתיות קטנות יותר. ניתוח של אזור PT נערך באמצעות צביעה פלואורסצנטית של לוטוס לקטין כדי לזהות גבולות מברשת PT שלמים בתאי PT מובחנים לחלוטין וקרינה אימונו עבור ציטוקרטין -20 (KRT-20) כדי לזהות PTs פצועים (8). בהשוואה לעכברים שטופלו ב-DMSO, גם לעכברי Klf6fl/fl וגם Klf6PTKD שטופלו ב-AAI היה אובדן משמעותי של PT בוגר, כפי שהוכח על ידי אובדן צביעת לוטוס לקטין, והשראת ביטוי KRT-20, מה שמצביע על נזק ל-PT בשני שלבים פעילים ושיפוץ (איור 2E ו-SI נספח, איור S2C). לעכברי Klf6PTKD שטופלו ב-AAI היה שימור משמעותי של PT בוגר בהשוואה לעכברי Klf6fl/fl, מלווה ברמות דומות של אינדוקציה של KRT- 20 הן בשלב הפעיל והן בשלב השיפוץ. צביעת טריכרום של שלב השיפוץכליותהראה שקיעה נרחבת של חומר פיברוטי בעכברי Klf6fl/fl, עם פחות פיברוזיס משמעותית בעכברי Klf6PTKD (איור 2F, צביעה כחולה; נספח SI, טבלה S1). שקיעה של רכיב המטריצה ​​הפיברוטית קולגן I, שזוהתה באמצעות אימונופלואורסצנטי (איור 2G ו-SI נספח, איור S2D), הראתה שקולגן I גדל משמעותית בעכברי Klf6fl/fl עם AAI אך לא בעכברי Klf6PTKD עם AAI בהשוואה ל-DMSO ב השלב הפעיל. בשלב השיפוץ, קולגן I גדל באופן משמעותי בעכברי Klf6fl/fl ו-Klf6PTKD עם AAI, עם אחוז נמוך משמעותית בעכברי Klf6PTKD עם AAI בהשוואה לעכברי Klf6fl/fl עם AAI. תאים דלקתיים אינטרסטיציאליים המורכבים מ-CD68 פלוס מקרופאגים ו-GR-1 פלוס מונוציטים מיאלואידים היו נוכחים ב-Klf6fl/fl

ועכברי Klf6PTKD שטופלו ב-AAI אך היו בשפע פחות משמעותית בעכברי Klf6PTKD הן בשלב הפעיל והן בשלב העיצוב מחדש (איור 2H). לפיכך, אובדן של KLF6 הספציפי ל-PT מגן מפני פציעת PT, פיברוזיס ודלקת הנגרמת על ידי AAI, למרות נוכחותן של כמויות דומות של תוספות AL-DNA בהשוואה לעכברי ביקורת שטופלו ב-AAI. אובדן PT-ספציפי של KLF6 מפחית איתות דלקתי ומשמר את חילוף החומרים הסלולרי לאחר טיפול AAI. ביקשנו להבין את המנגנונים שבאמצעותם אובדן של PT KLF6 מגן מפני פציעה, ולכן התחייבנו ל-RNA-seq שלכִּליָהcortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- או<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">

כדי לקבוע מסלולים שעלולים להיות מווסתים באופן ישיר ועקיף על ידי KLF6, ניתחנו עוד את הגנים המובעים בצורה דיפרנציאלית על ידי סיווגם על סמך נוכחותם ומיקומם של אתרי הקישור של KLF6, תוך שימוש בנתוני רצף חיסוני כרומטין של KLF6 (ChIP-Seq) מפרויקט Encyclopedia of DNA Elements . גנים מחלקה 2 הוגדרו כבעלי לפחות אתר קישור אחד של KLF6 בתוך ±1 kb מאתר התחלת התעתוק (TSS), גנים מחלקה 1 כבעלי אתר קישור KLF6 לפחות אחד בין ±1 ל-10 kb מה- גנים TSS ו-class 0 ללא אתר קישור של KLF6 בתוך ±10 kb מה-TSS. היו 538 גנים שהיו בוויסות גבוה יותר בעכברי Klf6fl/fl והן מווסתות מטה בעכברי Klf6PTKD לעומת Klf6fl/fl בשלב הפעיל. ניתוח העשרה של מסלולים של 538 גנים אלה הראה שמסלולים הקשורים למערכת החיסון המולדת (למשל, TYROBP, phagosome ומקרופאג) והיצמדות לתאים (למשל, אינטגרין, הידבקות מוקדית) - הועשרו באופן משמעותי (איור 3A). סיווג הגנים לפי אתרי קישור של KLF6 הראה שלרוב ה-DEGs (428/538) לא היו אתרי קישור של KLF6 (מחלקה 0), וניתוח העשרה של גנים מחלקה 2 (72) וגנים מחלקה 0 בנפרד הראה שהמשמעות של מסלולים אלה מונעת מאוד על ידי גנים מסוג 0, מה שמצביע על כך שהביטוי הנמוך יותר של גנים אלה בעכברי Klf6PTKD היה ככל הנראה השפעה עקיפה של פחות פגיעה ב-PT כתוצאה מ-Klf6 ספציפי ל-PT (איור 3A).

CISTANCHE ישפר את תפקוד הכליות/כליות

היו 388 גנים שהיו מווסתים מטה בעכברי Klf6fl/fl והן השתמרו באופן משמעותי (בווסת למעלה) בעכברי Klf6fl/fl לעומת Klf6fl/fl. ניתוח העשרת מסלולים הראה שגנים אלה ייצגו מסלולים מטבוליים, כאשר חילוף החומרים של חומצות אמינו ומטבוליזם חומצות שומן בולטים (איור 3B ו-SI נספח, איור S4). ניתוח העשרה של גנים מחלקה 2 (1{{10}}3) וגנים מחלקה 0 (246) הראה שלמרות שרק ל-25 אחוז מהגנים יש אתרי קישור של KLF6 בטווח של ±1 קילובייט מה-TSS ( class 2), תת-קבוצה זו של גנים הייתה המניע לערכי P המשמעותיים ביותר של מסלולים אלה. באופן מדהים, מסלולים מטבוליים של חומצות אמינו ספציפיות (Val, Leu ו-Ile [BCAA] ו-Gly, Ser ו-Thr) היו משמעותיים באותה מידה כאשר נותחו רק גנים מסוג 2, דבר המצביע על ויסות ישיר פוטנציאלי של מסלולים אלה על ידי KLF6 (איור 3B) . לעומת זאת, המשמעות הגבוהה של מסלולים מטבוליים של חומצות שומן ושל מסלול איתות PPAR נבעה ברובה על ידי גנים מסוג 0, מה שמרמז על שימור עקיף של מסלולים אלה כתוצאה מנפילת Klf6 ספציפית ל-PT. ניתוח העשרה של ערכת גנים עבור מסלולים מטבוליים ספציפיים של קיוטו אנציקלופדיה של גנים וגנומים (KEGG) (פירוק חומצות שומן, מטבוליזם של חומצות אמינו, מחזור TCA וגליקוליזה) תוך שימוש בכל הגנים המווסתים באופן דיפרנציאלי אישר כי אלה מווסתים (נשמרים) בצורה משמעותית ב Klf6PTKD לעומת עכברי Klf6fl/fl (איור 3C).

אינדוקציה של KLF6 מחמירהפגיעה בכליותומדכא גנים קטבוליים של BCAA לאחר טיפול AAI. כדי לקבוע אם ביטוי יתר של KLF6 יביא את ההשפעות ההפוכות, השתמשנו במערכת ה-"tet-on" כדי ליצור מודל עכבר עם ביטוי שניתן להשראת דוקסיציקלין (DOX) של KLF6 אנושי (hKLF6OE; CAG-rtTA,TRE-hKLF6 כפול מהונדס עכברים) (נספח SI, איור S5A). לעכברי hKLF6OE הייתה אינדוקציה חזקה של ביטוי hKLF6 לאחר השלמה של דיאטה עם DOX למשך 7 ימים ללא הבדלים משמעותיים בביטוי Klf6 של עכברים (נספח SI, איור S5B), והכליותלא הפגין פגיעה היסטולוגית גלויה או אובדן שלתפקוד כליותלאחר טיפול מתמשך עם DOX למשך 15 שבועות (נספח SI, איור S5 C ו-D) בהשוואה לעכברי ביקורת (TRE-hKLF6 עם טיפול DOX). עם זאת, כדי לגלות האם אינדוקציה של hKLF6 ב-PT החמירה את AKI וכִּליָהפיברוזיס, hKLF6OE ועכברי ביקורת טופלו במינון נמוך יותר של 1 מ"ג/ק"ג AAI או DMSO כל 3 ימים במשך 2 שבועות ואחריו המתת חסד לאחר 3 ימים נוספים (שלב פעיל) או שבועיים נוספים (שלב שיפוץ) (נספח SI, איור S6A). עכברי בקרה ו-hKLF6OE שקיבלו AAI איבדו כמויות דומות של משקל גוף (נספח SI, איור S6B) וכִּליָההמשקלים היו דומים בין כל הקבוצות (נספח SI, איור S6C). לעכברי hKLF6OE הייתה עלייה משמעותית בקריאטינין ובחנקן אוריאה בסרום בהשוואה לעכברי ביקורת לאחר טיפול ב-AAI בשלב הפעיל (איור 4 A ו-B). זה לווה באובדן של PT בוגר עם שיעור גבוה יותר של PT -20-חיובי KRT, שהוחמר בעכברי hKLF6OE בשתי נקודות הזמן (איור 4 C-E ו-SI נספח, איור S6D) ועלה. פיברוזיס בשני השלבים (איור 4F ו-SI נספח, איור S6E). ניתוח qRT-PCR של גנים המקודדים לאנזימים במסלול המטבולי BCAA הראה דיכוי של גנים BCAA לאחר טיפול ב-AAI בעכברי בקרה ו-hKLF6OE, עם דיכוי נוסף בעכברי hKLF6OE בהשוואה לעכברי ביקורת (איור 4G). יתרה מזאת, ביטוי של כמה מהגנים של BCAA גם הצטמצם באופן משמעותי (Hibch) או הראה מגמה של ביטוי נמוך יותר בעכברי hKLF6OE לעומת עכברי בקרה אפילו ללא טיפול ב-AAI (מטופל ב-DMSO) (איור 4G). נתונים אלה מצביעים על כך שאינדוקציה של hKLF6 בעכברים בוגרים הופכת אתכִּליָהרגישים יותר ל-AKI ולפיברוזיס בסופו של דבר עם חוסר ויסות משמעותי של גנים המקודדים לקטבוליזם של BCAA.

אינדוקציה של KLF6 מדכאת קטבוליזם של BCAA, שהוא מצע חשוב לייצור ATP במבחנה.טבוליזם מיטוכונדריאלי BCAA ca יכול לתרום לזרחון חמצוני על ידי ייצור של אצטיל-CoA ו-succinyl-CoA (נספח SI, איור S4B). כדי לחקור האם KLF6 מווסת BCAA ומטבוליזם תאי במבחנה, הערכנו תחילה את הביטוי של גנים מטבוליים של BCAA בתאי HK-2 עם ביטוי יתר של KLF6 (KLF6-OE), עם או בלי טיפול ב-AAI. כמו בעכברי hKLF6OE, ביטוי יתר של KLF6 בתאי HK-2 בלבד הוביל למגמה של דיכוי של מספר גנים המקודדים לאנזימי BCAA, בעיקר BCKDHB. טיפול בתאי KLF6-קונ עם 25 מיקרומטר AAI במשך 6 שעות דיכאו באופן משמעותי ביטוי של מספר אנזימים, ואלה דוכאו עוד יותר בתאי KLF6-OE שטופלו ב-AAI (איור 5A). ל

איור 3. אובדן של KLF6 מדכא מסלולים פרופיברוטיים ומשמר מסלולים מטבוליים לאחר טיפול AAI. (א) סיווג וניתוח העשרת מסלולים של גנים מווסתים מעלה בעכברי Klf6fl/fl לאחר AAI אך מווסתים פחות משמעותית בעכברי Klf6PTKD לאחר AAI לפי מחלקת אתר הקישור: מחלקה 2 עם אתר קישור גדול או שווה ל-1 KLF6 בתוך ±1 kb של TSS; class 1 עם יותר או שווה ל-1 KLF6 אתר קישור ב-±1 עד 10 kb מ-TSS; ומחלקה 0 ללא אתר קישור של KLF6 בטווח של ± 10 קילו-בייטים מ-TSS. (ב) סיווג וניתוח העשרת מסלולים של גנים מווסתים מטה בעכברי Klf6fl/fl לאחר AAI אך מווסתים פחות באופן משמעותי (כלומר, נשמר) בעכברי Klf6PTKD לאחר AAI לפי מחלקה של אתר קישור: מחלקה 2 עם יותר מ- או שווה ל- 1 אתר קישור של KLF6 בתוך ±1 kb מ-TSS; class 1 עם יותר או שווה ל-1 KLF6 אתר קישור ב-±1 עד 10 kb מ-TSS; ו-class 0 ללא אתר קישור של KLF6 בטווח של ±10 kb מ-TSS. (ג) חלקות ניתוח העשרה של סט גנים תוך שימוש בכל הגנים המובעים בצורה דיפרנציאלית, לפירוק חומצות שומן KEGG (FA DEGRAD), מטבוליזם של חומצות אמינו (AA METAB) ומחזור TCA (KEGG_TCA).

לקבוע אם דיכוי זה בביטוי גנים BCAA בנוכחות AAI הוביל לשינויים בקטבוליזם BCAA, מדדנו ריכוזי BCAA תוך תאיים. לאחר טיפול ב-AAI, תאי KLF6- Con הראו ירידה ב-BCAA, בהתאם לקטבוליזם מוגבר של ה-BCAA, אולי כפיצוי על אובדן חמצון FA (איור 5B). עם זאת, השפעה זו אבדה בתאי KLF6-OE, שלא הייתה להם ירידה ב-BCAA התוך תאי לאחר טיפול ב-AAI, בהתאם ליכולת מופחתת לפזר BCAA (איור 5B), וזה מתאם עם ייצור ATP המיטוכונדריאלי מופחת בהשוואה לתאי KLF6- שטופלו ב-AAI (איור 5C).

המדיה הסטנדרטית המשמשת למדידת ייצור ATP מכילה ריכוזים גבוהים של גלוקוז (10 מ"מ גלוקוז, 1 מ"מ גלוטמין ו-2 מ"מ פירובט), וכדי לקבוע אם ביטוי יתר של KLF6 לבדו יכול לשנות את השימוש במקורות אנרגיה שונים, ביצענו במקום מבחנים של קצב צריכת חמצן (OCR) במדיה מוגבלת אנרגיה (מדיה נטולת סרום עם 1 מ"מ גלוקוז, ללא גלוטמין וללא פירובט). לתאי KLF6-OE היה מופחת OCR מיטו כונדריאלי (מוגדר כ-OCR ראשוני פחות OCR לא-מיטוכונדריאלי שנקבע לאחר מתן רוטנון/אנטימיצין A) אך היה להם פיצוי דומה לאחר חסימת גליקוליזה עם 2-דאוקסיגלוקוז (2- DG) ו-FAO דומה (הפחתה ב-OCR לאחר חסימת FAO עם etomoxir) (איור 5 D ו-E). מכיוון שהתגובה המיטו כונדריאלית לאובדן הגליקוליזה וה-OCR כתוצאה מחמצון FA לא השתנו בתאי KLF6-OE, הדבר הצביע על כך שתפקוד המיטוכונדריה הכולל לא הושפע, אלא חוסר יכולת להשתמש ב-BCAA כמקור עלול להסביר את ההפחתה הבסיסית ב-OCR המיטוכונדריאלי בתנאים מוגבלי אנרגיה אלו. כדי לקבוע אם אובדן קטבוליזם של BCAA יוביל לירידה בייצור ATP המיטוכונדריאלי, יצרנו תאי HK-2 עם נוק-דאון של BCKDHB (נספח SI, איור S7). BCKDHA ו-BCKDHB מקודדות לשתי יחידות המשנה של קומפלקס חלבון גדול מסועף ketoacid dehydrogenase (BCKDH), אשר מזרז את השלב הבלתי הפיך ומגביל הקצב הראשון בקטבוליזם BCAA ומעוכב על ידי זרחון על ידי BCKDH kinase (BCKDK) (28). כדי להעביר את תאי BCKDHB-SCR הבקרה ולהפיל את תאי BCKDHB-sh לכיוון ייצור ATP מיטוכונדריאלי, הם הודגרו מראש ב-2-DG כדי לחסום גליקוליזה למשך שעה אחת לפני ביצוע מבחן ה-ATP Production Rate. נוק-דאון של BCKDHB הביא לירידה משמעותית בייצור ATP, מה שמראה ש-BCAA משמשים ליצירת ATP בבני אדםכִּליָהתאים (איור 5F). לעומת זאת, ל

איור 4. עכברי hKLF6OE החמירופגיעה בכליותעם דיכוי של גנים BCAA. (A ו-B) ריכוזי קריאטינין בסרום (A) וחנקן אוריאה (B) בבקרה ועכברי hKLF6OE שטופלו ב-DMSO או AAI בשלב הפעיל. n=4 עד 9 לקבוצה; $P < 0.05,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.0{="" {26}}1="" לעומת="" אותו="" גנוטיפ="" עם="" dmso;="" **p="">< 0.01="" לעומת="" שליטה="" עם="" aai;="" anova="" חד="" כיווני="" עם="" תיקון="" sidak="" לבדיקות="" מרובות.="" (c="" ו-d)="" תמונות="" היסטולוגיות="" נציגות="" מוכתמות="" באמצעות="" כתמי="" המטוקסילין="" ואאוזין="" (c)="" וחומצה="" תקופתית="" (d).="" חיצים="" צהובים:="" שפיכת="" צינוריות;="" חיצים="" שחורים:="" שאריות="" ממברנות="" בסיס;="" ראשי="" חץ="" צהובים:="" יציקות="" חלבון;="" וראשי="" חץ="" שחורים:="" מסתננים="" דלקתיים.="" (פסי="" קנה="" מידה,="" 100="" מיקרומטר.)="" (e)="" צביעה="" אימונופלואורסצנטית="" עבור="" ציטוקרטין-20="" (krt-20)="" כסמן="" של="" pt="" פצוע="" (אדום)="" עם="" צביעה="" עם="" לוטוס="" לקטין="" (ll)="" )="" כסמן="" של="" pt="" לא="" פצוע="" (ירוק).="" (ברים="" בקנה="" מידה,="" 250="" מיקרומטר.)="" (f)="" צביעה="" אימונופלואורסצנטית="" עבור="" -sma="" (ירוק)="" עם="" צביעה="" עבור="" edu="" (מגנטה).="" (סרגלי="" קנה="" מידה,="" 100="" מיקרומטר.)="" (g)="" ביטוי="" mrna="" של="" גנים="" bcaa="" בבקרה="" ועכברי="" hklf6oe="" שטופלו="" ב-dmso="" או="" aai="" בשלב="" הפעיל.="" n="5" עד="" 9="" לקבוצה;="" $p="">< 0.01,="" $$p="">< 0.001="" לעומת="" שליטה="" עם="" dmso;="" כל="" hklf6oe="" עם="" aai="" הם="" p="">< 0.001="" לעומת="" hklf6oe="" עם="" dmso;="" *p=""><0.05, **p=""><0.01, ***p=""><0.001 לעומת="" שליטה="" עם="" אותו="" טיפול;="" בדיקות="" t="" מרובות="" עם="" תיקון="" שיעורי="" גילוי="" שגוי="" באמצעות="" מודל="" העלאה="" דו-שלבי="" של="" benjamini,="" kreiger="" ו-yekutieli.="" הנתונים="" הם="" ממוצע="" ±="" sem="" כאשר="" n="" מציין="" את="" מספר="" השכפולים="">

לשפר את קטבוליזם BCAA, טיפלנו בתאי HK-2 ב-BT2, המעכב BCKDK, ובכך חסם את הזרחון המעכב של BCKDH. בתנאים מוגבלי אנרגיה, טיפול ב-BT2 הגביר את ה-OCR בתאים שטופלו ב-DMSO, שנמשך לאחר עיכוב הגליקוליזה ולא עקב שינוי ב-FAO או OCR non-mitochondrial (איור 5 G ו-H). ממצאים אלו מצביעים על כך שדיכוי 6-מתווך של KLF של קטבוליזם BCAA מפחית ייצור ATP המיטוכונדריאלי, מה שכנראה יחמיר את פציעת ה-PT במצב של לחץ בתאים, שבהם קיימים תנאים מוגבלים באנרגיה באופן דומה עקב פגיעה ב-FAO.

ביטוי גנים של BCAA מופחת בעכבר ובאדם מגווניםפציעות בכליות. כדי לקבוע אם אובדן של ביטוי גן BCAA מתרחש לפני אובדן PT ורמות קריאטינין מוגברות בפציעה הנגרמת על ידי AAI, ביצענו qRT-PCR בעכברי C57BL/6 שטופלו במנה אחת של AAI והורדנו לאחר 24 שעות. Bckdhb, Hibch ו-Mccc2 כבר היו מווסתים מטה באופן משמעותי בנקודת זמן זו, כאשר גנים אחרים (למשל, Acadm) מראים מגמה חזקה לקראת ויסות מטה (איור 6A). לחקור את ביטוי הגנים של BCAA בעכברים אחריםפגיעה בכליותמודלים, ביצענו qRT-PCR בעכברים שטופלו עם cisplatin (איור 6B) או בכפוף ל-UUO (איור 6C). בשני הדגמים, ביטוי Klf6 היה בעל ויסות גבוה יותר לעומת כלי רכב/בקרות. בעכברים שטופלו ב-cisplatin, כמה מהגנים של BCAA שנבדקו היו מווסתים באופן משמעותי, עם מגמות לכיוון הורדה של הגנים האחרים (איור 6B). בעכברים הכפופים ל-UUO, כל הגנים שנבדקו היו מווסתים מטה באופן משמעותי הן 3 ו-7 ימים לאחר UUO (איור 6C), מה שמרמז כי ויסות מטה של ​​גנים BCAA מתרחש מוקדם לאחר הפציעה.

איור 5. ביטוי יתר של KLF6 מדכא את ביטוי הגנים של BCAA, ייצור ATP וניצול BCAA במבחנה. (א) ביטוי של גנים מטבוליים KLF6 ו-BCAA בתאי HK-2 המבטאים ביציבות פלסמידים של ביטוי בקרה (Con) או KLF6 ביטוי יתר (OE), שטופלו ב-DMSO או AAI. n=4 לקבוצה; *P < 0.05,="" **p="">< {{10}}.01,="" ***p="">< 0.{="" {21}}01="" לעומת="" קון="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}}5,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.001="" לעומת="" אותו="" קו="" סלולרי="" עם="" dmso;="" anova="" דו="" כיווני="" עם="" תיקון="" של="" tukey="" לבדיקות="" מרובות.="" (ב)="" כימות="" של="" סך="" bcaa="" בתאי="" con="" ו-oe="" שטופלו="" ב-dmso="" או="" aai.="" n="6" לקבוצה;="" $p="">< 0.05="" לעומת="" con="" dmso;="" anova="" חד="" כיווני="" עם="" תיקון="" של="" sidak="" לבדיקות="" מרובות.="" (ג)="" שינוי="" אחוז="" בקצב="" ייצור="" atp="" המיטוכונדריאלי="" בתאי="" con="" ו-oe="" שטופלו="" ב-aai="" לעומת="" dmso.="" n="27" עד="" 30="" לקבוצה;="" *p="">< 0.05,="" ***p="">< 0.001="" לעומת="" dmso,="" $p="">< 0.05="" לעומת="" con="" aai;="" anova="" חד="" כיווני="" עם="" תיקון="" של="" sidak="" לבדיקות="" מרובות.="" (ד)="" מדידות="" ocr="" עבור="" תאי="" con="" ו-oe="" במדיה="" מוגבלת.="" היכן="" שצוין,="" נוספו="" 2-dg,="" etomoxir="" (eto)="" ושילוב="" של="" rotenone/antimycin="" a="" (rot).="" n="16" לקבוצה.="" (ה)="" כימות="" של="" ocr="" מיטוכונדריאלי="" בסיסי="" (התחלת="" ocr="" מינוס="" ocr="" פוסט-rot),="" ocr="" לא-מיטוכונדריאלי="" (post-rot="" ocr),="" ושינויים="" ב-ocr="" לאחר="" הוספת="" 2-dg="" (פיצוי="" מיטוכונדריאלי="" לאחר="" 2-dg)="" ו-etomoxir="" (fao).="" n="16" לקבוצה;="" **p="">< 0.01="" לעומת="" קון;="" anova="" דו="" כיווני="" עם="" תיקון="" של="" tukey="" לבדיקות="" מרובות.="" (ו)="" קצב="" ייצור="" atp="" מיטוכונדריאלי="" בתאי="" bckdhb-scr="" ו-bckdhb-sh.="" n="14" לקבוצה;="" **p="">< 0.05,="" בדיקת="" t="" לא="" מזווגת.="" (ז)="" מדידות="" ocr="" בתאי="" hk-2="" במדיה="" מוגבלת="" בהיעדר="" או="" נוכחות="" של="" bt2.="" היכן="" שצוין,="" נוספו="" 2-dg,="" eto="" ו-rot.="" (ח)="" כימות="" של="" ocr="" מיטוכונדריאלי="" בסיסי,="" ocr="" לא="" מיטוכונדריאלי="" ושינויים="" ב-ocr="" לאחר="" הוספת="" 2-dg="" ו-etomoxir="" בתאי="" hk-2="" בהיעדר="" או="" נוכחות="" של="" bt2.="" n="8" לקבוצה;="" *p="">< 0.05="" לעומת="" ללא="" bt2;="" anova="" דו="" כיווני="" עם="" תיקון="" של="" tukey="" לבדיקות="" מרובות.="" הנתונים="" הם="" ממוצע="" ±="" sem="" כאשר="" n="" מציין="" את="" מספר="" השכפולים="">

באופן דומה, כריית נתונים של מערך ביטויים שדווח בעבר מהתא הבין-בין-תפוחי של 36 חולי CKD אנושיים (יתר לחץ דם וסוכרתייםמחלות כליות) בהשוואה למטופלי ביקורת (6) הראו כמה גנים של BCAA מווסתים באופן דומה לעכברים שטופלו ב-AAI (איור 6D). כדי להבהיר יותר את הקשר ביןתפקוד כליות, ביטוי KLF6 וביטוי של גנים BCAA ב-CKD אנושי, השתמשנו במערך ביטוי שפורסם מהתא ה-tubu interstitial של סדרה של 164 חולים עםמחלות כליות (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 מ"ל/דקה/1.73 מ"ר (P < 0.001="" עבור="" כל="" הגנים),="" מה="" שמוכיח="" ששינויים="" אלה="" בביטוי="" הגנים="" עשויים="" להתרחש="" מוקדם="" ביחס="" לשינויים="" תפקודיים.="" יחד,="" נתונים="" אלה="" מצביעים="" על="" כך="" ש6-דיכוי="" klf="" של="" גנים="" קריטיים="" לקטבוליזם="" של="" bcaa="" עשוי="" למלא="" תפקיד="" קריטי="">פגיעה בכליותבדגמים עכברים שלכִּליָהפיברוזיס כמו גם ב-CKD אנושי.

דִיוּן

במחקר זה, אנו מדגימים את התפקיד in vivo של KLF6 ספציפי ל-PT במסגרת שלפגיעה בכליות.KLF6 מווסת באופן חזק ועקבי בשלב מוקדם של ה-PT בתגובהפגיעה בכליות, אך זוהי תגובה לא מסתגלת, כפי שהוכחה על ידי ההשפעה המגנה של אובדן PT Klf6 לאחר טיפול ברעלן הרלוונטי קלינית והספציפי מאוד ל-PT AAI. בנוסף, אנו מדגימים את המשמעות הפוטנציאלית של מטבוליזם BCAA לא מווסת ב-PT פצוע כתורם אפשרי ל-AKI ולפיברוזיס בעקבותיו. אובדן ה-Klf6 הוביל לשימור ביטוי האנזים הקטבולי של BCAA, כאשר לכמה מהגנים המקודדים לאנזימים אלו אתרי קישור של KLF6 בסמיכות ל-TSS שלהם, מה שמרמז ש-KLF6 עשוי להיות מדכא שעתוק של BCAAcatabolism. למרות שחבר אחר ממשפחת KLF, KLF15, הוכח בעבר כמווסת שריר השלד מסועף aminotransferase 2 (Bcat2) ביטוי (30), הרגולציה של אנזימי BCAA אחרים לא דווחה. אנו מניחים כי KLF6 פועל לדיכוי הביטוי של מספר גנים המקודדים לאנזימי BCAA.

ב-PT ללא פציעה, ביטוי Klf6 נמוך ומתבטא באופן משתנה בתאי PT מסוימים ולא באחרים. הרגולציה המהירה והחזקה המתרחשת לאחר מספר סוגי פציעה מעידה על תפקיד חשוב מבחינה פיזיולוגית עבור KLF6. בפיברובלסטים, לאחרונה הוכח כי KLF6 מווסת מעלה בתגובה ללחץ אונקוגני וגם ללחץ חמצוני, מה שמוביל להזדקנות תאית, בעוד שהשתקה של KLF6 הובילה להצטברות סמנים של נזק ל-DNA וחוסר יציבות גנומית (31). לפיכך, התפקיד הפיזיולוגי של KLF6 בפציעה עשוי להיות השראת הזדקנות תאית, המאפשר תיקון של נזקי DNA שעלולים לנבוע מעלבונות רעילים או חמצוניים/איסכמיים. עם זאת, בתאי PT פצועים, נראה שתוצאה שנייה של ויסות-על של Klf6 היא דיכוי של קטבוליזם BCAA, אשר בתאי PT במיוחד עלול להזיק. מעניין שלמרות ההפלה החלקית של Klf6 הספציפי ל-PT בקו הבסיס בעכברי Klf6PTKD, זה עדיין הצליח להעניק אפקט הגנה ברור לאחר פציעה. יש לכך השלכות טיפוליות חשובות, שכן הוא מצביע על כך שרק מניפולציה קטנה ברמות או בפעילות של KLF6 (למשל, באמצעות שימוש במעכב מולקולה קטנה) יכולה להראות יעילות טיפולית. אכן, גורמי שעתוק סבירים יותר ממשפחות גנים אחרות

בגנום האנושי יש רגישות למינון (32). באופן דומה, מגבלה אחת של המודל העכברי הניתן לביטוי-יתר של KLF6 שלנו היא שזה לא תאי PT מוגבלים, וככזה, מחקרים עתידיים יצטרכו להתמקד בשימוש במודל ספציפי לתא כדי להבהיר את התפקיד תלוי ההקשר התא של KLF6.

הוכחנו בעבר כי אובדן של Klf6 בפודוציטים גלומרולריים היה מזיק בסביבה של FSGS בשל תפקידו בהפעלה תעתיק של סינתזה של ציטוכרום c אוקסידאז 2 (Sco2). אובדן של Klf6 ב-FSGS הוביל לפיברוזיס גרוע יותר, עם הפעלה מוגברת של המסלול האפופטוטי הפנימי (15). חקירה של מערכי נתונים זמינים של RNA-seq חד-תא מראה כי בעכבר בריאכליות,Klf6 מתבטא בשיעור הרבה יותר גדול של פודו ציטים מאשר תאי PT, וברמה הרבה יותר גבוהה (ר' 33; https:// susztaklab.com/). לפיכך, KLF6 ממלא ככל הנראה תפקיד פיזיולוגי חשוב יותר בפודוציטים נורמליים מאשר בתאי PT, בעוד שמווסתים מיטוכונדריאליים ידועים אחרים (למשל, Ppara) מתבטאים הרבה יותר בתאי PT מאשר פודוציטים. לפיכך, לאובדן Klf6 בפודוציטים יש כנראה השפעה מזיקה יותר מאשר בתאי PT. התפקידים המנוגדים של KLF6 בסוגי תאים שונים בתוךכִּליָהמקביל לממצאים קודמים של השפעות ספציפיות לתא בלב ובכבד. לפיכך, נפילה של Klf6 במיוציטים לבביים בעכברים החלשה את פיברוזיס הלב לאחר עומס יתר של אנגיוטנסין II, מה שמרמז על תפקיד של KLF6 בהפצת פיברוזיס, אך נפילה של Klf6 ב-Myofibroblasts לבבית לא השפיעה על פיברוזיס (14). לעומת זאת, בכבד, להורדת Klf6 בהפטוציטים של עכברים לא הייתה השפעה על פיברוזיס בכבד לאחר מתן כרוני של CCl4, אך ביטוי יתר של KLF6 בתאי סטלט כבד הביא לירידה בפיברוזיס, מה שמצביע על כך ש-KLF6 מגן (13).

CISTANCHE ישפר כאבי כליות/כליות

אובדן FAO במהלךפגיעה בכליותידוע כעת כאירוע חשוב בפתולוגיה שלפגיעה בכליותואכן יכול לתרום ישירות לפיברוזיס. בהיעדר FAO, שהוא מקור האנרגיה העיקרי ל-PT ללא פגע, מקורות אנרגיה פוטנציאליים אחרים עשויים לקבל חשיבות רבה יותר. BCAAs תורמים למחזור TCA באמצעות ייצור של אצטיל-CoA ו-succinyl-CoA. מחקר שנערך לאחרונה הראה שלא רק BCAA המסומן ב-13C תורם לחומרי ביניים במחזור TCA בכִּליָהאבל הכִּליָההיה השילוב הרביעי בגובהו של 13C בתוצרי ביניים במחזור TCA של האיברים שנבדקו, אחרי לבלב, שריר ורקמת שומן לבנה (34), מה שמצביע על כך ש-BCAA הם פוטנציאל תורם חשוב למחזור ה-TCA. עם זאת, המשמעות של קטבוליזם BCAA בתרומה למחזור ה-TCA, בין אם אצל רגיל או בפצועכליות, לא נחקר בעבר. לדוגמה, לא ידוע אם אובדן של קטבוליזם PT BCAA לבדו יגרום לשינויים בהומאוסטזיס ו/או תיקון של PT, ומחקרים אלה ידרשו יצירת מודלים עכברים חדשים כמו עכברי Bckdhb הספציפיים ל-PT. בהגדרה שלכִּליָהפציעה, כאשר FAO מדוכא בצורה חמורה, דיכוי נוסף של

גנים המקודדים לאנזימים מטבוליים של BCAA עשויים לשלול מתאי צינור מקור אנרגיה פוטנציאלי חשוב. חשוב לציין שביטוי הגנים של BCAA כבר היה מווסת מטה 24 שעות לאחר הזרקה בודדת, לפני כל שינוי בקריאטינין בסרום או אובדן PT, מה שמצביע על כך שהורדת ויסות אלו היו תוצאה ספציפית של פציעת PT ואינם קשורים לירידה בביקוש לאנרגיה PT כתוצאה מכך. מ-GFR מופחת וכתוצאה מכך דרישה מופחתת לספיגת מומסים. מסלולים אלו נשמרו בעכברי Klf6PTKD שהיו מוגנים מפציעה ודוכאו עוד יותר בעכברי hKLF6OE שסבלו מפציעה גרועה יותר. בנוסף, תאי KLF6-OE הפחיתו את ייצור ATP המיטוכונדריאלי לאחר טיפול AAI בהשוואה לתאי KLF6-Con, ובעוד BCAA תוך תאיים הופחתו בתאי KLF6-Con, בהתאם לקטבוליזם שלהם , ירידה זו לא זוהתה בתאי KLF6-OE. יתרה מזאת, הורדת BCKDHB בתאי HK-2 הביאה לירידה בייצור ATP המיטוכונדריאלי. לפיכך, ביטוי משומר של גנים BCAA בעכברי Klf6PTKD עשוי לספק הגנה מפני פציעה על ידי אספקת תוצרי ביניים חיוניים למחזור TCA במצב של חמצון FA מופחת מאוד. מחקרים עתידיים המשתמשים בעכברים עם מניפולציות גנטיות של קטבוליזם BCAA ו/או טיפול ב-BT2 יאפשרו לנו לחקור את הדינמיקה בין קטבוליזם BCAA ל-FAO בפגיעה בכליות.

הראינו כי אובדן ביטוי של גנים BCAA מוביל לירידה בנשימה המיטוכונדריאלית וייצור ATP, וזה מייצג מנגנון אחד שבאמצעותו אובדן קטבוליזם BCAA עשוי לתרום לפגיעה בכליות. מנגנון חלופי יכול להיות באמצעות הצטברות של BCAA, אשר עשוי להיות בעל השפעה רעילה. אכן, זה הוכח בהגדרה של IRI לבבי. הצטברות של BCAA עקב אובדן קטבוליזם הוכחה כמעכבת את ניצול הפירובט המיטוכונדריאלי על ידי השבתת פירובאט דהידרוגנאז לאחר תרגום, ובכך מסירה מקור אנרגיה תאי נוסף ומחמירה את הפציעה (35). זה התהפך על ידי הגברת קטבוליזם BCAA על ידי טיפול בעכברים עם BT2 או על ידי הגברת חילוף החומרים של גלוקוז על ידי ביטוי יתר של GLUT1. מחקר שנערך לאחרונה הראה גם החמרה של IRI לבבי על ידי אובדן קטבוליזם BCAA בעכברים סוכרתיים. זה לווה בלחץ חמצוני מוגבר ושוב התהפך על ידי הפעלה מחדש של קטבוליזם BCAA (36). ידוע כי BCAA ובפרט לאוצין מפעילים את היעד היונקים של איתות rapamycin (mTOR) קומפלקס 1 (mTORC1). בדגם עכבר של פוליציסטימחלת כליות,שבהם לתאים המקיפים ציסטות יש הפעלה של mTOR

איתות, תוספת עם BCAA הפעילה עוד יותר את איתות mTORC1, והובילה להגברת התפשטות (37). פרופיל תעתיק של קרצינומות כבד תאי חשף ירידה בביטוי הגנים של BCAA, מה שהוביל להצטברות של BCAA ברקמת הגידול. זה היה קשור לאיתות מוגברת של mTORC1 והתפשטות, שהופחתה על ידי הגבלת BCAAs או טיפול ב-BT2, והוחמרה בעכברים שניזונו בתזונה עתירת BCAA (38). נדרש איתות mTORC1 לתפקוד PT, ומחקרים המשתמשים במעכבי mTOR בפגיעה בכליותהראו תוצאות סותרות, ככל הנראה עקב משטרי מינון שונים, תזמון טיפולים ומודלים של פציעה (39-42). איתות mTORC1 מוביל למספר רב של תגובות תאיות, כולל צמיחת תאים והתפשטות, סינתזת שומנים, סינתזה מיטוכונדריאלית ודיכוי אוטופגיה (43). סביר להניח שתת-הפעלה או יתר של איתות mTORC1 עלולה להיות מזיקה וכי נדרש איזון לתפקוד תאי תקין. לדוגמה, הפעלת יתר של איתות mTORC1 בפציעת PT עלולה להוביל לדיכוי מזיק של אוטופגיה, שנדרשת להסרת מיטוכונדריה פגומה, והוכחה כחשובה להחלמה לאחר PTפציעה (39, 42, 44, 45). לפיכך, להצטברות של לאוצין עשויה להיות תפקיד מזיק בפגיעה בכליותעל ידי הפעלת יתר של איתות mTORC1 ודיכוי אוטופגיה. לסיכום, הראינו כי הרגולציה העליונה החזקה של Klf6 שמתרחשת בפגיעה בכליותהוא מזיק, שבו אובדן של Klf6 הספציפי ל-PT שימר את ביטוי הגן BCAA והחליש את AKI ובסופו של דבר פיברוזיס. לעומת זאת, אינדוקציה של KLF6 בעכברים דיכאה את ביטוי הגנים של BCAA והפכה אתכִּליָהרגישים לפגיעה בכליות.יתר על כן, לגנים המקודדים לאנזימי BCAA מרובים יש אתרי קישור של KLF6, מה שמרמז על כך ש-KLF6 עשוי להיות מווסת שעתוק של קטבוליזם BCAA. ויסות מטה של ​​קטבוליזם BCAA במבחנה על ידי ביטוי יתר של KLF6 וטיפול ב-AAI, או על ידי ביטול של BCKDHB, הוביללירידה בייצור ATP המיטוכונדריאלי. ביחד, תזנתונים מצביעים על כך שמכוונת טיפולית לשימור שלקטבוליזם BCAA עשוי לספק מיטוכונדריאל חלופימקור אנרגיה במסגרת שלפגיעה בכליותשבו FAOמופחת.