מחלת כליות פוליציסטית

ali.ma@wecistanche.com

חלק Ⅱ: אורגנואידים בכליות שנוצרו מתאי אבות אריתרואידים של חולים עם מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice & et al.

רקע כללי:כִּליָהאורגנואידים התקבלו באופן נרחב מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) זמינים מסחרית; עם זאת, זה היה אתגר גדול לייצר ביעילות מודלים אורגנואידים כלייתיים מחולים עם פוליציסטיות אוטוזומליות דומיננטיותכִּליָהמחלה (ADPKD) המשחזרת הן את העובר והן את המנגנונים של ציסטוגנזה.

לחץ כדי לראות תופעות לוואי ותועלת לכליות

שיטות: אבות אריתרואידים בדם (EPs) משני ADPKD (פוליציסטיים אוטוזומליים דומיננטייםכִּליָהחולי מחלה ותורם בריא אחד (HC) שימש כבקרה השוואתית כדי לנרמל את השלבים הטכניים הרבים לתכנות מחדש של EPs וליצירת האורגנואידים. התמיינו לאורגנואידים צינוריים של הכליה ולאחר מכן גורו על ידי פורסקולין כדי לגרום להיווצרות ציסטות.

תוצאות: iPSCs (תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים) שמקורם ב-EPs הציגו את כל המאפיינים של פלוריפוטנטיות והיו מסוגלים להתמיין לכל שלוש שכבות הנבט. אורגנואידים צינוריים 3D נוצרו מתאי בודדים לאחר 28 ימים ב- Matrigel. HC ו-ADPKD(פוליציסטי אוטוזומלי דומיננטיכִּליָהמחלה) אורגנואידים לא יצרו ציסטות באופן ספונטני, אך עם גירוי פורסקולין, נצפו מבנים דמויי ציסטות ב-ADPKD(autosomal dominant polycysticכִּליָהמחלה) אורגנואידים אך לא באורגנואידים שמקורם ב-HC.

מסקנה: ממצאי מחקר זה הראו זאתכִּליָהאורגנואידים נוצרו בהצלחה מתאי EP בדם של ADPKD (פוליציסטי אוטוזומלי דומיננטיכִּליָהמחלה) חולים ותורם בקרה בריא. גישה זו צריכה לתרום ככלי רב עוצמה עבור העוברכִּליָהמודל פיתוח, המסוגל לשחזר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים המוקדמים מאוד המעורבים בציטוגנזה.

לחץ כאן כדי להיפרדⅠ

דִיוּן

במחקר הנוכחי, תיארנו בפירוט הליך ליצירת אורגנואידים בכליות מ-iPSCs אנושיים (תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים) המתקבלים מתאי אבות אריתרואידים בדם של חולים עם ADPKD (מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית). סוגי תאים סומטיים רבים תוכנתו מחדש בהצלחה ל-iPSCs (תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים), כולל תאי דם [Z]. כאן, בחרנו להשתמש באבות אריתרואידים בדם כסוג התא ההתחלתי ממספר סיבות, כגון שלמות הגנומית שלהם, זיכרון אפיגנטי ותכנות מחדש יעיל [11,17,18]. היעילות שבה הומרו אבות אריתרואידים ל-iPSCs הייתה טובה בשני סדרי גודל (7 אחוזים -28 אחוזים) מהיעילות של סוגי תאי דם מובחנים (0).0 2 אחוז -0.60 אחוז )או פיברובלסטים (0.74 אחוז )[Z]. למרות השפע הנמוך של תאים אלו בדם ההיקפי, ניתן בקלות לבודד ולהרחיב אותם במבחנה כדי לייצר מספר מספיק לתכנות מחדש. אחד האתגרים החשובים ביותר בהקמת iPSCs מתאימים הוא הגנוטיפ והשונות הפנוטיפית שלהם [6], אך ישנן כמה אסטרטגיות טכניות המוצעות כדי לעקוף או לצמצם שונות כזו. בניסויים הנוכחיים, השתמשנו במערכת אפיזומלית לא משתלבת לתכנות מחדש שאינה דורשת אינטגרציה של גנום כדי שהגנים המתוכננים יבואו לידי ביטוי [10], מה שמאפשר פחות אימונוגניות ויצירת תאים יציבים יותר מבחינה גנטית [19,20]. יתרה מכך, כל הדגימות נגזרו מאותו מקור, מה שעוזר למזער את השונות האפיגנטית [12] בהנחה שההתמיינות של התא ההתחלתי עשויה להשפיע על יעילות התוצאות הסופיות. ניתוח של סמני הפלריפוטנציה והיכולת של iPSCs (תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים) להתמיין לכל שלוש שכבות הנבט הושוו זה לצד זה, והם הושוו גם לקו התאים העובריים H9, ששימש כביקורת חיובית . כל ההשוואות הללו לא הראו הבדלים משמעותיים בין חולי ADPKD (מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית), HCs ותאי H9.

פותחו מספר פרוטוקולים להשראת ההתמיינות של iPSCs (תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים) לאורגנואידים בכליות [13,21]. בהתבסס על פרוטוקולים שתוארו על ידי Cruz et al. [6], השגנו מבנים עם המאפיינים של צינוריות פרוקסימליות, כולל הביטוי של NHE3 ו-AOP1. בנוסף, האורגנואידים ביטאו NPHS2, מה שמצביע על נוכחות של תאים דמויי פודוציטים.

לעומת זאת, AQP2 לא התבטא באורגנואידים צינוריים אלה. ממצא זה עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים המצביעים על מספר מגבלות בפיתוח מבנים שמקורם בניצן השופכן (UB) במבחנה, כאשר התפתחות של UB דורשת פרוטוקולים ספציפיים, שכן חלון התזמון להוספת המשרן הספציפי מוגבל מאוד [ 6,22,23].

בתהליך של יצירת אורגנואידים של הכליה מ-iPSCs (תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים), כל העוברות הכלייתית נקלטת במבחנה, הכוללת בתחילה היווצרות של כדוריות קוויטות מתאי יחיד [14]. ואכן, מצאנו ש-iPSCss (תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים) לא מובחנים מחולי ADPKD (מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית) וגם מבקרה בריאה יצרו מבנים כדוריים דמויי אפיבלאסט שהיו דומים מבחינה מורפולוגית. למרות שרצף DNA של הגנים PKD1 ו-PKD2 לא בוצע במחקר הנוכחי, הממצאים הנוכחיים מצביעים על כך שלסוג המוטציה שנשאו החולים לא הייתה השפעה על מורפוגנזה אפיפבלסטים טיפוסיים. עדיין נדרשים מחקרים נוספים כדי להעריך נכון יותר את הביטוי של מולקולות מרכזיות המעורבות בשלב זה של התפתחות עוברית.

על פי הפרוטוקול שפותח על ידי Freedman et al. [14], ראינו שספרואידים אכן התמיינו לאורגנואידים צינוריים 26 ימים לאחר השראת התמיינות, והתזמון היה דומה הן עבור חולי ADPKD (מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית) והן עבור HC(איור ③). עם זאת, הבחנו בשונות מסוימת לגבי לוח הזמנים של הביטוי ורמות סמני ההבחנה. מצד שני, המורפולוגיה של המבנים הצינוריים הייתה דומה וניתנת להשוואה בין דגימות מחולי ADPKD ו-HC. לעומת זאת, באמצעות iPSCs (תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים) שמקורם בביופסיות כליות של חולי ADPKD (מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית), קבוצת Cruz וחב' מצאה שונות גבוהה יותר ביכולת של תאים אלו ליצור אורגנואידים[6]. בנוסף למגוון העצום של מוטציות הטבועות במחלה זו, ההבדלים הללו ביעילות השגת האורגנואידים עשויים להיות מוסברים גם על ידי סוגי התאים ההטרוגניים הקיימים בדגימות ביופסיה, בניגוד לאבות האריתרואידים, המהווים אוכלוסיית תאים הומוגנית יותר. יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שלמרות השונות וההבדלים ביעילות של שיבוטים שונים של iPSC ליצירת אורגנואידים בכליות, השגת האחרון מ-ADPKD (מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית) עשויה להוות מודל ייחודי לחקר הצורות המרובות של ביטויים פנוטיפיים. של מחלה זו. יתר על כן, חשוב לציין שאם יש שונות ניכרת של מוטציות באוכלוסיית ה-ADPKD המושפעת, ה-iPSCs הספציפיים למטופל (תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים), יהיו תואמים לחלוטין למערכת החיסון, הם עשויים לשמש לטיפולים רגנרטיביים אינדיבידואליים בעתיד , בנוסף לאפשר פיתוח של מודל חוץ-גופני כדי לוודא אם הביטויים הפנוטיפיים המוקדמים מאוד גם מגוונים כמו ההצגה הקלינית.

חולי אורגנואידים לא מגורים שמקורם ב-HCor ADPKD (מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית) לא יצרו ציסטות באופן ספונטני. המורפולוגיה האופיינית של ציסטות והביטוי של סמני ציסטוגנזה לא היו ניתנים לזיהוי באף דגימה, אפילו האריכו את ההתמיינות האורגנואידית בתרבית עד להשלמת 35 ימים. הוכח כי שגשוג תאים לבדו אינו מייצר ציסטות[24]. יתר על כן, נדרש אירוע עצמאי שלישי (המכונה פגיעה שלישית) כדי להאיץ את היווצרות הציסטה וגדילתה in vivo [23]. לעומת זאת, היווצרות ציסטה המושרה על ידי פורסקולין אכן התרחשה באורגנואידים מחולי ADPKD אך לא באלו מ-HC. יש לציין, למרות שקיימות, ציסטות נצפו באחוז נמוך בדגימות ADPKD אפילו בנוכחות פורסקולין, כפי שנצפה גם על ידי Freedman et al. [14] באורגנואידים שנוצרו ממודל CRISPR/Cas9 של מחלת ADPKD. ניתן להעלות כמה השערות כדי להסביר את התדירות הנמוכה של ציסטות שנמצאו במודל הנוכחי. 1)אורגנואידים שתורבתו בסביבה תלת-ממדית הראו יעילות ציסטוגנזה גבוהה בהרבה בהשוואה לאורגנואידים נצמדים [6], מה שמעיד על כך שהמיקרו-סביבה מעורבת ישירות בציסטוגנזה.2) הפרוטוקול הניסוי שהופעל במחקר הנוכחי יצר אורגנואידים פרוקסימליים של צינוריות, אך לא חלקים דיסטליים של הנפרון [23]. למרות שכל מקטעי הנפרון יכולים להיווצר ציסטות כולל צינוריות פרוקסימליות [25], ככל הנראה אלה שמקורם בצינורות איסוף נראים גדולים יותר ובמספרים גבוהים יותר מאלו ממקטעים אחרים [26], 3) לבסוף, לאחרונה הוכח כי מקור הציסטות עשוי להיות קשור לנוכחות של מוטציות PKD1 מרובות הקובעות את חומרת המחלה וכי היווצרות ציסטה בצינורות האיסוף הייתה קשורה לחומרת המחלה [27, 28].

לסיכום, הממצאים הנוכחיים הראו כי ניתן ליצור אורגנואידים בעלי מבנים תלת מימדיים הדומים לארכיטקטורת האבות הכליות באמצעות iPSCs (תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים) שתוכנתו מחדש מאבות אריתרואידים אשר בודדו בקלות מ-ADPKD (מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית) חולים וכי האורגנואידים הללו מסוגלים ליצור ציסטות תחת גירוי פורסקולין. מתודולוגיה מבטיחה זו חושפת שיטה להגברת ההבנה של השלבים הגנטיים, הפנוטיפיים והפיזיולוגיים המוקדמים מאוד בהיווצרות ציסטות במסגרת ADPKD (מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית).

הפניות

1. Chebib FT, Torres VE: Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease: Core Curriculum 2016.AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07.0357PM0:76637PM0

2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW, et al: מוטציה סומטית בציסטות בודדות בכבד תומכת במודל של שני מכות של ציסטוגנזה במחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית.Mol Cell,2:{{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P, et al.: Somatic PKD2mutations in individual kidney and liver cysts תומכות במודל "שני מכות" של ציסטוגנזה במחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית מסוג 2.JAm Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: מתג התפתחותי קריטי מגדיר את הקינטיקה של יצירת ציסטות בכליות לאחר אובדן Pkd1.Nat Med, 13: 1490-1495,2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD, et al: פגיעה בכליות היא פגיעה שלישית המעודדת התפתחות מהירה של מחלת כליות פוליציסטית למבוגרים. Hum Mol Genet,18:2523-2531,2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. קרוז NM. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK, et al: ציסטוגנזה אורגנואידית מגלה תפקיד קריטי של מיקרו-סביבה במחלת כליות פוליציסטית אנושית. Nat Mater,16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: אינדוקציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מתרביות פיברובלסט. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ, et al: Reduced ciliary polycystin-2 in induced pluripotent cell cells from the polycystic kidney disease with mutations PKD1. J Am Soc Nephrol,24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Derivation of Transgene-Free Induced Pluripotent Stem Cells from a Single of Blood.Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10,2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il, et al.: Human induced pluripotent stam cells free of vector and transgene sequences.Science, 324:797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID:19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: שלב הדיפרנציאציה קובע את הפוטנציאל של תאים hematopoietic לתכנות מחדש לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM, et al.: גזירת תאי iPS אנושית יעילה על ידי פלסמיד לא משתלב מתאי דם עם חתימות אפיגנטיות וביטוי גנים ייחודיות. Cel/Res,21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: אורגנואידים בכליות שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים: טכנולוגיה דמוית in vivo in vitro. Eur J Pharmacol,790:12-20, 2016 https://ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, et al. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. מגיסטוני ר' דיקס ה, ואח'; קריטריונים מאוחדים לאבחון אולטרסאונד של ADPKD (מחלת כליות פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית). JAm Soc Nephrol, 20:205-212,2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T, et al: מעכב ROCK מאפשר הישרדות של תאי גזע עובריים אנושיים מנותקים. Nat Biotechnol, 25:681-686,2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Nuclear reprogramming and pluripotency.Nature,441:1061-1067,2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: מערכת בעלת יעילות גבוהה ליצירה ולמחקר של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם. תא / תא גזע. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420