הערכה חוץ גופית של הזנים הפרוביוטיים הפעילים ביותר המסוגלים לשפר את תפקודי מחסום המעי ולמנוע מחלות דלקתיות של מערכת העיכולⅡ

2. חומרים ושיטות

2.1. תרבויות תאים

תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס קווקזי אנושי Caco{0}} (ATCC® HTB-37™) ותאי HT29-MTX (Sigma Aldrich) המפרישים ריר אפיתל במעי הגס האנושי (Sigma Aldrich) הועלו לראשונה בנפרד, שניהם באמצעות מדיום DMEM (Gibco) בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (Gibco), 100 IU/mL פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין (Gibco) ו-2 mM גלוטמין (Gibco), ב-37 ◦C באווירה של 5% CO2. לאחר מכן, התרבויות המשותפות הוקמו בצלחות 12-wellTranswell® (עם הוספת פוליקרבונט בגודל 12 מ"מ ונקבוביות של 0.4 מיקרומטר) על ידי ציפוי התאים בתא הבזולטרלי ביחס Caco-2:HT של 75:25 29-MTX, ובוצע במשך 21 ימים, תוך החלפת המדיום כל יומיים.

לחץ כדי להקל על עצירות במהירות

2.2. זני חיידקים

זני לקטובצילוס, כולל Limosilactobacillus fermentum מבודד מ-buffalomilk [32], Levilactobacillus brevis SP-48, Lacticaseibacillus rhamnosus IMC501, Limosilactobacillus reuteri LR92 ו-Lacticaseibacillus paracasei סופקו על ידי פרויקט Incubacillus paracasei, IMC502D, IMC502D מעובד בתסיסה ביוריאקטור מעבדים ומיובשים בהקפאה לקבלת האבקות המשמשות כחומר המוצא. לפני הניסוי, האבקות הושעו מחדש וגודלו במרק Man, Rogosa ו-Sharpe (MRS-Oxoid) ב-37 ◦C בתנאים מיקרו-אירופיליים למשך 24 שעות.

2.3. טיפול בתאים

תאים בתרבית משותפת טופלו בזנים שונים של Lactobacillus spp. (108 CFUs/mL) בריבוי זיהום (MOI) של 100, לבד או בשילוב עם 20 מיקרוגרם/מ"ל של ליפופוליסכריד (LPS) של S. Typhimurium, למשך 24 שעות ב-37 ◦C ב-5% CO2 ב-DMEM ללא אנטיביוטיקה.

2.4. PCR בזמן אמת

כדי להעריך את הביטוי של ציטוקינים פרו ואנטי דלקתיים, HBD-2 ו-TJs, התאים בסיום הטיפולים נשטפו שלוש פעמים עם PBS סטרילי, וה-RNA הכולל חולץ באמצעות ערכת בידוד RNA גבוהה טהורה ( Roche Diagnostics). סה"כ 2{{20}}0 ng של RNA תאי הועתקו לאחור (Expand Reverse Transcriptase, Roche) ל-DNA משלים (cDNA) באמצעות פריימרים אקראיים של הקסאמרים (randomhexamers, Roche) ב- 42 ◦C למשך 45 דקות, לפי הוראות היצרן. PCR בזמן אמת עבור IL-6, IL-8, TNF-, IL-1, TGF-, HBD-2, אוקלודין, זונולין-1 וקלאודין{{ 14}}בוצע עם ערכת LC Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Diagnostics) תוך שימוש ב-2 μL של cDNA, המקביל ל-10 ng של RNA כולל בנפח סופי של 20 μL, 3 mMMgCl2 ו-0.5 μM פריימרים לחוש ואנטיסנס ( שולחן 1). לאחר ההגברה, ניתוח עקומת ההיתוך בוצע על ידי חימום ל-95 ◦C למשך 15 שניות בקצב מעבר טמפרטורה של 20 ◦C/s, קירור ל-60 ◦C למשך 15 שניות עם קצב מעבר טמפרטורה של 20 ◦C/s, ולאחר מכן חימום המדגם ב-0.1 ◦C/s ל-95 ◦C. התוצאות נותחו לאחר מכן באמצעות תוכנת LightCycler (Roche Diagnostics). העקומה הסטנדרטית של כל זוג פריימר נקבעה עם דילולים סדרתיים של cDNA. כל ה-PCR הופעלו בשלושה עותקים. הספציפיותממוצרי ההגברה אומתו באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז של 2% ווויזואליזציה על ידי צביעת אתידיום ברומיד [6].

2.5. בדיקת ELISA

הנוכחות של IL-6, IL-8, IL-1, TNF-, TGF-, HBD-2, Zonulin-1, Occludin ו-Claudin{{7 }} בליזטים התאיים של Caco-2/HT29-תרבויות משותף של MTX שנגועות בזנים שונים של לקטובצילים עם או בלי LPS נותחו באמצעות מבחן אימונוסורבנט מקושר אנזים (ELISA; Invitrogen, IL{{12 }}, IL-8, IL-1 alpha, TNF alpha ו-TGF בטא-1 HumanELISA Kit; Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Defensin 2, בטא (Human) - ערכת ELISA; Elabscience Biotechnology Inc. Human Zonulin, Human OCLN(Occludin) ו-Human CLDN1(Claudin 1) ELISA Kit).

2.6. בדיקת הידבקות ופולשנות

יכולתם של L. brevis, L. reuteri ו- L. rhamnosus להפחית את יכולת ההדבקה והפולשנות של S. Typhimurium ו-EIEC בתרבויות משותף במעיים נחקרה בשלושה סוגים ניסויים שונים: (i) ניסוי תחרותי, שבו הודגרו תאי אפיתל מעיים בו-זמנית עם lactobacilli (108 CFUs/mL) ו-S. Typhimuriumor EIEC (108 CFUs/mL) למשך 2 שעות. (ii) בדיקת עיכוב, שבה תאים הודגרו מראש עם לקטובצילים (108 CFUs/mL) למשך שעתיים, ולאחר מכן נוספו S. Typhimurium או EIEC (108 CFUs/mL) והודגרו למשך שעתיים נוספות. (iii) בדיקת עקירה שבה תאים הודגרו מראש עם S. Typhimurium או EIEC (108 CFUs/mL) למשך 2 שעות ולאחר מכן לקטובצילים (108 CFUs/mL) נוספו והודגרו במשך 2 שעות. בסוף הזמן הזה, השכבות החד-שכבות הנגועות נשטפו בהרחבה ב-PBS, ולאחר מכן הוסרו עם תמיסה של 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) ב-PBS למשך 10 דקות בחדר. טמפרטורה כדי לספור את החיידקים המופנמים. מנות הליסאטים של התאים הודללו באופן סדרתי וצופו על אגר Hektoen (OXOID) והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לכמת את סך החיידקים הקשורים לתאים (CFU/mL). עבור מבחני פולשניות, לאחר הדגירה עם חיידקים, השכבות החד-שכבות הנגועות נשטפו בהרחבה עם PBS סטרילי והודגרו במשך שעתיים נוספות במדיום DMEM, בתוספת gentamicinsulfate (250 µg ml-1) (Sigma-Aldrich) כדי להרוג את החיידקים החוץ-תאיים, לאחר מכן התאים עברו ליטוש וציפוי כפי שתואר קודם כדי לכמת את המספר הכולל של חיידקים מופנמים (CFU/mL).

2.7. ניתוח סטטיסטי

הבדלים משמעותיים בין הקבוצות הוערכו באמצעות ANOVA דו-כיווני באמצעות GraphPad Prism 8.0, וההשוואה בין הממוצעים חושבה באמצעות מבחן t של aStudent. הנתונים מבוטאים כממוצע ± סטיית תקן (SD) של שלושה ניסויים בלתי תלויים.

צמחי מרפא טבעיים להקלה על עצירות-Cistanche

Cistanche הוא סוג של צמחים טפילים השייך למשפחת ה- Orobanchaceae. צמחים אלו ידועים בסגולותיהם הרפואיות ושימשו ברפואה סינית מסורתית (TCM) במשך מאות שנים. מיני Cistanche נמצאים בעיקר באזורים צחיחים ומדבריים של סין, מונגוליה וחלקים אחרים של מרכז אסיה. צמחי ה- Cistanche מאופיינים בגבעולים הבשרניים והצהבהבים שלהם ומוערכים מאוד בשל היתרונות הבריאותיים הפוטנציאליים שלהם. ב-TCM, מאמינים כי ל-Cistanche יש תכונות טוניקות והוא משמש בדרך כלל להזנת הכליה, לשיפור החיוניות ולתמיכה בתפקוד המיני. הוא משמש גם לטיפול בבעיות הקשורות להזדקנות, עייפות ורווחה כללית. בעוד ל-Cistanche יש היסטוריה ארוכה של שימוש ברפואה מסורתית, המחקר המדעי על יעילותו ובטיחותו מתמשך ומוגבל. עם זאת, ידוע שהוא מכיל תרכובות ביו-אקטיביות שונות כגון פנילתנואידים גליקוזידים, אירידואידים, ליגנאנים ופוליסכרידים, אשר עשויים לתרום להשפעותיו הרפואיות.

של Wecistancheאבקת cistanche, טבליות cistanche, כמוסות cistanche, ומוצרים אחרים מפותחים באמצעותמִדבָּרcistancheכחומרי גלם, שלכולם השפעה טובה על הקלה על עצירות. המנגנון הספציפי הוא כדלקמן: ל- Cistanche מאמינים שיש יתרונות פוטנציאליים להקלה על עצירות בהתבסס על השימוש המסורתי שלו ותרכובות מסוימות שהוא מכיל. בעוד שמחקרים מדעיים ספציפיים על ההשפעה של Cistanche על עצירות מוגבלים, מניחים שיש לו מספר מנגנונים שעשויים לתרום לפוטנציאל שלו להקל על עצירות. אפקט משלשל:Cistancheזה זמן רב בשימוש ברפואה הסינית המסורתית כתרופה לעצירות. מאמינים שיש לו השפעה משלשלת קלה, שיכולה לעזור לקדם תנועות מעיים ולגרום לעצירות. ניתן לייחס השפעה זו לתרכובות שונות המצויות ב-Cistanche, כגון פנילתנואידים גליקוזידים ופוליסכרידים. לחות המעיים: בהתבסס על שימוש מסורתי, Cistanche נחשבת לבעלת תכונות לחות, המכוונות במיוחד למעיים. קידום הידרציה ושימון המעיים עשוי לעזור לרכך כלים ולהקל על מעבר קל יותר, ובכך להקל על עצירות. השפעה אנטי דלקתית: עצירות יכולה לפעמים להיות קשורה לדלקת במערכת העיכול. Cistanche מכיל תרכובות מסוימות, כולל פנילתנואידים גליקוזידים וליגננים, אשר מאמינים שיש להם תכונות אנטי דלקתיות. על ידי הפחתת דלקת במעיים, זה עשוי לעזור לשפר את סדירות תנועת המעיים ולהקל על עצירות.