בעיצוב סיליקו של חיסון כימרי רב-אפיטופי מופקר נגד מיקובקטריום שחפת חלק 1

תַקצִיר

שחפת (שחפת) היא איום בריאותי עולמי, והורגת כ-1.5 מיליון בני אדם מדי שנה. הדברת Mycobacterium tuberculosis, הגורם העיקרי לשחפת, מאתגרת יותר ויותר עקב הופעתם של זנים נרחבים עמידים לתרופות. חיסון נחשב לדרך יעילה להגן על המארח מפני פתוגנים, אך לחיסון השחפת המאושר קלינית, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), יש הגנה מוגבלת במבוגרים. נמצא כי חיסונים מולטי-אפיטופים מגבירים חסינות למחלות על ידי שילוב סלקטיבי של אפיטופים ממספר חלבונים מועמדים.

שחפת היא מחלה זיהומית הנגרמת על ידי החיידק Mycobacterium tuberculosis הפוגעת בעיקר בריאות אך עלולה לפגוע גם באיברים אחרים. לחסינות תפקיד חשוב בפיתוח וטיפול בשחפת.

במקרה של חסינות לא מספקת, Mycobacterium tuberculosis יכולה לפלוש בקלות לגוף האדם ולהתפתח לשחפת. לדוגמה, מערכת חיסונית שנפגעה ממחלות מסוימות או טיפולים רפואיים מגבירה את הסיכון לזיהום בשחפת. בנוסף, גורמים כמו תת תזונה, איכות חיים ירודה ומתח מוגזם עלולים גם הם להחליש את החסינות, מה שמוביל להתפתחות שחפת.

לכן, שמירה על בריאות טובה וחיזוק חסינות חשובה מאוד למניעת שחפת. ניתן לחזק את החסינות באמצעות תזונה בריאה, אורח חיים קבוע, פעילות גופנית נכונה ושינה מספקת, מה שיכול להפחית ביעילות את הסיכון לחלות במחלות שונות, כולל שחפת.

חסינות חשובה גם לטיפול ולהחלמה כאשר שחפת כבר התרחשה. ככל שמערכת החיסון חזקה יותר, כך הגוף יכול להגן על עצמו ביעילות רבה יותר מפני התקף של חיידק השחפת ולייצר מספיק נוגדנים כדי להילחם במחלה. לכן, שמירה על תזונה מספקת, פעילות גופנית נכונה וגישה חיובית יכולים לשפר את החסינות ולקדם התאוששות.

לסיכום, יש קשר חזק בין חסינות לשחפת. שמירה על בריאות טובה וחיזוק חסינות היא אחת הדרכים החשובות למניעה ולטפל בשחפת. תנו לנו להתמודד עם החיים בצורה חיובית, לשמור על אורח חיים בריא ולהתרחק ממחלות. מנקודת מבט זו, עלינו לשפר את החסינות שלנו. Cistanche יכול לשפר משמעותית את החסינות, מכיוון שאפר בשר מכיל מגוון של רכיבים פעילים ביולוגית, כמו פוליסכרידים, שתי פטריות, Huang Li ועוד. רכיבים אלו יכולים לעורר את מערכת החיסון סוגים שונים של תאים במערכת, להגביר את פעילותם החיסונית.

לחץ על היתרונות הבריאותיים של cistanche

מחקר זה נועד לתכנן חיסון מולטי-אפיטופים נגד שחפת באמצעות גישה אימונו-אינפורמטיקה. באמצעות העשרה תפקודית, זיהינו שמונה חלבונים המופרשים על ידי M. tuberculosis שנדרשים לפתוגנזה, מופרשים לחלל החוץ תאי, או שניהם. לאחר מכן ניתחנו את האפיטופים של חלבונים אלה ובחרנו 16 אפיטופים לימפוציטים T עוזרים עם פעילות משרה אינטרפרון, 15 אפיטופים לימפוציטים T ציטוטוקסיים ו-10 אפיטופים Bcell ליניאריים, וצימדנו אותם עם אדג'ובנט ו-Pan HLA DR-binding epitop (PADRE) תוך שימוש מתאים קישורים.

יתרה מכך, חזינו את המבנה השלישוני של חיסון זה, את האינטראקציה הפוטנציאלית שלו עם קולטן דמוי אגרה-4 (TLR4), ואת התגובה החיסונית שהוא עשוי לעורר. התוצאות הראו שלחיסון זה הייתה זיקה חזקה ל-TLR4, שיכולה לעורר באופן משמעותי תאי CD4 פלוס ו-CD8 פלוס להפריש גורמים חיסוניים ולימפוציטים B להפריש אימונוגלובולינים, כדי להשיג חסינות הומורלית ותאית טובה. בסך הכל, החלבון הרב-אפיטופי הזה נחזה להיות יציב, בטוח, מאוד אנטיגני ואימונוגני מאוד, שיש לו פוטנציאל לשמש כחיסון עולמי נגד שחפת.

1. הקדמה

שחפת (TB), מחלה מדבקת מאוד הנגרמת על ידי Mycobacterium tuberculosis, מדורגת על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) כגורם המוות העיקרי מגורם זיהומי יחיד [1-3]. בשנת 2021, המספר המוערך של מקרי מוות משחפת ומקרים חדשים הגיע ל-1.6 מיליון ו-10.6 מיליון, בהתאמה [4]. כיום, הטיפול הקליני בשחפת דל יחסית, ובעיקר נעשה שימוש בשילוב של מספר תרופות אנטי-מיקרוביאליות.
מחזור כימותרפיה זה ארוך מאוד, בדרך כלל לוקח תשעה עד שנים עשר חודשים, או אפילו יותר [5], מה שמגביר את הסיכון למוטציות עמידות לתרופות ב-M. tuberculosis [6,7]. בשנים האחרונות, כימותרפיה הפכה פחות יעילה בגלל הופעתה ושיעור הגדלת של M. tuberculosis עם ריבוי תרופות ועמידים לתרופות [6]. מניעת התפתחות שחפת עשויה להיות יעילה יותר מאשר טיפול בה. חיסון ידוע כדרך יעילה להגן על המארח מפני חיידקים פתוגניים [8].

נכון לעכשיו, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), שפותח לפני למעלה מ-100 שנה, הוא החיסון היחיד המאושר קלינית לשחפת [9]. למרבה הצער, BCG מגן רק על יילודים ותינוקות ובעיקר לא יעיל נגד מתבגרים ומבוגרים [2,10], אם כי ארגון הבריאות העולמי מדווח כי 89 אחוז ממקרי השחפת בשנת 2021 היו מבוגרים [4]. לכן, קיים צורך דחוף בפיתוח חיסון חדש ויעיל נגד שחפת, במיוחד עבור מתבגרים ומבוגרים.

פיתוח חיסון נגד שחפת מסובך על ידי מאפיינים מרובים של מיקובקטריה, כגון זיהום סמוי, התמדה והתחמקות חיסונית [11-13]. יש לתכנן חיסון אידיאלי לשחפת כדי למקד את החלבונים/מסלולים האחראים לתכונות אלו ב-M. tuberculosis ולהיות מסוגל לגרום ביעילות לתגובות חיסוניות בתיווך תאי T CD4 פלוס ו-CD8 פלוס [14].

יתר על כן, חיסון יעיל צריך לכוון גם למתחמי ההיסטו-תאימות העיקריים של המארח (MHC), שהם פולימורפיים מאוד [15]. מאפיינים אלה מציגים דרישות גבוהות מאוד לרבגוניות של החיסון, שכמובן לא ניתן להשיג על ידי חלבון טבעי אחד. חיסון מולטי-אפיטופים, חלבון רקומביננטי המורכב מסדרה של אפיטופים חופפים (פפטידים) [16], הוא סוג חדש של מועמד לחיסון שעשוי לתת מענה לבעיות הנ"ל.

בשנים האחרונות, חיסונים מולטי-אפיטופים משכו תשומת לב רבה בשל יתרונותיהם של חסינות גבוהה יותר ואלרגניות נמוכה יותר מאשר חיסונים קונבנציונליים [17,18]. נכון לעכשיו, חיסונים מולטי-אפיטופים תוכננו נגד מיקרואורגניזמים פתוגניים רבים, כולל Shigella spp. [19], וירוס מחלת הפה והטלפיים [20], הליקובקטר פילורי [21,22], וירוס הפטיטיס B [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], וירוס ניפאה [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28], וירוס לויקוזיס [29].

בפרט, הופעתה של מגיפת COVID-19 חיזקה את היישום של טכנולוגיה זו [16,30-32]. באשר לשחפת, מספר חיסונים מרובי-אפיטופים תוכננו להתמקד בשחפת פעילה מטבעה [33-39] ושחפת סמויה [40,41]. ביניהם, שלושה מועמדים לחיסון תוכננו בצורה של DNA [34,36,40], ושניים מהם שילבו אפיטופים בעמודי השדרה של החלבון ליצירת חיסונים רקומביננטיים [34,36].

יש לציין כי החלבונים המועמדים לחלק מהחיסונים הרב-אפיטופים הנ"ל נבחרים באקראי, וכיסוי האוכלוסייה של חיסונים אלו דורש מחקרים נוספים.

יתרה מכך, תוכננו שני מועמדים לחיסון מול שחפת עם כיסוי אוכלוסייה רחב, אפיטופ אחד נבחר מחלבוני שלפוחית ​​אקסוזומים אימונוגניים בעלי תכונות פתוגניות [39], והשני אינו מתמקד בחלבונים מועמדים, אלא בוחר באופן ישיר שמורים מאוד ומאומתים בניסוי. אפיטופים ממסד הנתונים של אימוניות חיסון (IEDB) [38]. עם זאת, לחלבונים מועמדים אלה אין העשרה תפקודית, ויכולתם של מועמדים לחיסון לגרום להפרשת אינטרפרון (IFN-) נותרה משופרת.

מחקר קודם הסיק כי ניתן להשיג אופטימיזציה רציונלית של אפיטופים על ידי שילוב של יכולת הקישור של MHC ויכולת האפיטופ להגיב עם קולטני תאי T [42]. יתר על כן, הם חזו שחיסונים עם אפיטופים קושרים של לימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTL) A1, A2, A3, A24 ו-B7 יהיו בעלי כיסוי של כמעט 100 אחוז בקבוצות האתניות העיקריות (שחורים, אסייתים, היספנים וקווקזים).

עם זאת, עד כה לא הייתה גישה דומה לתכנון חיסון לשחפת. במחקר זה, תכננו חיסון מול שחפת רב-אפיטופי מופקר ביותר תוך שימוש במאפיינים אנטיגנים שונים של שמונה חלבונים מועשרים בתפקוד. למועמד לחיסון הכימרי יש 15 אפיטופים של CTL, 16 אפיטופים של לימפוציטים T עוזרים (HTL) בעלי תכונות מעוררות IFN- - ו-10 אפיטופים ליניאריים של תאי B. ניתוח אימונו-אינפורמטיקה הראה שמועמד לחיסון זה היה 'מקיף', מה שהופך אותו לאבן יסוד פוטנציאלית להשגת 'אסטרטגיית ה- End TB'.

2. חומרים ושיטה

2.1. בחירת חלבון ואחזור רצף

כדי לבנות חיסון מולטי-אפיטופים נגד שחפת, בחרנו תחילה חלבונים של קומפלקס M. tuberculosis, המופקדים במסד הנתונים של IEDB [43] ואושרו כאפיטופים מחייבים מסוג MHC I ו-II. רצפי חומצות אמינו (מבנה ראשוני) של חלבונים מזן M. tuberculosis H37Rv התקבלו ממסד הנתונים של UniProt [44]. תחזיות בלתי תלויות יישור של אנטיגנים פוטנציאליים המבוססים על מאפיינים פיזיקוכימיים התקבלו מהשרת VaxiJen 2.0 [45], אשר עבר טרנספורמציה אוטומטית ו-Cross-covariance (ACC) של רצפי חלבון לוקטור אחיד של חומצת אמינו עיקרית. מאפיינים, כאשר סף האנטיגניות מוגדר ל-0.4 עבור כל חלבון חיידקי [45,46].

ביאור פונקציונלי של חלבונים הוערך באמצעות Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) 6.8 [47]. חלבונים שהופרשו הועשרו עוד יותר באמצעות שתי קטגוריות: מרחב חוץ-תאי ופתוגנזה באמצעות מסדי הנתונים DAVID ו-BioCyc [48], בהתאמה. הפרוטאום של Homo sapiens GRCh38.p13 הורד בפורמט FASTA ממסד הנתונים הלאומי של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (NCBI) [49]. BLASTp שימש לניבוי הומולוגיה (E-value =1e-5) בין חלבונים מופרשים לחלבוני H. sapiens.

2.2. חיזוי אפיטופ תאי T

חיזוי ובחירת אפיטופים הם שלבים חיוניים בבניית חיסונים מרובי-אפיטופים. מולקולות MHC I קושרות פפטידים קצרים (9-11 חומצות אמינו) מכיוון שהשסע הקושר לפפטיד של מולקולות MHC I המורכבות משרשרת אחת סגור [50]. ה-NetMHCpan-4.1 [51] הנגיש ללא תשלום שימש לחיזוי אפיטופים של CTL, המשתמש ב-NNAlign_MA כדי ליצור דרגות אחוזים (אחוז דירוג) על סמך שילוב של זיקות מחייבות של MHC I וליגנדים שנפלטו .

"אחוז דירוג" של רצף שאילתה נקבע על ידי השוואת ציון החיזוי שלו להתפלגות ציוני החיזוי עבור ה-MHC הרלוונטי שחושב באמצעות קבוצה של פפטידים מקומיים שנבחרו באקראי. אפיטופים עם דירוג אחוז < 0.5 אחוזים נחשבו לקשרים חזקים, בעוד אפיטופים עם דירוג אחוז < 2 אחוזים נחשבו לקשרים חלשים [51].

למרות שניתן לחזות עד 12 אפיטופים מסוג MHC Class I בשרת, השתמשנו רק ב-A1, A2, A3, A24 ו-B7 מכיוון שחמשת טיפוסי העל הללו מכסים 100 אחוז מהגזעים האנושיים העיקריים [42] . בחרנו קלסרים חזקים וחיזינו את האנטיגניות שלהם באמצעות VaxiJen2.0 [45], לאחר מכן, חזינו אימונוגניות מסוג I באמצעות מסד הנתונים הבינלאומי האפיטופים (IEDB) [52], אשר משתמש באימות צולב פי 3-.

לבסוף, סידרנו אפיטופים שהיו גם אנטיגנים וגם אימונוגניים לפי דירוג אחוז ובחרנו 15 אפיטופים בעלי ניקוד נמוך, שלושה לכל סוג על ולפחות אחד לכל חלבון מועמד, למעט חלבון מועמד שלא יכול להיות בעל אפיטופ חזק מקשר CTL שהוא אנטיגני ואימונוגני. לבסוף, ערכי IC50 עבור כל אפיטופ CTL נחזו מתוך NetMHC-4.0 [53].
מולקולות MHC Class II נקשרות לפפטידים אנטיגנים, וניתן לזהות את הקומפלקס שנוצר על ידי HTL. בדרך כלל, אורכם של פפטידים אנטיגנים נע בין 12 ל-20 שיירי חומצות אמינו, אך לעתים קרובות נצפים פפטידים באורך של בין 13 ל-16 שאריות [54].

ה-{{0}}-mers היו האפיטופים של MHC II הנפוצים ביותר עבור M. tuberculosis והופקדו ב-IEDB. כתוצאה מכך, השתמשנו ב-NetMHCIIpan-4.0 [51,55] כדי לחזות את הקישור של 15-mer פפטידים ל-Human Leukocyte Antigen-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, ו-H-2-1 אלל. החיזוי התבסס גם על NNAlign_MA עם דירוג אחוז של < 2 אחוזים ו<10 אחוזים הנחשבים כקלסרים חזקים וחלשים, בהתאמה [51].

כמו כן, חזינו 15-mer IFN השראת אפיטופים לחלבונים מועמדים באמצעות שרת IFNepitope [56], שמשתמש בגישה היברידית של מכונה וקטורית המאפשרת בדיקה וירטואלית של IFN- -מעורר פפטיד/אפיטופ בפפטיד ספרייה המורכבת מקושרי MHC II הניתנים להשראת IFN- - ולא ניתנים להשררה המפעילים תאי T-helper. לאחר מכן חזינו את האנטיגניות של האפיטופים מעוררי IFN [45], ולבסוף, בחרנו את 16 האפיטופים המופקרים ביותר שהיו מחייבים MHC-II חזק, מעוררי IFN ואנטיגנים.

חשוב לציין שפפטידי אות הוסרו מחלבונים מועמדים לפני חיזוי האפיטופ. במחקר זה, פפטידי אות נבדקו באמצעות SignalP 5.0 [57] ו-TargetP2.0 [58].

2.3. חיזוי אפיטופ ליניארי של תאי B

אפיטופים ליניאריים של תאי B (16-mers) נחזו באמצעות ABPred [59,60] עם סף ברירת מחדל של 0.51. יתרה מכך, כדי להגביר את המהימנות של תוצאות החיזוי, השתמשנו גם ב-BepiPred 2.0 [61] כדי לחזות אפיטופים של תאי B ליניאריים. אפיטופים שהתקבלו משתי התוכנות הללו עברו עוד יותר לחיזוי אנטיגניות באמצעות VaxiJen2.0 [45]. לבסוף, בחרנו עשרה אפיטופים ליניאריים של תאי B בהתבסס על ציוני ABCpred גבוהים ואנטיגניות, כאשר לפחות אפיטופ אחד נבחר עבור כל חלבון מועמד.

2.4. בניית המועמד לחיסון רב-אפיטופי בעל תכונות כימריות

החיסון הרב-אפיטופי המעוצב מכיל תוסף HBHA (המגלוטינין קושר להפרין), אפיטופ אחד מקשר Pan HLA DR (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 אפיטופים של תאי B ליניאריים ותג אחד His×6 (איור. 3). קישורים שימשו כדי להצטרף לאפיטופים, למנוע ייצור של אפיטופים של צומת, ולשפר את התהלוכה והתחדשות של אפיטופים בודדים בחיסונים כימריים [62].

לבניית מועמד לחיסון זה, התוסף HBHA (זיהוי UniProt: P9WIP9) היה ממוקם בקצה ה-N ומקושר ל-PADRE במורד הזרם באמצעות קישור EAAAK. לאחר מכן, האפיטופים של HTL שהצטרפו על ידי קישורי GPGPG נקשרו ל-PADRE. יתרה מכך, אפיטופים של CTL שהצטרפו על ידי מקשר AAY חוברו לאפיטופים של HTL באמצעות מקשר HEYGAEALERAG, אשר הצטרף גם ליחידת האפיטוף CTL לאפיטופים ליניאריים של תאי B המקושרים באמצעות מקשרי KK. לבסוף, תג His× 6 הוצמד לקצה ה-C של החלבון הכימרי.

2.5. אנטיגניות, אלרגניות ותכונות פיזיקוכימיות

האנטיגניות של החיסון מרובי האפיטופים ושמונה החלבונים המרכיבים את חזויה על ידי השרת VaxiJen 2.0 [45], בעוד שהאלרגניות של חלבונים אלו נחבאה על ידי השרת AllerTOP 2.0 [ 63]. AllerTOP 2.0 משתמש במתארי חומצות אמינו E, טרנספורמציה של ACC של רצפי חלבון, ושכנים קרובים (kNN) לסיווג אלרגנים.

השיטה השיגה דיוק של 85.3 אחוזים עם אימות צולב פי 5-. לצורך חיזוי של מאפיינים פיזיקוכימיים כגון זמן מחצית חיים, נקודה איזואלקטרית, אינדקס אי יציבות, אינדקס אליפטי וממוצע גדול של הידרופתיות (GRAVY) של חיסון מרובה-אפיטופים זה, נעשה שימוש בשרת ExPASy ProtParam [64].
יתרה מכך, המסיסות של פפטיד חיסון מרובה-אפיטופים הוערכה באמצעות שרת proteinSol (PROSO II) [65] בהתבסס על סיווג המנצל את ההבדלים העדינים בין החלבונים הבלתי מסיסים הידועים מ-TargetDB לבין החלבונים המסיסים מ-TargetDB ו-PDB. 66]. כאשר הוערך באמצעות אימות צולב של 10-פיפול, הוא השיג דיוק של 71.0 אחוזים (שטח מתחת לעקומת ROC=0.785).

2.6. סימולציה חיסונית

כדי לאפיין את פרופיל התגובה החיסונית והאימונוגניות של החיסון, בוצעו סימולציות חיסוניות בסיליקו באמצעות שרת C-ImmSim [67]. C-ImmSim מנבא אינטראקציות חיסוניות באמצעות מטריצות ניקוד ספציפיות למיקום הנגזרות מטכניקות למידת מכונה לחיזוי פפטידים.
הוא מדמה במקביל שלושה תאים המייצגים שלושה אזורים אנטומיים נפרדים המצויים ביונקים: (i) מוח העצם, שבו הודמו תאי גזע המטופואטיים לייצור לימפוציטים חדשים ותאי מיאלואיד; (ii) התימוס, שבו נבחרו תאי T תמימים כדי למנוע אוטואימוניות; ו-(iii) איבר הלימפה כגון בלוטות לימפה.

כדי לקדם ולהגביר את החיסון ביעילות, עקבנו אחר הגישה של [68] שבה ניתנו שתי זריקות בהפרש של ארבעה שבועות. כל פרמטרי הסימולציה נקבעו לערכי ברירת מחדל, כאשר שלבי הזמן נקבעו ל-10 ו-94 (כל צעד זמן הוא שמונה שעות).

2.7. חיזוי אזור מופרע

אזורים עם הפרעות מהותית (IDR) קיימים בחלבונים רבים. האזור המופרע נחזה באמצעות DISOPRED3 [69], אשר משתמש ב- DISOPRED2 ובשני מודולים אחרים מבוססי למידה מכונה שהוכשרו על IDRs גדולים כדי לזהות שאריות מופרעות. הם היו אז אנו

2.8. חיזוי מבנה משני ושלישוני

המבנה המשני של החיסון המתוכנן נחזה על ידי שרת PSIPRED 4.0 [70], אשר משתמש לראשונה ב-PSI-BLAST כדי לזהות רצפים הקשורים באופן הדוק לחלבון השאילתה. המבנה השלישוני של חיסון זה נחזה באמצעות שרת האיטרטיביים של חיזוק ההברגה (I-TASSER) [71].

ישנם ארבעה שלבים מרכזיים בדוגמנות ITASSER; א) זיהוי תבנית השחלה; ב) הדמיית הרכבת מבנה איטרטיבית; ג) בחירת דגם ועידון; וכן ד) ביאור פונקציונלי מבוסס מבנה [72,73].

I-TASSER ייצר חמישה דגמים, אשר הוקרנו באמצעות ProSA-web [74], והדגם עם ציון ה-Z הנמוך ביותר נבחר לשיפור נוסף. ProSA-web משווה את ציוני המודל שהתקבלו ממבנים מאומתים בניסוי שהופקדו ב-PDB. עלילת ציון איכות מקומית עוזרת לזהות אזורים בעייתיים במודל, ואותם ציונים יוצגו באמצעות קוד צבע בהצגת המבנה התלת-ממדי. זה שימושי לקביעה ועידון מבניים מוקדמים.

2.9. חידוד מבנה שלישוני

מודל התלת מימד ה"גס" של מועמד החיסון שהושג על ידי ITASSER שוכלל בשני שלבים באמצעות שני שרתים; תחילה עם ModRefiner [75] ואחריו GalaxyRefine [76]. ModRefiner משתמש ב-C עקבות כדי להשפיע על הבנייה והעידון של חלבונים המתקבלים על ידי מזעור אנרגיה ברמת שני שלבים.

ראשית, עקבות C שימשו לבניית השרשרת הראשית, ולאחר מכן חידוד של רוטמרים של שרשרת צד ואטומי עמוד שדרה באמצעות שדות כוח מורכבים מבוססי פיזיקה וידע. GalaxyRefine משתמש במספר תבניות כדי ליצור מבני ליבה אמינים, בעוד לולאות או מסופים לא אמינים נוצרו על ידי מודלים מבוססי אופטימיזציה.

2.10. אימות מבנה שלישוני

המבנה המעודן של מועמד החיסון אומת על ידי חלקות Ramachandran שנוצרו ממסד הנתונים PROCHECK [77] ו- MolProbity [78]. חלקות Ramachandran מעריכות את מבנה עמוד השדרה של חלבונים על ידי חלוקת שאריות חומצות אמינו לשני אזורים: מותר ואסור. PROCHECK משתמש בסטריאוכימיה כדי להעריך את האיכות נטו של מבני חלבון על ידי השוואתם למבנים המעודנים באותה רזולוציה ולאחר מכן הצגת אזורים הדורשים ניתוח נוסף.

Molprobity מאמתת מודלים מקומיים וגלובליים של מקרומולקולות (חלבונים וחומצות גרעין) על ידי שילוב של קריטריונים של רנטגן, NMR, חישוב ו-cryoEM [79]. הכוח והרגישות לאופטימיזציה של מיקום מימן וניתוח מגע של כל האטומים נמצאים בשימוש נרחב בגרסה מעודכנת של הקריטריונים של הגיאומטריה הקוולנטית וזווית הפיתול [80].

2.11. אפיטופים לא רציפים של תאי B

אפיטופים לא רציפים של תאי B במבנה החלבון המקומי נחזו באמצעות ElliPro [81]. ElliPro מיישמת שלושה אלגוריתמים להערכת צורת החלבון כאליפסואיד, מחשבת את מדד הבליטה של ​​השאריות (PI) ומקבצת שאריות שכנות על סמך ערכי ה-PI שלהן. ElliPro מספקת לכל אפיטופ פלט ציון המתואר כערך ה-PI הממוצע עבור שארית האפיטופ. אליפסואיד עם ערך PI של 0.9 מורכב מ-90 אחוז משאריות החלבון הכלולות, בעוד ש-10 האחוזים הנותרים מהשאריות נמצאים מחוץ לאליפסואיד. עבור כל שייר אפיטופ, ערך ה-PI מחושב ממרכז המסה של השייר השוכן מחוץ לאליפסואיד הגדול ביותר האפשרי.

2.12. עגינה מולקולרית של חלבונים כימריים

עגינה מולקולרית של החיסון המתוכנן (ליגנד) עם קולטן חיסוני מסוג Toll-Like-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) בוצעה באמצעות Patchdock [82]. 10 הדגמים המובילים שוכללו לאחר מכן באמצעות FireDock [83]. PatchDock מחליף את ייצוג פני הנקודה Connolly של המולקולות עם טלאים קעורים, קמורים ושטוחים.

לאחר מכן קיבלו ניקוד של המודלים על סמך התאמה גיאומטרית ופירוק אטומי. [82]. FireDock מייעל את קונפורמציות שרשרת הצד והכיוון של הגוף הנוקשה ומייצר פלט של קומפלקס מעודן תלת מימדי המבוסס על אנרגיית הקישור [83]. בחרנו את הדגם הראשון של Firedock המבוסס על אנרגיה גלובלית כמתחם העגינה. לבסוף, אנרגיית הקישור ותכולת הדיסוציאציה בתוך מתחם העגינה נחזה באמצעות שרת PRODIGY [84].

2.13. הדמיית דינמיקה מולקולרית

סימולציות דינמיות מולקולריות בוצעו על חלבונים באמצעות שרת האינטרנט המהיר והנגיש באופן חופשי, שרת קואורדינטות פנימיות לניתוח מצבים רגילים (iMODS) [85], ותוצאות עגינה עקביות ואופטימליות התקבלו משרת PatchDock-FireDock. בקואורדינטות פנימיות, ניתוח מצב רגיל (NMA) מייצר תנועות קולקטיביות קריטיות לתפקוד מקרומולקולרי. iMODS מציג מנגנונים לחקר מצבים אלה כמו ניתוח רטט, אנימציות תנועה ומסלולי שינוי שבוצעו כמעט באופן אינטראקטיבי ברזולוציות שונות [85].

2.14. תרגום הפוך, אופטימיזציה של קודונים ושיבוט בסיליקו של החיסון

כדי לבטא ביעילות את המועמד לחיסון בתאי Escherichia coli, cDNA נוצר בסיליקו באמצעות אופטימיזציה של קודונים ותרגום הפוך באמצעות הכלי Java Codon Adaptation Tool (JCAT) [86].

אופטימיזציה כללה (א) הימנעות ממסימי תעתיק בלתי תלויים ב-rho, ii) הימנעות מאתרי קישור לריבוזומים פרוקריוטיים, (iii) הימנעות מאתר ביקוע של אנזימי ההגבלה NcoI ו-XhoI, המשמשים כאתרי הגבלה N-טרמינליים ו-C-טרמינליים להחדרת cDNA תבנית חיסון, ו-(iv) אופטימיזציה חלקית בלבד ליישום מוטגנזה מכוונת-אתר. Codon Adaptation Index (CAI) ותוכן GC חזו את איכות ה-cDNA עם קודון עצירה אופל (TGA) שהוכנס אחרי תג His× 6. לאחר מכן, קטע ה-DNA האופטימלי של המועמד לחיסון הכימרי שולב בגדיל ההפוך של pET-28a(plus) באמצעות הכלי SnapGene [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com