כיצד להפריד בין אקטאוזיד ל-Cistanche Tubulosa

Helin Xu a, Xueqin Li a,⇑ , Yayan Hao a, Xiaobin Zhao a, Yun Cheng a, Jinli Zhang a,b

בית ספר לכימיה והנדסה כימית/מעבדת מפתח לעיבוד ירוק של הנדסה כימית של שינג'יאנג בינגטואן, אוניברסיטת שיהזי, שיהזי 832003, סין

b מעבדת מפתח לטכנולוגיה כימית ירוקה של משרד החינוך, בית הספר להנדסה כימית וטכנולוגיה, אוניברסיטת טיאנג'ין, טיאנג'ין 300072, סין

איש קשר:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

תַקצִיר

כדי להשיג הפרדה פשוטה ויעילה שלאקטאוזיד(ACT), מיצוי ACT מתמציות גולמיות שלCistanchetubulosaבאמצעות נוזל יוני (IL) המבוסס על מערכת דו-פאזית מימית (ATPS) נחקר. ה-IL–ATPS הכולל [C4mim]BF4 ו-(NH4)2SO4 מציג ביצועי חילוץ מצוינים, ומוציא כמעט את כל ה-ACT(Acteoside)בשלב העשיר של [C4mim]BF4-. הקוטביות הגבוהה של [C4mim]BF4 בעל קולטני קשרי מימן רב תורמת למיצוי ACT(Acteoside)בשלב העשיר ב-IL, ו-(NH4)2SO4 לא רק מספק מיקרו-סביבה חומצית חלשה להגברת יציבות ה-ACT בשלב העשיר ב-IL, אלא גם מפחית את המסיסות של ACT.(Acteoside)בשלב העשיר במלח באמצעות אפקט ההמלחה. בנוסף, תוצאות סימולציה מולקולריות מראות שמופק בשלב העשיר [C4mim]BF4- באמצעות אינטראקציות מרובות, כולל קשרי מימן, כוחות ואן דר ואלס וערימה p-p. מחקר זה צפוי לספק התייחסות חשובה להפרדה של מרכיבים ביו-אקטיביים ממוצרים טבעיים.

מילות מפתח:נוזלים יוניים, מלח, מערכת דו-פאזית מימית, מיצוי,אקטאוזיד

אקטאוזידבCistanche tubulosa

מבוא

Cistanchetubulosa(Orobanchaceae) הוא צמח טפיל הגדל על שורשי תמריקס וסלבדורה ומופץ בעיקר בארצות הצחיחות ובמדבריות של צפון מערב סין [1–3]. הגבעולים של Cistanche tubulosa, המכונה 'ג'ינסנג של המדבריות', מתועדים רשמית בפרמקופיה הסינית (מהדורת 2015) [4,5], ודווח כי המרכיבים העיקריים שלהם הם גליקוזידים פנילתנואידים (PhG), פוליסכרידים, ו אירידואידים.

תרכובות PhG, קבוצה של מרכיבים ביו-אקטיביים מסיסים במים בCistanchetubulosa, בעלי מבנה משותף המורכב מחלקי חומצה קינמית ו-hydroxyphenylethyl המחוברים לקבוצת b-glucopyranose באמצעות קישורים אסטרים וגליקוזידיים, בהתאמה [6].אקטאוזיד(ACT) הוא המרכיב העיקרי של תרכובות PhG והוא מרכיב המדד לקביעת התוכן שלCistanchetubulosa[7]. מחקרים כימיים ותרופתיים מודרניים הוכיחו כי ACT(Acteoside)מפגין פעילויות תרופתיות מרובות, כגון נוגד חמצון, אנטי עייפות, הגנה עצבית והגנה על הכבד [8-10]. לפיכך, ל-ACT סיכוי יישום רחב בתחומי הרפואה, הבריאות, המזון וכו'. עם זאת, ההפרדה והטיהור של ACT(Acteoside)קשים בשל ההרכב המורכב של תרכובות PhG, בעלות מבנה, קוטביות ומסיסות דומים. נכון לעכשיו, השיטות העיקריות להפרדה וטיהור של ACT כוללות הטבעה מולקולרית, הפרדת שרף ספיחה מאקרופורוסית, כרומטוגרפיה זרם נגדי במהירות גבוהה והפרדת ממברנות. לדוגמה, Liu וחב' השתמשו בשרף מאקרו-פורוס כדי להפריד בין PhG לבין Cistanche deserticola, ו-Xu et al. השתמשו בסופחי פחמן מזופוריים לספיחת PhG, ויכולת הספיחה הגיעה ל-358.09 מ"ג/גרם. עם זאת, לשיטות אלו יש חסרונות רבים, כגון צריכת זמן, הליך מורכב וסלקטיביות נמוכה. לכן, פיתוח שיטה פשוטה ויעילה להפרדה סלקטיבית של מרכיבים ביו-אקטיביים ממוצרים טבעיים רצוי מאוד.

חלק פלבנואיד מטוהר מיקרוני

בשנים האחרונות, מערכת הדו-פאזית המימית (ATPS), הניתנת לביצוע בסביבה מתונה וניתנת להרחבה בקלות [11-15], הופיעה כטכניקת מיצוי נוזל-נוזל חדשנית להפרדה של מרכיבים ביו-אקטיביים [16] –19]. על פי הרכבו, ניתן לחלק את ATPS לשלושה סוגים, כלומר, שני פולימרים או יותר, פולימר ומלח, או שני פעילי שטח [20-23]. עם זאת, כמעט לכל הפולימרים היוצרים פאזה יש צמיגות גבוהה וטווח קוטביות צר שאינם תורמים להעברת מסה ומגבילים את הסלקטיביות. בהקשר זה, נוזלים יוניים (ILs) מאופיינים בתנודתיות זניחה, יציבות כימית, מסיסות מקיפה לתרכובות אורגניות, ורוב ה-ILs ידידותיים לסביבה [24-28]. תכונות אלו הופכות IL-APTSs עם ביצועים טובים יותר מאשר ATPSs אחרים להפרדה של מרכיבים ביו-אקטיביים. בהשוואה ל-ATPS המסורתי, ה-IL-ATPS אוסף את היתרונות של IL וגם של ATPS, כגון הפרדת פאזות מהירה, ביצועי מיצוי גבוהים ותאימות ביולוגית סביבתית [12,29,30]. נכון לעכשיו, IL-ATPS לא יושמה על הפרדה וטיהור של ACT(Acteoside), אך נקבע שניתן ליישם IL-ATPS במיצוי והפרדה של פוליסכרידים [31], ונילין [32], פוליסכרידים אלוורה [33], ספונינים של ג'ינסנג [11] וכו'. לדוגמה, He et al. הפקת ג'ינסנג ספונינים ביו-אקטיביים באמצעות IL-ATPS, אשר הוכחה כשיטה פשוטה ויעילה למיצוי ג'ינסנוזידים ביעילות מיצוי גבוהה של 99.5 אחוז ומקדם חלוקה של 651. Gao et al. מופק אסטקסנטין בשלב העשיר ב-[P4448]Br באמצעות IL ATPS הכולל [P4448]Br ו-K3PO4 עם יעילות מיצוי של עד 93.08 אחוזים [34]. תוצאות אלו מראות של-IL-ATPS יש סיכויי יישום פוטנציאליים להפרדת מרכיבים ביו-אקטיביים ממוצרים טבעיים, וניתן לצפות ממנו להשיג הפרדה סלקטיבית ביותר של ACT מ-Cistanchetubulosa.

במחקר זה, טכניקה פשוטה, יעילה וירוקה המבוססת על מיצוי ATPS להפרדה סלקטיבית מאוד של ACT(Acteoside)מתמציות גולמיות שלCistanchetubulosaנחקר. ILs שונים ([C4mim][CF3SO3], [C4mim]Cl, [C4mim]BF4, [C2mim]Br, [C4mim]Br, [C6mim]Br ו-[C8mim]Br) וסוגי מלח (NaCl, Na2SO4,Na3C6H5O7 , (NH4)2SO4 ו-NaH2PO4) נחקרו כדי לקבוע את ה-IL-ATPS האופטימלי להפקת ACT(Acteoside). יתר על כן, תנאי המיצוי הותאמו כדי להשיג הפרדה סלקטיבית ביותר של ACT בשלב העשיר ב-IL. ההשפעה של תנאי מיצוי שונים (למשל, טמפרטורת מיצוי, ריכוז IL, ריכוז תמיסת דגימה, ריכוז מלח, pH וזמן שיווי משקל מיצוי) על ביצועי מיצוי ה-ACT נידונה בפירוט. יתר על כן, סימולציות מולקולריות נערכו על ACT, [C4mim]BF4 ו- H2O כדי לחשוף את מנגנון החילוץ.

cistanche tubulosa לעומת deserticola

2. ניסיוני

2.1. חומרים

הגבעולים שלCistanchetubulosaסופקו על ידי Cong Rongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, סין). הסטנדרטים של ACT(Acteoside)(טוהר - 98 אחוז, איור 1a) ו-echinacoside (טוהר - 98 אחוז, איור 1b) סופקו על ידי Sunny Biotech Co., Ltd. (שנחאי, סין). 1-בוטיל-3-מתילימידאזוליום טריפלואורו מתאן-סולפונט ([C4mim][CF3SO3]), 1-בוטיל-3-מתילימידאזוליום כלוריד ([C4mim]Cl), 1-בוטיל{ {13}}מתילימידאזוליום טטרפלואורובוראט ([C4mim]BF4), 1-אתיל-3-מתילימידאזוליום ברומיד ([C2mim]Br), 1-בוטיל-3-מתילימידאזוליום ברומיד ([C4mim] Br), 1-hexyl-3-methylimidazolium bromide ([C6mim]Br), ו-1-octyl-3-methylimidazolium bromide ([C8mim]Br) סופקו על ידי Chengjie Chemical Co. בע"מ (שנחאי, סין). אמוניום גופרתי בדרגה אנליטית ((NH4)2SO4), נתרן דימימן פוספט (NaH2PO4), נתרן סולפט (Na2SO4), נתרן פוספט די-בסיסי (Na2HPO4), דיפוטסיום מימן פוספט (K2HPO4), נתרן כלוריד (NaCl) ותרי סודיום 5O7C. ) סופקו על ידי Shengao Chemical Reagent Co., Ltd. (טיאנג'ין, סין). מתנול, חומצה אצטית ואצטוניטריל בדרגה כרומטוגרפית סופקו על ידי Aladdin Chemical Co., Ltd (Shanghai, סין). אתנול בדרגה אנליטית סופק על ידי Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (טיאנג'ין, סין).

איור. 1. מבנים כימיים של (א)אקטאוזיד(ACT), ו-(ב) enchinacoside.

2.2. הכנת תמציות גולמיות של Cistanche tubulosa

דגימת אבקה שלCistanchetubulosa(20 מ"ג) הושרו ב-500 מ"ל של תמיסה של 50 אחוז אתנול עם אולטרסאונד למשך 2 שעות. השאריות בתמיסה הופרדו בצנטריפוגה במהירות של 5000 סל"ד למשך 10 דקות. הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה סונן ברצף באמצעות מסננים של 0.45 ו-0.22 lm. לאחר מכן, התסנין רוכז וייבש ב-323 K בתנור ואקום. לבסוף, המוצר המיובש הומס במים, ותמצית חומה אדמדמה שלCistanchetubulosaהושג.

2.3. מיצוי של ACT(Acteoside)מאת IL-ATPS

סכימה לחילוץ יעיל של ACT(Acteoside)לפי IL-ATPS מוצג באיור. 2. בהתאם לכך, 3.75 מ"ל [C4mim]BF4, 3.5 מ"ל מים מזוקקים, 11.11 אחוז מלח ו-1.0 מ"ל תמיסה לדגימה עם אותו ריכוז של ACT ואכינאקוסיד הוסף לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. IL-ATPS נוסף עם אותם רכיבים למעט תמיסה המדגם הוכנה כמערכת ניגודיות. המלח של IL-ATPS הומס לחלוטין על ידי אולטרסאונד, והיווצרות של שני שלבים ברורים הואצה על ידי צנטריפוגה ב-8000 סל"ד למשך 8 דקות. השלב התחתון של IL-ATPS היה השלב העשיר ב-IL, והשלב העליון היה השלב העשיר במלח. המרכיבים של שני השלבים נותחו כמותית על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC).

הריכוז של ACT(Acteoside)ו- echinacoside בשני השלבים נקבע על ידי HPLC, וביצועי המיצוי הוערכו על ידי יעילות המיצוי (E, אחוז), מקדם החלוקה (K) וסלקטיביות (S). ההשוואה הבאה. (1) המשוואה שימשה לחישוב K

K=Cb/Ct (1)

כאשר Cb ו-Ct (mg/mL) הם ה-ACT(Acteoside)ריכוז בשלב התחתון והעליון, בהתאמה. השוואות (2) ו-(3) שימשו לחישוב E ו-S, בהתאמה.

E=Cb*Vb/Mv*100 אחוז (2)

S=K/Kt=Cb*Cet / Ct*Ceb (3)

כאשר mv (mg) הוא המשקל של ACT(Acteoside)בתמיסת הדגימה, Vb (mL) הוא הנפח בשלב התחתון, וריכוזי Cet ו-Ceb echinacoside בשלב העליון והתחתון (mg/mL), בהתאמה.

איור 2. סכמטי למיצוי יעיל של ACT על ידי IL-ATPS

2.4. ניסויים סלקטיביים

פעולה(Acteoside)ואכינאקוסיד נחשבים למתחרים להערכת הסלקטיביות של IL-ATPS ל-ACT(Acteoside)בשל המבנה המולקולרי הדומים והתכונות הכימיות של ACT(Acteoside)ואכינאקוסיד. 3.75 מ"ל[C4mim]BF4, 3.5 מ"ל מים מזוקקים, 11.11 אחוז מלח ו-1.0 מ"ל תמיסה מדגימה עם אותו ריכוז של ACT ואכינאקוסיד נוספו לשפופרת צנטריפוגה של 50 מ"ל. המלח של IL-ATPS הומס לחלוטין על ידי בדיקת קול, ויצירת שני שלבים ברורים הואצה על ידי צנטריפוגה ב-8000 סל"ד למשך 8 דקות. השלב התחתון של IL-ATPS היה השלב העשיר ב-IL, והשלב העליון היה השלב העשיר במלח. המרכיבים של שני השלבים נותחו כמותית על ידי HPLC.

2.5. ניתוח HPLC

ריכוז תמיסת הדגימה בשני השלבים נותח על ידי HPLC (2695, Waters Co., ארה"ב) עם עמודת C18 ב-33 0 ננומטר באמצעות גלאי אולטרה סגול. שיטת elution הגרדיאנט אומצה להפרדה וגילוי דגימות בטמפרטורת עמודה של 303 K. השלבים הניידים היו (א) אצטוניטריל ו-(ב) חומצה אצטית/מים (1:44, v/v), וקצב הזרימה היה מוגדר ל-1 מ"ל/דקה. השלב הנייד והדגימות סוננו דרך מסנן 0.22 lm לפני ההזרקה. כל הניסויים בוצעו שלוש פעמים, וסרגל השגיאה מופיע בכל הדמויות.

2.6. אִפיוּן

ACT, [C4mim]BF4 והשלב העשיר [C4mim]BF4- נותחו על ידי ספקטרוסקופיה של פורייה טרנספורמציה אינפרא אדום (FTIR) באמצעות Bruker Vertex 70 (Bruker Optics, Ltd., גרמניה). ספקטרום ה-FTIR של ACT, [C4mim]BF4 והשלב העשיר ב-[C4mim]BF4- התקבלו מ-4000 עד 500 ס"מ ברזולוציה של 2 ס"מ תוך שימוש באשלגן ברומיד כנקודת ההתייחסות.

2.7. סימולציה מולקולרית

כדי לקבל תובנות לגבי מנגנון החילוץ של IL-ATPS וכן על מצבי האינטראקציה בין ACT ו-[C4mim]BF4 ב-IL ATPS, נערכו חישובי העיקרון הראשון על סמך תיאוריית הפונקציונליות של הצפיפות (DFT). אופטימיזציות וחישובי אנרגיה חד-נקודתית בוצעו באמצעות הפונקציונלי M06–2X [35,36], והקבוצה הבסיסית 6–31 פלוס G (d) שימשה לתיאור אטומי C, H, F, B, N ו-O [37]. כדי לדמות במדויק אינטראקציות חלשות, נעשה שימוש בשיטת DFT-D3 לתיאור הולם של אינטראקציות פיזור [38]. על פי דיווחים קודמים [39], סימולציות מולקולריות נערכו על ה-ACT, [C4mim]BF4 ו-H2O. ראשית, הקונפורמציות האישיות של דגמי ACT ו-[C4mim]BF4 עברו אופטימיזציה, ולאחר מכן הקונפורמציה המחייבת של [C4mim]BF4 ו-ACT עברה אופטימיזציה על סמך התצורה האישית האופטימלית שלהם.

האנרגיות המחייבות (DE) של ACT(Acteoside)ו-[C4mim]BF4 ואנרגיות מחייבות (DE) של ACT ו-H2O הוערכו באמצעות Eqs. (4) ו-(5), בהתאמה.

△E = Ecom- (Eפעולהפלוס EIL)
△E = Ecom - (EH2O פלוס Eפעולה)

כאשר EH2O, EACT, EIL ו-Ecom הם האנרגיות הפוטנציאליות של ACT(Acteoside), [C4mim]BF4, H2O והקומפלקסים שלהם, בהתאמה. כל החישובים בוצעו באמצעות תוכנת Gaussian16 [40], וכל המולקולות צוירו באמצעות תוכנת VMD v.1.9.3. בינתיים, הוקם מודל שיפוע עצמאי (IGM) כדי לזהות ולכמת את הנחתת שיפוע צפיפות האלקטרונים נטו בתוכנת Multiwfn v.3.5.

אקטאוזידבCistanche tubulosa

3. תוצאות ודיון

3.1. אופטימיזציה של IL-ATPS

3.1.1. הקרנת ILs

כדי להעריך את ההשפעה של סוג ה-IL על ביצועי המיצוי ב-IL-ATPS, שבעה סוגים של ILs בעלי קטיונים ואניונים שונים נבחרו כרכיבים יוצרי פאזה להפקת ACT(Acteoside). כפי שמוצג באיור 3 (א), האינטראקציה בין אניונים ACT ו-IL נחקרה על ידי בחינת השילוב של [C4mim] פלוס כקטיון עם אניונים שונים כולל Br-, Cl-, [CF3SO3] - ו-BF{{7 }}. התוצאות הראו כי אניוני IL הגבירו את ה-ACT(Acteoside)ביצועי חילוץ בסדר BF4- > [CF3SO3] - > Br- > Cl- . האניון IL האופטימלי היה BF4, אשר ניתן לייחס לעובדה שה-IL המקביל יכול לספק יותר קולטנים לקשרי מימן עבור קבוצות ההידרוקסיל של ACT(Acteoside)מאשר אניוני IL אחרים [21]. זה מצביע על כך שקשר מימן הוא האינטראקציה העיקרית בין אניוני IL ו-ACT.

לאחר מכן, השילוב של Br עם קטיונים שונים כולל [C2mim] פלוס , [C4mim] פלוס , [C6mim] פלוס ו-[C8mim] פלוס נחקר כדי לחקור את התצורה הסטרית האופטימלית בין ACT(Acteoside)וה-ILscations. התוצאות הראו כי ה-ACT(Acteoside)ביצועי המיצוי גדלו עם ירידה באורך שרשרת אלקיל מ-[C8mim] פלוס ל-[C2mim] פלוס. מכיוון ש-[C2mim] פלוס לא יצר את ה-ATPS המקביל עם BF4, [C4mim] פלוס נבחר כקטיון ה-IL האופטימלי

ניתן לייחס זאת לקוטביות הגבוהה של שרשרת האלקיל הקצרה של [C4mim] פלוס , שהייתה מועילה להמסת ACT(Acteoside)ומיצוי אותו בשלב העשיר ב-IL. בנוסף, לקטיון האימידאזול של [C4mim] פלוס יש מערכת p ארומטית, שיכולה ליצור אינטראקציות p-p עם טבעת הבנזן של ACT כדי להשיג את תצורת הסטריאו האופטימלית. לכן, [C4mim]BF4 נבחר כאופטימלי עבור הניסויים הבאים.

3.1.2. הקרנת מלחים

להערכת השפעת סוג המלח על ACT(Acteoside)ביצועי מיצוי, חמישה סוגים של מלחים (NaH2PO4, (NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl ו-Na3C6H5O7) נבחרו ליצירת IL-ATPSs עם [C4mim]BF4, והתוצאות מוצגות באיור 3 (ב). ניתן לחלק את המלח למלחים חומציים (NaH2PO4 ו-(NH4)2SO4), ניטרליים (Na2SO4, ו-NaCl), ובסיסיים (Na3C6H5O7). ניתן לראות מאיור 3(ב) ש(NH4)2SO4 מספק IL-ATPS עם ביצועי מיצוי ACT מצוינים. התוצאה מצביעה על כך שההבדל ביעילות החילוץ, מקדם החלוקה והסלקטיביות קשור ליציבות של ACT(Acteoside)במיקרו-סביבות המיצוי השונות.

איור 3. הקרנה של ATPSs. (א) סוגי ILs, ו-(ב) סוגי מלחים

הגליקוזידים של פנולים חומציים של ACT יציבים במערכות חומציות חלשות. מכיוון ש-(NH4)2SO4 הוא מלח חומצי, הוא יכול לספק מיקרו-סביבה חומצית חלשה עבור IL-ATPSs. זה תורם להגברת יעילות המיצוי ולשמירה על יציבות ה-ACT(Acteoside)בשלב העשיר ב-IL. בנוסף, יכולת ההמלחה של סוגי מלח שונים הייתה שונה מזו של (NH4)2SO4 הייתה חזקה יותר מזו של NaH2PO4 [24,41]. המלח (NH4)2SO4 מתחרה מול ACT(Acteoside)למולקולות H2O בשלב העשיר במלח, ובכך להפחית את מסיסותו של ACT בשלב העשיר במלח, וניתן לחלץ את ה-ACT ביעילות בשלב העשיר ב-IL. לפיכך, (NH4)2SO4 נבחר כמלח האופטימלי בניסויים הבאים.

3.2. אופטימיזציה של תנאי מיצוי ב-IL–ATPS

3.2.1. השפעת טמפרטורת המיצוי

על פי מחקרים קודמים [42], לטמפרטורת המיצוי יש השפעה משמעותית על ביצועי המיצוי עבור מרכיבים ביו-אקטיביים ב-IL-ATPS, טמפרטורה נמוכה מועילה יותר להיווצרות IL-ATPS. איור 4 (א) מציג את ההשפעה של [C4mim] BF4-(NH4)2SO4 כ-IL-ATPS עם טמפרטורת מיצוי בטווח של 278-318 K על ביצועי המיצוי של ACT(Acteoside). איור 4(א) מראה שיעילות המיצוי, מקדם החלוקה והסלקטיביות ירדו עם הגדלת טמפרטורת המיצוי, מה שמצביע על כך שמצב של טמפרטורה גבוהה לא מתאים למיצוי ACT ב-IL–ATPS.

הסיבה המיוחסת בעיקר לכך שהשפעת ההמלחה נחלשה, והיא נבעה מכך שהמים בשלב העשיר ב-IL הועברו לשלב העשיר במלח ב-IL-ATPS בטמפרטורות מיצוי גבוהות [42]. בנוסף, מחקר הניסויים הראה שטמפרטורת מיצוי גבוהה לא תורמת לקיום יציב של ACT(Acteoside). לפיכך נקבעה טמפרטורת המיצוי האופטימלית להיות 278 K

3.2.2. השפעת ריכוז [C4mim]BF4

איור 4 (ב) מציג את ההשפעה של ריכוז [C4mim]BF4 מ-20 עד 60 אחוזים משקל על ביצועי המיצוי עבור ACT(Acteoside)ב-IL-ATPS. כפי שמוצג באיור 4 (ב), ביצועי מיצוי ה-ACT עלו בבירור כאשר ריכוז [C4mim]BF4 עלה מ-20 ל-50 אחוזי משקל. עם זאת, ביצועי המיצוי ירדו מעט כאשר ריכוז [C4mim]BF4 הועלה מ-50 ל-60 אחוזים במשקל. לפיכך, ריכוז גבוה של [C4mim]BF4 היה תורם להפקת ACT בשלב העשיר ב-[C4mim]BF4-, אך ריכוז מוגזם של [C4mim]BF4 מעל 50 אחוז משקל הביא לירידה בביצועי מיצוי ה-ACT.

הדבר נובע ככל הנראה מהעלייה במסיסות של ACT בשלב העשיר ב-[C4mim]BF4-בריכוז גבוה של [C4mim]BF4 עקב הזיקה הגבוהה בין ACT ל-[C4mim]BF4. לפיכך, ACT הוצא בקלות בשלב העשיר של [C4mim]BF4- על ידי הגדלת ריכוז [C4mim]BF4. עם זאת, מעל ריכוז [C4mim]BF4 של 50 אחוזי משקל, הצמיגות של ה-IL-ATPS עלתה, וכתוצאה מכך העברת מסה לקויה למיצוי. לפיכך, הריכוז האופטימלי [C4mim]BF4 להפקת ACT היה 50 אחוזי משקל.

3.2.3. השפעת ריכוז תמיסת המדגם

ריכוז תמיסת הדגימה היה תנאי חשוב ל-ACT(Acteoside)הוֹצָאָה. איור 4 (ג) מציג את ההשפעה של ריכוז תמיסת המדגם על יעילות המיצוי, מקדם החלוקה והסלקטיביות, מה שיכול לשקף את יכולת ההגירה של ACT בין השלב העליון והתחתון. איור 4 (ג) מראה שיעילות החילוץ, מקדם החלוקה והסלקטיביות של ACT(Acteoside)גדל עם הגדלת ריכוז תמיסת הדגימה מ-{{0}}.5 ל-2.5 מ"ג/מ"ל. עם זאת, ביצועי מיצוי ה-ACT ירדו מעט עם עלייה נוספת בריכוז תמיסת הדגימה מ-2.5 ל-3.0 מ"ג/מ"ל. ריכוז תמיסת דגימה גבוה קידם את המסיסות של ACT(Acteoside)בשלב העשיר של [C4mim]BF4- בשל הזיקה החזקה בין ACT ל-[C4mim]BF4.

ניתן לייחס את הירידה בביצועי המיצוי לסיבות הבאות: מצד אחד, עלייה מוגזמת בריכוז תמיסת הדגימה לא שיפרה את ביצועי המיצוי של IL-ATPS כאשר השלב העשיר ב-[C4mim]BF4- כבר היה רווי ב-ACT. מצד שני, עלייה בריכוז תמיסת הדגימה גרמה לשיפור של קשרי מימן תוך מולקולריים וצבירה של ACT(Acteoside)מולקולות, מה שלא היה תורם להעברת מסה. לפיכך, ריכוז תמיסת הדגימה האופטימלי נקבע כ-2.5 מ"ג/מ"ל.

3.2.4. השפעת ריכוז (NH4)2SO4

ההשפעה של ריכוזי (NH4)2SO4 שונים על יעילות המיצוי, מקדם החלוקה והסלקטיביות מוצגות באיור 4 (ד). תוצאת הניסוי הראתה ששלושת הפרמטרים עלו עם עלייה בריכוז (NH4)2SO4 מ-2.22 ל-11.11 אחוזי משקל. עם זאת, ביצועי מיצוי ה-ACT ירדו עם עלייה נוספת בריכוז תמיסת הדגימה מ-11.11 ל-16.66 אחוזי משקל.

ניתן לייחס זאת לאפקט ההמלחה, שהיא תכונה מרכזית לחילוץ ACT(Acteoside)in the [C4mim]BF4-rich phase. The increase in (NH4)2SO4 concentration can increase the salting-out effect, resulting in a decrease in the solubility of ACT in the(NH4)2SO4–rich phase, which favors ACT extraction in the [C4mim]BF4-rich phase. However, an excessive increase in the(NH4)2SO4 concentration (>11.11 אחוז משקל ) הביא לירידה בתכולת המים של השלב העשיר ב-[C4mim]BF4-, דבר שיחליש את הזיקה שלו ל-ACT. זה גרם לירידה ביעילות המיצוי, במקדם החלוקה ובסלקטיביות. לכן, הריכוז האופטימלי (NH4)2SO4 היה 11.11 אחוזי משקל.

3.2.5. השפעת ה-pH

השפעת ה-pH על ACT(Acteoside)יעילות מיצוי, מקדם חלוקה וסלקטיביות ב-IL-ATPS נחקרו בטווח pH 2.0-7.0. כפי שנצפה באיור 4 (ה), שלושת פרמטרי המיצוי עלו ככל שה-pH עלה מ-2.0 ל-6.0. עם זאת, ביצועי החילוץ ירדו ב-pH של 7.0.

מצד אחד, הגליקוזידים של פנולים חומציים של ACT(Acteoside)יהיה יציב בסביבה חומצית, בעוד שהוא יתנתק בתמיסות אלקליות [6]. מצד שני, ACT יכול לעבור יינון לפי שיווי המשקל HA $ H פלוס פלוס A בערכי pH שונים [33], בהיותו הצורה הלא מייננת הנוטה להיכנס לפאזה העשירה ב-IL המועדפת בתנאים חומציים. לפיכך, ניסוי המיצוי צריך להתבצע בסביבה חומצית בינונית ב-pH האופטימלי של 6.

3.2.6. השפעת זמן החילוץ

השפעת זמן המיצוי על ה-ACT(Acteoside) extraction efficiency, partition coefficient, and selectivity were explored in the range of 10–200 min. As can be seen from Fig. 4 (f), the ACT extraction performance increased with the extraction time, and the maximum extraction efficiency (>99%), partition coeffificient (>35), and selectivity (>225) התקבלו לאחר 130 דקות. בנוסף, ACT(Acteoside)נמצא כיציב במיקרו-סביבה חומצית חלשה במשך זמן רב. לכן, 130 דקות נבחרו כזמן המיצוי האופטימלי.

3.3. מנגנון של מיצוי ACT עם [C4mim]BF4–(NH4)2SO4 ATPS

3.3.1. ניתוח FTIR

איור 5 מציג את ספקטרום ה-FTIR של ACT(Acteoside), [C4mim]BF4 והשלב העשיר של [C4mim]BF4-. כפי שמוצג בספקטרום FTIR של [C4mim] BF4, ניתן לייחס את הפסגות ב-3162 ו-3122 ס"מ 1 לרטט המתיחה הסימטרי של CAH ולרטט המתיחה הא-סימטרי של CAH מהאימידאזול, בהתאמה. ניתן להקצות את הרצועה ב-1012 ס"מ 1 לרטט המתיחה של BF4-.

בספקטרום ה-FTIR של השלב העשיר [C4mim]BF4-, לא הופיעו פסגות חדשות בהשוואה לספקטרום ה-FTIR של ACT(Acteoside)ו-[C4mim]BF4. עם זאת, השיא האופייני של BF4- ב-1012 ס"מ- 1 עבר לתדר גבוה יותר עקב קשר המימן בין ACT לאטומי F. יתר על כן, השיאים האופייניים של CAH ב-3162 ו-3122 ס"מ 1 עברו לתדרים נמוכים יותר. ניתן לייחס זאת לשתי סיבות: (1) היווצרות של קשר מימן בין ACT לאטום N ב-[C4mim] פלוס, ו-(2) היווצרות של ערימה p–p בין טבעת הבנזן של ACT לטבעת האימידאזול. של [C4mim] פלוס . תוצאה זו הייתה עקבית עם תוצאות הסימולציה המולקולרית.

איור 5. ספקטרום FTIR של ACT, [C4mim]BF4 והשלב העשיר של [C4mim]BF4-.

3.3.2. סימולציה מולקולרית

כדי לחקור את מנגנון החילוץ, מצבי אינטראקציה אפשריים בין ACT(Acteoside)ו-[C4min] plus , BF4- ו- H2O נחקרו באמצעות סימולציות מולקולריות. איור 6 מציג את מצבי האינטראקציה האופטימליים וקונפורמציה מחייבת של ACT–[C4min] פלוס, ACT–BF4 ו-ACT–H2O. כפי שמוצג באיור 6a–h, ACT ו-[C4mim] פלוס הראו שתי קונפורמציות מחייבות אופטימליות, כלומר, ACT–[C4mim] פלוס –1 ו-ACT–[C4mim] פלוס –2, ל-ACT ו-BF4 הייתה קונפורמציה אופטימלית אחת. , ACT–BF4-, ול-ACT ו-H2O היו חמש קונפורמציות הקישור האופטימליות ACT–H2O–1, ACT–H2O–2, ACT–H2O–3, ACT–H2O–4 ו-ACT–H2O–5.

יתר על כן, ניתן להפעיל את אנרגיית הקישור כדי להסביר את האינטראקציות בין שתי מולקולות. על פי תוצאות הסימולציה המולקולרית, אנרגיות הקישור של ACT–[C4mim] פלוס –1, ACT–[C4mim] פלוס –2, ACT–BF4 , ACT–H2O–1, ACT–H2O–2, ACT–H2O–3 , ACT–H2O–4 ו-ACT–H2O–5 היו - 129.71, - 136.53,-130.82, - 60.78, - 53 .00, - 76.76, -66.55 ו--53.49 kJ/mol, בהתאמה. ערכים אלו מצביעים על כך שאנרגיית הקישור של עם [C4mim]BF4 הייתה חזקה יותר מזו של מולקולות H2O. לפיכך, ל-ACT הייתה זיקה גבוהה ל-[C4mim]BF4 ונכנס בקלות לשלב העשיר ב-[C4mim]BF4.

כדי להמשיך ולחקור את האינטראקציות בין המולקולות השונות, אופני האינטראקציה של ACT–[C4min] פלוס , ACT–BF4- ו-ACT–H2O הומחשו באמצעות ניתוח IGM. כפי שמוצג באיור 6a, ו-b, האינטראקציה בין ACT(Acteoside)ו-[C4mim] פלוס כללו בעיקר קשרי מימן וכוחות ואן דר ואלס. בנוסף, ACT–[C4mim] פלוס –1 ו-ACT–[C4mim] פלוס –2 הציגו מאפיינים קונפורמטיביים דומים, כאשר טבעת הבנזן של ACT וטבעת האימידאזול של [C4mim] פלוס מקבילות זו לזו וממוקמות במרחק של כ-4 Å. זה מצביע על קיומה של אינטראקציה של ערימת אפליקציות בין ACT(Acteoside)ו[C4mim] פלוס [43]. איור 6c מגלה את נוכחותם של קשרי מימן חזק ואינטראקציות של ואן דר וואלס בין ACT ו-BF4-. יתרה מכך, כפי שמוצג באיור 6d–h, כאשר ACT הומס ב-H2O, מולקולות ACT ו-H2O היו קשורות בעיקר באמצעות קשרי מימן ו-van der Waals. לפיכך, על בסיס המאפיינים הקונפורמטיביים וערכי האנרגיה המחייבת, ניתן להסיק ש-ACT הופק בשלב העשיר [C4mim]BF4- באמצעות קשרי מימן, אינטראקציות של ואן דר ואלס וערימה p - p.

איור 6. ניתוח IGM של אינטראקציות ACT–[C4min] פלוס, ACT–BF4- ו-ACT–H2O: (א) ACT–[C4mim] פלוס –1, (ב) ACT–[C4mim] בתוספת –2, (ג) ACT–BF4 , (ד) ACT–H2O–1, (ה) ACT–H2O–2, (f)ACT–H2O–3, (ז) ACT–H2O–4, ו-(h) ) ACT–H2O–5.

3.4. מיצוי תמצית גולמית

בתנאי מיצוי אופטימליים, נעשה שימוש ב-IL-ATPS כדי לחקור את המיצוי של תמצית גולמית. כפי שמוצג בטבלה 1, IL-ATPS יכול לחלץ ACT ביעילות(Acteoside)מתמצית גולמית שלCistanchetubulosaלשלב העשיר ב-IL, ול-IL-ATPS כמעט ואין שינוי בביצועי החילוץ של ACT(Acteoside)מהתמצית הגולמית בהשוואה לביצועי המיצוי של התמיסה הסטנדרטית. לכן, שיטה זו יכולה לחלץ ACT ביעילות(Acteoside)מהתמצית הגולמית שלCistanchetubulosa, שיכול לספק התייחסות למיצוי של מרכיבים ביו-אקטיביים בעתיד.

3.5. הפרדה של ACT משלב עשיר ב-IL

שיטות מיצוי ממס וספיחה לשחזור ACT(Acteoside)והשימוש החוזר ב-IL נחקר בסעיף זה. ראשית, ממיסים אורגניים נשקלו למיצוי אחורי, כגון n-בוטנול (NBA), אתיל אצטט (EA), איזופנטניל (IPA) וכלורופורם (CR). עם זאת, יעילות ההחלמה של מיצויים אורגניים הייתה נמוכה, כפי שמוצג באיור 7. יתרה מכך, מספר רב של מיצויים אורגניים נדיפים שימשו למיצוי חזרה, מה שישפיע על התכונה ה''ירוקה'' של תהליך ההפרדה.

שיטת הספיחה נבחרה להפרדת ה-ACT(Acteoside)מהשלב העשיר ב-IL, כגון פחמן מזופורי מסודר (CMK-3), גרפן (GR) וננו-צינוריות פחמן חד-קיר (SWCNT). השלב העשיר ב-IL לאחר מיצוי IL-ATPS היה מדולל 10 פעמים במים מפוזרים. יעילות ההתאוששות של שלושת הסופחים לעיל הושוו עבור ACT באותם תנאי ספיחה כדלקמן: יחס מוצק-נוזל של 1:1 (מ"ג/מ"ל), 303 K ו-12 שעות.

כפי שמוצג באיור 7, השחזור של SWCNT היה טוב יותר מזה של CMK-3 ו-GR. בנוסף, יעילות הספיחה של ACT(Acteoside)יכול להגיע ל-95.3 אחוזים באמצעות מתנול, חומצה אצטית ומים טהורים במיוחד עם יחס נפח של 1:1:8 ב-318 K. לכן, ניתן להשתמש ב-SWCNT להחלמה של ACT מהשלב העשיר ב-IL.

איור 7. השפעת סוג עם חומרים מיצויים וסופחים שונים להפרדה של ACT(Acteoside)מהשלב העשיר ב-IL.

4. מסקנות

במחקר זה, שיטה פשוטה ויעילה המבוססת על IL-ATPS למיצוי ACT(Acteoside)מהתמציות הגולמיות שלCistanche tubulosaפותחה בהצלחה. ה-IL-ATPS האופטימלי נקבע כ-[C4mim]BF4–(NH4)2SO4, ותנאי המיצוי האופטימליים היו טמפרטורת מיצוי של 278 K, ריכוז IL של 50 אחוזי משקל , ריכוז תמיסת דגימה של 2.5 מ"ג/מ"ל, ריכוז מלח של 11.11 אחוזי משקל, pH של 6.0 וזמן שיווי משקל של מיצוי של 130 דקות. בתנאי החילוץ האופטימליים, יעילות החילוץ, מקדם החלוקה והסלקטיביות של ACT(Acteoside)נמצאו 99.78 אחוז ± 0.84 אחוזים, 33.82 ± 1.82 ו-230.51 ± 8.26, בהתאמה. לכן, לסיכום, מערכת [C4mim]BF4-(NH4)2SO4 מציעה שיטה פשוטה ויעילה להפרדה סלקטיבית מאוד של ACT מהתמציות הגולמיות שלCistanchetubulosa. המלח החומצי (NH4)2SO4 מספק מיקרו-סביבה חומצית חלשה להבטחת היציבות של ACT(Acteoside)בשלב העשיר של [C4mim]BF4-. יתרה מכך, הקוטביות הגבוהה של [C4mim]BF4 בעל קולטנים לקשר רב מימן תורמת למיצוי ACT בשלב העשיר ב-[C4mim]BF4-. לבסוף, הוכח שהאינטראקציות ACT ו-[C4mim]BF4 כוללות קשרי מימן, כוחות ואן דר ואלס וערימה p-p. מחקר זה מספק תובנות למחקר עתידי על הפרדה סלקטיבית מאוד של תרכובות פנוליות מצמחים טבעיים.

הצהרת תרומת הכותבים של CrediT

הלין שו: מושגיות, מתודולוגיה, חקירה, אצור נתונים, כתיבה - טיוטה מקורית, כתיבה - סקירה ועריכה. Xue qin Li: מושג, ניהול פרויקטים, כתיבה - סקירה ועריכה, פיקוח. Yanyan Hao: אצור נתונים, כתיבה - סקירה ועריכה. Xiaobin Zhao: משאבים, ניתוח פורמלי. YunCheng: משאבים, ניתוח פורמלי. Jinli Zhang: ניהול פרויקטים, כתיבה - סקירה ועריכה.

הצהרת עניין מתחרה

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים או קשרים אישיים ידועים שהיו עשויים להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן האזורית למדע של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [מספר מענק22068032]; הקרן הלאומית למדעי הטבע למדענים צעירים של סין [מספר מענק 21706166]; תוכנית למנהיגי חדשנות מדעית וטכנולוגית צעירים ובני גיל הביניים בבינגטואן [מספר מענק 2019CB024]; התוכנית לכשרונות חדשניים צעירים של אוניברסיטת שיהזי [מספר מענק CXRC201802]ופרויקט המדע והטכנולוגיה הגדול של Xinjiang Bingtuan[מספר מענק 2017AA007/01]. אנו רוצים להודות למרכז הניתוח והבדיקה של אוניברסיטת שיהזי על המיקרוסקופיה והמיקרואנליזה של הדגימות שלנו.

אנתוציאנין

הפניות

[1] X. Wang, X. Wang, Y. Guo, קביעה מהירה בו זמנית של שישה רכיבים יעילים בCistanchetubulosaעל ידי ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום, Molecules 22 (2017) 843, https://doi.org/10.3390/molecules22050843.

[2] Y. Yan, Q. Song, X. Chen, J. Li, P. Li, Y. Wang, T. Liu, Y. Song, P. Tu, קביעה סימולטנית של רכיבים בעלי קוטביות וטווחי תוכן רחבים בCistanchetubulosaבאמצעות כרומטוגרפיה של אינטראקציה אינטראקציית שלב הפוכה-הידרופילי-צמוד סדרתי-טנדם ספקטרומטריית מסה, J. Chromatogr. 1501 (2017) 39–50
[3] W. Zhang, J. Huang, W. Wang, Q. Li, Y. Chen, W. Feng, D. Zheng, T. Zhao, G. Mao, L. Yang, X. Wu, מיצוי, טיהור , אפיון ופעילויות נוגדות חמצון של פוליסכרידים מCistanchetubulosa, Int. ג'יי ביול. מקרומול. 93 (2016) 448–458,
[4] Y. Song, Q. Song, J. Li, N. Zhang, Y. Zhao, X. Liu, Y. Jiang, P. Tu, אסטרטגיה משולבת להבחנה כמותית בין כימום בין Cistanche deserticola ו-C. tubulosa באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים – ספקטרומטריית מסה מלכודת יונים משולשת משולשת קוודרופול ליניארית, J. Chromatogr. 1429 (2016) 238–247
[5] W. Pei, R. Guo, J. Zhang, X. Li, Extraction of phenylethanoid glycosides fromCistanche tubulosaעל ידי מיצוי הומוגניזציה גזירה במהירות גבוהה, J. AOAC Int. 102 (2019) 63–68
[6] H. Xu, W. Pei, X. Li, J. Zhang, Highly efficient adsorption of phenylethanoid glycosides on carbon mesoporous, Front. Chem. 7 (2019)
[7] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang, YW Cheng, הערכת בטיחות שלCistanchetubulosaזיכרון מוצר מזון בריאות: גנוטוקסיות ו28-בדיקת רעילות במינון חוזר, Food Chem. טוקסיקול. 118 (2018) 581–588
[8] YJ Shiao, MH Su, HC Lin, CR Wu, Echinacoside משפר את ליקוי הזיכרון והחסר הכולינרגי הנגרם על ידי פפטידים עמילואיד-בטא באמצעות עיכוב של שקיעת עמילואיד ורעילות, Food Funct. 8 (2017) 2283-2294

[9] H. Shimada, Y. Urabe, Y. Okamoto, Z. Li, A. Kawase, T. Morikawa, P. Tu, O. Muraoka, M. Iwaki, המרכיבים העיקריים שלCistanchetubulosa, echinacoside ואקטאוזיד, מעכבים תאי גלוקוז קוטרנספורטר תלוי נתרן 1-מתווך ספיגת גלוקוז על ידי תאי אפיתל מעיים, J. Funct. מזונות 39 (2017) 91–95

[10] W. Li, R. Deng, X. Jing, J. Chen, D. Yang, J. Shen,אקטאוזידמשפר דלקת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיוני באמצעות עיכוב הפעלת מיטופאגיה בתיווך פרוקסיניטריט, Free Radicals Biol. Med. 146 (2020) 79–91,

[11] A. He, B. Dong, X. Feng, S. Yao, מיצוי של ספונינים של ג'ינסנג ביואקטיביים באמצעות מערכות מימיות דו-פאזיות של נוזלים ומלחים יוניים, ספט' פוריף. טכנול. 196 (2018) 270–280
[12] E. Suarez Garcia, CA Suarez Ruiz, T. Tilaye, MHM Eppink, RH Wijffels, C. van den Berg, Fractionation of proteins and carbohydrates from rude micro-anges using a aqueous two-phase system, Sep. פוריף. טכנול. 204 (2018) 56–65,
[13] L. Wang, W. Li, Y. Liu, W. Zhi, J. Han, Y. Wang, L. Ni, Green separation of bromelain in sample food with retret high of enzyme using aqueous two- מערכת פאזות המכילה קופולימר ומלח מסונתזים חדשים, Food Chem. 282 (2019) 48–57
[14] A. Tighrine, Y. Amir, P. Alfaro, M. Mamou, C. Nerín, מיצוי וניתוח סימולטני של חומרים משמרים וממתיקים מלאכותיים במיצים על ידי המלחה של שיטת מיצוי נוזל-נוזל לפני כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד. , Food Chem. 277 (2019) 586–594

[15] H. Shaker Shiran, M. Baghbanbashi, F. Ghazizadeh Ahsaie, G. Pazuki, Study of curcumin partitioning in polymer-salt water two-phase systems, J. Mol. Liq. 303 (2020) 112629

[16] X. Wu, R. Li, Y. Zhao, Y. Liu, Separation of polysaccharides from Spirulina platensis על ידי HSCCC עם אתנול-אמוניום סולפט ATPS ופעילויות נוגדות החמצון שלהם, Carbohydr. Polym. 173 (2017) 465–472

[17] VP Priyanka, RL Gardas, נוזלים יוניים מונו ודידיקיים מבוססי מערכות דו-פאזיות מימיות למיצוי נתרן דיקלופנק, ספט' פוריף. טכנול. 234 (2020) 116048
[18] J. Flieger, A. Czajkowska-Zelazko, מערכת דו-פאזית מימית המבוססת על נוזל יוני לבידוד כינין מדגימת פלזמה אנושית, Food Chem. 166 (2015) 150–157
[19] X. Zhang, G. Teng, J. Zhang, מערכת דו-פאזית מימית אתנול/מלח מבוססת מיצוי בסיוע קולי של פוליסכרידים מ- Lilium David Ivar. unicolor Salisb: אפיון פיזיקוכימי ותכונות אנטי-גליקציה, J. Mol. Liq. 256 (2018) 497–506,
[20] Q. Liu, X. Chen, Y. Guo, C. Han, J. Li, L. Jia, J. Liu, X. Wei, מחקר תרמודינמי של מערכות דו-פאזיות מימיות של 1- butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate and sodium dodecylbenzene sulfonate, J. Mol. Liq. 279 (2019) 18–22,
[21] DCV Belchior, MV Quental, MM Pereira, CMN Mendonça, IF Duarte, MG Freire. טכנול. 233 (2020)

[22] CA Suarez Ruiz, J. Kwaijtaal, OC Peinado, C. van den Berg, RH Wijffels, MHM Eppink, Multi-Step fractionation of micro-algal biomolecules using aqueous water two-phase systems, ACS Sustainable, Chem. Eng. 8 (2020) 2441–2452,

[23] AW Vieira, G. Molina, AB Mageste, GD Rodrigues, LR de Lemos, Partitioning of Salicylic and Acetylsalicylic acid by waterous two-phase systems: Aspects מנגנון ומחקר אופטימיזציה, J. Mol. Liq. 296 (2019) 111775
[24] L. Ran, C. Yang, M. Xu, Z. Yi, D. Ren, L. Yi, מיצוי מימי דו-פאזי משופר של פרואנטוציאנידינים מזרעי ענבים על ידי שימוש בנוזלים יוניים כתוספים, Sep. Purif. טכנול. 226 (2019) 154–161

[25] LA Mejía-Manzano, BA Barba-Dávila, P. Vázquez-Villegas, SO SernaSaldívar, J. González-Valdez, מיצוי משופר של הפריסטמירין הטבעי אנטי-סרטני מקליפת שורש Mortonia greggii באמצעות ממיסים ירוקים ומערכות דו-פאזיות מימיות, ספטמבר פוריף. טכנול. 211 (2019) 667–672