כיצד משפיע Cistanche Deserticola Polysaccharide על ספיגת העצם?

איש קשר: אודרי הוaudrey.hu@wecistanche.com

Cistanche deserticola polysaccharide מחליש אוסטאוקלסטוגנזה וספיגת עצם באמצעות עיכוב איתות RANKL וייצור מיני חמצן תגובתיים

דז'י סונג ואח'

אוסטאופורוזיס היא מחלה מטבולית המאופיינת באוסטיאופניה והידרדרות מיקרוסטרוקטורלית של העצם. אוסטאוקלסטים הם תאי המשפיעים העיקריים המפרקים את מטריצת העצם ותפקודם הבלתי תקין מוביל להתפתחות אוסטאופורוזיס. הצטברות מיני חמצן תגובתיים (ROS) במהלך מטבוליזם תאי מעודדת התפשטות והתמיינות של אוסטאוקלסטים, ולכן, ממלאת תפקיד חשוב באוסטיאופורוזיס.Cistancheמדבריתפוליסכריד(CDP) בעל אנטי גידול,אנטי דלקתי, ופעילות נוגדת חמצון. עם זאת, ההשפעה של CDPon osteoclasts אינה ברורה. במחקר זה, נעשה שימוש בצביעת חומצה פוספטאז עמידה לטרטרטים, אימונופלואורסצנטיות, תגובת שרשרת של שעתוק הפוכה-פולימראז וניתוח ווסטרנבלוט כדי להדגים ש-CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)מעכב אוסטאוקלסטוגנזה וספיגת הידרוקסיאפטיט. בנוסף, CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)גם עיכב את הביטוי של גנים של סמן אוסטאוקלסט כולל Ctsk, Mmp9 ו-Acp5, ולא השפיע על מפעיל הקולטן של ביטוי גורם גרעיני κB (RANK). ניתוחים מכאניסטיים חשפו ש-CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)מגביר את הביטוי של אנזימים נוגדי חמצון כדי להחליש את ייצור ROS בתיווך RANKL באוסטאוקלסטים ומעכב את הגורם הגרעיני של תאי T מופעלים והפעלת חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-CDP עשוי לייצג תרופה מועמדת לטיפול באוסטיאופורוזיס הנגרמת כתוצאה מפעילות יתר של אוסטאוקלסטים.

מילות מפתחספיגת עצם,Cistancheמדבריתפוליסכריד, MAPK, אוסטאוקלסט, מיני חמצן תגובתיים

1|מבוא

האיזון בין יצירת עצם, בתיווך אוסטאובלסטים, לבין ספיגת עצם, בתיווך אוסטאוקלסטים, ממלא תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס מטבולי של העצם (Manolagas, 2000; Zhuet al., 2018). כאשר ספיגת העצם עולה על היווצרות העצם, מתרחשת אוסטאופורוזיס, המתאפיינת בהפחתת מסת העצם ונזק מיקרו-מבני עצם (Ikeda, 2008). אוסטאופורוזיס היא מחלה נפוצה בקרב קשישים ונשים לאחר גיל המעבר והפתוגנזה שלה לא הובהרה במלואה (Cooper & Melton, 1992). מחסור באסטרוגן הוא הגורם העיקרי לאוסטאופורוזיס (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). בנוסף, מיני חמצן תגובתיים (ROS) ניתנים להשראה על ידי מפעיל קולטן של ליגנד גורם גרעיני κB (RANKL) והם קשורים להיווצרות אוסטאוקלסטים (Yip et al., 2005), ובכך עשויים לתרום להתפתחות אוסטאופורוזיס (Manolagas, 2010). כמה מחקרים מצאו כי מחסור בנוגדי חמצון ב-Nrf2 מגביר את רמות ה-ROS ומקדם התמיינות אוסטאוקלסטים המושרה על ידי RANKL (Hyeon, Lee, Yang, &Jeong, 2013). לכן, יש להעריך הפחתת ייצור ROS במהלך הבחנה אוסטאוקלסטית כאסטרטגיה טיפולית לטיפול באוסטיאופורוזיס.

אוסטאוקלסטים נגזרים מהשושלת המונוציטית או המקרופאג-המטופואטית והם התאים מרובי הגרעינים היחידים שמבצעים ספיגת עצם (Teitelbaum, 2000). לכן, למחקר הכרוך ביצירת אוסטאוקלסטים יש משמעות רבה בפיתוח טיפולים יעילים למחלות מטבוליזם של עצם (Lorenzo,2017). גורם מגרה מושבה מקרופאג (M-CSF) ו-RANKL, המיוצרים על ידי אוסטאובלסטים ותאי T משופעלים, הם ציטוקינים חשובים המווסתים אוסטאוקלסטוגנזה (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL משרה ביטוי של גורם גרעיני של תאי T משופעלים (NFATc1), שהוא גורם שעתוק קריטי הפעיל במהלך היווצרות אוסטאוקלסטים (Ishidaet al., 2002). NFATc1 מופעל מקדם את הביטוי של גנים לסמן אוסטאוקלסטים כגון חומצה פוספטאז עמידה לטרטרטים (TRAcP) וקאתפסין K (CTSK) המווסתים אוסטאוקלסטוגנזה ותפקוד אוסטאוקלסטים (Balkan et al., 2009; Crottiet al., 2008).

Cistancheמדבריתפוליסכריד(CDP) מבודד מהגבעולים הבשרניים שלCistancheוהוא בעל ויסות חיסוני, אנטי-גידול, אנטי-הזדקנות והשפעות פרמקולוגיות אחרות (Guo et al.,2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)הייתה השפעה מעכבת על ייצור תחמוצת חנקן (NO) המושרה על ידי ליפופוליסכריד בתאי moussemicroglial (תאי BV-2; Nan et al., 2013). בנוסף, תמצית עשירה באפנילתנואידים (ECD) שלCistancheשפר את יכולת השחייה של עכברים על ידי הפחתת הנזק לשרירים, עיכוב הצטברות חומצת החלב ושיפור אגירת האנרגיה (Cai et al., 2010). עם זאת, ההשפעות של CDP על תפקוד האוסטאוקלסט והפעילות נותרו בלתי ידועות.

במחקר זה, הדגמנו כי CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)מעכב התמיינות RANKL-inducedosteoclast וספיגת עצם. המנגנון הבסיסי היה ה-CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)משפר את הביטוי של אנזימים נוגדי חמצון כדי להחליש את ייצור ROS, ולאחר מכן מדכא את מפלי האיתות של RANKL-activatedNFAT ו-MITogen-activated protein kinase (MAPK). תוצאות אלו מצביעות על כך ש-CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)עשוי לשמש לטיפול באוסטיאופורוזיס הנגרמת על ידי ספיגת עצם אוסטאוקלסטית מוגזמת.

cistanche

2|חומרים ושיטות

2.1|חומרים

CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)(טוהר > 98 אחוזים) נרכש מ-Solarbio (בייג'ינג, סין) והוכן בריכוז מלאי של 1 mM ב-PBS (מלוחים מבופרים בפוספט). נוגדנים ספציפיים עבור c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2,TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, פוספוריל (p)-ERK, p-p38, p-JNK ו-אקטין התקבלו מסנטה קרוז ביוטכנולוגיה (סן חוזה, קליפורניה). נוגדנים ל-V-ATPase d2 הופקו כפי שתואר קודם (H. Feng et al., 2009). מערכת הבדיקה 3-(4,5-דימתיל-תיאזול-2-איל)-5-(3-קרבוקסי-מתוקסיפניל)-2-(4-סולפופניל)-2H-טטרזוליום (MTS) ו-Luciferase התקבלה מ-Promega (סידני, אוסטרליה). M-CSF רקומביננטי נרכש מ-R&D Systems (Minneapolis, MN). חלבון GST-rRANKL רקומביננטי הובע וטיהור כפי שתואר קודם (Xu et al., 2000).

2.2|תרבית תאים

תאי RAW264.7 (תאי מקרופאג עכברים) התקבלו מאוסף American Type Culture (ATCC, Manassas, VA) ותופחו במדיום חיוני מינימלי שונה (Thermo FisherScientific, Scoresby, אוסטרליה) בתוספת 10 אחוז בקר עוברי, 2 mM L-גלוטמין , 100 U/ml של פניצילין, ו-100 U/mL ofstreptomycin (מדיום שלם). מונוציטים שמקורם במח עצם (BMMs) בודדו מעכברי C57BL/6J בני 6 שבועות, אשר הומתנו על פי נהלים שאושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת מערב אוסטרליה (RA/3/100/1244). נותח ללא רקמות רכות ומח העצם נשטף מעצם הירך והשוק, אשר תורבה לאחר מכן במדיום שלם בנוכחות M-CSF (50 ננוגרם/מ"ל).

2.3|בדיקת אוסטאוקלסטוגנזה

BMMs צופו בצלחות תרבית של 96 בארות בצפיפות של 6 × 103 תאים לבאר וטופלו במדיום שלם המכיל M-CSF (50 ng/ml) ו- GST-rRANKL (100 ng/ml), בנוכחות או בהעדר. ריכוזים שונים של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>שלושה גרעינים) זוהו כאוסטאוקלסטים.

2.4|מבחני ציטוטוקסיות

BMMs נזרעו לתוך צלחות של 96 בארות ב-6 × 103 תאים לבאר ושאריות לילה כדי להיצמד. למחרת, התאים הודגרו עם ריכוזים משתנים של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד). לאחר 48 שעות נוספות, נוספה תמיסת MTS (20 μl/באר) והודגרה עם תאים למשך 2 שעות. הספיגה ב-490 ננומטר נקבעה עם קורא מיקרו-לוחיות (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|צביעה אימונופלואורסצנטית

BMMs נזרעו בצפיפות של 6 × 103 תאים לבאר בנוכחות M-CSF (50 ng/ml) למשך הלילה. לאחר מכן עוררו תאים עם M-CSF ו-GST-rRANKL (100 ng/ml) עד שנוצרו אוסטאוקלסטים בוגרים. לאחר מכן טופלו תיאוסטאוקלסטים בריכוזים משתנים של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)למשך 48 שעות לפני קיבוע עם 4 אחוז פרפורמלדהיד, חדירות עם 0.1 אחוז Triton X-100-PBS, וחסימה עם 3 אחוז אלבומין בסרום בקר ב-PBS. תאים מוכנים הודגרו עם פאלואידין מצומד לרודמין למשך 45 דקות כהה לכתם עבור F-אקטין. לאחר מכן נשטפו התאים עם PBS, גרעינים שנצבעו נגדי ב-4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), והורכבו עם כיסויי כיסוי למיקרוסקופיה קונפוקלית.

cistanche

2.6|בדיקת ספיגה של הידרוקסיאפטיט

כדי למדוד פעילות אוסטאוקלסטים BMMs (1 × 105 תאים לבאר) שהורכבו על צלחות מצופות קולגן עם שש בארות (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) עוררו עם GST-rRANKL (100 ng/ml) ו- M-CSF (50 ng/ml) ) עד שנוצרו אוסטאוקלסטים בוגרים (Zhou et al., 2016). לאחר מכן נותקו תאים בעדינות מתמיסת ניתוק התאים (Sigma-Aldrich) ומספר שווה של אוסטאוקלסטים בוגרים הוזרעו על גבי בארות בודדות בצלחות 96-בארים מצופות הידרוקסיאפטיט (Corning Osteoassay, Corning, NY). אוסטאוקלסטים בוגרים הודגרו במדיום המכיל GST-rRANKL ו-M-CSF עם או בלי CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)בריכוזים המצוינים. לאחר 48 שעות, מחצית מהבארות נצבעו אימונוהיסטוכימית עבור פעילות TRAcP, כמתואר לעיל, כדי להעריך את מספר התאים מרובי הגרעינים לבאר. הבארות הנותרות הולבינו במשך 10 דקות כדי להסיר תאים ולאפשר מדידה של האזורים שנספגו. אזורים שנספגו צולמו במיקרוסקופ אור סטנדרטי ותוכנת Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD) שימשה כדי לכמת את אחוז השטח של פני השטח הידרוקסיאפטיט שנספג על ידי האוסטאוקלסטים.

2.7|מבחני כתב לוציפראז

כדי לחקור הפעלת תעתוק של NFATc1, תאי RAW264.7 הועברו ביציבות עם מבנה luciferasereporter המגיב ל-NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). תאים שעברו תרבית ב-48 צפיפות בארות של 1 .5 × 105 תאים לבאר ומטופלים מראש בריכוזים שונים של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)למשך שעה. לאחר טיפול מקדים, תאים עברו גירוי עם GST-rRANKL (100 ng/ml) למשך 24 שעות, ופעילות הלוציפראז נמדדה באמצעות מערכת בדיקת ה-luciferase reporter לפי פרוטוקול היצרן (Promega).

2.8|ניתוח כמותי הפוך-תעתק פולימראז תגובת שרשרת (RT-PCR).

RNA הכולל בודד מתאי באמצעות ריאגנט Trizol לפי פרוטוקול היצרן (Thermo Fisher Scientific). DNA משלים סונתז באמצעות טרנסקריפטאז הפוך של נגיף לוקמיה של עכברים Moloney עם 1 ug של תבנית RNA ו-oligo-dT פריימרים. הגברה של תגובת שרשרת פולימר של רצפים ספציפיים בוצעה באמצעות התוכנית הבאה: 94 מעלות למשך 5 דקות, ולאחר מכן 30 מחזורים של 94 מעלות למשך 40 שניות, 60 מעלות למשך 40 שניות ו-72 מעלות למשך 40 שניות, ושלב הארכה אחרון של 5 דקות בשעה 72 מעלות. המידע המפורט של פריימרים ספציפיים מוצג בטבלה 1. רמות RNA שליח יחסי חושבו על ידי נורמליזציה לביטוי של גן משק הבית Hmbs.

table 1

2.9|ניתוח כתם מערבי

BMMs תורבו במדיום שלם עם M-CSF בצלחות עם שש בארים וגוירו עם GST-rRANKL (100 ng/ml) לפרקים הנקובים. התאים עברו ליטוש במאגר תמוגה רדיואימוני וחלבונים נפתרו על ידי אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליקרילאמיד והועברו לממברנות פולי(וינילידן פלואוריד) (GE Healthcare,Silverwater, אוסטרליה). הממברנות נחסמו בחלב רזה של 5 אחוזים למשך שעה ולאחר מכן נבדקו עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים שונים עם ניעור עדין למשך הלילה ב-4 מעלות. ממברנות נשטפו ולאחר מכן הודגרו עם נוגדנים משניים מצומדים חזרת פרוקסידאז. לאחר מכן זוהתה תגובתיות נוגדנים עם ריאגנט כימי-לומינסצנציה משופר (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, ניו ג'רזי) והוצגה עם Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|זיהוי ROS תוך תאי

רמות ROS תוך-תאיות זוהו באמצעות ערכת זיהוי תאית ROS 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (Abcam, מלבורן, אוסטרליה). BMMs (5 × 103 תאים לבאר) תורבו בצלחות של 96 בארות וטופלו עם RANKL (100 ננוגרם/מ"ל), M-CSF (50 ננוגרם/מ"ל) ו-CDP במשך 72 שעות. רמות ROS תוך תאיות נמדדו באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate, אשר מתחמצן ל-DCF פלואורסצנטי בנוכחות ROS. תאים נשטפו במאגר של האנק והודגרו בחושך למשך 30 דקות עם 10 מיקרומטר של DCFH-DA. התמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

2.11|ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים מייצגים לפחות שלושה ניסויים שבוצעו ללא תלות אלא אם צוין אחרת. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD. ניתוח חד-כיווני של שונות ואחריו מבחני Student-Newman-Keulspost-hoc שימשו כדי לקבוע את המובהקות של ההבדלים בין התוצאות, כאשר p < 0.05="" נחשב="">

3|תוצאות

3.1|CDP מעכב RANKL-inducedosteoclastogenesis ואיחוי אוסטאוקלסט

כדי לקבוע אם CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)יכול לדכא אוסטאוקלסטפורמציה המושרה על ידי RANKL, ביצענו לראשונה בדיקת אוסטאוקלסטוגנזה באמצעות BMMs של עכברים (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMMs טופלו עם RANKL ו- M-CSF במשך 5 ימים עם ריכוזים גדלים של CDP. CDP הפחית את מספר התאים מרובי-גרעינים חיוביים ל-TRAcP כאשר הריכוז של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)הגיע ל-5 מיקרומטר ומעלה (איור 1a,b). להערכת CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)רעילות ולאשר שתוצאות אלו לא היו השתקפות של מוות תאי או מספר, ביצענו בדיקת MTS. BMMs טופלו עם RANKL ו- M-CSF במשך 48 שעות עם מינונים משתנים של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד). CDP לא השפיע על התפשטות BMM בריכוז של 15 µMor פחות (איור 1c).

כדי לבדוק את ההשפעות של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)בהיתוך אוסטאוקלסטים, אוסטאוקלסטים נוצרו עם טיפול RANKL ו-M-CSF, עם או בלי מינונים משתנים של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד). אוסטאוקלסטים נצבעו עם rhodamine-phalloidin ו-DAPI כדי להעריך את מספר הגרעינים לכל אוסטאוקלסט (איור 2a). גם מספר האוסטאוקלסטים וגם המספר הממוצע של גרעיני אוסטאוקלסט ירדו בעקבות CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)טיפול (5-10 מיקרומטר; איור 2b,c). לכן, CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)היו לו השפעות מעכבות על אוסטאוקלסטוגנזה המושרה על ידי RANKL ועל איחוי אוסטאוקלסט באופן תלוי מינון.

3.2|CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)מחליש את פעילות הספיגה של אוסטאוקלסטי הידרוקסיאפטיט המושרה על ידי RANKL

בדיקת ספיגה של הידרוקסיאפטיט בוצעה כדי לזהות את ההשפעה של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)על תפקוד אוסטאוקלסט (איור 3א). לאחר 24-hrincubation, מספר האוסטאוקלסטים לבאר לא השתנה בעוד שאזור הספיגה של הידרוקסיאפטיט ירד משמעותית על ידי טיפול עם 5 ו-10 µM CDP בהשוואה לקבוצות ביקורת (איור 3b,c). תוצאות אלו מראות כי CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)יש השפעות מעכבות חזקות הן על היווצרות אוסטאוקלסט והן על פעילות ספיגה של אוסטאוקלסט ללא כל השפעות ציטוטוקסיות.

3.3|CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)מעכב ביטוי גנטי של סמן אוסטאוקלסט

כדי להמשיך ולחקור את ההשפעות המעכבות של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)על אוסטאוקלסטוגנזה וספיגת עצם אוסטאוקלסטית, BMMs טופלו עם RANKL ו- M-CSF במשך 5 ימים עם ריכוזים משתנים של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)לאחר מכן בוצע .RT-PCR כדי לזהות את הביטוי של גנים אוסטאוקלסטמרקר. הביטוי של Nfatc1, גורם שעתוק מכריע במהלך אוסטאוקלסטוגנזה, עוכב על ידי CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)באופן תלוי מינון (איור 4א). בנוסף, CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)(5 ו-10 מיקרומטר) הורידו את הביטוי של גנים הקשורים לספיגת עצם, כולל Mmp9, Ctsk ו-Acp5 (איור 4b-d).

3.4|CDP מדכא פעילות NFATc1 וביטוי חלבון במורד הזרם

לבחון את ההשפעה של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)בפעילות NFATc1 המושרה על ידי RANKL, בוצע בדיקת aluciferase reporter. טיפול עם CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד), בריכוזים של 5 µM ומעלה, עיכבו באופן משמעותי את פעילות NFATc1 המושרה על ידי RANKL (איור 5a). בנוסף, ניתוח הכתם המערבי הראה כי CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)דיכא באופן משמעותי את ביטוי החלבון של NFATc1 ו-c-Fos ב-BMMs שטופלו ב-RANKL ו-M-CSF במשך 3 ו-5 ימים (איור 5b). יתר על כן, הביטוי של חלבונים הקשורים לתפקוד אוסטאוקלסטים, כגון V-ATPase-d2 ו-CTSK, היה מורד ויסות בנוכחות CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)בהשוואה לקבוצות ביקורת. עם זאת, ל-CDP לא הייתה השפעה על ביטוי RANK (איור 5b).

3.5|CDP מקדם את הביטוי של נוגדי חמצון אנטנזימים כדי לנקות את ייצור ROS במהלך אוסטאוקלסטוגנזה המושרה על ידי RANKL

כדי לחקור את המנגנון הבסיסי של עיכוב אוסטאוקלסטוגנזה תלויה ב-CDP, BMM טופלו ב-RANKL (100 ng/ml) ו-M-CSF (50 ng/ml) יחד עם PBS או CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)למשך 72 שעות. בדקנו את ההשפעה של CDP על ייצור ROS תוך תאי המופעל על ידי RANKL. רמות ROS תוך תאיות עלו על ידי טיפול RANKL, שהוחלש על ידי CDP (5 ו-10 מיקרומטר; איור 6א). גם מספר התאים החיוביים ל-ROS וגם עוצמת צביעה של ROS ירדו על ידי טיפול ב-CDP באופן תלוי מינון (איור 6b,c). ניתוח הכתם המערבי הראה כי CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)קידם ביטוי של thioredoxin (TRX1) וגלוטתיון רדוקטאז (GSR) תוך דיכוי הביטוי של סינתאז תחמוצת החנקן הניתנת להשראה (NOS2) ב-BMMs שטופלו ב-RANKL ו-M-CSF במשך 3 ימים (איור 6ד).

כדי להמשיך ולחקור אם CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)דיכא את ההתמיינות של אוסטאוקלסטים על ידי הפחתת ייצור ROS, לאחר מכן טיפלנו ב-BMMs עם פרוקסיד (10 µM) כדי לחקות את מצב ה-ROS הגבוה בתאים. BMMs הושררו על ידי RANKL ו- M-CSF למשך 3 ימים והתוצאות של ניתוח westernblot ו-RT-PCR הראו שהפרוקסיד מקדם ביטוי NFATc1ו c-Fos בהשוואה לקבוצות הביקורת. בהתאם לתוצאות באיור 5, הביטוי של NFATc1 ו-c-Fos דוכא על ידי CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)בעוד מי חמצן הציל את ההשפעה המעכבת של CDP (איור 6e,f). נתונים אלה הצביעו על כך ש-CDP דיכא את הביטוי של NFATc1 ו-c-Fos על ידי ניקוי ייצור ROS.

3.6|CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)מדכא מסלולי MAPK במהלך אוסטאוקלסטוגנזה המושרה על ידי RANKL

לאחר מכן, חקרנו את ההשפעה של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)טיפול בביטוי RANKL-mediatedTRAF6 והפעלת מסלול MAPK. לאחר דגירה במדיום נטול סרום במשך 2 שעות, BMMs עוררו עם RANKL, ללא CDP, במשך 60 דקות. לגירוי עם CDP (10 µM) לא הייתה השפעה על ביטוי TRAF6 וזרחון מוחלש של JNK2 ו-ERK1/2 לאחר 10 ו-20 דקות (איור 7). בנוסף, זרחון p38 עוכב באופן משמעותי על ידי CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)טיפול של 60 דקות בהשוואה לקבוצות ביקורת (איור 7). נתונים אלה חושפים כי CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)מדכא מסלולי איתות MAPK המושרים על ידי RANKL, בהתאם להשפעתו המעכבת על היווצרות ופעילות אוסטאוקלסטים.

4|דִיוּן

Cistanche, המכונה "ג'ינסנג מדברי", משך תשומת לב רבה לאחרונה בשל יכולתו לווסת חסינות ולפעול מגן במהלך הזדקנות ולחץ חמצוני (Jia et al., 2012; Snytnikovaet al., 2012). הוכח כי גליקוזידים מוחלפים ב-Penylpropanoid, המרכיבים העיקריים הפעילים של Cistanche, מעכבים NOactivity במקרופאגים (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). בנוסף, אCistancheתמצית מופחתת סטרס חמצוני בשריר הלב המחודש לאחר איסכמיה ומילאה תפקיד משמעותי בעיכוב של מסלולים אפופטוטיים המובילים להגנת לב (Yu, Li, & Cao, 2016). כמרכיב חשוב של Cistanche,CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)בעל מגוון פונקציות פרמקולוגיות. המחקר הנוכחי שלנו מצא ש-CDP דיכא את ההתמיינות וההפעלה של אוסטאוקלסטים המופעלים על ידי RANKL על ידי החלשת ייצור ROS כמו גם הפעלת NFAT ו-MAPK.

בתור פוספטאז חומצי, TRAcP קיים במגוון תאים ונמצא בשפע באוסטאוקלסטים ובמקרופאגים מכתשי (Snipes, Lam, Dodd,Gray, & Cohen, 1986). TRAcP הוא אנזים אופייני לאוסטאוקלסטים והביטוי שלו קשור קשר הדוק לתפקוד האוסטאוקלסטים, הנחשב כאינדיקטור לפעילות אוסטאוקלסטים וספיגת עצם (Minkin, 1982). במחקר שלנו, CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)עיכב את מספר התאים החיוביים ל-TRAcP, מה שמצביע על כך שהאוסטאוקלסטוגנזה המושרה על ידי RANKL נחסמה על ידי CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד). השפלה של מטריצת העצם על ידי אוסטאוקלסטים תלויה ב-cathepsin K (CTSK) וב-MMPs (Gruber, 2015). כאן, CDP הוריד משמעותית את הביטוי של גנים תפקודיים אוסטאוקלסטים כגון Mmp9, Ctsk ו- Acp5.

ההתמיינות והתפקוד של אוסטאוקלסטים מוסדרים על ידי מסלולי איתות מרובים (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). לאחר הקישור ל-RANK, RANKL מגייס חלבון מתאם TRAF6 כדי להפעיל את הביטוי של NFATc1, שהוא גורם שעתוק חשוב ליצירת אוסטאוקלסטים, המשפיע על ביטוי גנים ספציפיים לאוסטאוקלסטים, כולל TRACP ו-CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). במחקר זה מצאנו ש-CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)לא הייתה השפעה על ביטוי RANK ו-TRAF6 באוסטאוקלסטים. עם זאת, CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)עיכב את הפעלת NFATc1 המושרה על ידי RANKL במהלך אוסטאוקלסטוגנזה של BMMs. חוץ מזה, הוכח ש-ROS, המיוצר על ידי מיטוכונדריה בתהליך של אספקת אלקטרונים, מקדם את השגשוג וההתמיינות של אוסטאוקלסטים ומווסת את השפלת מטריצת העצם (Ha et al., 2004). מחקר שנערך לאחרונה מצא ש-RANKL גרם לייבוא גרעיני של Bach1 והחליש ייצור אנזימים נוגדי חמצון בתיווך Nrf2, ובכך הגביר את ביטוי ROS תוך-תאי ואת אוסטאוקלסטוגנזה בעכברים (Kanzaki et al., 2017). בנוסף, יצירת ROS תוך תאית מוגברת על ידי הומוציסטאין משפר את היווצרות ופעילות הדוסטאוקלסט (Koh et al., 2006). המחקר שלנו מצא ש-CDP הפחית את הצטברות ROS באוסטאוקלסטים על ידי עיכוב ביטוי NOS2 וקידום הביטוי של אנזימים נוגדי חמצון, כגון TRX1 וגלוטתיון רדוקטאז. כאשר טיפלנו ב-BMMs עם מי חמצן כדי לשפר את הצטברות ה-ROS התוך-תאית, התוצאות שהגדילו את ה-ROS יכלו לשפר את הביטוי NFATc1 היה במעלה הזרם של ROS. NFATc1. מצאנו גם שהפרוקסיד הציל את ההשפעה המעכבת של ביטוי CDPon NFATc1. אז הנתונים שלנו מצביעים על כך ש-CDP מדכא הצטברות ROS כדי לעכב את ביטוי NFATc1, ולאחר מכן להיווצרות ולתפקוד של repressosteoclast.

ERK, JNK ו-p38 שייכים למשפחת MAPK, המעורבת גם בוויסות ההתמיינות של אוסטאוקלסטים (Seger & Krebs, 1995). RANKL מפעיל את מסלול MAPK על ידי הגדלת הזרחון של ERK, JNK ו-p38 (Mizukami et al., 2002). הוכחנו ש-CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)דיכא את הזרחון המתווך ב-RANKL של חלבוני מפתח במסלול MAPK, ובכך תרם להשפעה המעכבת של CDPon את הביטוי של גנים לסמן אוסטאוקלסט. למיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון המראה את ההשפעות המעכבות של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)על ייצור ROS, הפעלת NFAT ו-MAPK, המייצגים מנגנוני פעולה חדשים של CDP במבחנה.

לסיכום, הוכחנו ש-CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)מחליש אוסטאוקלסטוגנזה וספיגת הידרוקסיאפטיט, וביטוי של גנים לסמן אוסטאוקלסט כולל Ctsk, Mmp9 ו- Acp5. CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)ניתן לדכא ייצור ROS בתיווך RANKL, כמו גם הפעלת NFAT ו-MAPK (איור 8). ביחד, התוצאות שלנו מצביעות על כך ש-CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)עשויה לייצג תרופה מועמדת לטיפול במצבים הקשורים לאוסטאוקלסטים המלווים בייצור יתר של ROS.

איור 8 תרשים סכמטי של CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)תפקוד בדיפרנציאציה אוסטאוקלסטית. CDP(Cistancheמדבריתפוליסכריד)מדכא ייצור ROS המושרה על ידי RANKL, כמו גם הפעלת NFATc1 ו-MAPK, ומכאן מעכב אוסטאוקלסטוגנזה. CDP,Cistancheמדבריתפוליסכריד; MAPK, חלבון קינאז מופעל מיטוגן; NFATc1, גורם גרעיני של תא T משופעל; RANKL, מפעיל קולטן של גורם גרעיני κBligand; ROS, מיני חמצן תגובתיים [ניתן לראות את דמות הצבע ב-atwileyonlinelibrary.com]

תודות

מחקר זה נתמך על ידי קרן מדעי הטבע של סין (81572164), התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח טכנולוגיות מפתח של סין (2017YFC1103300), קרן מדעי הטבע של מחוז גואנגשי (2016GXNSFAA380295), ופרויקט מחקר המדע והטכנולוגיה של אוניברסיטת גואנגשי במחוז גואנגשי (KYB05Y2015Y ). זה גם נתמך בחלקו על ידי פרויקט GuangxiScientific מחקר ופיתוח טכנולוגיה (GKG13349003, 1598013-15), Western Australia Medical & HealthResearch Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, The University of Western Australia (UWA) Research CollaborationAwards, והאוסטרלי בריאות ורפואה מועצת המחקר (NHMRC, מס' 1107828 ו-1027932).