מעכב פרנסילטרנספראז LNK-754 מחליש ניוון אקסונלי ומפחית פתולוגיה עמילואידית בעכברים חלק 3

תוצאות

הפחתת עומס רובד עמילואיד והיפר-פוספורילציה של טאו במוחם של עכברי 5XFAD שטופלו כרונית ב-LNK-754

LNK-754 ו-lonafarnib הם FTI-מולקולות קטנות שנבדקו בעבר בבני אדם בניסויים קליניים בסרטן וידוע שהם חוצים את מחסום הדם-מוח [8, 9, 41, 42]. תכלילים של -synuclein [8] וטאו [9] מופחתים על ידי LNK-754 ו-lonafarnib, בהתאמה, אך הם עדיין לא הוערכו מול הפנוטיפ העמילואיד של AD. במחקר זה, חקרנו את ההשפעות שלהם על פתולוגיה עמילואיד במודל העכבר 5XFAD. עכברי 5XFAD מפתחים משקעי A החל מגיל חודשיים [36, 37], ונויריטים דיסטרופיים נצפים בשלבים המוקדמים ביותר של שקיעת עמילואיד [39, 43].

מחסום הדם-מוח והחסינות הם שני חלקים חשובים מאוד בגוף האדם, והם קשורים קשר בל יינתק. מחסום הדם-מוח הוא מחסום מגן בין המוח לדם המגן על המוח מפני חומרים מזיקים מבחוץ. חסינות היא מנגנון חשוב לגוף האדם להתנגד למחלות. אז מה הקשר הספציפי בין מחסום הדם-מוח לחסינות?

ראשית, מחסום הדם-מוח יכול למנוע מכמה חיידקים ווירוסים מזיקים לחדור למוח, ובכך להגן על המוח מנזק. בנוסף, מחסום הדם-מוח יכול לשלוט גם על חדירותם של חומרים מסוימים, ולאפשר להם להיכנס למוח רק במידה מוגבלת. זה קריטי להגנה על בריאות מערכת העצבים, שכן יותר מדי חומרים פנימיים מסוימים הנכנסים למוח עלולים לגרום לנזק לתאי עצב.

יחד עם זאת, חסינות יכולה גם לשחק תפקיד בהגנה על המוח. המערכת החיסונית של גוף האדם יכולה לזהות פתוגנים וחומרים מזיקים, ולאחר מכן לייצר נוגדנים מתאימים כדי להתנגד לפלישה שלהם, ובכך להגן על הגוף מפני מחלות. עם זאת, כאשר פתוגנים או חומרים מסוימים חוצים את מחסום הדם-מוח וחודרים למוח, מערכת החיסון מגיבה במהירות ומייצרת נוגדנים כדי לתקוף ולחסל אותם.

לכן, מחסום הדם-מוח והחסינות ממלאים תפקיד חשוב מאוד בשמירה על בריאות האדם. מחסום הדם-מוח מונע מחומרים מזיקים לחדור למוח, בעוד שחסינות מסירה פתוגנים וחומרים מזיקים אחרים שעוקפים את מחסום הדם-מוח וחודרים למוח. השניים עובדים יחד כדי להבטיח תפקוד בריא של המוח.

לסיכום, מחסום הדם-מוח והחסינות משתפים פעולה באמצעות המנגנונים המתאימים כדי למלא תפקיד חשוב בבריאות האדם. עלינו להתמקד בהגנה על בריאותם כדי להבטיח את הבריאות הכללית של הגוף. ניתן לראות שעלינו לשפר את הזיכרון שלנו. Cistanche deserticola יכול לשפר משמעותית את הזיכרון מכיוון ש-Cistanche deserticola הוא חומר רפואי סיני מסורתי עם השפעות ייחודיות רבות, אחת מהן היא שיפור הזיכרון. היעילות של בשר טחון מגיעה מהמרכיבים הפעילים הרבים שהוא מכיל, כולל חומצה, פוליסכרידים, פלבנואידים וכו'. מרכיבים אלו יכולים לקדם את בריאות המוח במגוון דרכים.

לחץ על יודע תוספי מזון כדי לשפר את הזיכרון

לכן, כדי לחפוף להתפתחות הפתולוגיה של עמילואיד בעכברי 5XFAD, טיפלנו בעכברים באופן כרוני במשך 3 חודשים עם הרכב, LNK-754, ו-lonafarnib, החל מגיל חודשיים. LNK-754 ו-lonafarnib הומסו בכלי של 0.5% נתרן קרבוקסימילצלולוזה ו-ip הוזרק מדי יום במינון של 1 מ"ג/ק"ג [8, 44].

ראשית ביקשנו לקבוע את ההשפעות של טיפול כרוני ב-LNK-754 ו-lonafarnib על עומס רובד בעכברי 5XFAD על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית עבור A 42 שמזהה עמילואיד מפוזר ומצטבר וגם טיאזין אדום (TR), המזהה רק רובד פיברילרי ליבות (איור 1A; איור S1). מצאנו ירידה משמעותית בשטח המכוסה באזורי מוח קליפת המוח של עכברים שטופלו ב-LNK754- בהשוואה לבקרות שטופלו ברכב (איור 1B). בהיפוקמפוס, השטח המכוסה ירד משמעותית בעכברים שטופלו ב-LNK-754- בהשוואה לעכברים שטופלו בלונפארניב, והייתה מגמה של ירידה בעכברים שטופלו ב-LNK-754 בהשוואה לטיפול בכלי רכב (איור .1C).

אזור מכוסה 42 בעכברים שטופלו ב-lonafarnib לא היה שונה באופן משמעותי מעכברים שטופלו ברכב בקליפת המוח או בהיפוקמפוס (איור 1A, B). גודל הפלאק ירד באזורי המוח בקליפת המוח וההיפוקמפוס על ידי טיפול ב-LNK-754 בהשוואה לטיפול ברכב; הבדל זה היה מובהק סטטיסטית בהיפוקמפוס (איור 1D, E; איור S2A, B). הבדל משמעותי בגודל הפלאק בין טיפול ב-lonafarnib ו-LNK-754 נצפה גם בהיפוקמפוס (איור 1D, E; איור S2A, B).

גודל הפלאק לא השתנה בעכברים שטופלו ב-lonafarnib בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב באזורי מוח קליפת המוח או ההיפוקמפוס (איור 1D, E; איור S2A, B). זריעת רובד כמתה על ידי ניתוח מספר הפלאק על ידי צביעת TR. מספר הפלאק ירד משמעותית בקורטקס, אך לא בהיפוקמפוס, של LNK-754 בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב (איור S2C, D). נטל הפלאק מופחת אושר על ידי מדידת A 42 על ידי ELISA ב-PBS והומוגניטים מסיסים להמיבריינים בגואנידין (איור 1F, G). בדומה לתוצאות המיקרוסקופיה האימונופלואורסצנטית שלנו, הייתה מגמה של פחות A 42 בשברי גואנידין ו-PBS בעכברים שטופלו בלונפרניב, בעוד שרמה נמוכה משמעותית של A42 בשברי גואנידין הושגה עם טיפול ב-LNK-754 (איור. 1. ו, ז).

מכיוון שדווחו השפעות מבוססות מין במודל העכבר 5XFAD עבור רמות APP במצב יציב ועומס פלאק [45, 46], ביצענו אימונובלוטים של עכברים זכרים ונקבות שטופלו עם Vehikel, LNK-754 או lonafarnib בנפרד לביטוי APP מהונדס (איור S3A). רמות APP מהונדס נמדדו על ידי אימונובלוט עם הנוגדן APP 6E10, המזהה רק APP אנושי, ולא השתנו בעכברים זכרים או נקבות שטופלו ב-LNK-754, לונפארניב או כלי רכב (איור S3B-D). תכונה מגדירה שניה של AD היא נוכחותם של תכלילים של טאו עם היפר-פוספורילציה במוח, ויחד עם שקיעת פלאק, טאו אנדוגני של עכבר עובר היפר-פוספורילציה בעכברי 5XFAD [47, 48].

כדי לקבוע אם היפר-פוספורילציה של טאו הושפעה מטיפול ב-FTI במודל עכבר עמילואיד, בוצעה ניתוח אימונובלוט עבור פוספו-טאו בסרין 404 (איור 1H; איור S3E), אפיטופ הידוע כמי שעבר זרחון יתר במוחות AD ועכברי 5XFAD [ 47, 49]. כאן, מצאנו רמות מופחתות של phospho-tau ser404 במוחם של עכברים שטופלו ב-lonafarnib ו-LNK-754 (איור 1I), בעוד שרמת הטאו הכוללת נותרה ללא שינוי (איור 1J; איור S3F). בסך הכל התוצאות שלנו מגלות שעומס רובד עמילואיד וזרחון טאו פתוגני מופחתים במודל העכבר 5XFAD על ידי טיפול תרופתי עם FTIs, למרות שטיפול ב-LNK-754 היה חזק בהרבה מ-lonafarnib.

טיפול כרוני עם LNK-754 מעכב פרנסילציה של חלבון במוחם של עכברי 5XFAD

כדי לאשר שהמיקוד ל-FTase עם LNK-754 ולונפרניב על ידי הזרקת ip עיכבה פרנסילציה של חלבון במוחם של עכברי 5XFAD, הערכנו מצעי FTase שונים וסמנים של עיכוב FTase במורד הזרם בהומוגניות של ההמיבריין של עכברי 5XFAD שטופלו כרונית עם כלי, LNK -754 או לונפארניב על ידי ניתוח אימונובלוט. תחילה ניתחנו prelamin A, אשר מצטבר כאשר FTase מעוכב [50]. עלייה ב-prelamin A נצפתה במוחם של עכברים שטופלו ב-LNK-754 בהשוואה לכלייל, בעוד שלא התרחש שינוי בעכברים שטופלו ב-lonafarnib (איור S4A, D). בשלב הבא הסתכלנו על HDJ-2, חלבון מלווה שעובר שינוי ניידות כלפי מעלה בעקבות טיפול ב-FTI ונמצא בשימוש נרחב כסמן לעיכוב FTase [50]. בהתאם ל-prelamin A, צורת הגירה איטית יותר של HDJ-2 הייתה קיימת בעכברים שטופלו ב-LNK-754- אך לא בעכברים שטופלו ב-lonafarnib (איור S4B, E). עלייה משמעותית במינים הנודדים האיטיים יותר של HDJ-2 נמצאה בעכברי LNK754 בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב או בלונפרניב (איור S4E).

בנוסף, פרנסילציה מפעילה את Ras, אז מדדנו גם את הזרחון של מולקולת האפקטור שלה במורד הזרם ERK1 (P44/P42) (איור S4C). בעוד HDJ-2 ו-prelamin A לא השתנו על ידי הטיפול ב-lonafarnib, נצפתה מגמה של הפחתת pERK1 (איור S4F). pERK1 ירד גם בעכברים שטופלו ב-LNK -754 (איור S4F). התוצאות שלנו מצביעות על כך ש-1mg/kg LNK-754 עיכב FTase במוח, עם זאת, lonafarnib היה פחות יעיל. זה יכול להיות בגלל העוצמה הנמוכה יותר וה-IC50 של lonafarnib כפי שהוצג בעבר [41, 51], או אולי חשיפה מופחתת מופחתת.

ירידה בהצטברות LAMP1 בנויריטים דיסטרופיים בעכברי 5XFAD שטופלו כרונית ב-LNK-754

בנוירונים בריאים, רכיבים ליזוזומליים מועברים לאנדוזומים ואברונים אוטופגיים בעצבים דיסטליים, אשר הופכים חומציים ומתבגרים במהלך סחר רטרוגרדי לכיוון הסומה העצבית [52, 53]. פלאקים עמילואידים משבשים את התהליך הזה, וכתוצאה מכך נויריטים דיסטרופיים הלוכדים אברונים אוטופגיים ואנדוליזומליים לא מתפקדים.

עצבים דיסטרופיים חוסמים את ההובלה האקסונלית של BACE1, מה שמוביל לדור בתוך עצבים דיסטרופיים ותצהיר פלאק חוץ תאי [16-18]. ידוע ש-FTI משפר את התפקוד הליזוזומלי ואת יציבות המיקרו-צינוריות, אז כדי להמשיך ולחקור כיצד FTIs מפחיתים את עומס הפלאק, התמקדנו במיוחד בנייריטים דיסטרופיים בעכברי 5XFAD.

כדי לכמת את ההצטברות של נויריטים דיסטרופיים סביב פלאקים, הערכנו חלבון ממברנה 1 (LAMP1) הקשור בליזוזומלית, סמן של אברונים הטרוגניים אנדוליזומליים ואוטופגיים. רקמות מוח היפוקמפוס וקליפת המוח מעכברי 5XFAD שטופלו ב- Vehikel, LNK -754 ו- lonafarnib נצבעו יחד עבור LAMP1 ו-A 42, ובוצעה מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית (איור 2A, B).
נקבע סף לחיסול אותות הקרינה של LAMP1 משלפוחיות בנויריטים בריאים ובסומסים כדי לנתח ספציפית נויריטים דיסטרופיים. השטח המכוסה LAMP1 ירד באופן משמעותי באזורי המוח בקליפת המוח וההיפוקמפוס של עכברים שטופלו ב-LNK -754 (איור 2C, D), בעוד שלא נצפה הבדל בעכברים שטופלו בלונפארניב בהשוואה לטיפול בכלי הרכב (איור 2C, D) . שקיעת פלאק עמילואיד יוזמת התפתחות של דיסטרופיות בעצבים סמוכים, בעיקר אקסונים ומסופים פרה-סינפטיים.

בהתאם, ההשפעות של LNK-754 ו-lonafarnib על נויריטים דיסטרופיים תואמות את ההשפעות שלהם על עומס הפלאק (איור 1). ניתוח נוסף של השפעת טיפול ב-FTI על נויריטים דיסטרופיים בוצע על ידי כימות היחס בין השטח המכוסה LAMP1 לאזור A 42 כדי לקבוע אם FTIs מגבילים את גודל הדיסטרופיה סביב הפלאק. ירידה ביחס של LAMP1: נצפתה A 42 עבור עכברים שטופלו ב-LNK-754 בהשוואה לעכברי כלי רכב, וטיפולי LNK-754 ו-lonafarnib היו שונים באופן משמעותי (איור 2E, F), מה שמצביע על כך ש-LNK -754 עכברים הקשורים עם פחות נויריטים דיסטרופיים.
רמות גבוהות של LAMP1 נמצאו בהומוגניות של ההמיבריין של עכברים שטופלו ב-LNK-754 או ב-lonafarnib (איור S5A, B), בהתאם למחקרים קודמים שהראו שלונפרניב ו-LNK-754 מגדילים את מספר האוטוליזוזומים רמות של חלבוני ממברנה ליזוזומליים והידרולאזות [8, 9]. בהתאם לתוצאות ניתוח אימונובלוט עבור LAMP1 (איור S5A, B), עוצמת הקרינה הממוצעת של צביעה חיסונית הכוללת LAMP1 גדלה באופן משמעותי במוחם של עכברים שטופלו ב-LNK-754 ו-lonafarnib בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב (איור S5C, D).

בניגוד לרמת הקרינה הכוללת של LAMP1, עוצמת הקרינה הממוצעת של LAMP1 בנויריטים דיסטרופיים לא השתנתה בין כלי הרכב, LNK-754 ועכברים שטופלו ב-lonafarnib (איור S5E, F). בקליפת המוח של עכברים שטופלו ב-LNK-754, עוצמת הקרינה של LAMP1 בדיסטרופיות ועומס הפלאק היו בקורלציה גבוהה, בעוד שלא נמצאה מתאם בין עוצמת LAMP1 בדיסטרופיה ונטל הפלאק בעכברים שטופלו ב-lonafarnib או בכלי רכב (איור 2G, H), חושף קשר בין הצטברות ניוריטים דיסטרופיים LAMP1 לעומס הפלאק בעכברי LNK-754. בהיפוקמפוס נצפתה מגמה של מתאם בין עוצמת LAMP1 בדיסטרופיה לבין עומס הפלאק. יחד, התוצאות שלנו מוכיחות שטיפול ב-LNK-754 מגביר את הרמה הכוללת של LAMP1 אך מחליש את ההצטברות הפתולוגית של LAMP1 בנויריטים דיסטרופיים הנמצאים בדרך כלל בעכברי 5XFAD.

ירידה בהצטברות BACE1 בנויריטים דיסטרופיים בעכברי 5XFAD שטופלו כרונית ב-LNK-754

LAMP1 נמצא על ממברנות של אברונים אנדוליזומליים המכוונים ל-BACE1 האקסונלי לליזוזומים בוגרים לצורך פירוק. לפיכך, FTIs יכולים לעכב את היווצרות A ושקע רובד חוץ תאי על ידי הפחתת היווצרות ניוון אקסונלי והצטברות של BACE1 סביב פלאקים. לתמיכה בהשערה זו, רמת הנויריט הדיסטרופי LAMP1 ועומסת הפלאק היו בקורלציה גבוהה באזורי מוח קליפת המוח בעכברי LNK-754.

הניתוח שלנו של צביעה חיסונית ב-LAMP1 גילה שבהשוואה לטיפול במכשיר או בלונפרניב, פלאקים בעכברי 5XFAD שטופלו ב-LNK-754 היו קשורים עם פחות נויריטים דיסטרופיים (איור 2). כדי לקבוע אם רמת BACE1 בנויריטים דיסטרופיים ירדה באופן דומה לכל רובד, ביצענו מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית של רקמות מוח בקליפת המוח וההיפוקמפוס של עכברים שטופלו בעורק, LNK-754 ו-lonafarnib עבור BACE1, בנוסף ל-LAMP1 ו-A 42 (איור 3A, B).

כאן, שטח מכוסה BACE1 ירד באופן משמעותי באזורי מוח קליפת המוח של עכברים שטופלו ב-LNK-754, ומגמה נצפתה בעכברים שטופלו ב-lonafarnib (איור 3C). הניתוח של אזור מכוסה BACE1 בנויריטים דיסטרופיים בהיפוקמפוס נבלם על ידי רמת הביטוי הגבוהה של BACE1 בטרמינלים פרה-סינפטים של מסלול סיבי האזוב ההיפוקמפוס CA3 [17]. בנוסף, ניתחנו אם פחות BACE1 התמקם לאנדוליזוזומים בנויריטים דיסטרופיים על ידי מדידת מקדם המתאם של פירסון עבור BACE1 ו-LAMP1 בדיסטרופיה. נמצאה ירידה משמעותית ב-BACE1 ו-LAMP1 משותף לכל רובד באזורי מוח קליפת המוח בעכברים שטופלו ב-LNK-754- בהשוואה לטיפול בכלי רכב (איור 3D).

בהיפוקמפוס נמצאה ירידה מובהקת בקולוקליזציה משותפת של BACE1 ו-LAMP1 לכל רובד עבור LNK-754 בהשוואה ל-lonafarnib, ונצפתה מגמה של ירידה בטיפול ב-LNK-754 בהשוואה לרכב (איור 3E). תוצאות אלו תואמות את הממצאים שלנו לגבי עומס פלאק ושטח מכוסה LAMP1, ותומכות עוד יותר ברעיון שטיפול ב-LNK-754 החליש את היווצרותם של נויריטים דיסטרופיים, והפחית את הצטברותם של אברונים אנדוליזוזומליים לקויים המכוונים ל-BACE1 לפירוק.

טיפול אקוטי עם LNK-754 מפחית הצטברות מאוחרת של אנדוזום וליזוזום בנויריטים דיסטרופיים בעכברי 5XFAD פרוסות מוח חיות

בשלב הבא בדקנו את ההשפעות החריפות של LNK-754 ולונפרניב על נויריטים דיסטרופיים על ידי ביצוע הדמיה קונפוקלית של רקמות מוח חיות. בניסוי זה, 5-עכברי 5XFAD בני חודש הוזרקו מדי יום עם כלי רכב, LNK-754 או lonafarnib למשך 3 שבועות. צבענו רקמות ב-LysoTracker-Green (LT), בדיקה בשימוש נפוץ למעקב וזיהוי סלקטיבי של אנדוזומים מאוחרים וליזוזומים בתאים חיים [53]. הדפוס של צביעה אדומה של LT ותיאזין הייתה עקבית עם תוצאות הצביעה החיסונית שלנו עבור סמני ניוריט דיסטרופיים בעכברי 5XFAD (איור 2A, B; איור 3A, B); אנדוזומים מאוחרים וליזוזומים חיוביים ל-LT היו מרוכזים מאוד בנויריטים דיסטרופיים הקשורים קשר הדוק לפלאקים עמילואידים ברקמות מוח חיות (איור 4A).

טיפול חריף של 3-שבוע של 5-עכברי 5XFAD בני חודש עם LNK-754 או לונפארניב לא הספיק כדי להפחית את גודל הפלאק (איור 4B), למרות שטיפול ב-LNK-754 גרם ירידה משמעותית ביחס של LT:TR לכל רובד וגודל נויריט דיסטרופי (איור 4C, D). מעניין לציין שבניגוד לממצאים שלנו עבור LAMP1 או BACE1, טיפול חריף ב-lonafarnib הפחית גם את גודל הדיסטרופיה ואת היחס בין LT:TR לפלאק (איור 4C, D). גודל נויריט דיסטרופי וגודל הפלאק נמצאו בקורלציה גבוהה בעכברי 5XFAD שטופלו ב-LNK-754 (איור 4F), ומתאם משמעותי נצפה גם בעכברים שטופלו בלונפרניב (איור 4G). לא היה מתאם בעכברים שטופלו ברכב (איור 4E). התוצאות שלנו מאשרות ש-LNK-754 הפחיתה ניוון אקסונלי ומצביעות על כך ש-FTIs יכולים להחליש הצטברות מאוחרת של אנדוזומים וליזוזומים סביב פלאקים, אפילו לאחר שקיעת פלאק נרחבת וניוון אקסון.

שיפור בחסרי למידה וזיכרון בעכברי hAPP/PS1 לאחר טיפול קצר מועד עם LNK-754

LNK-754 מנע הצטברות של LAMP1, BACE1 ו-LT בנויריטים דיסטרופיים בעכברי 5XFAD, מה שמרמז שטיפול ב-LNK-754 מגן מפני הפרעה סינפטית הקשורה ל-A. כדי להעריך האם לטיפול ב-LNK-754 הייתה השפעה מועילה על התפקוד הקוגניטיבי, הערכנו את היעילות לטווח קצר של טיפול ב-LNK-754 דרך הפה על למידה מרחבית וזיכרון במודל העכבר hAPP/PS1 AD [40] . הזיכרון המרחבי של עכברי hAPP/PS1 השתפר לאחר 12 ימים של טיפול פומי עם LNK -754, כפי שהוערך על ידי מבוך המים של מוריס (MWM).

במהלך מפגשי ההדרכה של הפלטפורמה הנסתרת, עכברי hAPP/PS1 שטופלו ב-LNK-754 למדו לאתר את הפלטפורמה מהר יותר מאשר עכברי hAPP/PS1 שטופלו ברכב, מה שהביא לעקומת למידה שונה משמעותית מזו של hAPP שטופלו ברכב עכברי בקרה / PS1 (איור 5A). לעכברי hAPP/PS1 שטופלו בכלי רכב נדרשו הרבה יותר זמן לאתר את הפלטפורמה בהשוואה לבקרות מסוג פרא שטופלו ברכב בימים 4 ו-7 של ניסויי האימון, בעוד שלא נמצאו הבדלים משמעותיים בין hAPP/LNK-754 שטופלו ברכב עכברי PS1 ועכברים מסוג פרא שטופלו ברכב (איור 5A-C).

במהלך בדיקת הגשושית, בעלי חיים מסוג hAPP/PS1 שטופלו ב-LNK-754- הראו זמן שהייה מוגבר ברביע המטרה (איור 5D) ותדירות מוגברת של מעברי פלטפורמה (איור 5E), בהשוואה לחיות מסוג בר שטופלו ברכב . 42 רמות נמדדו על ידי ELISA ולא השתנו בהומוגניות מוח מסיסות ובלתי מסיסות מעכברי hAPP/PS1 שטופלו בכלי רכב או ב-LNK-754- (איור 5F, G), מה שמצביע על כך ששיפור הזיכרון והלמידה המרחבית לא היו תוצאה של ירידה בנטל העמילואיד בעכברי hAPP/PS1 שטופלו ב-LNK-754.

For more information:1950477648nn@gmail.com