בחינת תפקידו של רומן אינטרלוקין-17 הומולוג מ-Intebrate Marine Mussel Mytilus Coruscus בתגובה חיסונית מולדת: האם ויסות שלילי מאת Mc-Novel_miR_145 הוא המפתח?

תַקצִיר: Interleukin-17 (IL-17) מייצג סוג של ציטוקינים פרו-דלקתיים המעורבים בהפרעות דלקתיות וניוון כרוניות. לפני מחקר זה, נחזה כי הומלוג IL-17 יכול להיות ממוקד על ידי Mc-novel_miR_145 להשתתף בתגובה החיסונית של Mytilus coruscus. מחקר זה השתמש במגוון שיטות מחקר מולקולריות וביולוגיה של התא כדי לחקור את הקשר בין Mc-novel_miR_145 והומולוגים IL-17 וההשפעות האימונומודולטוריות שלהם. תחזית הביואינפורמטיקה אישרה את השיוך של ההומלוג IL-17 למשפחת המוסל IL-17, ואחריו מבחני PCR כמותיים בזמן אמת (qPCR) כדי להדגים כי McIL-17-3 בא לידי ביטוי גבוה ב רקמות הקשורות למערכת החיסון והגיבו לאתגרים חיידקיים. תוצאות מבחני דיווח של luciferase אישרו את הפוטנציאל של McIL-17-3 להפעיל את NF-κb במורד הזרם ואת המיקוד שלו על ידי Mc-novel_miR_145 בתאי HEK293. המחקר גם הפיק אנטי-סרום של McIL-17-3 ומצא ש-Mc-novel_miR_145 מווסת לרעה את McIL-17-3 באמצעות מבחני בדיקת Western blot ו-qPCR. יתר על כן, ניתוח ציטומטריית זרימה הצביע על כך ש-Mc-novel_miR_145 מווסת לרעה את McIL-17-3 כדי להקל על אפופטוזיס המושרה על ידי LPS. ביחד, התוצאות הנוכחיות הראו של-McIL-17-3 היה תפקיד חשוב בהגנה החיסונית של רכיכות מפני התקפת חיידקים. יתר על כן, McIL- 17-3 היה מווסת לרעה על ידי Mc-novel_miR_145 כדי להשתתף באפופטוזיס המושרה על ידי LPS. הממצאים שלנו מספקים תובנות חדשות לגבי ויסות RNA לא מקודד במודלים של חסרי חוליות.

יתרונות cistanche לגברים מחזקים את המערכת החיסונית

מילות מפתח: קוסקוס מיטילוס; interleukin-17; microRNA; אפופטוזיס; חסינות מולדת

1. הקדמה

למערכת החיסון תפקיד מכריע בהגנת האורגניזם מפני פלישת פתוגנים אקסוגניים. באופן קונבנציונלי, מערכת ההגנה מחולקת לחסינות מולדת וחסינות נרכשת. חסינות מולדת מייצגת את קו ההגנה הראשון של הגוף מפני פתוגנים, שיכול לזהות פלישת פתוגנים ולחסל אותם חלקית [1]. חסינות מולדת מתווכת על ידי מגוון גדול של תאים, כולל תאי הורגים טבעיים, מונוציטים, נויטרופילים, אאוזינופילים, בזופילים ותאים דנדריטים במחזור, אשר ידועים ביחד בתור תאי חיסון מולדים. תאים אלו משחררים מספר רב של ציטוקינים המעורבים בתקשורת התאית ובכך מסייעים בתיאום תגובות חיסוניות [2]. במקרה של זיהום ודלקת, הציטוקינים מתפקדים כמאפננים: ציטוקינים מסוימים מחמירים את המחלה (פרו-דלקתית), בעוד שאחרים מעודדים בריאות (אנטי דלקתיים) [3]. ציטוקינים נתונים לרמות גבוהות של לחץ אבולוציוני ולכן מפגינים גיוון רצף [4], בעוד שמשפחת הציטוקינים IL-17 מציגה שימור גבוה, המתבטא בקפל ציסטאין בארכיטקטורה התפקודית שנוצר באמצעות אינטראקציות בין ארבעה שיירי ציסטאין משומרים [5]. מחקרים אחרונים הוכיחו ש-IL-17 הוא סוג של ציטוקינים פרו-דלקתיים המעורבים בהפרעות דלקתיות וניוון כרוניות [6]. ה-IL-17 מתפקדים על ידי קשירה ספציפית לקולטנים כדי לקדם התפתחות דלקת, דחייה חיסונית והמטופואזה. משפחת הציטוקינים IL-17 בבני אדם מורכבת משישה חברים (IL-17A עד IL-17F), המיוצרים על ידי לימפוציטים T מופעלים ואוכלוסיות תאים מולדות אחרות בתגובה ל-IL -1 ו-IL-23 [7,8]. עם זאת, כמות הולכת וגדלה של עדויות מצביעות על כך שמשפחת IL-17 חוותה התרחבות ניכרת ברכיכות ימיות ובמיני עגולים. בגנום של קיפוד הים הסגול Strongylocentrotus purpuratus, זוהו כ-30 גנים IL-17 [9]. באופן דומה, נמצאו 31 גנים דמויי תמנון IL-17- בצפליפודים קולואידים, שבהם ל-27 גנים יש ביטוי אדיר בפראיירים ובעור [10]. Saco, et al. [11] שלף 379 רצפי IL-17 ייחודיים מ-15 גנומים של מולים ברצף מחדש ומגנום ההתייחסות של M. galloprovincialis [12] וחילק אותם ל-23 איזופורמים באמצעות ניתוח פילוגנטי. יתר על כן, הם מצאו שאיזופורמים IL-17 ממינים Mytilidae נשמרו בין פרטים וחולקו בין מינים קרובים. בנוסף למיני Mytilidae, משפחות ה-IL-17 הגדולות נמצאו גם במינים אחרים של רכיכות, כולל Crassostrea gigas, Mizuhopecten yesoensis ו-Pinctada fucata martensii [13]. מי הים שופעים בפתוגנים, ורכיכות ימיות נמצאות איתם במגע מתמיד, ולכן יש צורך בארסנל רב עוצמה של מולקולות חיסוניות, ואז הרחבת משפחת IL-17 מקנה לבעלי חיים אלו תגובות חיסוניות יעילות יותר.

היו מספר מחקרים המצביעים על התפקיד המשמעותי של IL-17 בחסינות המולדת של בעלי חיים רכיכות. לדוגמה, מחקר מצא כי לאחר הדבקה על ידי Vibrio harveyi, רמת ה-mRNA של IL-17D הייתה מווסתת מאוד ב-Tegillarca granulosa [14], בעוד שב-C. gigas, CgIL17-5 הראתה תגובה ברורה ל-Vibrio splendidus [15]. בנוסף, הוכחו כי IL-17 מולוסקניים מגיבים לדפוסים מולקולריים רבים הקשורים לפתוגן (PAMPs), כגון ליפופוליסכריד (LPS), חומצה פוליאינוסינית: פוליציטידילית (polyI: C) ופפטידוגליקן (PGN). LPS הוא מרכיב עיקרי בדופן החיצונית של דפנות תאי חיידקים גראם-שליליים ומייצג את אחד הממריצים החיסונים הנפוצים ביותר בשימוש. מצד שני, polyI: C הוא אנלוגי RNA דו-גדילי המשמש לעתים קרובות כסימולטור וירוסים במחקר מדעי. לאחר הגירוי על ידי LPS, הביטוי התעתיק של גנים ממשפחת IL-17 הופעל במהירות באויסטר פסיפיק C. gigas וצדפה פנינה P. fucata [16,17]. גם בצדפות פנינים, נמצא כי PfIL-17 מעורב בתגובה החיסונית לגירוי polyI: C [17].

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

בנוסף, בדיקת לוציפראז כפולה הראתה ש-PfIL-17 היה מסוגל להפעיל גנים מטרה של חולייתנים המכילים אתרי קישור NF-kB ולהשתתף במסלול האיתות NF-kB בתאי HEK293 [17]. PGN קיים בדופן התא של חיידקים גראם חיוביים ומשמש לעתים קרובות כמחקה לחיידקים גראם חיוביים. הוכח כי ל-C. gigas IL17-5 רקומביננטי יש זיקה חזקה ל-PGN, שמעולם לא דווחה באינטרלוקינים של בעלי חוליות [18]. מחקרים אלה סיפקו הקדמה לחשיפת התפקוד האימונומודולטורי של IL-17 ברכיכות. בתור מחלקה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, הביטוי המוגזם של IL-17 יכול לגרום לנזק רציני לתאים. האורגניזמים פיתחו מנגנונים שונים כדי לשלוט בתגובת היתר של IL-17, מתוכם microRNAs (miRNAs) מייצגים את המעמד החזק והנחקר ביותר של RNAs שאינם מקודדים. MiRNAs הם משפחה של RNAs קצרים באורך של כ-22 nt שיכולים לווסת את הביטוי של גנים מטרה על ידי דיכוי תרגום או פירוק mRNA [19]. המחקר הנוכחי על ויסות IL-17 על ידי miRNA מתמקד בעיקר בהשפעות הסינרגיות שלהם במחלות אוטואימוניות אנושיות כגון טרשת נפוצה, דלקת מפרקים שגרונית, פסוריאזיס ואחרות [20]. הפיתוח הטכני של רצף תפוקה גבוהה וחישוב ביולוגי מאפשר לסרוק miRNAs רכיכות ברמה הגנומית, ומספר רב של miRNAs משומרים וחדשים זוהו ממינים רכיכות כגון צדפה שטוחה Ostrea edulis, צדפה פסיפיק C. gigas , Lymnaea stagnalis, musel M. galloprovincialis וכו' [21–29]. מחקרים אלה מספקים נתונים בסיסיים ותמיכה רבה לפרשנות הפונקציונלית של miRNAs ברכיכות. בנוגע לתפקיד האימונו-רגולטורי של מירנאים מסוימים ברכיכות, Tian, ​​et al. [30] מצא ש-Pm-miR-29a יכול לווסת באופן חיובי את IL-17 ב-Pinctada martensii; לאחר ביטוי יתר של Pm-miR-29a, הביטוי של IL-17 במעטפת ובזימה של המין היה מווסת למעלה. ב-C. gigas, cgi-miR-2d הגביר את הפגוציטוזיס של צדפה על ידי ויסות שלילי של CgIκB2 [31] וויסות שלילי של הביטוי של גן דמוי כולין טרנספורטר בשלב המוקדם של הזיהום, שהיה מעורב באימונומודולציה מתוחכמת [32].

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Enhance Immunity

【בקש עוד】 דוא"ל:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

במהלך ייבוש, נמצא כי cgi-miR-365 מושרה על ידי נוראדרנלין ומקדם ישירות ביטוי CgHSP90AA1 [33]. מחקרים אחרונים הראו שפיגום miRNA659_26519 מכוון לקלמודולין כדי לווסת ביטוי IL-17 בשלב המוקדם של התגובה החיסונית של C. gigas [34]. בנוסף, תפקודים ספציפיים של מירנאים מסוימים תוארו בחסרי חוליות אחרים, כגון מלפפון ים Apostichopus japonicus [35-39] וסרטן Litopenaeus vannamei [40]. מחקרים אלה פתחו את הצעיף למנגנונים הבסיסיים של miRNAs בחסרי חוליות וגם סיפקו הפניות טכניות ומתודולוגיות למחקר הנוכחי שלנו. במחקר הקודם שלנו, 26 miRNAs ו-667 גנים של M. coruscus חושבו ביולוגית לביטוי דיפרנציאלי לאחר אתגר Vibrio alginolyticus, אשר Mcnovel_miR_145 יכול למקד להומלוג IL-17 ולהיות מעורב בתגובה החיסונית לזיהום חיידקי [41]. מטרת המחקר הנוכחי היא לזהות את הגן IL-17 ולחקור את תפקידו הפוטנציאלי בחסינות מולדת ואת ויסותו על ידי ה-miRNA Mcnovel_miR_145 ב-M. coruscus. באמצעות מחקר זה, אנו שואפים להשיג הבנה טובה יותר של מנגנוני התגובה החיסונית של רכיכות ולשפוך אור על הבסיס המולקולרי של ההגנה החיסונית שלהם מפני פתוגנים. מחקר זה יכול גם לספק תובנות לגבי ויסות RNA לא מקודד במודלים של חסרי חוליות.

2. תוצאות

2.1. אפיון של McIL-17-3

רצף ה-cDNA של McIL-17-3 המכיל את ה-ORF המלא, 30 -UTR וה-UTR החלקי 50 - שובט בסיליקו מהתעתיק M. coruscus באורך מלא (מספר גישה: PRJNA798880, F{ {5}}תמליל_12404). McIL-17-3 מכיל אזור ORF של 585 bp המקודד 194 חומצות אמינו. המשקל המולקולרי החזוי הוא 21.77 kDa, והנקודה האיזואלקטרית היא 5.21. ניתוח SMART גילה תחום IL-17 טיפוסי בחלבון זה (איור 1A). עץ פילוגנטי נבנה על ידי גיוס חברי IL-17 ממינים של חולייתנים ו-Mytilidae, ו-IL2s שימשו כקבוצת החוץ. כפי שמוצג באיור 1B, IL-17 אלה נאספים לענף ספציפי כדי להבדיל אותם מ-IL-2. בתוך אשכול IL-17, הוצגו שני קלידים לכאורה, האחד מורכב מ-IL-17 של בעלי חוליות והשני מורכב מ-IL-17 של מולים. בקבוצת מולקולה IL-17, McIL-17-3 התקבץ לראשונה עם המולקולה המתאימה ממין Mytilus אחר, M. galloprovincialis (איור 1B).

2.2. יישור מרובה וחיזוי מבנה שלישוני

הליבה של McIL-17-3 מורכבת משני זוגות של גדילים אנטי-מקבילים; זוג אחד כולל גדילים 1 (שאריות 52-58) ו-2 (שאריות 66-72 ו-77-79), בעוד שהשני כולל גדילים 3 (שאריות 89-103) ו-4 (שאריות 110-125) (איור 2B, C) . שני גשרים דיסולפידיים (Cys97/Cys134 ו-Cys125/Cys169) מחברים גדילים 1 ו-3, 2 ו-4, בהתאמה (איור 2A, C). באופן עקבי, IL-17 רכיכות אחרות מכילות גם שני גשרים דיסולפידים אלה בין גדילים 1 ו-3, 2 ו-4 (איור 2A, C). יש לציין שלמרות ש-IL-17 של בעלי חוליות יש גם שני גשרים דיסולפידים, הם קיימים בין 2 ל-4 (איור 2A, C).

2.3. ביטוי תעתיק של McIL-17-3

פרופיל התפלגות הרקמה של תעתיקי McIL{{0}} הוערך על ידי qPCR. התמלילים של McIL-17-3 באו לידי ביטוי בכל הרקמות שנבדקו, ורמות הביטוי בהמוציטים ובזימים היו גבוהות משמעותית מאלו בשריר ה-aductor (איור 3A). הוערך גם ביטוי זמני של תעתיקי McIL-17-3 המוציטים בתגובה לאתגר V. alginolyticus. רמת ה-mRNA של McIL-17-3 הייתה מווסתת משמעותית ב-3 ו-12 HPC (3.13- או עלייה של פי 4.35- בהשוואה ל-0 HPC, בהתאמה), אך לא הייתה חוקיות זמנית ברורה באופן כללי (איור 3B).

איור 1. אפיון מולקולרי של McIL-17-3. (א) ניתוח ארכיטקטורה של דומיינים שמורים ב-McIL-17-3 באמצעות SMART. הוצג דומיין IL-17 שמור. (ב) ניתוח פילוגנטי של McIL-17-3. העץ הפילוגנטי נבנה באמצעות תוכנת MEGAX עם 2000 שכפולים של אתחול בשיטת הצטרפות שכן. McIL-17-3 סומן במשולש ירוק. המינים הכלולים בעץ הפילוגנטי מוצאים כולם ממסד הנתונים של Genebank, וגם מספרי גישה נרשמו בעץ. משולש ירוק מטעם McIL-17-3. (לפירוש ההתייחסויות לצבע באגדת הדמות הזו, הקורא מופנה לגרסת האינטרנט של מאמר זה.)

2.4. ההפעלה של Downstream על ידי McIL-17-3

כפי שמוצג באיור 4, McIL-17-3 רקומביננטי הגביר את פעילות הלוציפראז של pGLNF-κB-luc באופן תלוי מינון. ב-0.5 ו-1.0 מיקרוגרם/באר, פעילות הלוציפראז של pGLNF-κB-luc עלתה פי 2.07- ו-11.07-, בהתאמה.

2.5. אישור של McIL-17-3 כגן יעד של Mc-novel_miR_145

באמצעות חיזוי ביואינפורמטיקה, הגן McIL{{0}} מכיל רצף יעד סטנדרטי עבור Mc-novel_miR_145 ב-30 UTR שלו (איור 5A). חיקוי ומעכב של Mc-novel_miR_145 הועברו יחד עם הפלסמיד הכתב מסוג McIL-17-3-30 UTR מסוג Wild לתאי HEK293 כדי לאשר את המתאם שלהם. כפי שמוצג באיור 5B, חיקוי Mc-novel_miR_145 יכול לעכב את פעילות הלוציפראז של McIL-17-3-30 UTR-WT (0.{{2{{58} ירידה של פי }} בהשוואה לבקרה), בעוד מעכב Mc-novel_miR_145 מקל בצורה יוצאת דופן את ההשפעות (עלייה פי 1.64- בהשוואה ל-Mc-novel_ miR_145 לחקות כקבוצה שנוספה בלבד). כדי להעריך אם Mc-novel{{30}}miR_145 ממקד ישירות לגן McIL-17-3 דרך אתר היעד ב-30 UTR, בנינו את הגרסה המוטנטית של פלסמידים מדווחי לוציפראז ששינה את רצפי המיקוד של Mc-novel_miR_145 ב-MCIL-17-3 30 UTR. כפי שמוצג באיור 5C, חיקוי Mc-novel_miR_145 הפחית משמעותית את פעילות הלוציפראז של התאים שהועברו עם ה-MCIL-17-3-30 UTR-WT (פי 0.27-) ירידה), בעוד שלא נצפה שינוי בפעילות הלוציפראז בתאים שעברו טרנספוגציה עם UTR-MUT של McIL-17-3-30. בנוסף, ההשפעות תלויות המינון של ה-Mc-novel_miR_145 מחקות את העיכוב של פעילות הלוציפראז של McIL-17-3-30 UTR-WT גם ב-24 שעות לאחר ההעברה (0 .71-, 0.43- וירידה של פי 0.20- בהשוואה לבקרה, בהתאמה, איור 5D).

איור 2. יישור מרובים של McIL-17-3 עם בני משפחה אחרים של IL-17. (א) רצף חומצות האמינו של McIL-17-3 היה מיושר לזה של IL-17 אחרים שנשלפו ממולים ובעלי חוליות, כולל עכברים ודגי זברה. ציסטינים אלה, היוצרים קשר קנוני, סומנו בירוק, עם שאריות חומצות אמינו מוחלפות מסומנות באדום. קשר הציסטאין מסומן בקווי צבע, כחול פירושו נוכחותם ברכיכות ואדום פירושו נוכחותם בבעלי חוליות. הערה: רק החצי השני של יישור הרצף נשמר להדמיה. (ב) המבנה השלישוני של החלבון McIL-17-3 נחזה באמצעות המודל השוויצרי ותוכנת pyMol. ציסטינים אלה, היוצרים קשר קנוני, סומנו. (ג) ייצוג מצויר של קפל הציסטאין הקנוני. שאריות ציסטאין סומנו על ידי עיגולים מלאים; אלה שהיו בחלבוני IL-17 היו צהובים, בעוד שהשניים שהוחמצו היו אפורים. (לפירוש ההתייחסויות לצבע באגדת הדמות הזו, הקורא מופנה לגרסת האינטרנט של מאמר זה.)

איור 3. ניתוח פרופיל ביטוי של תמלילי McIL-17-3. (א) הפצה של תעתיקי McIL-17-3 ברקמות מולים נפוצות. (ב) שינויים בביטוי זמני של תעתיקי McIL-17-3 בתגובה לאתגר V. alginolyticus. התוצאות הובעו כממוצע ± SD (n=3, * p < 0.05, ** p < 0.01). (לפירוש ההתייחסויות לצבע באגדת הדמות הזו, הקורא מופנה לגרסת האינטרנט של מאמר זה.)

איור 4. ההפעלה של כתב NF-κB על ידי McIL-17-3. הוקטור הרקומביננטי pEGFP-McIL- 17-3 בשלושה ריכוזים (0.1, 0.5, ו-1.{{10}} מיקרוגרם/באר) הועבר במקביל לתוך תאי HEK293 באמצעות Lipo6000TM למשך 24 שעות. פעילויות הלוציפראז היחסיות חושבו על ידי נרמול לערך pRLTK. תוצאות הניסוי באו לידי ביטוי כשינויים מתקפלים על ידי השוואת פעילויות הלוציפראז של תאים המושרים וקטורים רקומביננטיים עם אלה של תאים ריקים המושרים על ידי וקטור באותו ריכוז. כל ערך הוצג כממוצע ± SD (n=3), והפסים עם סמל כוכבית היו שונים באופן מובהק (* p < 0.05, ** p < 0.01).

איור 5. Mc-novel_miR_145 ממוקד McIL-17-3. (א) רצף ה-MCIL-17-3 30 UTR הוכנס לווקטור pmiR-RB-Report™, פלסמידים מסוג פרא ומוטנטים שנבנו בהתאמה. רצף Mcnovel_miR{{10}} ואתר יעד של McIL-17-3-30 UTR ורצף אתר מוטנטי סומנו בסמנים אדומים. (ב) הפלסמיד של McIL-17-3-30 UTR-WT הועבר במקביל עם Mc-novel_miR_145 mimic או Mc-novel_miR{{{37} מעכב }}} לתוך תאי HEK293. (ג) תאי HEK293 הועברו עם McIL-17-3-30 UTR-WT או הסוג המוטנטי של McIL-17-3-30 UTR-MUT, יחד עם Mc-novel_miR_145 או NC , למשך 24 שעות. פעילות הלוציפראז נמדדה באמצעות מערכת בדיקת הדו-לוציפראז-דוא"ל. (ד) ניסויי שיפוע הריכוז נערכו עבור טרנספקציה של Mc-novel_miR_145. כל הנתונים מוצגים כאמצעי ± SD מלפחות שלושה ניסויים משולשים עצמאיים. **, p < 0.01, *, p < 0.05 לעומת הפקדים. (לפירוש ההתייחסויות לצבע באגדת הדמות הזו, הקורא מופנה לגרסת האינטרנט של מאמר זה.)

2.6. Mc-novel_miR_145 מווסת באופן שלילי את הביטוי של McIL-17-3

ההמוציטים של M. coruscus הועברו עם חיקוי Mc-novel_miR_145, מעכב Mcnovel_miR_145 והבקרות שלהם, והשינויים ב-MCIL{{ ביטוי 5}} הוערך על רמות התעתיק והחלבון. כפי שמוצג באיור 6A, הביטוי של Mc-novel_miR_145 היה מווסת באופן משמעותי כלפי מעלה (עלייה של פי 8.83-) על ידי החיקוי שלו ומווסת למטה ({{14 }}.41-ירידה פי כמה) על ידי המדכא שלו בהמוציטים, מה שמרמז על השפעות יעילות של חומרים מורכבים סינתטיים אלה. באיור 6B, הביטוי של McIL-17-3 אנדוגני עוכב באופן משמעותי (0.51-ירידה פי כמה) על ידי חיקוי Mc-novel_miR_145 ב- רמת שעתוק ומושרה באופן משמעותי (פי 2.42-עלייה) על ידי מעכב Mcnovel_miR_145. כדי לחקור את ההשפעות של Mc-novel_miR_145 על הביטוי של McIL-17-3 ברמת החלבון, נוצר נוגדן רב שבטי נגד McIL-17-3. כפי שמוצג בנתיבים 2 ו-3 באיור 6C, החלבון הרקומביננטי McIL -17-3 התבטא בהצלחה ב-E. coli. סגוליות הנוגדנים נבדקה עם חלבון מולים מהמוציטים על ידי Western blot. פס בודד של כ-22 kDa, התואם למסה המולקולרית של McIL -17-3, נצפתה (מסלול 4 באיור 6C). התוצאות של הכתם המערבי באיור 6D הראו את הרגולציה השלילית של McIL-17-3 ברמת החלבון על ידי Mc-novel_miR_145.

Fאיור 6. Mc-novel_miR_145 עיכב את הביטוי של McIL-17-3 בהמוציטים של M. coruscus. (א) הביטוי של Mc-novel_miR_145 הוערך על ידי qPCR בהמוציטים שהועברו ב-145 חיקויים, 145 מעכבים ובקרה שלהם. (ב) לאחר טרנספקציה במשך 24 שעות, רמות התעתיק של McIL-17-3 נקבעו על ידי qPCR. (ג) ביטוי רקומביננטי, טיהור ותכשיר האנטי-סרום עבור McIL-17-3. מסלול M, סמן משקל מולקולרי חלבון סטנדרטי. מסלול 1, בקרה שלילית (ללא אינדוקציה). מסלול 2, חלבון רקומביננטי מושרה McIL-17-3. נתיב 3, McIL מטוהר- 17-3. מסלול 4, כתם ווסטרן עם נוגדן אנטי-McIL{{20}} בהמוציטים של M. coruscus. (ד) לאחר טרנספקציה במשך 24 שעות, רמות החלבון של McIL-17-3 נקבעו על ידי Western blot. ** p < 0.01 לעומת הפקדים

2.7. אפופטוזיס של המוציטים

שיעור האפופטוטי המוציטים של ארבע קבוצות, כלומר, NC+LPS, McIL-17-3+LPS, Mcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS ו-Mc-novel{{6} }miR_145-i+McIL-17-3+LPS נותח על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות צביעה כפולה. לאחר ביטוי יתר של McIL-17-3, שיעור האפופטוזיס של המוציטים שאותרו ב-LPS היה מווסת באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 7A(a,b), B). כאשר McIL-17-3 הועבר במקביל עם Mc-novel_miR_145, שיעור האפופטוזיס של המוציטים המושרה על ידי LPS ירד באופן משמעותי בהשוואה לזה של McIL-17-3 שעבר טרנספקציה בלבד (איור 7A( ב, ג), ב). לעומת זאת, שיעור האפופטוטי המוציטים הראה עלייה יוצאת דופן בקבוצת Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS בהשוואה לקבוצת McIL-17-3+LPS (איור 7A) (ב, ד), ב).

איור 7. קצב האפופטוטי ההמוציטים הוערך על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות פרופידיום יודיד (PI) וכתם FITC-Annexin-V

3. דיון

IL-17 מוכרת כאחת ממשפחות הציטוקינים הפרו-דלקתיות החשובות, שיכולות להשתתף ביעילות בפתוגנזה של מחלות שונות [42]. במחקר הקודם שלנו, הומולוג M. coruscus IL-17 הראה ביטוי דיפרנציאלי לפני ואחרי זיהום V. alginolyticus באמצעות רצף תעתיקים [41], מה שמרמז על תפקידו הפוטנציאלי בתגובה החיסונית המולדת לאתגר חיידקי. כאן, אפינו את ההומלוג הזה של IL-17 וקראנו לו McIL-17-3. חיזוי התחום הפונקציונלי חשף תחום IL-17 טיפוסי, המעניק את השתייכות הגנים המזוהה כעת למשפחת הציטוקינים IL-17. בעץ הפילוגנטי, הגן החדש של IL-17 זה הראה קרבה מאוד קרובה ל-IL-17- 3 ממין Mytilus אחר, M. galloprovincialis. בנוסף, הם חלקו זהות גבוהה מאוד של חומצות אמינו של 95%, ולכן מינינו את הגן החדש IL-17 כ-McIL-17-3 כדי לעקוב אחר מוסכמות השמות המשמשת במיני Mytilus. משפחת IL-17 מורכבת משישה חברים וחמישה קולטנים בבני אדם [43], אך היא חוותה התרחבות גנטית עצומה בחסרי חוליות ימיים, במיוחד מולים [11]. בהתבסס על זה, הנתונים שלנו העלו ש-McIL-17-3 לא היה קשור ישירות לגנים מסוימים במשפחת ה-IL-17 האנושית. קפל הקשר הציסטאין הממוקם ב--sheets הוא המאפיין האופייני למשפחת IL-17 [5]. באופן צפוי, החיזוי של המבנה השלישוני חשף קפל ציסטאין-קשר בחלבון McIL-17-3, מה שהעמיק עוד יותר את הייחוס של McIL-17-3 למשפחת הציטוקינים IL-17. כדי להמשיך ולחקור את הבידול של רצפי חומצות אמינו IL-17 בין מינים שונים, כמה IL-17 של מולים טיפוסיים ו-Mus musculus IL-17-A ל-IL-17-F ו-Danio rerio IL-17-1 ל-IL-17-3 נבחרו לביצוע ניתוח היישור המרובה. התוצאות הראו ממצא מעניין שמיקום הקישור הדיסולפיד של IL-17s במולים ובעלי חוליות לא היה עקבי: שני קישורי דיסולפיד אלו התקיימו בין -גדילים 1 ו-3, 2 ו-4, בהתאמה, מולים, אך רק בין -גדילים 2 ו-4 בבעלי חוליות. באתר הציסטאין הראשון והרביעי, IL-17 של בעלי חוליות מחליפים את הציסטאין בסרין; לעומת זאת, באתר הציסטאין השני, IL-17 של מולים מחליפים את הציסטאין ב-threoninentiation בהצמדה דיסולפידית במולים ובעלי חוליות, והמנגנון הבסיסי שלו אינו ברור ודורש מחקר נוסף. בהתחשב בפולימורפיזם של IL-17s במולים, ייתכן שהקישור הדיסולפידי בין -גדילים 1 ו-3 לא יהיה חזק כמו זה שבין 2 ל-4, מה שמקנה להם פלסטיות רבה יותר במולים. בכל מקרה, ניתוח של תחומים פונקציונליים ומבנה שלישוני מצביע על כך שה-McIL-17-3 המזוהה כעת אופייני לציטוקין המוסל IL-17 ועשוי למלא תפקיד תפקודי דומה למקביליו ברכיכות. הביטוי של גנים IL-17 ברקמות אנושיות משתנה מאוד, כאשר חלקם מתבטאים בתאים בודדים בלבד ואחרים במספר רב של רקמות [44,45]. רוב המחקרים על רכיכות הראו של-IL-17 היה פרופיל ביטוי מכונן [13,15,17,46,47]. עם זאת, Li, Zhang, Zhang, Xiang, Tong, Qu ו-Yu [47] הראו תוצאה לא עקבית ב-C. gigas IL-17s: CgIL-17-2, -3, {{ 65}} ו--6 באו לידי ביטוי גבוה בזימים של C. gigas, בלוטות העיכול והמעטפת, אך כמעט ולא באו לידי ביטוי ברקמות אחרות. כאן, תעתיקי McIL-17-3 נמצאו בכל הרקמות שנבדקו, מה שמצביע על התפקידים התפקודיים המרובים שלו במגוון פעילויות פיזיולוגיות. עם זאת, רמות הביטוי הגבוהות של McIL-17-3 בחלק מהרקמות הקשורות למערכת החיסון הרכיכותית, כגון המוציטים, זימים ובלוטות עיכול, מרמזות על מעורבות קרובה יותר שלו לתגובה חיסונית. לאחר מכן, ההיענות המהירה שלו להתקפת V. alginolyticus מעמיקה נקודה זו. הזרקת V. alginolyticus הוסתה באופן משמעותי את הביטוי של McIL-17-3, ותוצאות דומות נצפו גם ב-IL-17 רכיכות אחרות. הזרקת V. anguillarum לתוך C. gigas גרמה לעלייה מהירה בשפע התעתיק של CgIL-17 בהמוציטים, מה שמצביע על כך שזה היה גן חיסוני בשלב מוקדם [46]. כאשר C. gigas סבל מהתקף של פתוגן אחר, V. splendidus, גם רמת ה-mRNA של CgIL-17-5 בהמוציטים עלתה באופן משמעותי [15]. הגירוי של LPS, המרכיב הפתוגני העיקרי של חיידקים, הגביר באופן דרמטי את הביטוי של PfIL-17 בבלוטות העיכול של צדפת הפנינה P. fucata [17]. בנוסף, LPS יכול לגרום לביטוי של CgIL-17-3 ב-C. gigas [47] ו-PmIL-17-2 ב-P. fucata martensii [13]. תוצאות אלו הצביעו ביחד על כך ש-IL-17 מילאה תפקיד חשוב בהגנה החיסונית של רכיכות מפני התקפת חיידקים. במחקר זה, McIL-17-3 הראה את יכולת ההפעלה של מסלול NF-κB במורד הזרם. תוצאות דומות נצפו גם בכמה מיני רכיכות. באויסטר הפנינה P. fucata, PfIL-17 הציג גם הפעלה של מסלול ה-NF-κB בתאי HEK293 על ידי מבחני ה-luciferase reporter [17]. ב-C. gigas, CgIL-17-5 קידם את ההפעלה של CgMAPKs ואת הטרנסלוקציה הגרעינית של CgRel ו-CgAP-1 כדי לקדם את ביטוי ה-mRNA של ציטוקינים ופפטידים אנטיבקטריאליים [15]. הוכח שאופן הפעולה של IL-17 מבוסס על האיחוד שלו לדימרים (הומודימרים או הטרודימרים), שפעילותם תלויה מאוד בהתקשרותם לקולטנים (IL-17Rs) שהם יַעַד. קולטנים אלו מכילים תחום ציטופלזמי משומר (SEFIR) המקיים אינטראקציה עם חלבוני מתאמים כדי ליזום מסלולי העברת אותות במורד הזרם להפעלת גורמי שעתוק כגון NF-KB וקידום ביטוי של גנים חיסוניים ופרו-דלקתיים, כגון ציטוקינים ופפטידים אנטי-מיקרוביאליים [ 11,48,49].

cistanche tubulosa- לשפר את המערכת החיסונית

תוצאות אלו מצביעות על כך ש-IL-17 רכיכות עשוי להיות בעל אותו אופן פעולה כמו עמיתיהם בבעלי חוליות. יש לאשר זאת במחקרים עתידיים. המתאמים בין miRNAs ו-IL-17 נמצאו במספר מודלים של מחלות אנושיות. Niimoto, et al. [50] אישר את המתאם החיובי בין miR-146a ו-IL-17a ביטוי בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי ובסינוביום מחולי דלקת מפרקים שגרונית וסיכם את התפקוד החיוני של miR-146a ב- בידול של תאים מייצרים IL-17-. בחולי פסוריאזיס, miR-146a פועל כמעכב חזק של דלקת עור המונעת IL-17-, ורמות הנמוכות שלו עשויות לתרום להופעת מחלה מוקדמת אצל אנשים רגישים גנטית [51]. MiR-146a עשוי לשפר דלקת חניכיים על ידי ויסות מטה של ​​הביטוי של IL-17 ועיכוב שגשוג של תאי גזע של רצועות חניכיים [52]. MiR-155 מווסת באופן שלילי את הביטוי של IL-17 כדי להשתתף בתגובה החיסונית של המארח לדלקת ריאות חיידקית פוסט-ויראלית בריאת עכברים; עכברים מעוכבי miR-155 מראים ביטוי חזק יותר של IL-17 בריאה, מלווה בפינוי חיידקי משופר [53]. מחקרים אלו מצביעים על כך ש-IL-17 מווסת על ידי מספר רב של miRNA ומשתנה בהתאם למחלה ולסוג התא [20]. במחקר קודם, ביצענו ניתוח משולב של ה-miRNAome וה-transcriptome כדי לחקור את הרגולציה האינטראקטיבית של miRNA-mRNA על ידי M. coruscus בתגובה לזיהום V. alginolyticus. התוצאות חזו ש-Mc-novel_miR_145 יכול למקד את McIL-17-3 להשתתף בתגובה החיסונית המולדת לזיהום חיידקי [41]. במטרה לחקור לעומק את המנגנון הבסיסי של הרגולציה של Mcnovel_miR_145 של McIL-17-3, סדרה של ניסויי מעבדה נערכו במחקרים הנוכחיים. החישוב חזה ש-Mc-novel_miR_145 יכול למקד ל-30 UTR של McIL-17-3. מבחני הדיווח של הלוציפראז הבאים שבוצעו בתאי HEK293 שהועברו יחד על ידי Mc-novel_miR_145 מחקים, מחקים NC, מעכב, מעכב NC עם McIL-17-3-30 UTR-WT, -MUT reporter פלסמידים אישרו עוד נקודה זו. בנוסף, Mc-novel_miR_145 מחקה, מחקה NC, מעכב ומעכב NC הועברו להמוציטים של M. coruscus כדי להעריך את השפעתם על ביטוי McIL-17-3 ברמות תעתיק וחלבון . הביטוי של McIL-17-3 היה מווסת מטה באופן משמעותי בקבוצת ה-Mc-novel_miR_145 מחקות טרנספקציה, בעוד שהוסדרה עלייה משמעותית ב-Mc-novel_miR _145 קבוצת טרנספקציית מעכבים, מה שמציע רגולציה שלילית של McIL-17-3 על ידי Mc-novel_miR_145. התוצאות הנוכחיות היו מנוגדות למחקר קודם. ב-Pinctada martensii, Tian, ​​Zheng, Huang, Jiao ו-Du [30] מצאו שלמרות ש-Pm-miR-29a יכול לכוון ל-IL-17, הרגולציה הייתה חיובית, כביטוי של IL{{ 65}} במעטפת והזימה של Pinctada martensii היה מווסת מעלה לאחר ביטוי יתר של Pm-miR-29a. בהתחשב בכך ש-P. martensii ו-M. coruscus שייכים שניהם לביסתיים וקשורים קרובים יחסית, תוצאות לא עקביות אלו מצביעות על כך שהוויסות של IL-17s ברכיכות עשוי להשתנות עם miRNAs. מלבד זאת, אף ספרות לא דיווחה על המתאם בין miRNAs ו-IL-17s ברכיכות, ולכן אין מחקרים מקבילים יותר להשוואת התוצאות הנוכחיות. עם זאת, כמה מחקרים דיווחו על קשרי מיקוד בין מירנאים ספציפיים וגנים ספציפיים הקשורים למערכת החיסון ברכיכות.

לדוגמה, cgi-miR-2d מגביר את הפגוציטוזיס של צדפות על ידי ויסות שלילי של CgIκB2 ב-Crassostrea gigas [31]. בנוסף, cgi-miR-2d גם מווסתת באופן שלילי את הביטוי של גן אחד דמוי כולין טרנספורטר כדי להשתתף באימונומודולציה מתוחכמת של המוציטים של צדפות בשלב מוקדם של זיהום [32]. מחקרים אלה לפחות מצביעים על כך ש-miRNAs ממלאים תפקיד פוטנציאלי באיתות חיסוני מולד על ידי מיקוד לגנים ספציפיים ברכיכות, בדיוק כפי שהם עושים בבעלי חוליות. לאחר מכן, ביקשנו לחקור את הפונקציה הפוטנציאלית של האינטראקציה בין Mcnovel_miR_145 ו-McIL{{10}} בחסינות המולדת של M. coruscus, ותפקידם ב אפופטוזיס המושרה על ידי LPS הוא מוקד תשומת הלב שלנו. LPS היא מולקולה פרו-דלקתית מאוד המהווה מרכיב במעטפת החיצונית של כל החיידקים הגראם-שליליים. הוכח כי LPS מעורר אפופטוזיס בתאים ורקמות שונות, כגון מקרופאגים [54], תאי אנדותל [55] וריאות עכברים [56]. ניסוי ראשוני הוכיח שחשיפה ל-LPS בריכוז נומינלי של 0.1 מ"ג/מ"ל למשך 24 שעות גרמה באופן משמעותי לאפופטוזיס של המוציטים מ-M. coruscus. לאחר ביטוי יתר של McIL-17-3, רמת האפופטוזיס של המוציטים של M. coruscus עלתה משמעותית בהשוואה לקבוצת הביקורת, מה שמצביע על כך ש-M.CIL-17-3 עשויה לחזק אפופטוזיס המושרה על ידי LPS של המוציטים ב-M. coruscus. התוצאות הנוכחיות היו עקביות עם כמה מחקרים קודמים. בניוטרופילים אנושיים, IL-17A יכול להפחית את ההשפעות האנטי-אפופטוטיות המתווכות על ידי גורם מגרה של מושבה של מקרופאגים גרנולוציטים [57]. IL-17 גורם לאפופטוזיס של תאי אנדותל כלי דם, שהוא מנגנון פוטנציאלי של תסמונת כלילית חריפה [58]. מחיקה גנטית של IL-17A מפחיתה אפופטוזיס של תאי מכתשית מסוג II ובכך מקלה על מחלת ריאות חסימתית כרונית [59]. עם זאת, יש עדיין כמה טיעונים מנוגדים. כאשר עכברים נדבקים בנגיף האנצפלומיאליטיס של תיילר, IL-6 ו-IL-17 מקדמים באופן סינרגטי התמדה ויראלית על ידי עיכוב אפופטוזיס תאית [60]. התנגשויות אלו מצביעות על כך שהמנגנון הבסיסי של אפופטוזיס -17-מתווכת IL הוא מורכב, ו-IL-17 עשויים לשחק פונקציות הפוכות בהתאם לסוג הזיהום.

כאשר McIL-17-3 הועברו במקביל עם Mc-novel_miR_145, רמת האפופטוזיס המושרה על ידי LPS הייתה מווסתת משמעותית בהשוואה ל-MCIL-17-3 היחיד שעבר טרנספקציה בקבוצה, בהתאם, רמת האפופטוזיס הייתה מווסתת משמעותית לאחר ש-McIL-17-3 הועבר במקביל עם מעכב Mc-novel_miR_145. הוכח כי Mc-novel_miR_145 מווסת לרעה את McIL-17-3, ולפיכך הגענו למסקנה ש-McIL-17-3 החמירה את האפופטוזיס של המוציטים המושרה על ידי LPS, בעוד Mc-novel _miR_145 הקל על ההשפעות. כמה miRNAs שהוכחו כמעורבים באפופטוזיס של תאי אדם ועכבר זוהו ברכיכות בשנים האחרונות. לדוגמה, miR-125b ו-miR- 335 נמצאו בצדפה שטוחה Ostrea edulis [21], miR-184 נמצאה בהמוציטים של צדפה Crassostrea gigas [23], ו-miR{{ 26}}, -29, -96, -182 ו--193 נמצאו במערכת העצבים המרכזית המתחדשת של L. stagnalis [25]. מיRNA הקשורים לאפופטוזיס אלו שזוהו באמצעות רצף תפוקה גבוהה וחישובי ביולוגיה מאשרים את קיומה של אפופטוזיס בתיווך מירנה ברכיכות. חן וחב'. דיווח על ויסות מעלה של miR-2ד לאחר אתגר Vibrio splendidus בהמוציטים של Crassostrea gigas. ביטוי היתר של miR-2d היה בקורלציה עם ביטוי מופחת של IκB2, ועלייה משמעותית בשיעור הפגוציטוזיס של המוציטים, קשור לדיכוי של אפופטוזיס [31]. התוצאות היו עקביות עם המחקר הנוכחי שלנו, ביחד, לכאורה מרמזות ש-miRNAs מפעילים פונקציה מעכבת על אפופטוזיס של תאים ברכיכות. למעשה, רוב ה-miRNAs הקשורים לאפופטוזיס בבני אדם הראו השפעות מעכבות על אפופטוזיס. MiR-146 מגן על תאי A549 ו-H1975 מפני אפופטוזיס הנגרמת על ידי LPS ופגיעה בדלקת באמצעות וויסות מעלה של Sirt1 ובכך חוסם את נתיבי NF-κB ו-Notch [61]. יתר על כן, miR-146 מחליש אפופטוזיס הפטוציטים המושרה על ידי הקרנה ו-LPS באמצעות עיכוב של מסלול TLR4 [62]. MiR-93 מעכב אפופטוזיס של כונדרוציטים בדלקת מפרקים ניוונית על ידי מיקוד למסלול האיתות TLR4/NF-κB [63]. MiR-129-5p מקל על פגיעה בחוט השדרה בעכברים באמצעות דיכוי אפופטוזיס דרך מסלול HMGB1/TLR4/NF-κB [64]. עם זאת, יש עדיין כמה מירנאים ספציפיים שמראים פעולות חיזוק על אפופטוזיס. לדוגמה, נמצא כי miR-203 מאיץ אפופטוזיס המושרה על ידי LPS על ידי מיקוד ל-PIK3CA בתאי אפיתל מכתשית [65]. תוצאות אלו מצביעות על המורכבות של המנגנון הבסיסי של אפופטוזיס בתיווך מירנה.

4. חומרים ושיטות

4.1. עיצוב נסיוני

ראשית, McIL-17-3 זוהה ואופיינה מ-M. coruscus באמצעות ניתוח ביואינפורמטי. לאחר מכן, התפלגות הרקמות של תעתיקי McIL-17-3 וכן התגובה שלה לאתגר חיידקי הוערכו על ידי מבחני PCR כמותיים בזמן אמת (qPCR). לאחר מכן, הקשר בין McIL-17-3 ל-Mc-novel_miR_145 נקבע על ידי אנליזה של luciferase reporter שבוצעה בתאי HEK293 וב-M. coruscus hemocytes. בנוסף, תפקידם התפקודי באפופטוזיס המושרה על ידי LPS הוערך על ידי ציטומטריית זרימה.

4.2. מי ים מלאכותיים

לאחר שלושה ימים של אוורור של מי ברז עירוניים, הוסיפו גביש ים מיידי (Haiding LTD, Ji'an, סין), ערבבו ביסודיות והותכו להגיע למליחות של 30‰. יש לאוורר את מי הים המלאכותיים המוגדרים במשך שעתיים לפני השימוש.

4.3. בעלי חיים

מולית עבה M. coruscus (אורך קונכייה, 9.82 ± 0.53 ס"מ; רוחב קונכייה, 4.68 ± 0.45 ס"מ; משקל רטוב, 71.2 ± 2.7 גרם) נרכשה משוק דונגה בג'ושאן, מחוז ג'ג'יאנג, סין. כל המולים נשמרו במיכלים מלאים ב-ASW של כ-25 ◦C ובמליחות של 30‰ במשך יותר משבוע לפני הניסויים הבאים.

4.4. זיהוי cDNA של McIL-17-3

הומולוג IL-17 (McIL-17-3) היה בסיליקו משובט מהתעתיק באורך מלא של M. coruscus (מספר גישה: PRJNA798880, F01_תעתיק_12404). הליך ה-Blast בוצע כדי לחזות את רצף חומצות האמינו המשוער של McIL-17-3, ואחריו ניתוח תחום תפקודי עם SMART והערכת קשר פילוגנטי עם MEGA-X. היישור המרובה בוצע באמצעות הליך ClustalW. המודל השוויצרי והמאגר שימשו כדי לחזות את המבנה השלישוני של החלבון McIL-17-3. ההליך המפורט היה על פי המחקר הקודם שלנו [66].

4.5. מבחני PCR כמותיים בזמן אמת

מבחני PCR בזמן אמת כמותיים (qPCR) הם כלי רב עוצמה לאיתור ומדידה של רמות ביטוי גנים. כאן, התפלגות הרקמות של McIL-17-3 הוערכה בשיטת qPCR. בנוסף, שינויים בביטוי של McIL-17-3 mRNA בתגובה לזיהום חיידקי זוהו גם על ידי qPCR. פרופיל התפלגות הרקמות של McIL-17-3 נקבע בזימים, מעטפת, בלוטות עיכול, גונדה, שריר אדוקטור והמוציטים באמצעות qPCR שתוכנת ב-95 ◦C למשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95 ◦C למשך 10 שניות, 60 ◦C למשך 45 שניות. רקמות אלו נותחו מתשעה יחידי מולים ואוחדו יחד כדי להקל על התמיינות אינדיבידואלית. בניסוי האתגר החיידקי, V. alginolyticus חי שימש כגירויים חיסוניים. נפח של 100 μL של חיידקים מומסים במי ים (1 × 108 CFU mL−1 ) הוזרק לתוך התוספת של מולים. לא נעשה שימוש במולים שהוזרקו כביקורת. תשעה מולים נדגמו באופן אקראי מכל קבוצה ב-0, 3, 6, 12, 24 ו-36 שעות לאחר האתגר (hpc). ההמוציטים משלושה מולים אספו יחד כדי להיחשב כדגימה אחת, והיו שלוש דגימות לכל נקודת זמן. מיקרו-RNA חולצו באמצעות ערכת ה-miRNA Extraction (HaiGENE, מס' קטגוריה: B1802), וה-cDNA סונתז באמצעות ערכת ה-MiRcute Plus miRNA First-Strand cDNA (Tiangen, מס' קטגוריה: 4992786) ו-qPCR בוצע באמצעות ערכת miRcute Plus miRNA qPCR (Tiangen, מס' קטגוריה: 4992887). גנים U6 ו-Actin שימשו כאסמכתאות פנימיות עבור qPCR ו-miRNAs qPCR, בהתאמה. צמדי הפריימרים הספציפיים המשמשים בניסוי זה מפורטים בטבלה 1. רמות הביטוי היחסיות נמדדו בשיטת 2−∆∆Ct [67].

טבלה 1. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בזוגות פריימר של PCR.

4.6. תרבית תאים

תאי HEK293 של יונקים (RiboBio Ltd., גואנגג'ואו, סין) הועסקו כדי לבצע את מבחני הדיווח לוציפראז כדי לקבוע את ההפעלה במורד הזרם על ידי McIL- 17-3 וכן את הקשר בין Mc-novel_miR{{ 4}} ו-McIL-17-3. תאי HEK293 תורבו במדיום OPTI-MEM (GIBCO) ב-37 ◦C, 5% CO2. כדי להמשיך ולחקור את הרגולציה של McIL-17-3 על ידי Mc-novel_miR_145 ותפקידם התפקודי באפופטוזיס המושרה על ידי LPS, המוציטים של M. coruscus נלקחו משריר האדוקטור של כל אחד מהם. מול עם מחט חד פעמית 0.5 מ"מ בקוטר (25 גרם) המכילה 0.5 מ"ל של נוגד הקרישה. המוציטים נאספו בצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-3000 סל"ד, 4 ◦C ונוספו 0.25% טריפסין (Solarbio). המוציטים הושעו במדיום L-15 המכיל 15% סרום בקר עוברי (Solarbio) ותופחו ב-26 ◦C עם 5% CO2.

4.7. סינתזה של חיקוי מירנה ומעכבים

נוקלאוטידים ה-Mc-roman_miR_145 המחקים, המעכבים והבקרה הורכבו על ידי GenePharma (שנחאי). הרצף שלהם הוא כדלקמן: Mc-novel_miR_145 mimic, 52032- UCCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; מעכב Mc-novel_miR_145, 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (שונה כימית על ידי 20 אומות); חיקוי בקרה שלילי, 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; ומעכבי בקרה שליליים, 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (שונה כימית על ידי 20 אומות).

4.8. ניתוח כתב לוציפראז

מבחני כתב לוציפראז נמצאים בשימוש נרחב לחקר ביטוי גנים ופעילות רגולטורית. כמות האור שנוצרת היא פרופורציונלית לכמות האנזים לוציפראז המיוצר, אשר בתורו משקפת את פעילות האלמנט הרגולטורי. לאחר מכן מודדים את פעילות הלוציפראז באמצעות luminometer, והתוצאות מנותחות ומתפרשות כדי לקבוע את הפעילות הרגולטורית של האלמנט הנחקר. מבחני דיווח של Luciferase הופעלו כדי לנתח את ההפעלה במורד הזרם של McIL {{0}}. בניסוי זה, הפלסמיד pEGFP-McIL-17-3 (0.1, 0.5 ו-1.0 מיקרוגרם/באר) יחד עם ה-pGLNF-κb- פלסמיד luc reporter (0.25 מיקרוגרם/באר) הועברו במקביל לתאי HEK293 באמצעות Lipo6000TM למשך 24 שעות. פלסמיד ריק pEGFP-N1 שימש כביקורת. פעילות לוציפראז נמדדה באמצעות מערכת Dual-Luciferase® Reporter Assay (Promega, מדיסון, WI, ארה"ב) על פי המפרט, כאשר Renilla luciferase משמש כאמצעי הבקרה. Mc-novel_miR_145 המיקוד על McIL-17-3 אושר גם על ידי מבחני דיווח של luciferase. החישוב הביואינפורמטי חזה ש-Mc-novel_miR_145 יכול למקד את ה-30 -UTR של McIL-17-3, ולאחר מכן שיבט את 30 -UTR של McIL{{ 29}} לתוך וקטור ה-luciferase reporter pmiR-RB-ReportTM כדי לבנות את הפלסמיד הפראי McIL-17-3-30 UTR-WT reporter. וקטור הכתב מסוג McIL-17-3-30 UTR-MUT נבנה על ידי מוטציה של הנוקלאוטיד ב-1023-1040 אתרים: TCCGAAGCGCTTTTCTGG ל-AGGCTTCGCGAAGACC. אוליגו RNA (Mc-novel_miR_196 NC, mimic, NCi, inhibitor) הועבר יחד עם McIL-17-3- 3 0 UTR-WT או McIL-17-3-30 UTR-MUT לתוך HEK293 תאים באמצעות Lipo6000TM.

4.9. ביטוי רקומביננטי, טיהור והכנת אנטי-סרום

כדי להעריך את ההשפעה של Mc-novel_miR_145 על הביטוי של החלבון McIL-17-3, הוכן אנטי-סרום של McIL-17-3. קטע ה-cDNA המכסה את מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של McIL-17-3 הוגבר עם זוג פריימר ספציפי אחד (טבלה 1) והוכנס לוקטור pET-32. הפלסמיד הרקומביננטי pET-32a-McIL{{10}} עבר טרנספורמציה ל-Escherichia coli (DE3) (Takara) והודגר במדיום LB (המכיל 50 מ"ג L-1 kanamycin) ב-37 ◦C עם ניעור ב-130 סל"ד למשך 4 שעות. לאחר שהצפיפות האופטית הגיעה לספיגה 0.6 ב-600 ננומטר, הוספה לתמיסת החיידקים האיזופרופיל-ביתא-D-תיוגלקטופיה בפנים (IPTG) עם ריכוז סופי של 1 mM כדי לגרום לביטוי של McIL רקומביננטי{ {24}} חלבון (rMcIL-17-3). לאחר דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות, המדיום עבר צנטריפוגה ב-8000 סל"ד למשך 30 דקות כדי לאסוף את החיידקים, ולאחר מכן השעיה במאגר TBS (20 מ"מ Tris-HCl, 150 מ"מ NaCl, pH 8.0). ה-rMcIL -17-3 טוהר על ידי כרומטוגרפיה זיקה של Ni-nitrilotriacetic acid (NI-NTA), והחלבון המטוהר עבר דיאליזה מתוך imidazole למשך 24 שעות. החלבון שנוצר בודד על ידי הפחתת 12% אלקטרופורזה של ג'ל SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE). החלבון המטוהר קופל מחדש במאגר שיפוע urea-TBS גליצרול (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM גלוטתיון מופחת, 10% גליצרול, 0.2 mM אוקסיד גלוטתיון, ריכוז אוריאה שיפוע של 6, 4, 3, 2 , 1 ו-0 M אוריאה בכל שיפוע, pH 7.4, כל שיפוע ב-4 ◦C למשך 12 שעות). לאחר מכן, החלבון שנוצר שימש כדי לחסן עכברים 6-בני שבוע כדי לרכוש נוגדנים רב שבטיים.

4.10. סוטה מערבית

דגימות חלבון חולצו מהמוציטים עם חיץ תמוגה RIPA (Beyotime), ולאחר מכן זוהה הריכוז עם ערכת BCA. לאחר בידוד על ידי SDS-PAGE, החלבון הועבר לממברנות PVDF עם אטימה על ידי 5% אבקת חלב רזה ב-TBST (20 Mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Tween-20, pH 8.0), ואחריו הדגירה של הנוגדן נגד McIL-17-3 למשך הלילה. לאחר מכן, הממברנות הודגרו עם תמיסה מדוללת של נוגדן IgG עז נגד עכבר וצימוד פוספטאז אלקליין (Thermo Fisher Scientific, מס' קטגוריה: 31324) במאגר דילול הנוגדנים המשני (Beyotime, P0258) למשך 3 שעות. לבסוף, החלבונים האימונראקטיביים זוהו על ידי מערכת זיהוי ECL.

4.11. אפופטוזיס

אפופטוזיס המוציטים הוערך באמצעות ציטומטריית זרימה לפי המדריך של FITC-Annexin-V ערכת זיהוי אפופטוזיס (Beyotime). בקצרה, ההמוציטים שנאספו טופלו במשך 24 שעות עם LPS (0.1 mg/mL), 20 ננומטר של פלסמיד pEGFP-McIL-17-3, Mc novel_miR{{9} } לחקות, ומעכב Mc-novel_miR_145. לאחר שטיפה עם PBS, התאים הושעו מחדש במדיום L15 בריכוז סופי של 1 × 106 תאים mL-1 והוצבעו ב-FITC-Annexin-V ו-PI על ידי הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות בחושך. . לבסוף, מכשיר הציטומטריה של הזרימה (Beckman CytoFLEX FCM) שימש כדי לזהות אפופטוזיס של התא, והנתונים נותחו באמצעות תוכנת FlowJoTM 10. 4.12. ניתוח סטטיסטי תוצאות ניסוי הוצגו כממוצע ± סטיית תקן (SD). התוצאות עובדו באמצעות ניתוח ANOVA דו-כיווני של שונות עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey, ותוכנת Origin2021 הופעלה כדי לנתח את הנתונים ולבנות דמויות.

מערכת חיסון מגבירה צמח cistanche

5. מסקנות

במחקר זה, הומולוג חדש של IL-17, McIL-17-3, זוהה מ-M. coruscus ונמצא שהוא ממלא תפקיד מכריע בהגנה החיסונית של רכיכות מפני התקפת חיידקים. יתרה מכך, התגלה ש-McIL-17-3 מוסדר לרעה על ידי Mc-novel_miR_145, אשר תורם להשתתפותו באפופטוזיס המושרה על ידי LPS. התוצאות של מחקר זה מספקות תובנות חשובות לגבי התפקיד הרגולטורי של IL-17 בתגובה החיסונית של מולים ומדגישות את הפוטנציאל של RNA לא מקודד בוויסות מנגנוני ההגנה החיסונית של חסרי חוליות. עם זאת, חשוב לציין כי קיימות מגבלות מסוימות במחקר זה. באופן ספציפי, המנגנון העומד בבסיס מצב הפעולה של McIL-17-3 לא נחקר ודורש חקירה נוספת. בנוסף, מחקר זה התמקד רק באינטראקציה בין Mc-novel_miR_145 לבין McIL-17-3 ולא חקר את המעורבות האפשרית של miRNAs אחרים בתגובה החיסונית. בסך הכל, מחקר זה מדגיש את התפקיד החשוב של RNA לא מקודד במנגנוני הגנה חיסוניים ומציע שהאפנון שלהם יכול לשמש כאסטרטגיה פוטנציאלית לטיפולים ממוקדים למחלות שונות.

הפניות

1. מדז'יטוב, ר.; Janeway, C., Jr. חסינות מולדת. N. Engl. J. Med. 2000, 343, 338–344. [CrossRef] [PubMed]

2. לייסי, פ.; Stow, JL שחרור ציטוקינים מתאי חיסון מולדים: קשר עם מסלולי סחר מגוונים של ממברנות. Blood J. Am. Soc. המטול. 2011, 118, 9–18. [CrossRef] [PubMed]

3. דינרלו, CA ציטוקינים פרו-דלקתיים. חזה 2000, 118, 503–508. [CrossRef] [PubMed]

4. ראוטה, יחסי ציבור; נייאק, ב.; Das, S. מערכת חיסון ותגובות חיסון בדגים ותפקידם במחקר חסינות השוואתי: מודל לאורגניזמים גבוהים יותר. אימונול. Lett. 2012, 148, 23–33. [CrossRef]

5. הימוביץ, ש.ג; Filvaroff, EH; יין, ג'; לי, ג'; קאי, ל.; ריסר, פ.; Maruoka, M.; מאו, ו.; פוסטר, ג'; Kelley, RF IL-17 מאמצים קפל של קשר ציסטין: מבנה ופעילות של ציטוקין חדש, IL-17F, והשלכות על קישור קולטן. EMBO J. 2001, 20, 5332–5341. [CrossRef]

6. באקלי, ק"מ; הו, ECH; היבינו, ט.; שרנקל, CS; Schuh, NW; וואנג, GZ; גורמי Rast, JP IL17 הם מווסתים מוקדמים באפיתל המעי במהלך התגובה הדלקתית ל-Vibrio בזחל קיפוד הים. eLife 2017, 6, e23481. [CrossRef]

7. קואה, DJ; Tato, CM Innate IL-17-ייצור תאים: הזקיפים של מערכת החיסון. נאט. כומר אימונול. 2010, 10, 479–489. [CrossRef]

8. Mills, KH IL-17 ו-IL-17-מייצרים תאים בהגנה מול פתולוגיה. נאט. כומר אימונול. 2022, 10, 479–489. [CrossRef]

9. היבינו, ט.; לוזה-קול, מ.; מסייר, ג; Majeske, AJ; כהן, ע"ה; Terwilliger, DP; באקלי, ק"מ; Brockton, V.; נאיר, SV; ברני, ק. רפרטואר הגנים החיסון מקודד בגנום קיפוד הים הסגול. Dev. ביול. 2006, 300, 349–365. [CrossRef]

10. אלברטין, CB; סימקוב, או.; מיטרוס, ט.; וואנג, ZY; פונגור, JR; אדזינגר-גונזלס, ע.; ברנר, ש.; Ragsdale, CW; Rokhsar, DS הגנום של התמנון והאבולוציה של חידושים עצביים ומורפולוגיים של cephalopod. טבע 2015, 524, 220–224. [CrossRef]

11. סאקו, א.; ריי-קמפוס, מ.; רוזני, יו.; נובאה, ב.; Figueras, A. האבולוציה והמגוון של interleukin-17 מדגישים התרחבות בחסרי חוליות ימיים ותפקידו השמור בחסינות הרירית. חֲזִית. אימונול. 2021, 12, 692997. [CrossRef] [PubMed]

12. גרדול, מ.; מוריירה, ר.; קרוז, פ.; Gómez-Garrido, J.; ולאסובה, א.; רוזני, יו.; וניר, פ.; Naranjo-Ortiz, MA; מורגרלה, מ.; Greco, S. וריאציה מסיבית של נוכחות-היעדר גנים מעצבת פאן-גנום פתוח במולי הים התיכון. גנום ביול. 2020, 21, 1–21. [CrossRef]

13. קאו, י.; יאנג, ס.; פנג, סי; ז'אן, ו'; ז'נג, ז'; וואנג, ש; דנג, י.; Jiao, Y.; Du, X. אבולוציה וניתוח פונקציות של גן אינטרלוקין-17 מ-Pinctada fucata martensii. דג רכיכה אימונול. 2019, 88, 102–110. [CrossRef] [PubMed]

14. וואנג, ש; שיאו, ג'; הו, ג.; חן, ר.; לי, מ.; Teng, S. Interleukin-17D מתווך שינויים הקשורים לזיהום Vibrio harveyi ב-Tegillarca granulosa באמצעות הפעלה של חלבון מפעיל 1 in vivo. Aquaculture 2023, 566, 739178. [CrossRef]

15. לב, X.; סאן, ג'; לי, י.; יאנג, ו.; וואנג, ל.; לנג, ג'; יאן, X.; גואו, ז.; יאנג, ש; Wang, L. CgIL17-5 מווסת את ביטויי ה-mRNA של אפקטורים חיסוניים באמצעות גרימת הזרחון של CgMAPKs והטרנסלוקציה הגרעינית של CgRel ו-CgAP-1 באויסטר השקט Crassostrea gigas. Dev. Comp. אימונול. 2022, 127, 104263. [CrossRef] [PubMed]

16. וואנג, ל.; סאן, ג'; וו, ז.; ליאן, X.; האן, ס.; הואנג, ס.; יאנג, סי; וואנג, ל.; Song, L. AP-1 מסדיר את הביטוי של IL17-4 ו-IL17-5 בצדפה השקט Crassostrea gigas. דג רכיכה אימונול. 2020, 97, 554–563. [CrossRef]

17. וו, ס.-ז.; הואנג, X.-D.; לי, ש; הוא, M.-X. אינטרלויקין-17 בצדפת פנינה (Pinctada fucata): שיבוט מולקולרי ואפיון פונקציונלי. דג רכיכה אימונול. 2013, 34, 1050–1056. [CrossRef]

18. שין, ל.; ג'אנג, ה.; ג'אנג, ר.; לי, ה.; וואנג, ו.; וואנג, ל.; וואנג, ה.; קיו, ל.; Song, L. CgIL17-5, ציטוקין דלקתי עתיק ב-Crassostrea gigas המציג את פונקציות ההטרוגניות בהשוואה למולקולות interleukin17 של בעלי חוליות. Dev. Comp. אימונול. 2015, 53, 339–348. [CrossRef]

19. דנלי, AM; צמרות, BB; Plasterk, RH; Ketting, RF; Hannon, GJ עיבוד של microRNAs ראשוני על ידי קומפלקס המיקרו-מעבד. טבע 2004, 432, 231–235. [CrossRef]

20. חאן, ד.; Ansar Ahmed, S. Regulation of IL-17 במחלות אוטואימוניות על ידי גורמי שעתוק ומיקרו-RNA. חֲזִית. ג'נט. 2015, 6, 236. [CrossRef]

21. מרטין-גומז, ל.; וילבה, א.; Kerkhoven, RH; Apollo, E. תפקידם של microRNAs בתהליך החסינות של הצדפה השטוחה Ostrea edulis נגד בונה מיוזיס. לְהַדבִּיק. ג'נט. Evol. 2014, 27, 40–50. [CrossRef] [PubMed]

22. שו, פ.; וואנג, X.; פנג, י.; הואנג, ו.; וואנג, ו.; לי, ל.; פאנג, X.; קו, ה.; Zhang, G. זיהוי של microRNAs משומרים וחדשים בצדפה פסיפיק Crassostrea gigas על ידי רצף עמוק. PLoS ONE 2014, 9, e104371. [CrossRef]

23. ג'ואו, ז'; וואנג, ל.; שיר, ל.; ליו, ר.; ג'אנג, ה.; הואנג, מ.; Chen, H. הזיהוי והמאפיינים של microRNAs הקשורים למערכת החיסון בהמוציטים של צדפה Crassostrea gigas. PLoS ONE 2014, 9, e88397. [CrossRef] [PubMed]

24. Burgos-Aceves, MA; כהן, א.; סמית, י.; Faggio, C. ויסות microRNA פוטנציאלי של גנים הקשורים למערכת החיסון בהמוציטים חסרי חוליות. Sci. Total Environ. 2018, 621, 302–307. [CrossRef]

25. ווקר, SE; ספנסר, GE; נקקוב, א.; Carlone, RL זיהוי ואפיון של microRNAs במהלך התחדשות הנגרמת על ידי חומצה רטינואית של מערכת עצבים מרכזית מולוסקנית. Int. י.מול. Sci. 2018, 19, 2741. [CrossRef] [PubMed]

26. אבו-עלאלה, ח"ג; Faggio, C. תגובת מתח בתיווך מיקרו-RNA במינים דו מסתיים. Ecotoxicol. סביבה. סאף. 2021, 208, 111442. [CrossRef] [PubMed]

27. הואנג, ש.; יושיטאקה, ק.; אסדוזמאן, מ.; קינושיטה, ש.; Watanabe, S.; Asakawa, S. גילוי והבנה תפקודית של miRNAs ברכיכות: גישת פרופיל גנום רחב. RNA ביול. 2021, 18, 1702–1715. [CrossRef]

28. רוזני, יו.; Bortoletto, E.; באי, סי-מ.; נובאה, ב.; פיגראס, א.; וניר, פ.; פרום, ב. חפירה ב-miRNAomes של שני מסתיים: בין שימור לחדשנות. פילוס. עָבָר. R. Soc. B 2021, 376, 20200165. [CrossRef]

29. ראשון, X.; ג'אנג, ט.; לי, ל.; טו, ק.; יו, ט.; וו, ב.; ג'ואו, ל. טיאן, ג'יי; Liu, Z. חתימת ביטוי MicroRNA בשרירי החיבור המפוספסים והחלקים של ה-Yeso Scallop Patinopecten yessoensis. Genomics 2022, 114, 110409. [CrossRef]

30. טיאן, ר.; ז'נג, ז'; הואנג, ר.; Jiao, Y.; Du, X. miR-29a השתתפה ביצירת ציפורניים ובתגובה חיסונית על ידי מיקוד Y2R ב-Pinctada martensii. Int. י.מול. Sci. 2015, 16, 29436–29445. [CrossRef]

31. חן, ח.; ג'ואו, ז'; וואנג, ה.; וואנג, ל.; וואנג, ו.; ליו, ר.; קיו, ל.; Song, L. MicroRNA מגיב לחסרי חוליות ספציפי ומגיב למערכת החיסון מגביר את הפגוציטוזיס של צדפות על ידי מיקוד ל-CgIκB2. Sci. נציג 2016, 6, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

32. חן, ח.; ג'ואו, ז'; וואנג, ל.; וואנג, ה.; ליו, ר.; ג'אנג, ה.; Song, L. מירנה ספציפית לחסרי חוליות מכוונת למערכת הנוירואנדוקרינית הכולינרגית העתיקה של צדפות. פתח את ביול. 2016, 6, 160059. [CrossRef]

33. חן, ח.; שין, ל.; שיר, X.; וואנג, ל.; וואנג, ו.; ליו, ז.; ג'אנג, ה.; וואנג, ל.; ג'ואו, ז'; Qiu, L. מירנה המגיב לנוראפינפרין מקדם ישירות ביטוי CgHSP90AA1 בהמוציטים של צדפות במהלך ייבוש. דג רכיכה אימונול. 2017, 64, 297–307. [CrossRef] [PubMed]

34. האן, ז; לי, ג'; וואנג, ו.; לי, ג'; Zhao, Q.; לי, מ.; וואנג, ל.; Song, L. קלמודולין שממוקד על ידי miRNA scaffold659_26519 מווסת את ביטוי IL-17 בתגובה החיסונית המוקדמת של צדפה Crassostrea gigas. Dev. Comp. אימונול. 2021, 124, 104180. [CrossRef] [PubMed]

35. לב, ז; לי, ג; ג'אנג, פ.; וואנג, ז.; ג'אנג, ו.; Jin, C.-H. miR-200 מווסת פעילויות אנטיבקטריאליות של coelomocytes ו-LPS priming באמצעות מיקוד Tollip ב-Apostichopus japonicus. דג רכיכה אימונול. 2015, 45, 431–436. [CrossRef]

36. לי, ג; זאו, מ.; ג'אנג, סי; ג'אנג, ו.; ז'או, X.; דואן, X.; Xu, W. miR210 מווסת פרץ נשימתי ב-Apostichopus japonicus coelomocytes באמצעות מיקוד קולטן דמוי Toll. Dev. Comp. אימונול. 2016, 65, 377–381. [CrossRef]

37. לב, מ.; חן, ח.; שאו, י.; לי, ג; ג'אנג, ו.; ז'או, X.; ג'ין, ג'; Xiong, J. miR-92a מווסת את האפופטוזיס של coelomocytes במלפפון ים Apostichopus japonicus באמצעות מיקוד Aj14-3-3ζ in vivo. דג רכיכה אימונול. 2017, 69, 211–217. [CrossRef]

38. שאו, י.; לי, ג; שו, ו.; ג'אנג, פ.; ג'אנג, ו.; Zhao, X. miR-31 קושר את חילוף החומרים של שומנים ואפופטוזיס של תאים ב-Apostichopus japonicus המתמודד עם חיידקים באמצעות מיקוד CTRP9. חֲזִית. אימונול. 2017, 8, 263. [CrossRef]

39. גואו, מ.; וואנג, י.; פו, X.; טאו, ו.; Li, C. circRNA1149 מ-Apostichopus japonicus מדכא אפופטוזיס של coelomocyte פועל כספוג מירר-92 לוויסות ביטוי Bax בתגובה לזיהום Vibrio splendidus. Aquaculture 2023, 562, 738812. [CrossRef]

40. זואו, ה.; וונג, ק.; לואו, מ.; יאנג, ל.; וונג, ש.; הוא, ג'; Xu, X. A MicroRNA-1- עיכוב מתווך של נתיב NF-κB על ידי נתיב JAK-STAT בחסר חוליות Litopenaeus vannamei. J. Immunol. 2020, 204, 2918–2930. [CrossRef]

41. יאנג, ה.; שו, ז; גואו, ב.; ג'אנג, X.; ליאו, ז; Qi, P.; Yan, X. ניתוח משולב של miRNAome ושל transcriptome מגלה ויסות רשת miRNA-mRNA ב-Vibrio alginolyticus נגוע בקונכייה עבה של Mytilus coruscus. מול. אימונול. 2021, 132, 217–226. [CrossRef] [PubMed]

42. דה מוראלס, JMGR; פויג, ל.; דאודן, E.; Cañete, JD; Pablos, JL; מרטין, AO; Juanatey, CG; Adán, A.; מונטלבן, X.; Borruel, N. תפקיד קריטי של אינטרלויקין (IL)-17 בהפרעות דלקתיות וחיסוניות: סקירה מעודכנת של העדויות המתמקדות במחלוקות. אוטואימונית. Rev. 2020, 19, 102429. [CrossRef] [PubMed]

43. קוואגוצ'י, מ.; אדאצ'י, מ.; אודה, נ.; קוקובו, פ.; Huang, S.-K. משפחת ציטוקינים IL-17. J. Allergy Clin. אימונול. 2004, 114, 1265–1273. [CrossRef] [PubMed]

44. סטארנס, ט.; Broxmeyer, HE; רוברטסון, MJ; Hromas, R. חוד החנית: IL-17D, חבר חדש במשפחת IL-17, ממריץ ייצור ציטוקינים ומעכב המופואזיס. J. Immunol. 2002, 169, 642–646. [CrossRef] [PubMed]

45. גפן, SL; קרמר, JM; ג'פרי, JY; Shen, F. משפחת הציטוקינים IL-17. ויטאם. הורם. 2006, 74, 255–282. [PubMed]

46. ​​רוברטס, ש.; Gueguen, Y.; דה לורג'ריל, י. Goetz, F. הצטברות מהירה של תעתיק הומולוגי interleukin 17 בהמוציטים של Crassostrea gigas בעקבות חשיפה לחיידקים. Dev. Comp. אימונול. 2008, 32, 1099–1104. [CrossRef] [PubMed]

47. לי, ג'; ג'אנג, י.; ג'אנג, י.; שיאנג, ז'; טונג, י.; קו, פ.; Yu, Z. אפיון גנומי וניתוח ביטוי של חמישה גנים חדשים של IL-17 בצדפה הפסיפית, Crassostrea gigas. דג רכיכה אימונול. 2014, 40, 455–465. [CrossRef]

48. Gaffen, SL מבנה ואיתות במשפחת קולטני IL-17. נאט. כומר אימונול. 2009, 9, 556–567. [CrossRef]

49. חתה, ק.; אנדו, א.; שימאדה, מ.; Fujino, S.; במבה, ש; עראקי, י. אוקונו, ט.; פוג'יאמה, י.; Bamba, T. IL-17 מגרה תגובות דלקתיות באמצעות מסלולי NF-κB ו-MAP קינאז במיופיברובלסטים של המעי הגס אנושיים. אמ. J. Physiol. -מערכת העיכול. כבד פיזיול. 2002, 282, G1035–G1044. [CrossRef]

50. ניימוטו, ט.; נקסה, ט.; אישיקאווה, מ.; אוקוהרה, א.; איזומי, ב.; דיי, מ.; סוזוקי, או.; אדאצ'י, נ.; Ochi, M. MicroRNA-146a מתבטא בתאי T המייצרים אינטרלוקין-17 בחולי דלקת מפרקים שגרונית. שריר BMC. אי-סורד. 2010, 11, 1–11. [CrossRef]

51. Srivastava, A.; Nikamo, P.; Lohcharoenkal, W.; לי, ד.; מייזגן, פ.; Landén, NX; Ståhle, M.; Pivarcsi, A.; Sonkoly, E. MicroRNA- 146a מדכא IL-17- דלקת עור מתווכת וקשורה גנטית לפסוריאזיס. J. Allergy Clin. אימונול. 2017, 139, 550–561. [CrossRef] [PubMed]

52. ז'או, ש.; צ'נג, י.; Kim, JG microRNA-146a מווסת מטה את IL-17 ו-IL-35 ומעכב שגשוג של תאי גזע של רצועות חניכיים אנושיות. J. Cell. Biochem. 2019, 120, 13861–13866. [CrossRef] [PubMed]

53. פודיאד, א.; Standiford, TJ; באלינגר, MN; איקין, ר.; פארק, פ.; Kunkel, SL; מור, BB; Bhan, U. MicroRNA-155 מסדיר את התגובה החיסונית של המארח לדלקת ריאות חיידקית פוסט-ויראלית באמצעות מסלול IL-23/IL-17. אמ. J. Physiol. -תא ריאה. מול. פיזיול. 2016, 310, L465–L475. [CrossRef]

54. Xaus, J.; קומלדה, מ.; Valledor, AF; לוברס, ג'; לופז-סוריאנו, פ.; Argilés, JM; בוגדן, סי; Celada, A. LPS גורם לאפופטוזיס במקרופאגים בעיקר באמצעות ייצור אוטוקריני של TNF-. Blood J. Am. Soc. המטול. 2000, 95, 3823–3831.

55. באנרמן, ד"ד; גולדבלום, SE מנגנונים של אפופטוזיס אנדותל הנגרמת על ידי ליפופוליסכריד חיידקי. אמ. J. Physiol.-Lung Cell. מול. פיזיול. 2003, 284, L899–L914. [CrossRef]

56. פליז, ד"מ; Hollingsworth, JW; סינק, מ.; לי, ז; פוטס, E.; טולוזה, ע.; פוסטר, WM; שוורץ, DA שאיפת LPS כרונית גורמת לשינויים דמויי אמפיזמה בריאות העכבר הקשורים לאפופטוזיס. אמ. J. Respir. Cell Mol. ביול. 2008, 39, 584–590. [CrossRef]

57. דרקון, ש.; Saffar, AS; שאן, ל.; Gounni, AS IL-17 מחליש את ההשפעות האנטי-אפופטוטיות של GM-CSF בנויטרופילים אנושיים. מול. אימונול. 2008, 45, 160–168. [CrossRef] [PubMed]

58. ז'ו, פ.; וואנג, ש; גואו, סי; וואנג, X.; קאו, X.; שי, י.; גאו, פ.; מק.; Zhang, L. IL-17 גורם לאפופטוזיס של תאי אנדותל כלי דם - מנגנון פוטנציאלי לתסמונת כלילית חריפה אנושית. קלינ. אימונול. 2011, 141, 152–160. [CrossRef]

59. צ'אנג, י.; אל-עלוואן, ל. אודוסו, ש.; Chouiali, F.; קרלבארו-פיטה, י. איוואקורה, י.; Baglole, CJ; אידלמן, ד"ה; Hamid, Q. מחיקה גנטית של IL-17A מפחיתה דלקת הנגרמת עשן סיגריות ואפופטוזיס של תאי מכתשית מסוג II. אמ. J. Physiol. -תא ריאה. מול. פיזיול. 2014, 306, L132–L143. [CrossRef]

60. Hou, W.; ג'ין, י.-ה.; קאנג, HS; Kim, BS Interleukin-6 (IL-6) ו-IL-17 מקדמים באופן סינרגטי התמדה ויראלית על ידי עיכוב אפופטוזיס תאי ותפקוד תאי T ציטוטוקסי. J. Virol. 2014, 88, 8479–8489. [CrossRef]

61. וואנג, ש; לי, ד.; האן, י.; דינג, X.; שו, ט.; Tang, B. MicroRNA-146 מגן על תאי A549 ו-H1975 מפני אפופטוזיס הנגרמת על ידי LPS ופגיעה דלקתית. J. Biosci. 2017, 42, 637–645. [CrossRef] [PubMed]

62. חן, י.; וו, ז.; יואן, ב.; דונג, י.; ג'אנג, ל.; Zeng, Z. MicroRNA-146a-5p מחליש את הפעלת תאי הכבד של כוכבי כבד הנגרמת על ידי קרינה ו-LPS ואפופטוזיס של הפטוציטים באמצעות עיכוב של מסלול TLR4. Cell Death Dis. 2018, 9, 1–16. [CrossRef] [PubMed]

63. דינג, י.; וואנג, ל.; Zhao, Q.; וו, ז.; Kong, L. MicroRNA-93 מעכב אפופטוזיס של כונדרוציטים ודלקת בדלקת מפרקים ניוונית על ידי מיקוד למסלול האיתות TLR4/NF-κB. Int. י.מול. Med. 2019, 43, 779–790. [CrossRef]

64. וואן, ג'; כל.; טאו, ג'; וואנג, י.; ג'ואו, ש; יאנג, ר.; Liang, Q. MicroRNA-129-5p מקל על פגיעה בחוט השדרה בעכברים באמצעות דיכוי האפופטוזיס והתגובה הדלקתית דרך מסלול HMGB1/TLR4/NF-κB. Biosci. נציג 2020, 40, BSR20193315. [CrossRef] [PubMed]

65. Ke, X.-F.; פאנג, ג'; וו, X.-N.; יו, C.-H. MicroRNA-203 מאיץ אפופטוזיס בתאי אפיתל מעוררי LPS מעוררי LPS על ידי מיקוד ל-PIK3CA. Biochem. ביופיס. מילון Commun. 2014, 450, 1297–1303. [CrossRef] [PubMed]

66. Qi, P.; Tang, Z. מולקולת Nrf2 מפעילה הגנה נוגדת חמצון מפני חשיפה חריפה לבנזו(א)פירן בקונכיית הצד העבה Mytilus coruscus. Aquat Toxicol 2020, 226, 105554. [CrossRef]

67. שמיטגן, TD; Livak, KJ ניתוח נתוני PCR בזמן אמת בשיטת CT השוואתית. נאט. פרוטוק. 2008, 3, 1101–1108. [CrossRef]