בחינת הפוטנציאל של תמציות אצות איסלנדיות המיוצרות על ידי מיצוי בסיוע שדות חשמליים מימיים עבור יישומים קוסמטיים חלק 2

אנא צור קשרoscar.xiao@wecistanche.comלמידע נוסף

2.4. יכולות נוגדות חמצון של תמציות אצות איסלנדיות

ל-A.esculenta הייתה פעילות ניקוי ה-DPPH החזקה ביותר מבין התמציות הגולמיות של שלושת מיני האצות (p<0.05), with="" scavenging="" effects="" higher="" than="" 90%(table="" 3).="" compared="" with="" the="" different="" standard="" solutions,="" a.esculenta="" showed="" comparable="" scavenging="" activity="" as="" 100ug/ml="" of="" ascorbic="" acid="" (87.9%),="" gallic="" acid="" (91.0%),="" and="" α-tocopherol="" (87.9%).="" our="" results="" were="" in="" agreement="" with="" recent="" studies="" [50],="" which="" also="" reported="" a="" positive="" antioxidant="" activity="" of="" a.esculenta="" extracts.="" surprisingly,="" no="" significant="" differences="" in="" antioxidant="" activity="" were="" observed="" between="" the="" different="" extraction="" methods="" tested="" (p="">0.05). היה צפוי שתמציות PEF יציגו ערכי נוגדי חמצון טובים יותר מהתמציות המיוצרות עם המיצוי המסורתי החם שכן מחקרים אחרים הראו כי טכניקות ירוקות (כגון מיצוי בעזרת מיקרוגל או מיצוי אנזימטי) יכולות למנוע ביעילות את הפירוק של תרכובות ביו-אקטיביות, המציגות גבוה יותר פעילות נוגדת חמצון [59,60].

גם יכולתן של תמציות אצות להפחית ברזל (Fe8#) ליון ברזל (Fe2 plus ) והיכולת לנקות את ה-ABTS הרדיקלי, בשיטת FRAP ו-ABTS, בהתאמה. תוצאות FRAP הראו מגמות דומות ל-DPPH, והראו ל-A. esculenta את היכולת החזקה ביותר להפחית יונים ברזליים (Fe3 פלוס ) ליונים ברזליים (Fe2 פלוס ) מבין התמציות הגולמיות של שלושת מיני האצות (p<0.05). however,="" a="" different="" behavior="" was="" found="" for="" the="" abts.="" all="" seaweed="" extracts="" showed="" a="" similar="" ability="" to="" scavenge="" the="" radical="" abts="" (p="">0.05), המציין שמינים אלה מכילים כנראה כמה תרכובות יעילות שאחראיות לפעילות הניקיון שלהם.

אנא לחץ כאן כדי לדעת יותר

באופן כללי, ידוע כי אצות חומות מציגות פוטנציאל נוגד חמצון גבוה יותר בהשוואה למשפחות אדומות וירוקות [61]. התוצאות שלנו גם הראו שתמציות מימיות מ-A. esculenta הציגו פעילות נוגדת חמצון יעילה בכל הנוגע לניקוי רדיקלים חופשיים והפחתת הכוח, מה שמצביע על כך ש-A. esculenta עשוי להיות משאב לנוגדי חמצון טבעיים. פעילות נוגדת החמצון הגבוהה שנצפתה עבור תמציות A.esculenta יכולה להיות קשורה לתכולה הגבוהה של תרכובות פנוליות שנקבעו בתמציות האצות החומות. במחקרים רבים, פעילות נוגדת החמצון של תמציות אצות מיוחסת לתרכובות הפנוליות, והראתה מתאמים חיוביים בין תוכן פנולי ויכולת ניקוי בעיקר עם DPPH[62,63]. תוצאות מתאם דומות נמצאו במחקר הנוכחי עבור תמציות A.esculenta (ראה דיון טוב יותר בסעיף 2.6. מתאמים בין תרכובות כימיות ותכונות ביו-אקטיביות).

2.5.פעילויות מעכבות אנזומטיות של תמציות אצות איסלנדיות

תמציות אצות איסלנדיות הראו השפעות מעכבות חיוביות כלפי כל האנזימים שנבדקו (טבלה 4), ופתחו אפיקים חדשים לניצול מעכבים אנזימטיים טבעיים ממשאבי אצות. למיטב ידיעתנו, זו הפעם הראשונה שנבדקה פעילות מעכבת אנזימטית של תמציות אצות איסלנדיות המיוצרות על ידי PEF.

לקנות cistanche

2.5.1. פעילות עיכוב קולגנאז

תמציות A.esculenta הראו עיכוב חיובי של קולגנאז שנע בין 68 ל-91 אחוזים, בעוד שתמציות P. palmaria ו-U. Lactuca הציגו פעילויות עיכוב לא משמעותיות כנגד קולגנאז (טבלה 4). תמצית מים חמים של A.esculenta הראתה פעילות של 71.1 אחוזים של עיכוב קולגנאז, אשר הייתה גבוה מהפתרון הסטנדרטי של epigallocatechin-3-gallate(EGCG)(63.2 אחוזים) וניתן להשוואה לתקן חיובי המסופק על ידי הערכה האנזימטית המסחרית (74.9 אחוזים). ממצא חשוב היה שתמציות A.esculenta המיוצרות על ידי ה-PEF הראו עיכוב קולגנאז של 91 אחוז, והפגינו פעילות גבוהה אף יותר מהמעכב שסופק על ידי הערכה המסחרית. יש להדגיש שפעילות זו נצפתה רק בתמציות המים המיוצרות על ידי PEF ולא בשילוב של PEF פלוס HW. ניתן להסביר התנהגות זו על ידי האפשרות שתהליך המים החמים עלול להשפיע לרעה על התרכובות האחראיות לעיכוב פעילות הקולגנאז. עם זאת, נדרשים מחקרים נוספים כדי להסביר את התוצאות הללו בשל המורכבות של תמציות אצות גולמיות. קבוצת המחקר הנ"ל עובדת כעת על זיהוי מולקולות העיכוב בתמציות A.esculenta כדי להבין טוב יותר את ההשפעות החיוביות הללו שנוצרו על ידי ה-PEF.

Cistanche יכול אנטי אייג'ינג

התוצאות לגבי עיכוב הקולגנאז על ידי תמציות A.esculenta הן בהתאם לנתונים קודמים, שבהם נעשה שימוש בא.אסקולנטה בתמציות מסחריות בשל השפעתה האנטי-אייג'ינגית. הפירוק של הקולגן מתרחש עם ההזדקנות עקב פעילות הקולגנאז, וכתוצאה מכך קמטים על העור. עיכוב הקולגנאז על ידי תרכובות טבעיות הוא הזדמנות מעניינת למוצרי אנטי אייג'ינג. לדוגמה, SEPPIC, ספקית מרכיבים לתעשיית הקוסמטיקה, מציעה תמצית ליפופילית של A.esculenta(Kalpariane AD) [64].

2.5.2. פעילות עיכוב אלסטאז

Only the crude extracts of A.esculenta inhibited elastase, exhibiting activities higher than 70% of inhibition (Table 4). However, the anti-elastase activities of A.esculenta extracts did not statistically differ among extraction methods (p>{{0}}.05). בהשוואה לתמיסות קוורצטין, מעכב אלסטז ידוע שהראה 100 אחוז עיכוב ב-1 mM ו-58.7 אחוז ב-0.5 mM, הביצועים של תמציות מ-A. esculenta היו גבוהים.

Elastase הוא אנזים פרוטאינז שיכול להפחית אלסטין על ידי שבירת קשרים פפטידים ספציפיים. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש בעיכוב פעילות האלסטאז בשכבת הדרמיס כדי לשמור על גמישות העור [65]. תמציות צמחים רבות זוהו כמעכבי אלסטאז [17]; עם זאת, מעט חקירות בוצעו על עיכוב האלסטאז ממשאבי אצות. על פי נתוני הספרות, ידוע כי פוליפנולים המופקים מצמחים הם מעכבי אלסטאז והיאלורונידאז חזקים [66]. מחקר שנערך לאחרונה דיווח שהפלורוטנינים, סוג הטאנין באצות חומות, תמציות של אופני אצות ים Eisenia ואצה חומה Ecklonia cava, מועילים לעור על ידי הפחתת פעילות האלסטאז באופן משמעותי [67]. תמציות A.esculenta שהופקו במחקר זה הראו את ערכי ה-TPC וה-TFC הגבוהים ביותר בהשוואה למינים האחרים שנחקרו (טבלה 4), כך שזו יכולה להיות הסיבה לכך שהתמציות המימיות מ-P. palmaria ו-U. Lactuca לא הראו אנטי- פעילויות אלסטאז. כדי לאשש השערה זו, נערך ניתוח מתאם של פירסון, המצביע על כך שהפעילויות האנטי-אנזימות מתואמות באופן חיובי עם התוכן של חומרים פנולים (ראה דיון נוסף בסעיף 2.6. מתאמים בין תרכובות כימיות ותכונות ביו-אקטיביות).

2.5.3. פעילות עיכוב טירוזינאז

תמציות A.esculenta הראו עיכוב חיובי של טירוזינאז גבוה מ-90 אחוז עבור כל שיטות המיצוי בשימוש, בעוד שתמציות P.palmaria ו-U. Lactuca לא הציגו השפעות מעכבות טירוזינאז (טבלה 4). עם זאת, פעילויות האנטי-טירוזינאז של תמציות A.esculenta לא היו שונות (עמ'<0.05) with="" extraction="" methods.="" comparing="" the="" effect="" of="" a.esculenta="" extracts="" with="" the="" quercetin="" solutions="" tested,="" the="" crude="" extracts="" of="" the="" brown="" algae="" showed="" better="" inhibitory="" activities="" than="" these="" solutions(88="" and75%="" for="" the="" 0.5="" and="" 1="" mm="" quercetin="" solutions,="" respectively).="" based="" on="" the="" literature,anti-tyrosinase="" activities="" of="" plants,="" bacteria,="" and="" fungi="" have="" been="" reported="" by="" several="" researchers="" i68i.="" however,="" though="" different="" studies="" suggest="" that="" bioactive="" compounds="" derived="" from="" marine="" algae="" have="" a="" good="" potential="" to="" be="" utilized="" as="" skin="" whitening="" agents="" [13],="" this="" is="" still="" an="" unexplored="" domain="" and="" only="" a="" few="" studies="" have="" been="" carried="" out.="" most="" of="" the="" studies="" performed="" in="" this="" area="" have="" been="" focused="" on="" brown="" algae,="" agreeing="" with="" the="" results="" of="" the="" present="" study="" in="" which="" a.esculenta="" extracts="" exhibited="" the="" best="" anti-tyrosinase="" activities.="" for="" instance,="" phloroglucinol="" derivatives="" and="" phlorotannins,="" common="" secondary="" metabolites="" found="" in="" brown="" algae,="" have="" shown="" inhibitory="" activity="" against="" tyrosinase="" due="" to="" their="" ability="" to="" chelate="" copper="" [69].="" in="" a="" recent="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" lessonia="" trabeculate="" produced="" by="" microwave-assisted="" extraction="" inhibited="" a="" tyrosinase="" activity="" of="" 33.73%[60].in="" another="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" turbinaria="" conoides="" showed="" activity="" as="" an="" antioxidant="" and="" tyrosinase="" inhibitor,="" however,="" in="" this="" case,="" ethanol="" was="" used="" as="" solvent="" [70].="" a="" significant="" correlation="" between="" the="" inhibitory="" potency="" of="" polyphenols="" extracted="" from="" plants="" on="" mushroom="" tyrosinase="" has="" been="" reported="" in="" previous="" studies="" [68].="" likewise,="" the="" results="" of="" this="" study="" suggest="" that="" the="" inhibitory="" activity="" towards="" tyrosinase="" was="" positively="" correlated="" with="" flavonoid="" and="" phenolic="" content="" (see="" section="" 2.6.="" correlations="" between="" chemical="" compounds="" and="" bioactive="">

cistanche แอ ม เว ย์

טירוזינאז ממלא תפקיד חשוב בביוסינתזה של פיגמנט המלנין בעור. המלנין אחראי להגנה מפני קרינה אולטרה סגולה מזיקה, העלולה לגרום למספר מצבים פתולוגיים [71]. בנוסף, זה יכול ליצור בעיות אסתטיות כאשר מלנין מצטבר ככתמים היפר-פיגמנטים [72]. לפיכך, שילוב של מעכבי טירוזינאז במוצרים קוסמטיים יכול להיות אטרקטיבי עקב השפעות הלבנה ו/או הבהרה.

2.5.4. פעילות עיכוב היאלורונידאז

כל תמציות האצות הפגינו פעילות אנטי-hyaluronidase גבוהה משמעותית (טבלה 4), והראו תוצאות דומות לתמיסות החומצה הטאנית (מעכב ידוע של היאלורונידאז). באופן ספציפי, תמציות A.esculenta הראו 100 אחוז של עיכוב עבור כל השיטות שנבדקו. יתרה מכך, תמציות U. Lactuca הציגו פעילויות גבוהות מ-90 אחוז מהעיכוב, כאשר העיכוב של התמציות המיוצרות על ידי PEF (96.8 אחוז o) והשילוב של PEF פלוס HW (97.3 אחוזים) היה גבוה יותר מהעיכוב שנוצר על ידי החם המסורתי שיטת המים 93.4 אחוז )(עמ'<0.05). all="" p.palmaria="" extracts="" exhibited="" similar=""><0.05), the="" inhibition="" of="" the="" extracts="" produced="" by="" pef="" was="" (91.9="" %)and="" the="" combination="" of="" pef+hw="" (89.5%)="" and="" the="" traditional="" hot="" water="" method="">

מחברים אחרים תיארו גם את פעילות האנטי-hyaluronidase של תמציות שונות של אצות ים, במיוחד תמציות עשירות בפלורוטנינים מאצות חומות [73,74]. עם זאת, למיטב ידיעתנו, זו הפעם הראשונה שדווח על פעילות מעכבת היאלורונידאז של תמציות P.palmata ו-U. Lactuca המיוצרות על ידי PEF.

חומצה היאלורונית היא מרכיב עיקרי בדרמיס, שם היא מעורבת בתיקון רקמות, היא מתפרקת עם ההזדקנות, גורמת לקמטים ואובדן מוצקות העור. במובן זה, מעכבי היאלורונידאז מעלים את רמת החומצה ההיאלורונית של המטריצה ​​החוץ-תאית העורית לשיפור מראה עור הפנים המזדקן [13].cistanchלכן, התוצאות של מחקר זה עשויות לפתוח אפיקים חדשים לניצול מעכבי היאלורונידאז טבעיים ממשאבי אצות עם שימוש פוטנציאלי במוצרים קוסמטיים.

לסיכום, הנתונים שנאספו אפשרו לנו להסיק שתמציות A.esculenta הציגו באופן כללי פעילות מעכבת טובה יותר מאשר P.palmaria ו-U.lactuca כלפי האנזימים שנבדקו. לפיכך, בהיותו זן האצות המבטיח ביותר עם פעילות אנטי-אנזימטית מצוינת ולכן הוא נבחר למחקרים נוספים במעבדה שלנו. למרות שנראה כי תמציות גולמיות מ-A. esculenta הן מועמדות טובות לניסויים במבחנה, יש צורך לבצע מחקרים נוספים כדי להבהיר את זהות המטבוליטים האחראים להשפעות ביולוגיות אלו.

2.6. מתאמים בין תרכובות כימיות ומאפיינים ביו-אקטיביים

התוצאות מניתוח רכיבים עיקריים (PCA), הראו שההפרדה העיקרית של הקבוצות הוגדרה על ידי PC1 ו- PC2, שהיוו 71.9 אחוזים ו-14.5 אחוזים מהשונות בנתונים, בהתאמה (איור 2). תמציות A.esculenta אופיינו בתכולה גבוהה יותר של פלבנואידים ותרכובות פנוליות, השפעות מעכבות על אנזימים (קולגנאז, טירוזינאז ואלסטאז), וערכי DPPH ו-FRAP, מאשר המינים האחרים, P. palmata ו-U.lactuca. מצד שני, ל-A.esculenta הייתה תכולת פחמימות נמוכה יותר, במיוחד בהשוואה ל-P. palmitate (שהייתה ממוקמת בצד הנגדי של ה-PC1). השונות בנתונים לאורך ה-PC2 הייתה קשורה בעיקר ל-ABTS ולעיכוב היאלורונידאז. כפי שצוין על ידי המיקום על החלקה, ל-P. palmitate היה מתאם חזק יותר ל-ABTS ואילו ל-U.lactuca היה קשור יותר להשפעות עיכוב היאלורונידאז, בהשוואה לשני המינים הללו.

מתאם חיובי גבוה ומובהק בין TPC, TFC, DPPH, FRAP והשפעות מעכבות על קולגנאז, אלסטאז וטירוזינאז הוכח על ידי ניתוח מתאם של פירסון (טבלה 5).

כמה cistanche לקחת

זה היה בהסכמה עם מחקרים קודמים, שדיווחו שתרכובות פנוליות (כולל פלבנואידים) הן התורמות העיקריות לפעילות נוגדת החמצון של אצות ים שונות [75-77]. פעילות נוגדת החמצון הגבוהה של תמציות מאצות חומות קשורה לקבוצה ספציפית של פוליפנולים, פלורוטנינים ולמבנה המולקולרי הייחודי שלהם. לפי דיווחים יש ל-Plorotannis מאצות חומות עד שמונה טבעות פנול מחוברות זו לזו הפועלות כמלכודות אלקטרונים [78,79]. היה צפוי ש-ABTs יהיו בקורלציה עם TPC ופרמטרים נוגדי חמצון אחרים. סיבות אפשריות עשויות להיות שהשיטות מבוססות על תנאי תגובה שונים ושהתגובתיות שונה הן מבחינת הזמן והן מבחינת טווח הרכיבים. לדוגמה, ה-ABTSreagent מגיב עם מגוון רחב יותר של נוגדי חמצון מאשר רדיקל DPPH [80]. מצד שני, אחת המגבלות שהוזכרו עבור ABTS היא תגובה ארוכה וזמן התגובה הכללי עלול לא לאפשר הגעה לנקודת קצה.

התוצאות מצביעות על כך שיש מתאם חיובי גבוה בין TPC ל-TFC לפעילות המעכבת של קולגנאז, אלסטאז וטירוזינאז ({{0}}.93-0.99), בעוד שהקשר לעיכוב של היאלורונידאז לא היה חזק כל כך (r=0.42 ו-0.54, בהתאמה). זה מצביע על כך שמרכיבים אחרים עשויים תרמו להשפעה המעכבת של התמציות. מחקרים אחרים דיווחו שלפוליסכרידים יש פעילות מעכבת היאלורונידאז, למשל, חומצה אלגית באצות חומות [81,82]. יש צורך במחקרים נוספים על ההרכב הכימי של מיני האצות על ההשפעות של תרכובות מבודדות על האנזים כדי להעריך את התרומה של כל רכיב כימי שכן במחקר זה התמקדו בתמציות גולמיות. הממצאים היו בהרמוניה עם מחקרים קודמים, וקבעו כי ההרכב הכימי ורמות הפעילות הביולוגית של התמציות משתנים באופן משמעותי בין שלושת השושלות (אצות אדומות, ירוקות וחומות) ובין מינים שונים השייכים לאותו קבוצה ומושפעים מגיל. וסוג הרקמה. יתר על כן, ההרכב והמאפיינים תלויים בגורמים סביבתיים רבים המשפיעים על התפוצה והצמיחה של מאקרו אצות. לדוגמה, אור (קרינת UV), טמפרטורה, זמינות חומרים מזינים, חשיפה לאוויר, תנועת מים, חשיפה לגלים ומליחות. הטמפרטורה תוארה כגורם בעל ההשפעות החזקות ביותר על היווצרות פיגמנט וריכוז חומרים מזינים, מליחות וקרינת UV כגורמים המשפיעים על ריכוז ה-TPC [83].

התפוצה של מיני אצות שונות משתנה בהתאם לעומק המים. מיקומים גבוהים יותר במעלה החוף באזור הגאות והחוף מלחיצים יותר שכן המינים הגדלים שם חייבים לעמוד בשינויים מרובים בגורמים אביוטיים עקב שינויים בגאות. למשל, השפעת הייבוש של האוויר, קרינת שמש גבוהה (בשפל), שינויים במליחות ובטמפרטורה, ובתנאים של טמפרטורות אוויר נמוכות, כולל הקפאה. מתחת לסימן המים הנמוכים, הגדלת העומק מביאה לירידה מהירה מאוד בעוצמת האור ופחות חשיפה לקרינה.

מה זה cistanche

לאצות הגדלות בטווח הגאות והשפל יש רגישות נמוכה יותר לקרינת UV והן מתאוששות מהר יותר מלחץ השמש. ואילו אצות הגדלות באזור התת-ליטורי רגישות יותר לקרינת UV והתאוששות נמוכה יותר מלחץ השמש [84]. במקביל, עמוד המים מספק הגנה. במחקר הנוכחי, ככל הנראה, החשיפה לאור השמש הייתה חזקה יותר עבור P. palmitate, בהשוואה למינים האחרים. מחקרים אחרים הראו כי היווצרות MAA קשורה ישירות לאור השמש [85], מגינה על האורגניזמים מפני קרינת UV-A ו-UV-B. יתרה מכך, הוכח כי הכמות הספציפית של MAA ירדה עם הגדלת עומק האיסוף. אצות כגון A.esculenta, ידועות ככאלה שגדלות באזור התת-ליטורלי העליון אך גם משתרעות אל תוך הגאות הנמוכה ביותר ממש מעל סימן המים הנמוכים. כלומר עמודת המים סיפקה הגנה חזקה יותר מאשר עבור P. palmitate. בנוסף, המאפיינים המורפולוגיים שונים, הלהבים של A.esculenta עבים יותר בהשוואה לשני המינים האחרים. ממשק משתמש. lactuca, הגדל בעיקר באזור הגאות והסאבליטורל מסוגל לבצע פוטוסינתזה ולגדול תחת קרינה נמוכה מאוד. הוצהר כי חשיפה לאור UVB מאיצה את ההתאוששות של פרמטרים פוטוסינתטיים של U.lactuca מההשפעות השליליות של אור UVA. הוא קטן יותר, פשוט יותר במבנה, וקצר אורך חיים (3 חודשים) גם מ-A.esculenta (5-7 שנים) וגם מ-P. palmata שיש לו גידול חדש מדי שנה.

לסיכום, ניתן להניח את ההנחות שההבדלים העיקריים בתכונות התמציות הם השונות בתוחלת החיים, המאפיינים המורפולוגיים ותנאי הגדילה של מיני האצות.

3. חומרים ושיטות

3.1. חומרים

אצות ים איסלנדיות U.lactuca(אצה ירוקה), A.esculenta (אצה חומה) ו-P. palmitate (אצה אדומה) סופקו על ידי מולים כחולים איסלנדיים ואצות ים, אשר קצרו עשבי ים בברידפיורדור (מערב איסלנד). לאחר הקטיף. האצות יובשו (כ-90 אחוז חומר יבש), נטחנו ונמסרו ארוזו בוואקום. הדגימות נשמרו במקום יבש וחשוך בטמפרטורת החדר עד לשימוש.

טירוזינאז מפטריות, L-3,4-דיהידרוקסיפנילאלנין (L-DOPA), אלסטאז מהלבלב החזירי, חומצה אסקורבית, N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide(AAPVN), היאלורונידאז מ- אשכי בקר, קוורצטין, א-טוקופרול, חומצה טאנית,2,2-דיפניל-1-פיקרילהידראזיל(DPPH),2.4,6-Tripyridyl-s-Triazine(TPTZ), Trolox, Folin- ריאגנט Ciocalteu, חומצה גאלית וערכת בדיקה קולורימטרית של פעילות קולגנאז (MAK293) נרכשו מ-Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, ארה"ב). מלח נתרן חומצה היאלורונית נרכש מחברת MakingCosmetics (Redmond, WA, ארה"ב). כל הכימיקלים והריאגנטים האחרים שהיו בשימוש היו בדרגה אנליטית והתקבלו מ-VWR International, LLC. מים דהיוניים (Elix Essential, Merck, Darmstadt, גרמניה) שימשו להפקה והכנה של תמיסות על בסיס מים.

3.2.עיצוב ניסוי

נעשה שימוש בתכנון פקטוריאלי להערכת ההשפעות של מיני אצות איסלנדיות (U. Lactuca, A. esculenta, P. palmitate) וטיפול מיצוי (מיצוי מים חמים (HW, 95 מעלות ), מיצוי בסיוע PEF (PEF) והשילוב של שתי הטכניקות (PEF פלוס HW), על הרכב התמצית והפעילות הביולוגית (טבלה 6) המיצוי בוצע בשלושה עותקים עבור כל קבוצה וכל שכפול של תמצית נותח בשלושה עותקים.

ביופלבנואיד

3.3. הפקת חומרים ביו-אקטיביים מאצות הים האיסלנדיות

הניצול של ביומסה מאקרו-אצתית ברמות שונות הניע מדענים לחקור טכניקות מיצוי ידידותיות יותר לסביבה, יעילות וחסכוניות יותר, המבוססות על גישות מיצוי ירוק. בעבודה זו, מיצוי בסיוע PEF הוערך כשיטה חדשה וירוקה להפקת תמציות פונקציונליות, בעוד מיצוי מים חמים מסורתי שימש להשוואה. יתרה מכך, נחקרה ההשפעה של השילוב של שתי הטכניקות, טיפול PEF של מאקרו אצות ואחריו מיצוי מים חמים מסורתיים, על ההתאוששות הביו-אקטיבית. עקב האלקטרופורציה הצפויה שנוצרת בממברנות התא לאחר הטיפול הפיזי, המיצוי הבא עם מים חמים עשוי להקל עוד יותר על שחרור החומר התוך תאי [86], להגדיל את שדה המיצוי. נדרש זמן לאחר הטיפול כדי שהחומרים יתפזרו אל מחוץ לתאים [87,88], ובניסוי זה המתינו התרחיפים לילה עד להפרדת הנוזל (תמצית) מהעיסה.

לגבי מצע מיצוי, נעשה שימוש במים מזוקקים להפקת תמציות האצות כדי להתגבר על מגבלות הנוגעות לשימוש ברעלים ובממיסים אורגניים. מים הוכחו כממסים טובים להפקה של מספר תרכובות ביו-אקטיביות מאצות ים [46,89-91], והם ידידותיים לסביבה. בנוסף, מים משמשים בדרך כלל לחילוץ בעזרת PEF מכיוון שהם מוליך טוב לחשמל.

3.3.1. הליכי חילוץ

עבור כל שכפול בכל קבוצה, אצות ים (15 גרם) הושרו למשך הלילה בטמפרטורת החדר (22 מעלות) במים מפושטים (300 מ"ל). לאחר מכן, התרחיף טופל ב-PEF (PEF), מחומם (HW), או גם שטופל ב-PEF וגם מחומם (PEF פלוס HW). התרחיפים נשמרו לילה במקרר ולאחר מכן סינון עם נייר סינון גס (20 אום). לאחר מכן אוחסנו התסננים (תמציות) ב-4 מעלות עד לניתוח שלהם.

חילוץ השדה החשמלי הדופק בוצע באמצעות מחולל דופק שנבנה בבית. היו לו קבלים של FuGHCK-200-2000 (Fu.G.Elektronik GmbH, Rosenheim, גרמניה) ופער ניצוץ (18.5 קילו וולט OG75, Perkin-Elmer Optoelectronics, GMBH, Wiese-baden, גרמניה). ציוד ה-PEF יצר פולסי דעיכה אקספוננציאליים ברוחב של 0.96 us ומשרעת של 18 קילוואט. תא טיפול בפרספקס במידות (L×H×W) 20×8×2.5 ס"מ, כאשר המרחק הקצר ביותר הוא בין אלקטרודות הלוח שימש לטיפול במתלים בשדה חשמלי של 8 קילוואט/ס"מ ב-1.2 הרץ למשך 10 דקות . תמציות HW הוכנו על ידי חימום התרחיף בכוס באמבט מים תרמוסטטי ונשמרו על 95 מעלות למשך 45 דקות. עבור השדה החשמלי המשולב וטיפול החימום, התרחפים טופלו ב-PEF ואז הוכנסו לכוס, מחוממו באמבט מים, ונשמרו ב-95 מעלות למשך 45 דקות.

3.3.2. מדידות מוליכות, pH וטמפרטורה

המוליכות החשמלית וה-pH של תרחפי אצות נמדדו לאחר ההשריה ולאחר טיפולי המיצוי, בטמפרטורת החדר, באמצעות מד pH (Orion StarTM A215 pH/Conductivity Benchtop Meter, Thermo Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) המצויד בחיישן מוליכות ואלקטרודה משולבת PH/ARC טריודה. יתר על כן, נרשמו שינויים בטמפרטורה עקב טיפולים.

3.4. פרופילים ספקטרליים של תמציות אצות

ספקטרום הספיגה של UV-VIS של תמציות האצות השונות נמדדו בטווח של 200 עד 450 ננומטר באמצעות קרן כפולה Thermo Scientific Evolution 350 UV-Vis ספקטרופוטומטר (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) עם קובטות קוורץ בגודל 1 ס"מ. בוצעו שלוש סריקות לכל תמצית אצות.

3.5. קביעת התוכן הפוליפנולי הכולל

התוכן הפנולי הכולל (TPC) בתמציות אצות נקבע באמצעות ריאגנט Folin-Ciocalteu לפי שיטה שונה במקצת שתוארה על ידי Zhang [92] באמצעות Multiskan Sky Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ארה"ב). נפח של 20 μL של תמצית אצות או תמיסה סטנדרטית סדרתית עורבבו עם 100 μL של ריאגנט Folin-Ciocalteu (10 אחוז במים מזוקקים). לאחר 5 דקות, נוספו 80 μL של תמיסת נתרן קרבונט 7.5 אחוזים (/w). תערובת התגובה הוספה דגירה בטמפרטורת החדר ובחושך למשך 30 דקות. הספיגה נמדדה באורך גל של 760 ננומטר. מים מזוקקים שימשו כריק. עקומה סטנדרטית של חומצה גאלית שימשה לקביעת התוכן הפנולי הכולל ומבוטאת כ-ug של שוות ערך חומצה גאלית（ GAE) לכל גרם של חומר יבש （ug GAE/g do）.

3.6. קביעת תכולת הפלבנואידים הכוללת

תכולת הפלבנואידים הכוללת (TFC) בתמציות אצות נקבעה בשיטה שתוארה על ידי Kamtekar 【93】 והותאמה ל96-מיקרופלטות היטב. בקצרה, נפח של 25 μL של תמצית אצות או תמיסה סטנדרטית סדרתית היה מעורבב עם 100 μL של נתרן ניטריט (0.375 אחוזים w/o). לאחר 5 דקות, נוספו לתערובת 25 μLof אלומיניום כלוריד (3% w/o) והודגרו במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, נוספו לתערובת 100 μL של נתרן הידרוקסיד (2% w/ø) וערבבו. מיד נמדדה הספיגה באורך גל של 510 ננומטר. מים מזוקקים ואתנול שימשו כחסר. עקומה סטנדרטית של קוורצטין (מומס באתנול) שימשה לקביעת תכולת הפנולים הכוללת והובאה ל-ug של מקבילות לקוורצטין (QE) לגרם של חומר יבש (ug QE/g do). 3.7.קביעת תכולת הפחמימות

תכולת הסוכר החופשי נמדדה לפי השיטה המתוארת על ידי [94], עם שינויים קלים. 50 μL של תמיסת פנול (4 אחוזים) ו-250 μL של חומצה גופרתית (96 אחוז) נוספו ל-100 μL של דגימה או תמיסה סטנדרטית. לאחר 10 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, ספיגת התערובת נקראה ב-490 ננומטר. עקומה סטנדרטית של גלוקוז שימשה לקביעת תכולת הפחמימות הכוללת והיא מבוטאת כמ"ג שוות ערך לגלוקוז (GluE) לגרם של חומר יבש (mg GluE/g do).

3.8. תכונות נוגדות חמצון של תמציות אצות

3.8.1.2,2 Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Assay Free Radical Scavenging

הפעילות נוגדת החמצון (DPPH) של תמציות אצות נקבעה לפי המתודולוגיה שתוארה קודם לכן 【94】 עם כמה שינויים. בקצרה, 200 μL של תמיסת DPPH 10.825 × 10-5 M נוספו ל-100 ul של דגימה (1:1 במתנול) בצלחת 96-באר. אותו נפח של DPPH היה מעורבב עם 50μL סטנדרטי בתוספת 50μL מתנול. לאחר מכן הדגימות והתקן הודגרו במקום חשוך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הספיגה נמדדה באורך גל של 517 ננומטר. מים מזוקקים שימשו כריק. היכולת לנקות את הרדיקל DPPH חושבה באמצעות המשוואה הבאה: כאשר הבקרה היא הספיגה של הבקרה (תמיסת DPH ללא דגימה), דגימת A היא הספיגה של דגימת הבדיקה (תמיסת DPPH פלוס דגימת בדיקה), וה-A ריק מדגם הוא הספיגה של הדגימה בלבד (דגימה ללא תמיסת DPPH) ואמנול ריק הוא הספיגה של מתנול בלבד. נוגדי חמצון מסחריים (חומצה אסקורבית, חומצה גאלית ו-טוקופרול) שימשו כביקורות חיוביות.

3.8.2. בדיקת כוח נוגד חמצון מפחית יון ברזל (FRAP).

פעילות FRAP נמדדה לפי השיטה של ​​Benzie and Strain [95]. בקצרה, חיץ אצטט (300mM,pH3.6),2.4,6-tripyridyl-s-triazine(TPTZ)10mM ב-40mMHCl, ו-FeCl; 6H-O (20 מ"מ) ערבבו ביחס של 10:1 כדי להשיג את מגיב ה-FRAP הפועל. תערובת התגובה הודגרה ב-37 מעלות למשך 10 דקות. מדגם A50 μL מכל תמצית היה מעורבב עם 150 μL של תמיסת FRAP עובדת למשך 8 דקות בטמפרטורת החדר. הספיגה של המוצר הצבעוני, Ferrous-TPTZ נמדדה באורך גל של 593 ננומטר. ערכי FRAP של תמציות אצות הובאו כ-uM של מקבילי Trolox (TE) לגרם של חומר יבש.

3.8.3.2,2 בדיקת אזינו-ביס(3-אתיל-בנזותיאזולין-6-סולפונית)(ABTS)

הניתוח בוצע באמצעות פרוטוקול דה-צבע של ABTS [76] עם כמה שינויים. קטיון ABTS רדיקלי (ABTS plus ) הופק על ידי תגובה של ABTS(66mg) עם 10 מ"ל של תמיסת אשלגן פרסולפט (2.45 מ"מ). התערובת הושארה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 12-16 שעות לפני השימוש. תמיסת ABTS plus דוללה במים לספיגה של 0.700 ב-734 ננומטר. תערובת התגובה (200 ul) הועברה ל-microplate, נוספו 50 μL מהדגימה ולאחר מכן 150 μL מתמיסת המגיב. הצלחת נערה במשך 10 שניות במהירות בינונית, והספיגה נמדדה ב-734 ננומטר לאחר 5 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר. עקומת סטנדרט הוכנה על ידי ציור העיכוב של A734nm של תקני Trolox כפונקציה של הריכוזים שלהם. ערך הקיבולת נוגדת החמצון המקבילה של Trolox (TEAC) של הדגימות חושב באמצעות המשוואה שהתקבלה מהרגרסיה הליניארית של העקומה הסטנדרטית שהחליפו ערכי A734nm עבור כל דגימה:

3.9. פעילות אנטי אנזימטית של תמציות אצות

3.9.1. בדיקת עיכוב קולגנאז

ערכת בדיקה קולורימטרית של פעילות קולגנאז (MAK293), שנרכשה מ-Sigma-Aldrich, שימשה לקביעת עיכוב הקולגנאז של תמציות אצות. הערכה מדדה את פעילות הקולגן באמצעות פפטיד סינטטי (FALGPA) המחקה את מבנה הקולגן. ההליך בוצע בהתאם להוראות הערכה.

3.9.2. בדיקת עיכוב אלסטאז

עיכוב האלסטאז של תמציות אצות נחקר בתמיסת חיץ של TRIS בשיטה המשתנה כפי שתוארה קודם לכן 【96】. בקצרה, 100 μL של תמיסת TRISbuffer 0.1 M (pH8.0), 25 μL של אלסטאז (1 U/mL במאגר TRIS) ותמציות דגימה של 25μL עורבבו והודגרו במשך 15 דקות בשעה 30 C לפני הוספת המצע כדי להתחיל את התגובה. לאחר זמן הדגירה, נוספו 50μL של תמיסה של 2 מ"מ AAAPVN. לאחר מכן, הספיגה ב-420 ננומטר נוטרה במשך 20 דקות באמצעות קורא מיקרו-לוחות בטמפרטורה קבועה של 30 C. לבסוף, עיכוב אלסטאז חושב באחוזים באמצעות המשוואה: כאשר בקרת Abs היא הספיגה של הבדיקה באמצעות המאגר במקום מעכב (דגימה) ו- Absmples הספיגה של תמציות הדגימה. קוורצטין שימש כביקורת חיובית. חיץ טריס שימש כריק.

3.9.3. בדיקת עיכוב טירוזינאז

בדיקת מעכבי טירוזינאז בוצעה על פי השיטה שתוארה קודם לכן על ידי 【66】 תוך שימוש ב-L-DOPA כמצע. 20 μL מהדגימה, 10 μL של תמיסת טירוזינאז פטריות (50 U/mL במאגר פוספט) ו-80 μL של חיץ פוספט (pH=6.8) עורבבו במיקרו-לוח והודגרו מראש ב-37C 5 דקות. לאחר מכן, נוספו 90 ul של L-DOPA (2 מ"ג/מ"ל). היווצרות של דופאכרום נוטרה מיידית למשך 20 דקות ב-475 ננומטר בקורא microplate תחת טמפרטורה קבועה של 37 מעלות. אחוז העיכוב של אנזים טירוזינאז חושב באמצעות המשוואה: כאשר בקרת Abs היא הספיגה של המבחן באמצעות המאגר במקום מעכב (דגימה) ודגימה היא הספיגה של תמציות הדגימה. קוורצטין שימש כביקורת חיובית. חיץ פוספט שימש כריק.

3.9.4. בדיקת עיכוב היאלורונידאז

פעילות מעכבת Hyaluronidase נמדדה כפי שתואר בעבר על ידי [66] עם מעט שינויים. נפח של 100 ulof type-1-Sbovine testes hyaluronidase（2100 U/mL）מומס ב-0.1 M חיץ אצטט (pH 3.5) היה מעורבב עם 100 μL של תמצית והודגר ב-37 מעלות למשך 20 דקות. נפח של 200 μL של 6mM של סידן כלורי הוסף לתערובת התגובה, ולאחר מכן התערובת הודגרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. Hyaluronidase מופעל Ca2 פלוס זה טופל ב-250 ul של נתרן היאלורונט (1.2 מ"ג/מ"ל) מומס במאגר אצטט של 0.1 M (pH 3.5) ולאחר מכן הודגר באמבט מים ב-37 מעלות למשך 40 דקות. 50 μL של 0.9 M נתרן הידרוקסיד ו-100 μL של 0.2 M נתרן בוראט נוספו לתערובת התגובה ולאחר מכן הודגרו באמבט מים רותחים למשך 5 דקות. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, נוספו 250 ul של תמיסת p-dimethylaminobenzaldehyde (DAMB) לתערובת התגובה. תמיסת ה-DAMB הוכנה על ידי המסת 0.25 גרם DAMB ב-21.88 מ"ל של 100 אחוז חומצה אצטית ו-3.12 מ"ל של חומצה הידרוכלורית 10N. קבוצת הביקורת טופלה ב-100 μL של 5 אחוז מים במקום תמצית. הספיגה נמדדה באורך גל של 585 ננומטר לאחר 45 דקות. אחוז עיכוב האנזים חושב באמצעות המשוואה הבאה: כאשר בקרת Abs היא הספיגה של המבחן באמצעות המאגר במקום מעכב (דגימה) ודגימת Abs היא הספיגה של תמציות הדגימה. חומצה טאנית משמשת כתקן ייחוס.

3.10.ניתוח סטטיסטי

הממוצע של הניתוח המשולש של כל תמצית חושב והשתמש בו כדי למצוא את הערכים הממוצעים וסטיות התקן עבור כל קבוצה (n=3). מודלים ליניאריים כלליים (GLM) עבור גורמים קבועים יושמו כדי להעריך את ההשפעות העיקריות והאינטראקציות הדו-כיווניות של הגורמים הניסויים (מינים ושיטות מיצוי) על משתנים נמדדים. יתר על כן, ANOVA ומבחן Tukey-Kramer שימשו לזיהוי מובהק (עמ'<0.05)differences between="" the="" groups.="" pearson="" correlation="" was="" used="" to="" evaluate="" linear="" relationships="" between="" the="" variables.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" was="" used="" to="" detect="" structure="" in="" the="" relationship="" between="" measured="" variables="" and="" experimental="" factors.="" the="" pca="" reduces="" voluminous="" data="" to="" a="" small="" set="" of="" linear="" combinations="" of="" related="" variables(i.e.,="" factors)="" based="" on="" patterns="" of="" correlation="" among="" the="" original="" variables.="" the="" resulting="" linear="" attribute="" combinations="" can="" be="" used="" for="" profiling="" specific="" product="" characteristics="" based="" on="" the="" variables="" studied.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" ncss="" 2020="" statistical="" software="" (2020)="" (ncss,="" llc.,="" kaysville,="" ut,="">

4. מסקנות

התוצאות של ניסוי ההקרנה הראשון הראו את הפוטנציאל של שלושה מיני אצות איסלנדיות על ידי מתן השפעות מועילות יעילות באמצעות מספר מסלולים. הגישה הירוקה שפותחה באמצעות שדות חשמליים מימיים הראתה תוצאות דומות למיצוי המים החמים המסורתיים, והראתה מספר יתרונות כמו אופיו הלא תרמי וזמן המיצוי קצר יותר (10 דקות לעומת 45 דקות). מבין שלושת מיני האצות, האצות החומות A.esculenta הראו את התכולה הגבוהה ביותר של TPC ו-TFC המציגות גם את היכולות הגבוהות ביותר של נוגדי חמצון. יתר על כן, תמציות מים A.esculenta הראו פעילות מעכבת טובה יותר מאשר P. palmaria ו-U. Lactuca כלפי קולגנאז, אלסטאז, טירוזינאז, והיאלורונידאז הוא סוג אצות הים המבטיח ביותר עם פעילויות אנטי אנזימטיות מצוינות לשימושם בהלבנת עור, אנטי אייג'ינג ובריאות העור. מעניין לציין שתמציות A.esculenta שהופקו בשיטת PEF הראו עיכוב קולגנאז של 91 אחוז, גבוה מפעילות העיכוב שמוצגת על ידי מיצוי המים החמים המסורתיים ואף גבוה מהמעכב שסופק על ידי הערכה המסחרית. לסיכום, המחקר המקדים שלנו מצביע על כך שתמציות המבוססות על אצות ים איסלנדיות, במיוחד התמציות מהאצות החומות A. esculenta, המיוצרות על ידי מיצוי מימי בסיוע שדות חשמליים בקצב פעימות הן מרכיבים פונקציונליים פוטנציאליים שיכולים לשמש כתרכובות פעילות לניסוחים קוסמטיים וקוסמטיים. בעתיד הקרוב.

מאמר זה מופק מ-Mar. Drugs 2021, 19, 662. https://doi.org/10.3390/md19120662 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs