שיפור פרוטאומיקה מלמעלה למטה של ​​רקמת מוח עם FAIMS חלק 1

תַקצִיר

חקירות פרוטאומיות של אלצהיימר ומחלת פרקינסון סיפקו תובנות חשובות לגבי הפרעות ניווניות עצביות. עד כה, החקירות הללו הוגבלו במידה רבה לגישות מלמטה למעלה, מה שמפריע למידת האפשר לאפיין את מצבו ה"שלם" של חלבון.

מחלת אלצהיימר היא מחלה ניוונית עצבית בעלת השפעות בלתי הפיכות על הזיכרון והיכולות הקוגניטיביות של האדם. למרות שאנשים אינם יכולים לרפא את המחלה לחלוטין, באמצעות טיפול ומניעה זהירים, ניתן להאט ככל האפשר את התקדמות המחלה ולשמור על בריאותו הפיזית והנפשית של החולה.

זיכרון הוא אחד ההיבטים הברורים ביותר המושפעים מחולי אלצהיימר. לעתים קרובות הם עלולים לשכוח מידע חשוב, כגון שמם, שמות יקיריהם, תאריכים חשובים וכו'. בנוסף, ייתכן שנשכח גם כמה אוצר מילים מתקדם ללמידה עצמית, כמו מושגים מופשטים ומילים נרדפות. עם זאת, עם כמה אימון וטיפול קוגניטיביים, חולי אלצהיימר עדיין יכולים לשמור על הזיכרון שלהם בהיבטים מסוימים.

למרות שמחלת האלצהיימר יכולה להביא השפעות שליליות, עלינו להסתכל עליה בחיוב. ראשית, על ידי הגברת המודעות וההבנה למחלה, נוכל למנוע ולטפל בה טוב יותר. שנית, מטפלים ובני משפחה של חולי אלצהיימר יכולים גם ללמוד כיצד לתקשר ולתקשר איתם ביעילות כדי לעזור לחולים לשמור על כבוד עצמי ולחיות באושר ככל האפשר.

באופן כללי, למרות שמחלת האלצהיימר עלולה לגרום להשפעות בלתי הפיכות על הזיכרון והיכולות הקוגניטיביות, יש לשמור על גישה אופטימית ולנסות להאט את התקדמות המחלה באמצעות טיפול ואמצעי מניעה. במקביל, כדאי גם להעניק יותר עזרה ותמיכה למי שמטפל בחולים עם מחלת האלצהיימר, וליצור במשותף קהילה חמה ואינטראקטיבית יותר. ניתן לראות שעלינו לשפר את הזיכרון. Cistanche יכול לשפר משמעותית את הזיכרון מכיוון שהוא חומר רפואי סיני מסורתי עם השפעות ייחודיות רבות, אחת מהן היא שיפור הזיכרון. ההשפעה של Cistanche מגיעה מהמרכיבים הפעילים השונים שהוא מכיל, לרבות חומצה טאנית, פוליסכרידים, גליקוזידים פלבנואידים וכו'. מרכיבים אלו יכולים לקדם את בריאות המוח בדרכים רבות.

לחץ לדעת 10 דרכים לשיפור הזיכרון

פרוטאומיקה מלמעלה למטה (TDP) מתגברת על מגבלה זו; עם זאת, הוא מוגבל בדרך כלל לצפייה רק ​​בפרוטאופורמים הנפוצים ביותר בגודל קטן יחסית.

לכן, טכניקות חלוקה משמשות בדרך כלל כדי להפחית את מורכבות המדגם. כאן, אנו חוקרים פיצול פאזי גז באמצעות ספקטרומטריית ניידות יונים בצורת גל אסימטרית בשדה גבוה (FAIMS) בתוך TDP.

תוך ניצול מדגם במורכבות גבוהה שמקורה ברקמת המוח של מחלת אלצהיימר (AD), אנו מתארים כיצד הוספת FAIMS ל-TDP יכולה לשפר בצורה חזקה את עומק הכיסוי של הפרוטאום.

לדוגמה, היישום של FAIMS עם מתח פיצוי חיצוני (CV) בדרגה של -50, -40 ו-30 CV יכול להכפיל את המספר הממוצע של פרוטאופורמים, גנים וכיסוי רצף פרוטומים שאינם מיותרים בהשוואה ללא-FAIMS.

מצאנו גם ש-FAIMS יכול להשפיע על העברת פרוטאופורמים ומעטפות המטען שלהם בהתבסס על גודלם. חשוב לציין, FAIMS אפשרה זיהוי של פרוטאופורמים עמילואידבית (A) שלמים, כולל וריאנט A 1-42 המועד לצבירה, המקושר חזק ל-AD.

נתונים גולמיים וקבצים קשורים הופקדו ל-ProteomeXchange Consortium דרך מאגר הנתונים MassIVE עם מזהה מערך הנתונים PXD023607.

מָבוֹא

במהלך 2 העשורים האחרונים, השכיחות של מחלות ניווניות נוירו-דגנרטיביות הוכפלה יותר מכל ברחבי העולם, כאשר מחלת אלצהיימר (AD) היא הצורה הנפוצה ביותר.1 שני מיני חלבונים, פפטידים עמילואיד בטא (A) וחלבון מזורחן מיקרוטובולי טאו(טאו), 2-5 קשורים מאוד עם AD.

לכן, לאפיון פרוטאו-מאפיין מפורט של AD הייתה חשיבות מיוחדת.6,7 ספקטרומטריית מסה מילאה תפקיד מרכזי בחקירות אלה,8 בעיקר על ידי גישות מלמטה למעלה.9-16

עם זאת, עיכול הפרוטאזות הנדרש לניתוח מלמטה למעלה מעכב את לכידת המצב השלם של חלבון, שיכול להשתנות עקב אללים גנטיים, שחבור חלופי, עיבוד פרוטאוליטי ושינויים לאחר תרגום (המכונה "פרוטאפורמים").17– 20

מאז גישות פרוטאומיות מלמעלה למטה (TDP) מנתחות חלבונים במצב שלם, הסבירות ללכידת פרוטאופורמים הקשורים לפתולוגיות מסוימות גדולה יותר ומאפשרת קשר חזק וישיר יותר בין גנוטיפ לפנוטיפ.20-22

לדוגמה, TDP מתאים במיוחד ללכידת מקטעים פרוטאוליטיים אנדוגניים שמקורם בחלבונים כגון טאו, אשר נקשרו לפתולוגיה של אלצהיימר.23–26מספר יישומי TDP קודמים הראו הבטחה רבה בחשיפת הטרוגניות אזורית של פרוטאום מוח ושינויים נוירונים בתגובה לגירויים שונים. .27–30

עם זאת, TDP של דגימות מורכבות דורשת בדרך כלל טכניקות חלוקה לא מקוונות כדי להפחית את מורכבות הדגימה, שכן הפרוטאום האנושי משתרע על פני מספר סדרי גודל בגודל ובשפע, וחלבונים בדרך כלל אינם נפתרים היטב עם כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בפאזה הפוכה (LC).31

ניתן לבצע חלוקה לא מקוונת זו באמצעות אלקטרופורזה של לכידה של חלק נוזלי הנפלט בג'ל, כרומטוגרפיה של אי-הכללה בגודל, כרומטוגרפיה של חילופי יונים, או טיהור זיקה, למנות כמה.22,32-35

למרבה הצער, חלוקה לא מקוונת מפחיתה בדרך כלל את התפוקה והתפוקה על-ידי דרישת טיפול ממושך בדגימה.36 הפרדת ניידות יונים בשלבי גז היא חלופה אטרקטיבית לחלוקה שניתן להציג בין ממדי LC ו-MS מבלי להידרש לשלבי טיפול נוספים בדגימה.

ספקטרומטריית ניידות יונים בצורת גל א-סימטרית בשדה גבוה (FAIMS) מתאימה במיוחד למשימה זו עם ההשקה האחרונה של מכשיר ה-FAIMS Pro, שהעיצוב המודולרי שלו מאפשר שילוב קל של ניידות יונים בכמה מכשירי Orbitrap הנוכחיים.37

FAIMS, המכונה גם ספקטרומטריית ניידות דיפרנציאלית, מפרידה יונים בגז נשא בהתבסס על שילובים של גורמים כגון גודל, מטען או צורה באמצעות החדרת צורת גל א-סימטרית עם שדות חשמליים גבוהים ונמוכים.38 כדי למנוע התנגשות של היונים עם אלקטרודה, סטייה בנתיב היון מוכנסת באמצעות יישום של מתח פיצוי DC (CV),39 המאפשר העברה סלקטיבית של אותו יון.38

היישום של FAIMS לניתוח חלבון שלם הוגבל ברובו להפרדה של קונפורמים של חלבונים בודדים או שילובים קטנים של חלבונים; 40-45

עם זאת, FAIMS יושמה לאחרונה על ניתוח חלבון שלם ומקורי באמצעות ניתוח משטח מיצוי נוזלים. 46–50 כאן, אנו מיישמים ניתוח FAIMS-TDP על דגימת רקמה שלמה מהפרונטאלקורטקס המדיאלי (MFC) של חולה אלצהיימר.

סריקה על פני טווח CV של −50 עד −20 CV עם צעדים חיצוניים אפשרה לנו לקבוע כיצד אפנון של FAIMS CV משפיע על המאפיינים של היונים המועברים דרך יחידת FAIMS הגלילית, וכיצד ניתן לנצל את הקשר הזה כדי למקד פרוטאופורמים על סמך גודל.

FAIMS-TDP הכפיל יותר את זיהויי הפרוטאופורמים ב-CV בודד בהשוואה ללא FAIMS ואפשר חקירה עמוקה יותר של פרוטאופורמים הרלוונטיים למחלות נוירודגנרטיביות, כולל -, -, ו -סינוקלינים, PARK7, איזופורמים טאו splice ומספר פרוטאופורמים A שלמים.

ביחד, עבודה זו מתארת ​​כיצד ניתן להשיג זיהויים גדולים יותר של פרוטאופורמים וכיסוי פרוטאו-אומית באופן שחזור באמצעות פיצול פאזי גז עם FAIMS ב-TDP.

שיטות

הכנת דוגמא

דגימת ה-MFC התקבלה ממרכז מחלת האלצהיימר של אוניברסיטת Rush. המשתתפים היו אנשים מבוגרים המבוססים על מרפאה שנרשמו עם תלונות זיכרון ו/דימנציה מ-1992 עד 2005.

הם הוערכו ב-Rush Memory Clinic עבור דמנציה אפשרית והסכימו לתרומת מוח כחלק מהליבה הקלינית של מרכז הליבה של Rush Alzheimer's Disease Core. המחקר אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של המרכז הרפואי האוניברסיטאי רוש.

לאחר המוות, קרובי המשפחה סיפקו הסכמה לנתיחה. קטגוריית האבחון הקוגניטיבית הכוללת של החולה הייתה דמנציה של אלצהיימר ללא גורמים אחרים לפגיעה קוגניטיבית,51 בעוד שהמרווח שלאחר המוות היה 230 דקות.

כל שלבי הטיפול בדגימות בוצעו עם אמצעי זהירות BSL{{0}}. 33 מ"ג של רקמת MFC מאוחסנת ב-80 מעלות הועברו לצינורות LoBind Eppendorf של 1.5 מ"ל (Eppendorf, Cat# 022431081) בתוספת של 0.5 מ"ל של חיץ הומוגגניזציה המורכב מ-8 M אוריאה, 10 מ"מ מממוניום ביקרבונט (ABC) ו-10 מ"מ. tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ב-pH7.5.

הומוגניזציה הושגה באמצעות הפרעה פיזית על ידי מריחת כדור כף יד מונע על ידי מנוע למשך 3 0 שניות (BioVortexer עם SpiralPestle; Biospec 1083 ו-1017), לפני הוספת 0.5 מ"ל של חיץ הומוגניזציה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הדגימה הדגירה ב-37 מעלות למשך 60 דקות ב-1200 סל"ד באמצעות ThermoMixer כדי לאפשר מיצוי ודנטורציה של חלבונים תאיים. הפלטה של ​​החומר הבלתי מסיס באוריאה הושגה באמצעות צנטריפוגה ב-18,000ג' למשך 20 דקות ב-22 מעלות, ולאחר מכן הוספה הסופרנטנט שנוצר ל-3 מ"ל של חיץ כביסה (WB; 8 M אוריאה, 10 מ"מ ABC, pH7 .5) בתוך מסנן 4 מ"ל 100 kDa חיתוך משקל מולקולרי (MWCO) כדי להסיר מינים גדולים של MW.

לאחר שעה אחת של צנטריפוגה ב-22 מעלות ו-5000 גרם, נפח הרטנטאט היה 200 מיקרון אדמה, נפח התסנין היה 3.8 מ"ל. 3.8 מ"ל מהתסנין הועבר למסנן MWCO של 3 kDa כדי להסיר מזהמים בעלי מולקולות קטנות ופפטידים ב-MW נמוך.

מסנן MWCO של 3 kDa עבר צנטריפוגה ב-22 מעלות וב-7300 גרם למשך שעה אחת, מה שנותן נפח רטנטט של 200 μL. 200μL של retentate ממסנן MWCO של 100 kDa נשטף פעם נוספת על ידי דילולו ל-4 מ"ל עם WB וסינונו שוב דרך אותו מסנן.

זרימה זו נוספה לאותו מסנן MWCO של 3 kDa כפי שהוזכר לעיל ורוכזה פעם נוספת.

ה-200 μL הסופיים של retentate משטיפת מסנן MWCO של 3 kDa הועברה לצינור של 1.5 מ"ל LoBindEppendorf. כדי להחמצן את המדגם, נוספו 10 μL של 10% חומצה פורמית (FA), וכתוצאה מכך ריכוז FA של 0.5% בדגימה הסופית.

הדגימה עברה צנטריפוגה ב-18,000g למשך 15 דקות כדי להסיר את החומר המשקע לפני מדידת ריכוז החלבון באמצעות מבחן חומצה ביצינצ'ונינית (BCA).

סטנדרטים של אלבומין בסרום בקר הוכנו ב-8 M אוריאה, 10 mM ABC ו-0.5% FA כדי לקחת בחשבון כל תרומה פוטנציאלית של חיץ למבחן BCA. ריכוז החלבון על ידי בדיקת BCA נקבע כ-1.1 מ"ג/מ"ל, המקביל לתפוקה הסופית של 0.22 מ"ג של סך החלבון המוחזר בדגימה של ~200 μL. הדגימה הייתה מדולל ל-0.5 מ"ג/מ"ל עם WB המכיל 0.5% FA ומאוחסן ב-80 מעלות עד ניתוח LC-MS.

יש לציין שניסויים ראשוניים (נתונים לא פורסמו) באמצעות קוקטייל מסורתי של מעכבי פרוטאז/פוספטאז בתוך מאגר ההומוגניות שלנו הובילו לתוצאות מטעות של BCAassay ו-LC-MS עקב השמירה של מספר מרכיבי קוקטייל על ידי מסנן 3KMWCO.

יתר על כן, רבים ממעכבי הפוספטאז והפרוטאז המשמשים בדרך כלל אינם תואמים מבחינה כימית עם חומרים מפחיתים כגון TCEP. בהתחשב באי-תאימות אלה, ושהתנאים המדנטורים מאוד של 8 M אוריאה עם 10 mM TCEP צפויים להשבית את רוב הפרוטאזות, האמנו שהפירוק פרוטאוליטי עדיין יהיה ממוזער בתנאים אלה.

ניתוחי LC-MS/MS והגדרות FAIMS

דגימות נותחו באמצעות מערכת Waters NanoACQUITY UPLC עם פאזות ניידות המורכבות מ-{{0}}.2% FA ב-H2O (פאזה ניידת A) ו-0.2% FA ב-ACN (פאזה ניידת B).

גם עמודה קדם הלכידה (100 מיקרומטר id, 5 ס"מ אורך) והעמודה האנליטית (75 מיקרומטר id, 50 ס"מ אורך) היו תמיסות ארוזות עם חומר האריזה C2 (5 ו-3 מיקרומטר למלכודת/אנליטי, בהתאמה, 300 Å, טכנולוגיית שיטות הפרדה) . דגימות הוטענו לתוך 5 μLloop, המקביל ל-2.5 ug מכמות החומר הטעון, והוזרקו לעמודת הלכידה עם זרימה איזוקרטית של 5% b ב-3 μL/דקה במשך 20 דקות.

ההפרדה בוצעה עם שיפוע של 5-50% b במשך 180 דקות ב-300 nL/min. לצורך ניתוח MS/MS של חלבונים, מערכת NanoACQUITY צומידה לספקטרומטר מסה Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid המצויד בממשק FAIMS Pro.

פרמטרי המקור כללו מתח אלקטרוספריי של 2.2 קילו וולט, טמפרטורת נימי העברה של 275 מעלות ומשרעת תדר רדיו של משפך יונים של 60%. FAIMS נקבעה לרזולוציה סטנדרטית ללא זרימת גז נשא משלימה נשלטת על ידי משתמש ומתח פיזור של -5 קילו וולט (שווה ערך לשדה פיזור של -33.3 קילו וולט/ס"מ), 50 בעוד שה-CV השתנה בהתאם לניסוי (המכונה "צעד חיצוני ").

ה-Fusion Lumos הוגדר למצב יישום "intactprotein", המוריד את לחץ ה-C-trap dissociation (HCD) בעל אנרגיה גבוהה יותר של cellN2 ל-2 mTorr, והנתונים נאספו כפרופיל מלא. נתוני MS1 ו-MS2 נרכשו ברזולוציה של 120k ו-60k, סריקות מיקרו של 3 ו-2, בטווח של 500–2,{12}} m/z ו-400–2,000 m/z, ועם יעדי AGC של 5 × 106 ו-5 × 105, בהתאמה.

MS1 ו-MS2 נרכשו גם עם זמן הזרקה מקסימלי של 400 אלפיות השנייה. הגדרות תלויות נתונים כללו מבחר של 6 היונים החזקים ביותר, אי הכללה של יונים נמוך ממצב המטען5+, הכללה של מצבי מטען לא מוגדרים והדרה דינמית לאחר תצפית אחת למשך 30 שניות.

יונים שנבחרו עבור MS2 בודדו על פני חלון של ±1.5 מ"ר וחולקו דרך ניתוק המושרה בהתנגשות (CID) עם אנרגיית התנגשות של 35%. השתמשנו ב-CID במקום HCD בשל התלות הנמוכה יותר של אנרגיית התנגשות מנורמלת להשגת ספקטרום פיצול חלבון הניתנים לפירוש, ובכך נתנו עדיפות לרוחב התצפיות הפרוטאופורמיות שלנו על פני כיסוי רצף.52

ערכות נתונים עבור כל קורות חיים של FAIMS נאספו בשלושה עותקים. כל הקבצים הגולמיים הופקדו במאגר הנתונים של MassIVE וניתן לגשת אליהם דרך הצטרפותה MSV000086696, או עם PXD023607 onProteomeXchange.

For more information:1950477648nn@gmail.com