Empagliflozin משפר תסמינים של סוכרת ותפקוד לקוי של צינורית הכליה בדגם חולדה של סוכרת עם כליה מוגדלת (DEK)

איש קשר: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 דוא"ל:audrey.hu@wecistanche.com

איאקה דומון¹, Kentaro KatayamaID¹, טוקו סאטו², יוקי טוצ'יגי¹, Hiroyuki Tazaki², Hiroetsu SuzukiID^1*

תַקצִיר

רקע: מעכבי סודיום-גלוקוז קוטרנספורטר 2 (SGLT2) נמצאים בשימוש נרחב להפחתת היפרגליקמיה. המחקר הנוכחי חקר את ההשפעות של מעכב SGLT2, empagliflozin, על היפרגליקמיה במודל חדש של חולדות של סוכרת מסוג 2 ללא השמנת יתר עם מוגדלתכליות(DEK). Methods: Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations ≤300 mg/dl and >300 מ"ג/ד"ל סווגו כלא סוכרתיים וסוכרתיים, בהתאמה. קבוצות של חולדות לא סוכרתיות (ביקורת) וסוכרתיות (המשך) קיבלו מאכל סטנדרטי במשך 12 שבועות, בעוד שקבוצה אחרת של חולדות סוכרתיות (DM-empa) קיבלה מאכל סטנדרטי המכיל אמפגליפלוזין (300 מ"ג/ק"ג/יום) למשך 12 שבועות. . נמדדו גלוקוז בדם, משקל גוף, סבילות לגלוקוז, צריכת מזון ומים, נפח שתן, פלזמה ופרמטרים ביוכימיים בשתן וצפיפות מינרלים בעצמות.כליותוהלבלב נותחו היסטולוגית. תוצאות: טיפול באמפגליפלוזין הפחית את ריכוז הגלוקוז בדם ואת צריכת המזון בחולדות סוכרתיות, אך עיכב אובדן מושכות האדפס והוביל לעלייה במשקל הגוף. Empagliflozin החליש את הפוליאוריה והפולידיפסיה אך העלה את ריכוזי הפלזמה של כולסטרול כולל, נתרן וחלבון כולל לרמה נורמלית. Empagliflozin גם הפחית באופן משמעותי את הפרשת החלבונים והאלקטרוליטים בשתן והחזיר את צפיפות המינרלים של העצם ואת ריכוזי הפלזמה של ולין ואיזולאוצין לרמות נורמליות. יתר על כן, הרחבת צינוריות הכליה וכִּליָהההגדלה לא הוחלשה בקבוצת DM-empa. מסקנה: התגובה של חולדות DEK לאמפגליפלוזין הייתה שונה מזו של מודלים אחרים של בעלי חיים סוכרתיים, מה שמצביע על כך שלחולדות DEK יש מאפיינים ייחודיים ללימוד והערכת ההשפעות הביולוגיות המרובות של מעכבי SGLT2. ממצאים אלה גם הצביעו על כך ש-empagliflozin יכול לשפר את חילוף החומרים המערכתי ולשפרשֶׁל הַכְּלָיוֹתתפקוד צינורית בסוכרתיתנאים.

Cistanche tubulosa מונעכִּליָהמחלה, לחץ כאן כדי לקבל את המדגם

מבוא

השכיחות העולמית של סוכרת (DM) ממשיכה לעלות, כאשר מספר החולים נאמד להגיע ל-700 מיליון עד 2045 [1]. לכ-90-95 אחוז מהחולים הללו יש DM מסוג 2, המתאפיין בהפחתה מתקדמת של הפרשת אינסולין עם או בלי תנגודת לאינסולין [2] ומהווה גורם סיכון עיקרי למחלות כליות ולמחלות לב וכלי דם [3]. סוג 2 DM הוא הגורם המוביל לאי ספיקת כליות סופית (ESRD), עם נפרופתיה סוכרתית, הנקראת גם סוכרתיתכִּליָהמחלות, האחראיות ל-ESRD ב-20-40 אחוז מהחולים הללו [4]. חולים עם ESRD זקוקים לדיאליזה או השתלת כליה כדי לשמור על תקיןתפקוד כליות. נהלים אלה מטילים עומסים חברתיים וכלכליים על חברות ויחידים, וכן משפיעים על איכות החיים של המטופל [5]. לכן נדרשים מאמצים כדי למנוע או לשפר DM ונפרופתיה סוכרתית [6].

מעכבי סודיום-גלוקוז קוטרנספורטר 2 (SGLT2) הם סוג חדש של תרופות אנטי-סוכרתיות הפועלות ללא תלות באינסולין אנדוגני [7]. מעכבי SGLT2 מפחיתים את ריכוזי הגלוקוז בדם על ידי עיכוב ספיגה חוזרת של גלוקוז באבובות הכליות הפרוקסימליות [7]. למעכבי SGLT2 יש גם השפעות מועילות על סיבוך הכליות והקרדיווסקולרי של DM [8-10], כמו גם שיפור חילוף החומרים [11], כל אלה אינם תלויים בחלקם בהשפעותיהם להורדת הגלוקוז. יתר על כן, מעכבי SGLT2 משפרים את התוצאות הכליות בחולים שאינם DM עם כרוניכִּליָהמחלות [12]. עם זאת, ההשפעות של מעכבי SGLT2, כולל תוצאות כליות, משתנות בין החולים [13]. וריאציות אלה משקפות כנראה הבדלים במספר גורמים, כולל נטייה גנטית, מצב מטבולי, המודינמיקה ואורח חיים.

לאחרונה הקמנו זן חולדות חדש של DM ללא השמנה מסוג 2 עם מוגדלכִּליָה(DEK) מ-LEA. PET-pet congenic זן. בזן DEK, כ-50 אחוז מהגברים מראים סוכרת עד גיל 30 שבועות. חולדות סוכרתיות אלו הראו ירידה מתקדמת בריכוז האינסולין בפלזמה עקב אובדן תאי הלבלב, הפרנכימה הכלייתית מוגברת והגדלה ניכרת שלכליותעם הרחבת צינוריות הכליה [14]. חולדות DEK הראו גם ירידה בריכוזי הפלזמה של כולסטרול כולל (TCHO), חלבון כולל ואלבומין [14]. תכונות היסטולוגיות ומטבוליות אלו ייחודיות לחולדות DEK, מה שמבדיל מודל זה ממודלים אחרים של סוכרת בבעלי חיים ומציעים שחולדות DEK יכולות להיות שימושיות לחקר ההשפעות הפרמקולוגיות של תרופות אנטי-סוכרתיות עלכליותוחילוף חומרים. לפיכך, המחקר הנוכחי העריך את ההשפעות של מעכב SGLT2, empagliflozin, על הכליות והמטבוליזם המערכתי של חולדות DEK.

Materials and methods Animals Blood samples were obtained from the tail veins of non-fasting male DEK rats (total n = 33), and glucose concentrations were measured with GLUCOCARD PlushCare (Arkray Inc., Kyoto, Japan). Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations≤300 mg/dl and >300 מ"ג/ד"ל סווגו כלא סוכרתיים וסוכרתיים, בהתאמה [14]. כל החולדות נשמרו בתנאים קונבנציונליים, כולל מחזור אור: חושך של 14:10 שעות, טמפרטורת חדר של 20 ±2˚C ולחות יחסית של 50±10 אחוזים. כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ניפון וטרינרית ומדעי החיים ובוצעו בהתאם להנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ניפון וטרינרית ומדעי החיים.

Male rats with blood glucose concentrations >300 מ"ג/ד"ל בגיל 15-20 שבועות בזן DEK חולקו באופן אקראי לקבוצת דיאטת אמפאגליפלוזין (DM-empa) (n=5) וקבוצת דיאטה רגילה (DM-cont) (n {{6} }) תוך 2-3 שבועות לאחר התפתחות DM. חולדות זכרים עם ה-DM ללא DM (רמת הגלוקוז בדם עדיין הייתה נמוכה מ-300 מ"ג/ד"ל בגיל 30 שבועות) בזן DEK הוגדרו כביקורת (n=12). לקבוצות בקרה ו-DM-Cont הייתה גישה אד-ליביטום למים ולתזונה סטנדרטית (CR-LPF, Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo. Japan) במשך 12 שבועות, בעוד שלעכברושים בקבוצת DM-empa הייתה גישה אד-ליביטום למים ודיאטה סטנדרטית בתוספת אמפגליפלוזין (300 מ"ג/ק"ג; אלי לילי יפן; קובי, יפן). המינון של empagliflozin תוכנן בהתייחס לדיווחים קודמים [15, 16]. ריכוזי הגלוקוז בדם ללא צום, משקל הגוף וצריכת המזון נמדדו מדי שבוע. כל החולדות הוקרבו לאחר 12 שבועות, והןכִּליָהנאספו דגימות לבלב ודגימות דם. קבענו נקודות קצה אנושיות עבור כל בעלי חיים שירדו ב-25 אחוז ממשקל הגוף או הראו תסמינים הקשורים לחולה קשה. עם זאת, לא היו חולדות שהראו ירידה כה חמורה במשקל הגוף ובמצב חולה במחקר זה.

בדיקת סבילות לגלוקוז דרך הפה (OGTT)

בדיקות סבילות לגלוקוז דרך הפה (OGTT) בוצעו יום לאחר תקופת הטיפול בת 12 השבועות, כמתואר [14]. בקצרה, החולדות צמו במשך 16 שעות וקיבלו 2 גרם/ק"ג משקל גוף (BW) של גלוקוז דרך הפה. דם התקבל מוריד הזנב, וריכוזי הגלוקוז נמדדו 0, 30, 60, 120, 180 ו-240 דקות לאחר העמסת הגלוקוז. דגימות דם נאספו גם מוריד הצוואר בהרדמה איזופלורנית הנשלטת על ידי מרדים לבעלי חיים קטנים (TK-7, Biomachinery, Chiba, יפן) ב-0, 30 ו-60 דקות לאחר העמסת גלוקוז, מעורבב עם הפרין וצנטריפוגה. למשך 15 דקות ב-4˚C כדי להשיג פלזמה. ריכוזי האינסולין בפלזמה נמדדו באמצעות LBIS Rat Insulin ELISA Kit (RTU) (Shibayagi, Gunma, יפן).

מדידת פרמטרים כלייתיים

במהלך שבוע 12, החולדות שוכנו בנפרד בכלובים מטבוליים למשך 24 שעות, ונמדדו נפח השתן ונפח מי השתייה [14]. ריכוזי שתן של קריאטינין (Cre), חנקן אוריאה (UN), סידן (Ca), Na-K-Cl וגלוקוז (Glu) נמדדו עם Dri Chem 3500V (FUJIFILM, טוקיו, יפן). ריכוזי חלבון בשתן נמדדו באמצעות Protein Assay Rapid Kit Wako II (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, טוקיו, יפן). דם נאסף מהווריד הקאודלי בהרדמה איזופלורנית, וריכוזי פלזמה של UN, אלבומין (Alb), חלבון כולל (TP), כולסטרול כולל (Tcho), Ca ו- Na K-Cl נמדדו באמצעות Dri-Chem 3500V. ריכוז הפלזמה של Cre נמדד באמצעות FUJIFILM VET Systems Co., Ltd. (טוקיו, יפן). פינוי קריאטינין (Ccre), גלוקוז (Cglu), סידן (Cca), נתרן (Can), אשלגן (Ck) וכלור (Ccl) חושב באמצעות הנוסחה:

פינוי (Cx) (ml/min/kg)=[ריכוז שתן (mg/dl או mEq/l) × urine volume (ml/min)] / ריכוז פלזמה (mg/dl או mEq/l) / משקל גוף (ק"ג).

הפרשה חלקית של גלוקוז (FEglu), סידן (FEca), נתרן (FEna), אשלגן (FEk) וכלור (FEcl) חושבה באמצעות הנוסחה:

הפרשת חלקים (FEx) ( אחוזים )=Cx (ml/min/kg) / Ccre (ml/min/kg) × 100.

ריכוז השתן של קושרת חומצות שומן בכבד (L-FABP) נמדד באמצעות ערכת FABP1/L-FABP עכבר/עכברוש (R&D Systems, Inc., MN, ארה"ב)

היסטולוגיה, אימונופלואורסצנטי וחישוב שטח חיובי לאינסולין

בעלי חיים הורדו עם מנת יתר של נתרן פנטוברביטל לאחר תקופת טיפול של 12 שבועות. הכליותוהלבלב הוסרו מכל חולדה מומתת ונשקלו. דגימות רקמות תוקנו עם 4 אחוז פרפורמלדהיד במי מלח מבוצר פוספט (PBS), הוטמעו בפרפין לפי נהלים סטנדרטיים, ונחלקו בעובי של 1 מיקרומטר או 4 מיקרומטר עבור צביעת חומצה מחזורית (PAS) וצביעה אימונופלואורסצנטית. הרחבת הצינורית הכלייתית נמדדה כמתואר קודם [17]. נמדדו עשרה שדות אקראיים שאינם חופפים של 40 x מוגדלים של קליפת הכליה ושל האזור ה-juxtamedullary. הרחבת צינורית נמדדה בסולם של {{10}}-3, כאשר 0, 1, 2 ו-3 מציינים 0,<5, 5–10,="" and="">10 dilated tubules per field, respectively. Pancreas sections were blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) in PBS and incubated overnight at 4˚C with guinea pig anti-insulin polyclonal antibody (1: 100, Abcam K. K., Tokyo, Japan) or mouse anti-glucagon polyclonal antibody (1: 200, Abcam K.K.). The sections were rinsed with PBS and incubated for one hour at room temperature with Alexa Fluor 488 conjugated goat anti-guinea pig IgG antibody (1: 1000, Life Technologies, Carlsbad, CA) or Alexa Fluor 568 conjugated donkey anti-mouse IgG antibody (1: 1000, Life Technologies). After rinsing in PBS, the sections were mounted with ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Images were acquired with a Biozero BZ-X800 all-in-one fluorescence microscope, (KEYENCE, Tokyo, Japan). Islet areas and insulin-positive areas were measured in >10 קטעי איים לכל חולדה באמצעות תוכנת Image J, ואחוז השטח החיובי לאינסולין לאזור האי חושב.

ניתוח צפיפות עצם של עצם הירך

עצם הירך נכרתה מארבע חולדות ללא DM, שלוש חולדות DM-cont ושלוש DM-empa לאחר תקופת טיפול של 12 שבועות, ונסרקו עם מערכת מיקרו-CT (Latheta LCT-100, אלוקה, טוקיו, יפן) . צפיפות המינרלים של העצם (BMD, mg/cm3) ותכולת המינרלים בעצם (BMC, mg) חושבו באמצעות תוכנת Latheta.

ניתוח כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה (GC-MS) של חומצות אמינו פלזמה

דגימות פלזמה התקבלו מחולדות ביקורת בנות 30-שבוע ומחולדות DM המשך ו-DM-empa בנות 27-32 שבועות לאחר תקופת הטיפול של 12-שבוע. דגימות הפלזמה טופלו עם Phenomenex EZ: ערכת ניתוח מהירה AA (Phenomenex, Torrance, CA), כאשר נורוואלין משמש כסטנדרטים הפנימיים [18]. GCMS-QP2010Plus ותוכנת פתרונות GCMS (Shimadzu, קיוטו, יפן) שימשו לניתוח GC-MS [19].

ניתוח סטטיסטי

התוצאות, שהוצגו כממוצע ± שגיאה סטנדרטית (SE), הושוו בשתי קבוצות על ידי מבחני t של סטודנטים דו זנבים ובמספר קבוצות על ידי מבחני Tukey-Kramer. ערך p < 0.05="" נחשב="" מובהק="">

תוצאות

מצבים כלליים הקשורים לסוכרת

מדידות שבועיות של צריכת המזון הראו כי צריכת המזון היומית הממוצעת המשוערת הייתה מעט גבוהה יותר ב-DM-cont מאשר בקבוצת DM-empa (36.9±1.5 גרם לעומת 34.3±1.0 גרם). המינון היומי המשוער של empagliflozin בקבוצת DM-empa היה 23.7±0.7 מ"ג/ק"ג משקל גוף (BW). Empagliflozin הפחית באופן דרמטי את ריכוז הגלוקוז בדם ביום שלאחר התחלת הטיפול, מ-404.6±36.3 מ"ג/ד"ל ל-143.8±14.6 מ"ג/ד"ל), כאשר רמת הגלוקוז בדם בקבוצת DM-empa נמוך משמעותית מאשר ב-DM. -cont group במהלך תקופת הטיפול של 12-שבוע (איור 1A). רמה זו ב-DM-empa דמתה לשליטה רגילה עם תזונה רגילה (147.{{40}}±1.2 מ"ג/ד"ל) [14]. BW עלה בהדרגה עם הגיל בקבוצת DM-empa, אך לא בקבוצת DM-cont (איור 1B), כאשר ה-BW הסופי לאחר 12 שבועות היה 444.6±18.0 גרם ב-DM empa ו-372.3±26.4 גרם ב-DM- קבוצת המשך. באותו גיל, משקל הגוף של הביקורת היה כ-533.4±9.8 גרם [14]. בהתאם לעלייה במשקל הגוף, מושכות האדפס (1.4±0.2 גרם) נשארו ב-DM-empa אך לא בקבוצת ה-DM-cont.

חולדות DEK מושפעות הראו בעבר אי סבילות חמורה לגלוקוז, ללא הפרשת אינסולין בתגובה להעמסת גלוקוז ואובדן תאים [14]. בדקנו האם אמפגליפלוזין משפר את סבילות הגלוקוז והפרשת האינסולין ומנע אובדן תאים. רמת הגלוקוז בדם לאחר 16 שעות צום הייתה נמוכה משמעותית ב-DM-empa מאשר בקבוצת DMcont, וכך גם רמת הגלוקוז בדם 60-240 דקות לאחר העמסת גלוקוז (איור 1C). השינוי הקשור בזמן של גלוקוז בדם ב- OGTT של DM-empa כמעט דומה לזה בחולדות בקרה ללא סוכרת מזן DEK [14]. עם זאת, הפרשת אינסולין המושרה על ידי גלוקוז לא התרחשה באף אחת מהקבוצות (איור 1D). צביעה אימונופלואורסצנטית של אינסולין באיי הלבלב לא הראתה אותות אינסולין חלשים בקבוצת ה-DM-cont וכמעט 100 אחוז אותות חיוביים בחולדות הביקורת, בעוד שאות אינסולין חלש, הכולל 24.2±3.5 אחוזים לאזור האי נצפה בשלוש חולדות קבוצת DM-empa (איור 2).

פרמטרים מטבוליים וכליות וצפיפות עצם

מדידות של פרמטרים מטבוליים לאחר תקופת טיפול של 12 שבועות הראו כי צריכת המזון הייתה נמוכה משמעותית ב-DM-empa מאשר בקבוצת DM-cont הן בערכים יחסיים (איור 3A) והן בערכים מוחלטים (S1 איור). בנוסף, צריכת המים (איור 3B, S1 איור) ונפח השתן (איור 3C, S1 איור) היו נמוכים בכ-50 אחוז ב-DM-empa מאשר בקבוצת DM-cont.

בסוף תקופת הטיפול של 12-שבוע, ריכוזי ה-Tcho, Cre, Alb, TP ו-Na בפלזמה היו נמוכים משמעותית ב-DM-cont מאשר בקבוצת הביקורת, עם רוב הפחתות אלו ב-DM-cont. קבוצה המציגה התאוששות חלקית בקבוצת DM-empa. בפרט, ריכוזי Tcho, TP ו-Na בפלזמה היו גבוהים משמעותית ב-DM-empa מאשר בקבוצת DM-cont, אם כי כל הריכוזים הללו היו נמוכים יותר ב-DM-empa מאשר בקבוצת הביקורת. רמות פלזמה Alb ו-Cre היו גבוהות יותר גם ב-DM-empa מאשר בקבוצת DM-cont, אך הבדלים אלו לא היו מובהקים סטטיסטית (טבלה 1). הפרשות בשתן של גלוקוז, UN, Ca, Na, K, Cl וחלבון היו גבוהות יותר באופן מובהק בקבוצת ה-DM-cont מאשר בקבוצת הביקורת, כאשר רוב העליות הללו הוקלו בקבוצת DM-empa. בפרט, הפרשות בשתן של Glu, UN, Na, K ו-Cl היו נמוכות משמעותית ב-DM-empa מאשר בקבוצת DM-cont, אם כי כל ההפרשות הללו היו גבוהות משמעותית ב-DM-empa מאשר בקבוצת הביקורת. . הפרשות מוגברות בשתן של Ca וחלבון הוקלו גם בקבוצת DM-empa, ללא הבדל משמעותי בין DM-empa לקבוצות הביקורת (טבלה 2). פרט ל-Ccre, שלא היה הבדל מובהק בין שלוש הקבוצות, כל הפינויים וההפרשות שנבדקו היו גבוהים משמעותית ב-DM-cont מאשר בקבוצת הביקורת (טבלה 3). יתרה מכך, למעט Cglu ו-FEglu, שנותרו גבוהות יותר בקבוצת ה-DM-empa, רוב העליות הללו בקבוצת ה-DM-cont הוקלו בקבוצת ה-DM-empa. בפרט, Cca, Cna ו-Ccl היו נמוכים משמעותית ב-DM-empa מאשר בקבוצת DM-cont אך נשארו גבוהים יותר ב-DM-empa מאשר בקבוצת הביקורת (טבלה 3).

BMD עצם הירך היה נמוך משמעותית ב-DM-cont מאשר בקבוצת הביקורת, כאשר empagliflozin נמצא כמחזיר את BMD femoral בקבוצת DM-empa (טבלה 4). BMC נטה להיות גבוה יותר ב-DM-empa מאשר בקבוצת DM-cont, אך ההבדל לא היה מובהק סטטיסטית (טבלה 4)

פתולוגיה של הכליות

חולדות DEK שנפגעו הראו הגדלה מתקדמת של כליות עם צינוריות מורחבות [14]. למרות שטיפול באמפגליפלוזין הפחית באופן דרמטי את רמות הגלוקוז בדם, הוא לא הפחית

משקל כליות, שהיה דומה בקבוצות DM-empa ו-DM-cont (2.35±0.08 גרם לעומת 2.24 ±0.08 גרם). בדיקה היסטולוגית הראתה כי התרחבות חמורה הייתה בולטת באבוביות הכליות של האזורים ה-juxtamedullary הן בחולדות DM-cont ו-DM-empa (איור 4A). Empagliflozin לא החליש את ההתרחבות באבוביות הכליות (איור 4B ו-4C). בהתאם לכך, הפרשת L-FABP בשתן, סמן ביולוגי של פגיעה בצינורית הכלייתית [20], הייתה גבוהה יותר ב-DM-cont ו-DM-empa בהשוואה לבקרה, ולא היה הבדל בין DM-cont ל-DM-empa ( איור 4D ו-4E). כפי שדווח בעבר [14], לא היה נגע גלומרולרי טיפוסי כגון היפרטרופיה ב-Control, DM-cont ו-DM-empa (איור 4F).

ניתוח GC-MS של חומצות אמינו בפלזמה

Metabolic profiling using PLS-DA multivariate analysis showed differences in amino acid status among the control, DM-cont, and DM-empa groups (S2 Fig). The loading plot corresponded to a score plot consisting of 24 amino acids (S2 Fig). The variable influences on projection (VIP) parameters are shown in S2 Fig. Amino acids colored red had VIP >1 and were considered to have a relatively high impact for separating these groups. Moreover, statistical analysis of amino acids showed a VIP >1.

סרקוזין פלזמה נוטה להיות גבוה יותר ב-DM-cont מאשר בקבוצת הביקורת, כאשר אמפגליפלוזין מגביר עוד יותר את הסרקוזין בפלזמה. לעומת זאת, טריפטופן פלזמה נוטה להיות נמוך יותר ב-DM-cont מאשר בקבוצת הביקורת, כאשר אמפגליפלוזין מפחית עוד יותר את הטריפטופן בפלזמה (טבלה 5). רמות הגליצין בפלזמה היו דומות בקבוצות ה-DM-cont והביקורת, אך היו גבוהות משמעותית ב-DM-empa מאשר בשתי הקבוצות האחרות. ריכוזי גלוטמין ואורניתין היו נמוכים משמעותית ב-DM-cont מאשר בקבוצת הביקורת ולא שוחזרו על ידי טיפול באמפגליפלוזין. בהשוואה לקבוצת הביקורת, פלזמה -aminobutyric חומצה הייתה נמוכה משמעותית בקבוצת DM-cont, כאשר empagliflozin הפחית עוד יותר את ריכוזו. ריכוזי הוולין והאיזולאוצין בפלזמה היו גבוהים יותר באופן משמעותי ב-DM-cont מאשר בקבוצת הביקורת, כאשר ריכוזים אלו הוחזרו לרמת הביקורת על ידי טיפול באמפגליפלוזין.

דִיוּן

מעכבי SGLT2 מפחיתים את רמות הגלוקוז בדם בצורה בלתי תלויה באינסולין ומציגים השפעות הגנה מפני רינו בחולים עם DM מסוג 2, כמו גם במספר מודלים של בעלי חיים [8, 12, 21-23]. רוב המחקרים בבעלי חיים עם מעכבי SGLT2 נערכו בחיות שמנות עם DM מסוג 2 [22, 24-28]. עם זאת, חולי DM רבים מסוג 2, במיוחד באסיה, אינם סובלים מהשמנת יתר [29]. ההשפעות של מעכבי SGLT2 על חולים עם נגעים בכליות או סוכרת שאינה שמנה נותרות לא ברורות [29, 30]. המחקר הנוכחי חקר את ההשפעות של empagliflozin על מטבוליזם, תפקוד כליות והיסטופתולוגיה בחולדות DEK, מודל חדש של חולדות סוכרתיות ללא השמנת יתר עם נטייה לכליות מוגדלות [14]. בהשוואה למודלים של בעלי חיים סוכרתיים עם השמנת יתר, הפנוטיפ של חולדות DEK סוכרתיות התאפיין בהפחתה מתקדמת של ריכוז האינסולין בפלזמה עקב אובדן תאי הלבלב, במקום עמידות לאינסולין, כך שחולדות DEK סוכרתיות הראו ירידה ב-BW ובשומן עם התקדמות DM. בנוסף, חולדות DEK סוכרתיות הראו פרנכימה כלייתית מוגברת והגדלה ניכרת של הכליות עם התרחבות של צינוריות הכליה [14].

מעכבי SGLT2 מקדמים את הניצול של שומן, שריר וחומצות אמינו כמקורות אנרגיה [31-33], ומפחיתים מסת שומן ו-BW בבני אדם ובעלי חיים שמנים [28, 34, 35]. אובדן מסת שומן וירידה בעלייה במשקל נצפו גם במכרסמים סוכרתיים שאינם שמנים שטופלו במעכבי SGLT2 [31]. בנוסף, גם בני אדם וגם מכרסמים שטופלו במעכבי SGLT2 הראו היפרפגיה מפצה כדי לשמור על איזון האנרגיה והתזונה שלהם [27, 32, 36]. במחקר זה, טיפול באמפגליפלוזין הוריד את רמות הגלוקוז בדם של חולדות DEK תוך 24 שעות, כאשר ריכוזים נמוכים אלה נשמרו לאורך כל תקופת הטיפול של 12-שבוע, בדומה למחקרים אחרים של מעכבי SGLT2 [15, 24]. בניגוד לממצאים קודמים [27, 28,36], מצאנו שטיפול באמפגליפלוזין הפחית את צריכת המזון והחליש את אובדן מושכות האדפס ואת העיכוב של עלייה ב-BW. תוצאה בלתי צפויה זו הייתה קשורה כנראה לשיפורים במאזן האנרגיה. בתחילה, הפרשת הגלוקוז בשתן הייתה נמוכה משמעותית בחולדות DM-empa מאשר בחולדות DM-cont, אם כי ה-Cglu הגבוה באופן ניכר בקבוצת DM empa נבע מעיכוב מוחלט של ספיגת גלוקוז מחדש, כאשר FEglu היה כמעט 100 אחוז. ממצא זה נתמך עוד יותר על ידי הפחתה משמעותית בהפרשת UN בשתן, פרמטר של קטבוליזם חלבון, למרות רמת BUN תקינה, בקבוצת DM-empa [37]. בנוסף, העלייה ב-TP הפלזמה והירידה בחלבון השתן בקבוצת DM-empa הצביעו על כך ש-empagliflozin שיפר את שימור החלבון. ייתכן שהשמירה והניצול של גלוקוז והחזרה ממצב קטבולי למצב מוטמע בחולדות שטופלו באמפגליפלוזין נבעו מהשליטה המוצלחת שלו על רמות הגלוקוז בדם.

מעכבי SGLT2 הוכחו כמגדילים את נפח השתן, כאשר עלייה בספיגה חוזרת של הצינוריות מפצה על אובדן של נוזלי גוף ואלקטרוליטים [21, 25, 38]. לכן, נפח השתן גדל מיד לאחר תחילת הטיפול במעכבי SGLT2, אך טיפול ארוך טווח עשוי להפחית הן את נפח השתן והן את צריכת המים [38, 39]. למרות שרמת ה-Cre בפלזמה הייתה נמוכה משמעותית ב-DM-cont ו-DM-empa מאשר בקבוצת הביקורת, Ccre לא נבדלה משמעותית בין קבוצות הביקורת, DM-cont ו-DM-empa. לכן, מכיוון שלא הייתה עדות ברורה להיפרטרופיה גלומרולרית בחולדות DEK-DM [14], ייתכן שסינון יתר גלומרולרי בקושי התרחש או להיות קל ב-DM-contence. בנוסף, כליה מוגדלת עם פרנכימה מוגברת עשויה להגדיל את מספר הנפרונים, מה שמצביע על כך שכליה מוגדלת הן ב-DM-cont והן ב-DM-empa עשויה להיות קשורה להפחתת רמות ה-Cre בפלזמה. לכן, ייתכן שנפח השתן המופחת בקבוצת DM-empa נבע משיפורים בספיגת מים מחדש באבוביות הכליה, ולא מקצב סינון גלומרולרי מופחת. בסך הכל, ההפרשה המוגברת של אלקטרוליטים בשתן בקבוצת DM-cont נחלשה בקבוצת DM empa, מה שמעיד על כך שריכוזי הפלזמה המופחתים של אלקטרוליטים בקבוצת DM-cont הוחלשו על ידי טיפול באמפגליפלוזין באמצעות שיפור בתפקוד הצינורית הכלייתית. השערה זו נתמכה על ידי הפחתות עקביות של הפינוי שלהם עם ירידה בהפרשות של חלקים בקבוצת DM-empa.

מעכבי SGLT2 דווחו כבעלי השפעות מזיקות על העצם [31, 40]. מכיוון שאוסטאופורוזיס הוא סיבוך שכיח של DM, השווינו BMD ו-BMC ​​בשלוש קבוצות החולדות. BMD ו-BMC ​​היו נמוכים משמעותית ב-DM-cont מאשר בקבוצת הביקורת, אך הפחתות אלו הוחלשו בקבוצת DM-empa. יתרה מכך, עליות אלו ב-BMD וב-BMC בקבוצת ה-DM-empa לוו בהפחתות בהפרשת Ca בשתן. מכיוון שרמות Ca בפלזמה מוסדרות בקפדנות, לא היו הבדלים משמעותיים ברמות Ca בפלזמה בין קבוצות הביקורת, DM-cont ו-DM-empa. ממצאים אלו הצביעו על כך שמאזן Ca שלילי בקבוצת DM-cont עשוי להיות מקוזז על ידי התגייסות של a מהעצם לתוך מחזור הדם, כאשר מצב זה מוחלש חלקית על ידי שיפור התפקוד הצינורי הכלייתי של Ca בקבוצת DM-empa.

ייתכן שההפחתה של היפופרוטאינמיה בקבוצת ה-DM-empa נבעה משיפור בפרוטאינוריה. אף על פי שלא הוצגו בבירור היפרפילטרציה והיפרטרופיה בקבוצת DM-cont, רמת הגלוקוז המופחתת בדם עלולה להפחית את הסינון הגלומרולרי של Alb. בנוסף, ייתכן ששיפורים בספיגה החוזרת של חלבונים וחומצות אמינו תרמו לסינתזה של חלבוני פלזמה בכבד. חולדות DEK מושפעות מאופיינות בריכוזי Tcho נמוכים בפלזמה [14]. מכיוון שייצור מוגבר של Alb מלווה בייצור מוגבר של Tcho בכבד [41], רמות Tcho בפלזמה הגבוהות יותר בקבוצת DM-empa עשויות להיות קשורות לייצור מוגבר של Alb. ייתכן שהאחרון נבע מהגדלת חומצות אמינו ואספקת אנרגיה הקשורה לשיפורים בשימור חלבון ובאיזון האנרגיה.

הומאוסטזיס של חומצת אמינו מסועפת (BCAA) נקבעת במידה רבה על ידי פעילות קטבולית של BCAA ברקמות [42], כאשר פגמים בהומאוסטזיס BCAA נחשבים כמדד לתנגודת לאינסולין או מצב סוכרת [43-45]. ניתוח GC-MS שלנו של חומצות אמינו הראה שריכוזי הפלזמה של valine ואיזולאוצין בחולדות DM-empa היו שווים לאלו בחולדות בקרה ללא סוכרת, מה שמצביע על כך שטיפול באמפגליפלוזין משפר את קטבוליזם החלבון ואת מצבי הסוכרת. בנוסף, ראינו שעלייה ספציפית לאמפגליפלוזין ברמת הגליצין בפלזמה קשורה לשיפור בסוכרת. מעניין לציין שרמה נמוכה של גליצין בפלזמה נצפתה בסוכרת אנושית [46], ונמצא כי מתן גליצין משרה השפעות נוגדות חמצון והגנה מפני רינו בחולדות עם סוכרת הנגרמת על ידי סטרפטוזוטוצין [47]. רמות גבוהות יותר של גליצין בפלזמה עשויות להיות קשורות להחלשות של עקה חמצונית ונפרופתיה סוכרתית בחולי סוכרת וחיות ניסוי שטופלו באמפגליפלוזין. רמות הפלזמה של חומצות אמינו מושפעות מניצולן על ידי רקמות ואיברים בכל הגוף ותלויות במצבים אנבוליים וקטבוליים. נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע כיצד שינויים ברמות של חומצות אמינו אלו ואחרות קשורים למצב מטבולי.

מעכבי SGLT2 מפעילים השפעות הגנה מחדש על ידי דיכוי מספר תהליכים הקשורים למחלות כליה, כגון אלבומינוריה ומשקל כליות מוגבר [15, 24, 48, 49]. הרחבת צינורות הכליה וחלבון הם סמנים לנזק לכליות הקשור לסוכרת [50]. עם זאת, empagliflozin לא הצליח לדכא התרחבות צינורית הכליה והפרשת L-FABP מוגברת בשתן במודל החולדות שלנו, אך שיפר משמעותית את תפקוד הצינוריות. אי התאמה זו העלתה כי השיפור הקשור לאמפגליפלוזין בתפקוד הצינורי נבע מהשפעות קלות או משניות שאינן מלוות בשינויים אורגניים באבוביות הכליות. לחלופין, מכיוון שהרחבת צינורות עם פציעה ומשקל כליות מוגבר נשמרה במצבים נורמוגליקמיים בחולדות DEK מושפעות, ייתכן ששינויים אלו היו תכונות גנטיות הקשורות לסוכרת בחולדות DEK ולא משניות להיפרגליקמיה.

למרות שמעכבי SGLT2 מכוונים לצינורות הכליה, מעט ידוע על ההשפעות של חומרים אלו על השינויים הכוללים בתפקוד של צינוריות הכליה, מלבד היפרטרופיה גלומרולרית כרוכה בהובלה צינורית של נתרן עם גלוקוז [13, 22, 24]. מחקרים על ההשפעות של מעכבי SGLT2 על תפקוד הצינוריות הראו שספיגה חוזרת של מים לא רק נדכאה על ידי משתן אוסמוטי, אלא הוגברה על ידי וויסות עלייה של אקוואפורין ושל מעביר אוריאה על ידי מנגנון שעדיין לא נקבע [21, 25]. תאי אפיתל צינורי כלייתי של חולי סוכרת מושפעים לא רק מהלחץ האוסמוטי של הגלוקוז הקיים בנוזל הצינורי, אלא מעודף גלוקוז ונתרן הנלקחים לתאים באמצעות SGLT2. לאחרונה, סטרס חמצוני באבובי הכליה נחשב חשוב להתקדמות של נפרופתיה סוכרתית (DN), ואיפרגליפלוזין הראה השפעות הגנה מפני רינו באמצעות מניעת ייצור יתר של ROS באבוביות הכליות [51]. למרות שלא נמצאה התקדמות רצינית של DN בחולדות DEK מושפעות, לחץ חמצוני עלול לפגוע בתפקוד הצינורי. נכון לעכשיו, אין הסכמה מאוחדת לגבי ההשפעות של מעכבי SGLT2 על תפקוד הצינורית, מה שמצביע על צורך במחקרים נוספים כדי להבהיר את המנגנון שבאמצעותו empagliflozin משפר את תפקוד הצינוריות בחולדות DEK.

נמצא כי מעכבי SGLT2 משמרים מסת תאים במודלים מסוג DM מסוג 1 והשמנת יתר מסוג 2 [52, 53]. זיהינו תאים עם אותות אינסולין חלשים בקבוצת DM-empa, אך ללא תאים בקבוצת DM-cont. עם זאת, OGTT הראה שיפורים מתונים בסבילות לגלוקוז ללא הפרשת אינסולין בקבוצת DM-empa. מכיוון שלאמפגליפלוזין יש זמן מחצית חיים קצר של כ-8 שעות, רמות הגלוקוז המופחתות בדם שנצפו לאחר צום של 16 שעות והשיפור בסבילות לגלוקוז לא נבעו מההשפעות של שאריות אמפגליפלוזין. ממצאים אלו, לפיכך, מצביעים על כך שניהול ארוך טווח של אמפגליפלוזין עשוי לשפר את חילוף החומרים של הגלוקוז ולהפחית באופן מתון את רמת הגלוקוז בדם לאחר העמסת גלוקוז חד פעמית באופן בלתי תלוי באינסולין.

לסיכום, תוצאות המחקר הנוכחי מצביעות על כך שהאמפגליפלוזין משפר את חילוף החומרים המערכתי ואת תפקוד הצינורות הכלייתי בחולדות DEK, אם כי המנגנונים המפורטים העומדים בבסיס התגובה הייחודית של בעלי חיים אלו לאמפגליפלוזין נותרו לא ברורים. ממצאים אלה גם מצביעים על כך שחולדות DEK הן מודל שימושי לחקר והערכת ההשפעות הביולוגיות המרובות של מעכבי SGLT2 בסוכרת.

הפניות

1. הפדרציה הבינלאומית לסוכרת. אטלס סוכרת צה"ל מהדורה 9. בריסל, בלגיה 2019.

2. האגודה האמריקאית לסוכרת. סיווג ואבחון של סוכרת. סעיף 2. סטנדרטים של טיפול רפואי בסוכרת-2019. טיפול בסוכרת. 2019; 42 (ספק 1): S13–S28.

3. Zheng Y, Ley SH, Hu FB. אטיולוגיה ואפידמיולוגיה גלובלית של סוכרת מסוג 2 וסיבוכיה. Nat Rev Endocrinol. 2018; 14(2):88–98.

4. Lin CC, Li CI, Liu CS, Lin WY, Lin CH, Yang SY, et al. פיתוח ותיקוף של מודל חיזוי סיכון למחלת כליות סופנית בחולים עם סוכרת מסוג 2. Sci Rep. 2017; 7(1):10177.

5.Valderra´bano F, Jofre R, Lo´pez-Go´mez JM. איכות חיים בחולי מחלת כליות בשלב סופי. Am J Kidney Dis. 2001; 38(3):443–64.

6. אולם PM. מניעת התקדמות בנפרופתיה סוכרתית. סוכרת ספקטר. 2006; 19(1): 18–24.

7. Hsia DS, Grove O, Cefalu WT. עדכון על מעכבי מעבירים משותפים של סודיום-גלוקוז-2 לטיפול בסוכרת. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2017; 24(1):73–79.

8. Perkovic V, Jardine MJ, Neal B, Bompoint S, Heerspink HJL, Charytan DM, et al. קנאגליפלוזין ותוצאות כליות בסוכרת מסוג 2 ונפרופתיה. N Engl J Med. 2019; 380(24):2295–2306.

9. Sarafidis PA, Tapas A. Empagliflozin, תוצאות קרדיווסקולריות ותמותה בסוכרת מסוג 2. N Engl J Med. 2016; 374(11):1092.

10. Wiviott SD, Raz I, Bonaca MP, Mosenzon O, Kato ET, Cahn A, et al. Dapagliflozin ותוצאות קרדיווסקולריות בסוכרת מסוג 2. N Engl J Med. 2019; 380(4):347–357.

11. Brown E, Rajeev SP, Cuthbertson DJ, Wilding JPH. סקירה של מנגנון הפעולה, הפרופיל המטבולי וההשפעות ההמודינמיות של מעכבי נתרן-גלוקוז-קו-טרנספורטר-2. סוכרת השמנת יתר Metab. 2019; 21 משלים 2:9–18.

12. Heerspink HJL, Stefansson BV, Chertow GM, Correa-Rotter R, Greene T, Hou FF, et al. הרציונל והפרוטוקול של הניסוי האקראי מבוקר Dapagliflozin ומניעת תוצאות שליליות במחלת כליות כרונית (DAPA-CKD). השתלת חוגה של Nephrol. 2020; 35(2):274–282.

13.Bae JH, Park EG, Kim S, Kim SG, Hahn S, Kim NH. השפעות של מעכבי נתרן-גלוקוז קוטרנספורטר 2 על תוצאות הכליות בחולים עם סוכרת מסוג 2: סקירה שיטתית ומטה-אנליזה של מחקרים אקראיים מבוקרים. Sci Rep. 2019; 9(1):13009.

14. Domon A, Katayama K, Tochigi Y, Suzuki H. אפיון של מודל חולדות סוכרת מסוג 2 ללא השמנה חדשני עם כליות מוגדלות. J Diabetes Res. 2019; 2019:8153140. PMID: 31467929

15. Vallon V, Gerasimova M, Rose MA, Masuda T, Satriano J, Mayoux E, et al. מעכב SGLT2 empagliflozin מפחית את הצמיחה הכלייתית ואלבומינוריה ביחס להיפרגליקמיה ומונע סינון יתר גלומרולרי בעכברי אקיטה סוכרתיים. Am J Physiol Renal Physiol. 2014; 306(2): F194–204.

16. Vickers SP, Cheetham SC, Headland KR, Dickinson K, Grempler R, Mayoux E, et al. שילוב של מעכב הנתרן-גלוקוז-קוטרנספורטר-2 empagliflozin עם אורליסטט או סיבוטרמין משפר עוד יותר את הפחתת משקל הגוף ואת ההומאוסטזיס של הגלוקוז של חולדות שמנות הניזונות מדיאטת קפיטריה. סוכרת Metab Syndr השמנת יתר. 2014; 7:265–75.

17. Glastras SJ, Chen H, The R, McGrath RT, Chen J, Pollock CA, et al. מודלים של עכברים של סוכרת, השמנת יתר ומחלת כליות קשורה. PLoS ONE. 2016; 11(8):e0162131.

18.Badawy AA, Morgan CJ, Turner JA. יישום של ערכת ניתוח חומצות אמינו Phenomenex EZ:faast™ לקביעה מהירה של גז כרומטוגרפיה של ריכוזי טריפטופן בפלזמה ומתחרי הספיגה שלו במוח. חומצות אמינו. 2008; 34(4):587–96.

19. Michishita M, Saito N, Nozawa S, Furumoto R, Nakagawa T, Sato T, et al. פרופיל מטבוליטים בתאים יוצרי כדור משורות תאים אדנוקרצינומה של חלב כלבים באמצעות כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה. J Vet Med Sci. 2019; 81(9):1238–1248.

20. Kamijo-Ikemori A, Sugaya T, Kimura K. חלבון קושר חומצות שומן בשתן במחלת כליות. Clin Chim Acta. 2006; 374(1–2):1–7.