השפעות של סך הגליקוזידים של Cistanche Deserticola על התפשטות, אפופטוזיס וביטוי של Wnt/-Catenin Signaling Pathway חלבון של תאי HepG2

FENG Duo1,2, WANG Jing2, JIANG Yong-jun3, ZHOU Shi-qi1, DUAN Hao1,GUO Yu1, ZHAO Jian1, YAN Wen-jie1,*

（1. מעבדת מפתח בייג'ינג לחומרים ביו-אקטיביים ומזון פונקציונלי, המכללה להנדסה ביוכימית, אוניברסיטת בייג'ינג יוניון, בייג'ינג 100023, סין; 2. המכון לפיתוח מזון ותזונה, משרד החקלאות וענייני הכפר, בייג'ינג 100081, סין; 3. מונגוליה הפנימית Sankou Biotechnology Co., Ltd., Ordos, Inner Mongolia 017000, China）

תַקצִיר: כדי לחקור את ההשפעה המעכבת שלסך הגליקוזידים שלCistanche deserticola(TG) על תאי HepG2 והמנגנון שלו. במאמר זה, ריכוזים שונים (0, 3.5, 10.5, 21, 31.5, 42 ug/mL) של TG טופלו במשך 24 שעות בתאי סרטן כבד HepG2, והכדאיות של תאי HepG2 זוהתה באמצעות מבחן CCK8 . שיטת צביעה כפולה Hoechst33342/PI ו-Annexin V-FITC / PI שימשו לזיהוי אפופטוזיס של תאי HepG2. התופעה של נדידת תאים זוהתה על ידי בדיקת נדידת תאים. בינתיים, שינויים בהתקדמות מחזור התא זוהו על ידי ציטומטריית זרימה. והביטוי של -fetoprotein(AFP), -catenin, Disheveled (Dsh) ו-GSK-3 זוהה באמצעות כתם מערבי. התוצאות הראו ש-TG יכול להפחית את התפשטות תאי HepG2 באופן תלוי ריכוז, עם רק 31.04 אחוז כדאיות לתאים כאשר TG היה 42 ug/mL. בנוסף, TG יכול לפגוע במבנה התא ולעורר אפופטוזיס של התא, ושיעור האפופטוזיס יכול להגיע ל-32.44 אחוזים על ידי זיהוי AV/PI. יתר על כן, TG יכול גם לקדם נמק של תאים ולהגביל את נדידת התאים. היו הבדלים משמעותיים בין הקבוצה שטופלה לקבוצת הביקורת. בינתיים, ריכוז גבוה של TG יכול לעצור תאי HepG2 בשלב G2/M. לבסוף, בהשוואה לקבוצת הביקורת, הביטוי היחסי של -catenin ו-Dsh ירד, בעוד ש-GSK-3 עלה בקבוצות שטופלו ב-TG. לסיכום, TG יכול לעכב את צמיחת תאי HepG2 על ידי השפעה על התקדמות מחזור התא, קידום אפופטוזיס והגבלת נדידת התאים. המנגנון עשוי להיות דרך מסלול האיתות Wnt/-catenin, שהפעיל את GSK-3 כדי לפרק את-catenin כדי להשיג עיכוב של סרטן הכבד.

מילות מפתח: Cistanche deserticola; סך גליקוזידים; תא HepG2; אנטי-הפטומה; מסלול אותות Wnt/ -Catenin

Cistanche deserticola maשייך לחומר הומולוגי תרופתי ומזון והוא צמח טפיל עשב רב שנתי של ה-Orobaceae.יש לו השפעות של נוגד חמצון, אנטי עייפות, אנטי אייג'ינג, אנטי גידול, הגנה על הכבד, ויסות אנדוקרינית, שיפור יכולת הזיכרון ואנטי אוסטיאופורוזיס. זה ידוע כ "ג'ינסנג מדברי". לאחר שאישר ש- deserticola deserticola הפך לחומר הומולוגי תרופתי ומזון ב-2018, הוא משך תשומת לב רבה. הוא יכול לא רק לשחק את ערך היישום הקליני של רפואת הצמחים הסינית אלא גם להשפיע על השפעת ההתערבות התזונתית של מזון.זה גם מראה פוטנציאל גדול בפיתוח מוצרים טבעיים חדשים נגד סרטן הכבד [2-3]. המחקר התזונתי וההשפעות הפונקציונליות של מזונות דסרטיקולה הופכים יותר ויותר מעמיקים [4].

ציסטאנצ'ה חיה במדבר

בשנים האחרונות דווח כי ל- Cistanche deserticola ישנגד גידוליםהשפעה. Ye et al. [5]מצאו שאכינצאה המופקת ממלח Cistanche deserticola יכולה לעכב את התפשטות תאי HepG2 על ידי הפחתת הביטוי של TREM2 וחסימת מסלול האות PI3K/AKT; כמה חוקרים מצאו שגליקוזידים פנילתנואידים מ-Cistanche deserticola יכולים לעכב את התפשטות תאי HepG2 [6]; לאכינוסיד השפעה מעכבת מסוימת על התפשטות סרטן הכליה 786-תאי O [7] ו-SW480 סרטן המעי הגס [8]; במחקר אחר, הוכח כי phenylethanoid glycosides מ- Cistanche deserticola מפחיתים נזק לכבד בעכברים הנושאים גידולים H22, ומשפרים את תפקוד החיסון על ידי הפחתת רמות AFP, ובכך משפיעים לרעה על צמיחת הגידול [9]. ניתן להעביר גם מרתח Cistanche deserticola [10] וגם פוליסכריד [11] דרך Wnt/ - מסלול איתות Catenin משפר את הסימפטומים הקליניים של חולדות פרקינסון וממלא תפקיד נוירו-הגנה. בנוסף, מחקרים מצאו שאכינצאה יכולה לעכב Wnt על ידי/ - מסלול איתות Catenin ממלא תפקיד אנטי סרטן שד [12]; בנוסף, זה יכול גם להפחית תאי THP-1 בלוקמיה חריפה אנושית - ביטוי חלבון Catenin [13]. לאורך כל הדרך, מסלול איתות Wnt/ - Catenin זכה לתשומת לב רבה [14]. מדווח כי ניתן להבחין בה ב-20% - 35 אחוז ממקרי HCC [15] - הפעלה של Catenin. ישנן עדויות הולכות וגדלות לכך שמסלול האיתות Wnt/- Catenin ממלא תפקיד חשוב בהתרחשות והתפתחות סרטן הכבד [16], אך האם סך הגליקוזידים של Cistanche deserticola מווסת את Wnt/ - ישנם דיווחים מעטים על ההשפעה האנטי-הפטומה של מסלול האיתות של קטנין. סך הגליקוזידים של תמצית Cistanche deserticola, כולל גליקוזידים פנילאתנואידים וגליקוזידים אחרים [17], נחקרו בניסוי זה על ידי לימוד התפשטות, אפופטוזיס, הגירה ורמות ביטוי חלבון קשורות של תאי HepG2 שנגרמו על ידי Total Glycosides of Cistanche deserticola (TG) , לחקור את המנגנון של TG המעכב סרטן כבד, ולהסביר את המנגנון הפוטנציאלי של TGs נגד סרטן הכבד, לספק את הבסיס המדעי המסוים להעשרת היישום הקליני של Cistanche deserticola בתחום סרטן הכבד.

פנילטנול גליקוזיד הוא המרכיב הפעיל העיקרי של Cistanche deserticola

1.חומר ושיטות

1.1 חומרים וכלים

תאי HepG2 (Human Hepatocellular Carcinomas) נרכשו ממרכז התא של המכון לרפואה בסיסית, Peking Union Medical University, סין.סך הגליקוזידים שלאבקת תמצית Cistanche(שבר מסה גדול או שווה ל-75 אחוזים, בשילוב עם echinacoside ובריכה, מסופק על ידי Inner Mongolia Sankou Biotechnology Co., Ltd.) הומסו במדיום DMEM לריכוזים תואמים של TG לניסויים הבאים.

אבקת תמצית Cistanche

לחץ כאן לצפייה במוצרי Cistanche Extract Protect Liver

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

סרום בקר עוברי נרכש מגיבקו, ארה"ב; נוגדנים (תמיסה מעורבת של פניצילין-סטרפטומיצין גנטמיצין), מדיום DMEM-H, ערכת אפופטוזיס ומחזור תאים, תמיסת Annexin V-FITC/צבע ותמיסת צבע אפופטוזיס Hoechst 33342/PI נרכשו מ-Genview; ערכת קביעת ריכוז חלבון BCA {{4}.25% נרכשה מ- Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd; נוגדני ארנב נגד קטנין נרכשו מ-ABclonal; נוגדן אנטי-Dsh ארנב (ADAR1) נרכש מ-Bios; נוגדני ארנב נגד GSK3 ונוגדנים נגד AFP לארנב נרכשו מ-Affinity. חממת תאי CO2 (Innova CO-170), צנטריפוגה שולחנית במהירות גבוהה בטמפרטורה נמוכה (3K15, Sigma, גרמניה), מכשיר לתיוג אנזימים רב תכליתי (INFINITE M NANO TECAN), מיקרוסקופ פלואורסצנטי (C-SHG1, Nikon, יפן ), ציטומטריית זרימה (FACSCALIBUR, BD, ארה"ב), מכשיר אלקטרופורזה (EN027015, BIO-RAD, ארה"ב), מכשיר העברת ממברנה (043BR57802, BIO-RAD, ארה"ב).

1.2 שיטה נסיונית

1.2.1 מעבר תאים

תאי HepG2 תורבו במדיום מלא DMEM המכיל 10 אחוז סרום בקר עוברי ו-1 אחוז נוגדנים משולשים (100 יחידות למ"ל פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין וג'נטמיצין) בחממת תאי CO2 של 5% ב-37 תואר . לאחר שהתאים גדלו למפגש של 80 אחוז עד 90 אחוז, הם עוכלו עם 0.25 אחוז טריפסין (- EDTA) ותת-תרבות ביחס של 1:2 עד 4. לאחר 2-3 ימים של גידול תאים, צמיחה לוגריתמית תאי פאזה נלקחו לתת-תרבות או לניסויים הבאים

1.2.2 השפעת TG על המורפולוגיה של תאי HepG2

תאי HepG2 משלב הגדילה הלוגריתמי נלקחו וחוסנו בצלחת 24-באר עם ריכוז תאים של 5 לבאר × 104 חתיכות/מ"ל, לאחר שהתאים נצמדים לקיר, הוסף TG לריכוז הסופי של 0, 3.5, 10.5, 21, 31.5, 42 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מ"ל לבאר, תורבת במשך 24 שעות, וצפה במורפולוגיה של התא של כל קבוצה במיקרוסקופ אור.

1.2.3 השפעת TG על התפשטות תאי HepG2

קח תאי HepG2 בשלב הגדילה הלוגריתמי והתאם את ריכוז התא ל-1 × 104 חתיכות/באר, מחוסן בצלחות של 96 באר, הוספת 100 חתיכות לבאר μ 50. דגירה באינקובטור תאים. לאחר שהתאים נצמדים לדופן, הם מטופלים בתרופות לפי 1.2.2 לעיל, ולכל קבוצה יש שישה רפרפורציות, בתרבית במשך 24 שעות. שיעור ההישרדות של התא נמדד בשיטת CCK8, וערך הספיגה (OD) נמדד באורך גל של 450 ננומטר. שיעור הישרדות התא ושיעור עיכוב התאים חושבו באמצעות הנוסחה הבאה.

בנוסחה, הקבוצה הריקה מכילה נוזל CCK8 בלבד, בעוד שקבוצת הביקורת מכילה 0 קבוצת טיפול מיקרוגרם/מ"ל, קבוצת ניסוי: 3.5, 10.5, 21, 31.5, 42 מיקרוגרם/מ"ל קבוצת טיפול.

1.2.4 השפעת TG על מחזור התא HepG2

קח תאי שלב צמיחה לוגריתמי ולחץ על 5 × צפיפות תאים של 105 תאים לבאר חוסן לתוך צלחת עם שש בארות, ומערכת של 2 מ"ל לבאר שהכילה 5 × 105 תאים הוכנסה לקופסת תרבית ונתונה לטיפול תרופתי כמתואר בסעיף 1.2.2 לעיל. לאחר התרבית, בוצעו פעולות עוקבות בהתאם להוראות הערכה.

1.2.5 השפעת TG על הגירה של תאי HepG2:

בחר תאי שלב צמיחה לוגריתמי והנח אותם על צלחת שש בארות. מערכת של 2 מ"ל לבאר המכילה 6 × 105 תאים הוסרה כאשר הידבקות התא וצבירה של התאים היו מעל 90 אחוזים. בצע טיפול תרופתי לפי 1.2.2 לעיל. בשעה 0, בחר באקראי 5 שדות ראייה תחת המיקרוסקופ לצילומים, הנח אותם באינקובטור לטיפוח נוסף למשך 24 שעות, צלם תמונות תחת המיקרוסקופ האופטי, השתמש בתוכנת Image J כדי לנתח את שטח השריטה של ​​התאים, וחשב את קצב הגירה לפי הנוסחה הבאה (2) [18].

1.2.6 שיטת צביעה כפולה Hoechst 33342/PI לזיהוי אפופטוזיס

בחר תאי שלב צמיחה לוגריתמי והנח אותם על צלחת באר {{0}}, עם מערכת של 0.5 מ"ל המכילה 3 × 104 תאים טופלו בתרופות לפי 1.2.2 לעיל, ו-1 מ"ל של חיץ צביעת תאים התווסף, ואחריו 5 μ לצבע Hoechst ופתרון צבע 5 μ LPI לצביעה. דגירה בחושך ב-37 מעלות למשך 7-10דקות, הוצא 24-צלחת חור, הרטב אותה עם PBS, וצלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתצפית.

1.2.7 זיהוי של אפופטוזיס של תאי HepG2 על ידי צביעה כפולה Annexin V-FITC/PI

בחרו תאי שלב צמיחה לוגריתמי והנחו אותם על צלחת בעלת שש בארות, עם מערכת של 2 מ"ל לבאר המכילה 2 × 105 תאים טופלו בתרופות לפי 1.2.2 לעיל, והפעולות הבאות בוצעו לפי הוראות הערכה, הוספת 5 μ L Annexin V-FITC ו-5 μ L צביעת תמיסת PI הודגרה ב-4 מעלות בחושך ולאחר מכן הונחה על ציטומטריית זרימה לזיהוי אפופטוזיס.

1.2.8 השפעת TG על ביטוי חלבון בתאי HepG2

עיתונות 2 × 106 תאים/תא טופלו בתרופות לפי 1.2.2 לעיל, תוך שימוש ב-80 μL lysate (RIPA: PMSF=100:1) ליזה חלבונים, ולאחר מכן באמצעות אלקטרופורזה SDS-PAGE כדי להפריד כל דגימת חלבון (50 דגימות לבאר מיקרוגרם) השלם את העברת החלבון לממברנת PVDF באמבט קרח, באמצעות 1 × נקה את הסרט עם תמיסת חיץ TBST, אטום לאט את שולחן הניעור של BSA בטמפרטורת החדר למשך שעה והוסף נוגדן (AFP, GSK3) בפרופורציה- , - Catenin, Dsh), דגירה ב-4 מעלות למשך הלילה, ולאחר מכן דגירה על קרום PVDF עם הנוגדן המשני המדולל בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. GAPDH משמש כאסמכתא פנימית. לאחר פיתוח ותיקון קרום PVDF, צפה בשינויים בביטוי חלבון היעד [6].

1.3 ניתוח נתונים

ניתוח מובהקות של גורם יחיד של ANONA נערך באמצעות תוכנה סטטיסטית SPSS 25.0 לביטוי; הנתונים הניסויים של ציטומטריית זרימה נותחו באמצעות Flowjo; השתמש ב-Graphpad Prism 8.0.2 לציור. פ<0.05 indicates a statistically significant difference, while P<0.01 indicates a highly significant difference.

2.תוצאות וניתוח

2.1 השפעת TG על המורפולוגיה של תאי HepG2

איור 1 תאי hepg2 שטופלו בריכוזים שונים של tg במשך 24 שעות (200x)

במהלך תהליך האפופטוזיס, קודם כל, נפחו יקטן בהדרגה ותעוות, ולאחר מכן תאים נצמדים יעברו לאט לאט תהליכים כמו התכווצות, עיגול, נשירה ופיקנוזה של כרומוזום תוך תאי. חלק מהגרעינים יעברו שבירה, שוליים והיווצרות שלפוחיות אפופטוטיות. כפי שנצפה באיור 1, 3.5 ו-10.5 מיקרון כאשר תאי HepG2 טופלו ב-g/mL TG, נפח התא ירד בהדרגה; ואז צפה ויזואלית ב-21 מיקרומטר ב-g/mL, הגרעין החל להתכווץ והנפח הפך קטן יותר; שלושים ואחת נקודה חמש μ ב-g/mL, התאים היו מלווים בפסולת ציפה ותאים; ארבעים ושתיים מיקרומטר ב-g/mL, קרום התא נקרע לחלוטין, התאים עוברים תמוגה, נמק מתרחש והגבול אינו ברור. התאים נמצאים במצב של קריסה ומוות קרובים.

2.2 השפעת TG על התפשטות תאי HepG2

איור 2 איור 2 השפעת TG על התפשטות תאי HepG2

הערה: * מייצג את זהה ל-0 μ ההבדל היה משמעותי ב-g/mL (P<0.05), and * * indicates a significant difference (P<0.01).

כפי שניתן לראות באיור 2, לאחר 24 שעות של טיפול בריכוזים שונים של TG, שגשוג תאי HepG2 מוגבל בדרגות שונות. בהשוואה לשיעור הישרדות התאים בקבוצת הביקורת, שיעור הישרדות התאים בקבוצת הטיפול מראה מגמת ירידה עם עליית ריכוז, שהיא 96.95 אחוז, 92.59 אחוז, 92.78 אחוז, 77.24 אחוז, 31.04 אחוז, והריכוז הוא 3.5, 10.5 ו-21, בהתאמה μ לא היה הבדל מובהק ב-g/mL והירידה הייתה קטנה, בעוד ש-31.5% μ G/mL ו-42 μ ב-g/mL, היה הבדל משמעותי (P<0.01), with an IC50 of 37.77 after TG treatment μ g/mL. CCK8 test results indicate that when TG concentration is 21 μ When the concentration is above g/mL, the inhibitory effect on HepG2 cells is better.

2.3 השפעת TG על מחזור התא HepG2

איור 3 השפעות של ריכוזים שונים של TG על מחזור התא של תאי HepG2

כפי שמוצג באיור 3, לאחר 24 שעות של טיפול בריכוזים שונים של TG, נמצא שככל שהריכוז עלה, שלב G0/G1 ירד בהדרגה, והיווה 59.9 אחוזים, 56.7 אחוזים, 56 אחוזים, 54 אחוזים, 33.4 אחוזים ו-29.1 אחוזים, בהתאמה, עם ירידה משמעותית; שיעור שלב S היה 14.3 אחוזים, 15.8 אחוזים, 16.8 אחוזים, 18.7 אחוזים, 25.1 אחוזים ו-27.6 אחוזים, בהתאמה, עם דרגות שונות של עלייה; 3.5-21 בהשוואה לקבוצת הביקורת (23.88 אחוז) μ ב-g/mL, שלב ה-G2/M משתנה מעט, והוא מהווה 25.85 אחוז, 24.92 אחוז ו-25.33 אחוז, בהתאמה. כאשר TG הוא 31.5 מיקרוגרם גרם/מ"ל ו-42 מיקרומטר בגרם/מ"ל, הוא עלה באופן משמעותי, 37.89 אחוז ו- 39.42 אחוזים, בהתאמה. בדיקה זו מצאה ש-TG בריכוזים נמוכים (3.5-21 μ G/mL), אינו מעכב חלוקת תאים ושגשוג באופן העיקרי המשפיע על מחזור התא, ובריכוזים גבוהים (31.5 μ G/mL ו- 42 מיקרוגרם G/mL) יכול לגרום לעצור תאים בשלב S ו-G2/M, ובכך לעכב את התפשטות התאים. יחד עם זאת, כאשר TG הוא 31.5 מיקרוגרם G/mL ו-42 מיקרומטר ב-g/mL, גם subG1 גדל, מה שעולה בקנה אחד עם המחקר של Sun Qian וחב'. [19] שנגזרות ארטמיסינין יכולות להגביר את שיא תת-G1 של תאי HepG2 בריכוזים גבוהים. הוא גם מצא שעם העלייה בריכוז הארטמיסינין, שיעור תאי שלב ה-G2/M עולה. תוצאות מחזור התא מצביעות על כך ש-TG עשוי לקדם את עיכוב התקדמות מחזור התא, ובכך לגרום לאפופטוזיס של התא.

2.4 השפעת TG על נדידת תאי HepG2

איור 4 השפעות של ריכוזים שונים של TG על נדידת תאי HepG2

הערה: * מייצג את זהה ל-0 μ ההבדל היה משמעותי ב-g/mL (P<0.05), and * * indicates a significant difference (P<0.01).

גרורות בתאי סרטן היא אחד המפתחות לטיפול בסרטן, וגם הישנות הסרטן קשורה קשר הדוק אליו. על מנת לחקור האם TG יכול לעכב את הגירה של תאי HepG2, נעשה שימוש בשיטת שריטה כדי לצפות בנדידת התאים. כפי שמוצג באיור 4, עם העלייה בריכוז TG, ניידות השעה 24- פוחתת בהדרגה, והשפעת העיכוב הברורה היא. הניידות היא 14.82 אחוז , 13.42 אחוז , 12.66 אחוז , 10.11 אחוז , 8.46 אחוז , 7.24 אחוז , 21 מיקרוגרם G/mL הראו הבדלים משמעותיים (P<0.05), 31.5 μ G/mL and 42 μ G/mL showed a significant difference (P<0.01). The results of this experiment indicate that TG can inhibit the migration of liver cancer cells, thereby limiting the metastasis of cancer to other tissues.

2.5 שיטת צביעה כפולה Hoechst 33342/PI לזיהוי אפופטוזיס

איור 5 השפעות של ריכוזים שונים של TG על Hoechst 33342/PI בתאי HepG2

צביעה גרעינית בוצעה עם Hoechst 33342 כדי לזהות עיבוי כרומטין [20]. תאים נורמליים הראו כחול נמוך, תאים אפופטוטיים הראו כחול/אדום נמוך ותאים נמקיים הראו כחול/אדום גבוה נמוך. כפי שניתן לראות מאיור 5, בהשוואה לקבוצת הביקורת, בקבוצת הטיפול ב-TG, נצפו ריכוז כרומטין ופיצול גרעיני. במקביל, כאשר TG היה ב-3.5-21, נצפה ש-μ בטווח של g/mL, הקרינה הכחולה עלתה בהדרגה, מה שמרמז ש-TG מעכב בעיקר את התפשטות התאים באמצעות אפופטוזיס בריכוזים נמוכים; ומעל 21 מיקרון ב-g/mL, הקרינה האדומה עולה, מה שמצביע על כך ש-TG בעיקר פוגע והורס את מבנה התא כדי להרוג תאים בריכוזים גבוהים יותר. תוצאות ניסוי זה מצביעות על כך שטיפול ב-TG יכול לגרום לאפופטוזיס ונמק של תאי HepG2.

2.6 צביעה כפולה של Annexin V-FITC/PI לזיהוי השפעת TG על אפופטוזיס של תאי HepG2

איור 6 השפעת TG על צביעה כפולה AV/PI של תאי HepG2

הערה: * מייצג את זהה ל-0 μ ההבדל היה משמעותי ב-g/mL (P<0.05), and * * indicates a significant difference (P<0.01).

כדי לקבוע עוד יותר את ההשפעה מעוררת אפופטוזיס של TG על תאי HepG2, השתמשנו בשיטת צביעה כפולה של Annexin V-FITC/PI כדי לצבוע תאי HepG2. כפי שמוצג באיור 6, עם עליית הריכוז, שיעור האפופטוזיס מראה מגמת עלייה, 0, 3.5, 21, 41 μ שיעורי האפופטוזיס של g/mL היו 5.63 אחוז, 7.65 אחוז, 10.93 אחוז, ו 32.44 אחוזים, בהתאמה, באופן תלוי מינון. התוצאות הראו ש-TG יכול לגרום לאפופטוזיס על ידי הרס שלמות הממברנה של תאי HepG2. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם תוצאות צביעה AV/PI של תאי HepG2 שנדונו על ידי Qi Xinxin וחב'. [6].

2.7 השפעת TG על ביטוי חלבון בתאי HepG2

איור 7 ביטוי חלבון בתאי HepG2 שטופלו בריכוזים שונים של TG

הערה: * מייצג את זהה ל-0 μ ההבדל היה משמעותי ב-g/mL (P<0.05), and * * indicates a significant difference (P<0.01).

Alpha-fetoprotein (AFP) משמש כסמן בסרום לאבחון ובדיקת יעילות של סרטן כבד ראשוני [21]. כפי שניתן לראות באיור 7, בהשוואה לקבוצת הביקורת, רמת הביטוי של AFP בקבוצת הטיפול ירדה, דבר המצביע על כך ש-TG יכול לעכב את התרחשות סרטן הכבד במידה מסוימת, אך ההסתברות להיפוך סרטן הכבד קטנה מאוד. . בנוסף, Dsh - רמת הקטנין ירדה באופן ליניארי עם עליית ריכוז התרופה; GSK-3 עלה בהדרגה, אך לא באופן תלוי מינון. לכן, משערים ש-TG יכול לווסת את Dsh - Catenin ו- GSK-3 ביטוי יחסי, באמצעות מסלול איתות קלאסי Wnt/ - Catenin כדי לגרום לאפופטוזיס בתאי HepG2.

3 .דיון ומסקנה

סרטן הכבד הוא אחד הגידולים הממאירים הנפוצים ביותר בסין והוא גם מדורג בין שלוש המחלות המובילות עם תמותה[22]. שיטות הטיפול העיקריות בסרטן הכבד כוללות כריתה כירורגית, השתלת כבד, כימותרפיה ואימונותרפיה [23-25]. דווח כי בשנת 2016, שיעור ההיארעות של סרטן הכבד בסין היה 9.57 אחוזים, ושיעור התמותה היה גבוה עד 13.92 אחוזים [26]. "בשל התסמינים הלא ספציפיים של סרטן כבד מוקדם, ברגע שמופיעים תסמינים, הם נמצאים בעיקר בשלבים האמצעיים והמאוחרים. לכן, אנשים פעילים יותר בשימוש ברפואה סינית מסורתית לטיפול בסרטן הכבד [27]". אנשים מאמינים שתרכובות טבעיות הם בעלי הרעילות המולקולרית הפחותה והוכחו כמועילים לטיפול בסרטן הכבד, ולכן הם בודקים באופן פעיל תרכובות טבעיות חדשות לאנטי סרטן כבד.

סך הגליקוזידים של Cistanche deserticola יכול לעכב תאי סרטן כבד בשלב מוקדם של סרטן הכבד

בשנים האחרונות, ההשפעות המרובות שלCistanche deserticolaמשכו תשומת לב רבה והפכו בהדרגה לאחת הנקודות החמות בפיתוח מזון בריא ומחקר תרופות. ניסויי מורפולוגיה של תאים ו-CCK-8 אישרו שריכוז מסוים של TG יכול להרוס את המורפולוגיה של התא ולעכב את הצמיחה והשגשוג של תאי HepG2, והריכוז נמצא ביחס ישר לקצב עיכוב התא.

מחזור התא מתייחס לכל התהליך שעובר תא מהשלמת מיטוזה אחת ועד סוף החלוקה הבאה. הוא מחולק לשני שלבים: אינטרפאזה וחלוקה. ציטומטריית זרימה משתמשת בצבעים פלורסנטים כדי להבחין בפאזה G{{0}/G1, פאזה S ופאזה G2/M. באמצעות זיהוי מחזור התא נמצא כי לאחר טיפול בריכוזים שונים של TG, נמצא כי בריכוז גבוה של TG (31.5 μ G/mL ו-42 μ G/mL) יכול לחסום תאים מלהיות בשלב G2/M ולהשפיע על הפעילות של תאי HepG2, וכתוצאה מכך ציטוטוקסיות, ובכך לעכב את התפשטות התאים. במהלך התקדמות הסרטן, תאים סרטניים מגידולים ראשוניים פולשים לרקמות נורמליות סמוכות, שולחים גרורות לאתרים מרוחקים ויוצרים מושבות חדשות. ההערכה היא כי סך של 90 אחוז מהתמותה הקשורה מסרטן נובע מגרורות [28]. מסלול האיתות Wnt מעורב בתהליך של טרנספורמציה של תאי אפיתל-למזנכימליים וטרנספורמציה של תאי מזנכימלי לאפיתל כדי לקדם גרורות של סרטן. בקרצינומה כבדית (HCC), רמות גבוהות של - Catenin קשורות לגרורות מוגברת ולפרוגנוזה גרועה [29]. במחקר זה נמצא כי קצב הנדידה של תאי HepG2 שטופלו ב-TG במשך 24 שעות ירד בהדרגה עם עליית הריכוז, באופן תלוי ריכוז.זה מצביע על כך ש-TG יכול לשלוט בנדידה של תאים סרטניים ולמנוע התפשטות נוספת של הסרטן, אולי באמצעות הפחתת מסלול האיתות Wnt - Expression of Catenin.באופן כללי, הגרעינים המושפעים נראים קטנים יותר; חלק מהכרומטין מתרכז או מצטבר בפריפריה, בעוד שלאחרים יש מאפיינים אופייניים כמו פיצול של כרומטין גרעיני ויצירת גופים אפופטוטיים [30-31]. Hoechst 33342 הוא צבע פלואורסצנטי כחול שיכול לחדור לממברנת התא ובעל רעילות נמוכה לתאים. מחקרים מסוימים מצאו כי מאפיינים מורפולוגיים של תאים אפופטוטיים, כולל קרישה גרעינית ופרגמנטציה, נצפו בתאי HepG2 שנצבעו ב-Hoechst 33342 [32]. בניסוי זה, נמצא כי לאחר 24 שעות של טיפול ב-TG, שיעור התאים עם קרישת כרומטין ושברי גרעין ניאון גדל באופן תלוי ריכוז, דבר העולה בקנה אחד עם תוצאות המחקר של Yang וחב'. [33] על אפופטוזיס המושרה על ידי ג'ינג'רול של תאי HepG2. באמצעות שיטת צביעה כפולה Annexin V-FITC/PI לזיהוי תאי HepG2 שטופלו ב-TG במשך 24 שעות, נמצא כישיעור האפופטוזיס של התאים עלה בהדרגה עם עליית הריכוז.

לטל גליקוזידים של Cistanche deserticol

Dsh, - Catenin ו-GSK-3 הוא Wnt טיפוסי/ - Disheveled (Dvl/Dsh) הוא מווסת חשוב במסלול האיתות של Catenin, שהוא חלבון מפתח במסלול האיתות של Wnt ויכול להעביר אותות Wnt למורד הזרם משפיעים [34]. במסלול האיתות הקלאסי Wnt, Dsh מזומן לממברנת התא על ידי הקולטן Frizzled, הפועל כפרוטו-אונקוגן וקשור לגורם המעכב את הציר הסומטי (Axin), הגן האדנומטי פוליפוזיס קולי (APC) ו-GSK -3 מתקשר ליצירת קומפלקס פירוק המעכב GSK-3 כן - הפירוק הזרחתי של Catenin גורם - Catenin נכנס לגרעין ומתפקד [34-36]. - קטנין מתבטא בעיקר בקרום התא של תאים נורמליים וקשור להידבקות תאים. הוא גם משתתף בהעברת מידע של מסלולי איתות Wnt, ויסות התפשטות תאים והתמיינות. כאשר מסלול האיתות Wnt מופעל בצורה לא תקינה, - הפיזור מחדש של Catenin עשוי להיות אחת הסיבות להופעת הגידול [37]. על פי הדיווחים, ניתן להבחין בה ב-20% - 35 אחוז ממקרי HCC [15] - הפעלה של Catenin. במקביל, ניתן גם לדכא Wnt על ידי/ - מסלול איתות Catenin מפעיל אוטופגיה לעיכוב שגשוג של תאי HepG2 [38]. מחקר זה מצא כי לאחר טיפול ב-TG, תאי HepG2, Dsh - רמת הקטנין ירדה באופן ליניארי עם העלייה בריכוז התרופה; GSK-3 גדל בהדרגה, אך לא באופן תלוי מינון. לכן, ניתן להסיק ש-TG עובר מסלול איתות Wnt/- Catenin כדי לגרום לאפופטוזיס בתאי HepG2.

הסמנים הביולוגיים הנפוצים ביותר של סרטן כבד ראשוני ברחבי העולם הם - Alpha-fetoprotein (AFP) [39]. AFP ממלא תפקיד חשוב בניטור מוקדם, סיווג פתולוגי, בחירת טיפול ופרוגנוזה של חולים עם סרטן כבד ראשוני 9. ללא קשר לשיטת הטיפול, כאשר רמת ה-AFP גבוהה מ-400 ng/mL, זה יוביל להישרדות לקויה [40]. על ידי זיהוי רמת הביטוי של חלבון AFP בתאים שטופלו ב-TG,נמצא ש-TG יכול להפחית ביעילות את הביטוי של AFP, מה שמצביע על כך ש-TG יכול למלא תפקיד בעיכוב תאי סרטן הכבד בשלב מוקדם של סרטן הכבד.

תה Cistanche

לסיכום,הגליקוזידים הכוללים של Cistanche deserticola מעכבים את השגשוג והצמיחה של תאי HepG2 על ידי השפעה על התקדמות מחזור התא, הרס מבנה התא, קידום אפופטוזיס והגבלת נדידת התאים.מנגנון הפעולה עשוי להיות דרך מסלול האות Wnt/ - Catenin, הפעלת GSK-3 Degradation - Catenin יכול לעכב סרטן כבד, אך יש צורך במחקר נוסף. בעתיד, מומחים וחוקרים יכולים לחקור לעומק את היישום של Cistanche deserticola ב-Wnt/ - מולקולות החלבון במעלה הזרם ומורד הזרם של מסלול האיתות Catenin משמשות לאימות גני המטרה ולחקור עוד את מנגנון הפעולה של סך הגליקוזידים של Cistanche deserticola נגד תאי HepG2. בנוסף, כחומר הומולוגי תרופתי ומזון, ניתן לצרוך cistanche deserticola בתזונה היומית כדי לספק גם מניעה וגם טיפול, וגם לספק בסיס תיאורטי מסוים לתרגול תחזית האוכל הגדולה, לקידום בניית "סין בריאה", ושיפור רמת הבריאות של האנשים.

[1] FENG D, HE Y, JIANG YJ, et al. התקדמות מחקר על תפקוד אנטי-אייג'ינג של Cistanches[J]. Journal of Food Safety & Quality, 2021, 12(11): 4429-4437.

[2] Ma G, Chen J, Wei T, et al. עיכוב תפקידים של FOXA2 בנדידת תאי סרטן כבד ובפלישה על ידי דיכוי תעתיק של microRNA103a-3p והפעלת ציר GREM2/LATS2/YAP[J]. ציטוטכנולוגיה. 2021, 73:523-537.

[3] LI MQ, WANG K, ZHOU X. עיכוב של פפטיד שעועית מונג על התפשטות בתא HepG2[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2018, 18(10): 52-57.

[4] HU Y, WANG S, WU X, et al. תרכובות שמקורן ברפואת צמחים סינית לטיפול בסרטן: התמקדות בקרצינומה הפטוצלולרית [J]. J Etnopharmacol. 2013, 149(3):601-612. doi:10.1016/j.jep.2013.07.030.

[5] YE Y, SONG Y, ZHUANG J, et al. השפעות אנטי-סרטניות של אכינאקוסיד במודל עכבר קרצינומה הפטוצלולרית ותאי HepG2[J]. J Cell Physiol. 2019, 234(2): 1880-1888. doi:10.1002/jcp.27063

[6] QI XX, YOU SP, HE ZX, ועוד. השפעת Cistanche deserticola phenylethanol glycoside על שגשוג ואפופטוזיס של תאי HepG2 במבחנה [J]. Journal of Xinjiang Medical University, 2021, 44(09): 1041-1047.

[7] XIE YT. השפעות של Echniacoside על 786-אפופטוזיס של תאי O ומנגנונים אינדוקטיביים במבחנה[D]. מכללת המורים באוטו, 2020.

[8] HAN YM, JIN WM, ZENG H, et al, Effects of Echniacoside על התפשטות, פלישה וגרורות של תאי סרטן המעי הגס SW480 במבחנה וב-Vivo[J]. Journal of Guangzhou University of Chinese Traditional Medicine, 2020,37(08):1542-1549.

[9] HU Q, YOU SP, LIU T, et al. חקירה על ההשפעה נגד סרטן הכבד של cistanche[J]. Carcinogenesis,Teratogenesis & Mutagenesis, 2018,30(03):194-199.

[10] XU Q, QIN W, WU FZ, et al. השפעת מרתח Roucongrong(Herba Cistanches Deserticolae) על ה-substantia nigra דרך מסלול איתות Wnt/-catenin בחולדות עם מחלת פרקינסון הנגרמת על ידי 6-הידרוכלוריד הידרוקסידופמין[ J].Journal of Chinese Traditional Medicine,2021,41(05):762-770.

[11] YIN SL, WANG HB, YANG S. השפעות נוירו-הגנה של Polysaccharide של Cistanche Deserticola על חולדות פרקינסון הנגרמות על ידי 6-HODA הנגרמת על ידי הפעלת מסלול האותות Wntt/ -catenin[J]. Chinese 10 Journal of Integrative Medicine on Cardio-Cerebrovascular Disease, 2020,18(08):1227-1230.

[12] TANG C H. Echinacoside מעכב תאי סרטן שד על ידי דיכוי מסלול איתות Wnt/-catenin[D]. האוניברסיטה הרפואית של צ'ונגצ'ינג, 2020.

[13] FENG L, MA QL, SHI L, et al. אכינאציין מעכב את התפשטותם של תאי לוקמיה מיאלואידית חריפה על ידי דיכוי אות SOX4/Wnt/Beta-Catenin[J]. Immunological Journal, 2020,36(02):138-142.

[14] חכמים ח, ואח'. איתות Wnt/ -catenin ומחלה[J]. תָא. 2012, 149(6):1192-205.

[15] ראסל JO, Monga SP. איתות Wnt/-Catenin בהתפתחות כבד, הומאוסטזיס ופתוביולוגיה[J]. עננו ר' פאתול. 2018, 13: 351-378. doi:10.1146/annurev-pathol-020117-044010

[16] LIU CY, CHEN KF, CHEN PJ. טיפול בסרטן הכבד [J]. Cold Spring Harb Perspect Med. 2015, 5(9):a021535.

[17] WANG F, LI R, TU P, et al. סך הגליקוזידים של Cistanche deserticola מקדמים שחזור תפקוד נוירולוגי על ידי גרימת התחדשות נוירווסקולרית באמצעות נתיב Nrf-2/Keap-1 בחולדות MCAO/R. גבולות בפרמקולוגיה 2020, 11, 236.

[18] שיר QJ. השפעה מעכבת של תמציות פירות Akebia על הידבקות, הגירה ופלישה של תאי HepG2 Hepatoma אנושיים ומנגנונים קשורים[D]. אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית, 2019.

[19] SUN Q, WANG J, LI Y, et al. סינתזה והערכה של פעילויות ציטוטוקסיות של נגזרות ארטמיסינין [J]. Chem Biol Drug Des. 2017, 90(5): 1019-1028.

[20] ZHAO YM, SUN LN, ZHOU HY, et al. תעלות אשלגן תלויות מתח מעורבות באפופטוזיס המושרה על ידי גלוטמט של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדה [J]. Neurosci Lett. 2006, 398(1-2):22-27.

[21] GALLE PR, FOERSTER F, KUDO M, et al. ביולוגיה ומשמעות של אלפא-פטופרוטאין בקרצינומה הפטוצלורית [J]. Liver Int, 2019, 39(12): 2214-2229.

[22] MA G, CHEN J, WEI T, et al. עיכוב תפקידים של FOXA2 בנדידת תאי סרטן כבד ובפלישה על ידי דיכוי תעתיק של microRNA-103a-3p והפעלת ציר GREM2/LATS2/YAP[J]. ציטוטכנולוגיה. 2021, 73(4): 523-537.

[23] KAMARAJAH SK, FRANKEL TL, SONNENDAY C, et al. הערכה קריטית של מערכת הבמה ה-8 של הוועדה האמריקנית המשותפת לסרטן (AJCC) עבור חולים עם קרצינומה כבדית (HCC): ניתוח מעקב, אפידמיולוגיה, תוצאות סופיות (SEER)[J]. J Surg Oncol. 2018, 117(4):644-650.

[24] EDGE SB, COMPTON CC. הוועדה המשותפת האמריקאית לסרטן: המהדורה השביעית של מדריך הבימוי לסרטן AJCC והעתיד של TNM[J]. אן סורג אונקול. 2010, 17(6):1471-1474.

[25] VAUTHEY JN, LAUWERS GY, ESNAOLA NF, et al. שלב פשוט עבור קרצינומה כבדית [J]. כתב עת לאונקולוגיה קלינית: כתב עת רשמי של האגודה האמריקאית לאונקולוגיה קלינית. 2002, 20(6): 1527-36.

[26] ZHENG R, ZHANG S, ZENG H, et al. שכיחות סרטן ותמותה בסין, 2016. Journal of the National Cancer Center, 2022, 2(1), 1–9.

[27] ANWANWAN D, SINGH SK, SINGH S, et al. אתגרים בסרטן הכבד וגישות טיפול אפשריות[J]. Biochim Biophys Acta Rev סרטן. 2020, 1873(1): 188314.

[28] CHAFFER CL, WEINBERG RA. פרספקטיבה על גרורות של תאי סרטן [J]. Science, 2011, 331(6024): 1559-1564.

[29] ZHONG Z, YU J, VIRSHUP DM, et al. Wnts וסימני ההיכר של הסרטן[J]. גרורות סרטן Rev 2020, 39: 625–645.

[30] SYAM S, ABDUL AB, SUKARI MA, et al. השפעות דיכוי הגדילה של girinimbine על HepG2 כרוכות באינדוקציה של אפופטוזיס ועצירת מחזור התא [J]. מולקולות. 2011, 16(8):7155-7170.

[31] ZHANG X, LUO W, ZHAO W, et al. Isocryptotanshinone Induced Apoptosis ואיתת MAPK פעיל בתאי MCF-7 סרטן שד אנושיים[J]. J סרטן השד. 2015, 18(2):112-118.

[32] Ponselvi Induja M, Ezhilarasan D, Ashok Vardhan N. Evolvulus alsinoides תמצית מתנולית מעוררת אפופטוזיס בתאי HepG2[J]. אביסנה ג'יי פיטומד. 2018, 8(6): 504-512.11

[33] YANG G, WANG SP, ZHONG LF, et al. 6-ג'ינג'רול גורם לאפופטוזיס דרך ציר ליזוזומלי-מיטוכונדריאלי בתאי הפטומה G2 אנושיים[J]. Phytother Res. 2012, 26(11):1667-1673. doi:10.1002/ptr.4632

[34]  LI J, GUO G, FAN YM, et al. Disheveled מקדם שגשוג של גליומה: מחקר ניסיוני[J]. Chinese Remedies & Clinics, 2021, 21(18): 3077-3080.

[35] Fiedler M, Mendoza-Topaz C, Rutherford TJ, Mieszczanek J, Bienz M. Disheveled מקיים אינטראקציה עם ממשק פילמור תחום ה-DIX של Axin כדי להפריע לתפקוד שלו בוויסות מטה של ​​-catenin[J]. Proc Natl Acad Sci US A. 2011;108(5):1937-1942. doi:10.1073/pnas.1017063108.

[36]  SHI QQ, ZUO GW, FENG ZQ, ועוד. מחקר על השפעת אנטי-הפטומה של ג'ינסנוסיד Rh2 ומנגנון הפירוק של -קטנין באמצעות הפעלת GSK -3 [J]. תרופות סיניות מסורתיות וצמחי מרפא, 2016,47(18):3231-3238.

[37] HE S, TANG S. WNT/ -catenin איתות בהתפתחות של סרטן כבד[J]. Biomed Pharmacother. 2020, 132: 110851.

[38] HU P, CHENG B, HE Y, et al. אוטופאגיה מדכאת שגשוג של תאי HepG2 באמצעות עיכוב איתות glypican-3/wnt/-catenin[J]. Onco Targets Ther. 2018;11:193-200.

[39] GAO YX, YANG TW, YIN JM, et al. התקדמות וסיכויים של סמנים ביולוגיים בסרטן כבד ראשוני (סקירה) [J]. Int J Oncol. 2020, 57(1): 54-66.

[40] Tangkijvanich P, Anukulkarnkusol N, Suwangool P, et al. מאפיינים קליניים ופרוגנוזה של קרצינומה כבדית: ניתוח מבוסס על רמות אלפא-פטופרוטאין בסרום [J]. J Clin Gastroenterol. 2000, 31(4):302-308.

[41] FENG D, DUAN H, LYU YN, et al. יישום של Cistanche Deserticola Ma במזון פונקציונלי בסין[J]. Food Science and Technology, 2021,46(12):76-81.